CN105039147B - 一种高通量基因测序碱基荧光图像捕获系统装置及方法 - Google Patents

Abstract

一种高通量基因测序碱基荧光图像捕获系统装置，待测DNA片段样品放置于基因测序仪的基因芯片中，包括：激光控制单元，控制激光光源输出Y向的平行线型激光束对基因芯片进行X向及Y向扫描，激发待测DNA片段样品中核苷酸携带的荧光染料基团发光；图像捕获单元，对荧光染料基团所发的光进行分离得到几种不同波长的光，并利用TDI相机模块对该几种光成像，本发明还提供了利用该装置进行图像捕获的方法，控制扫描振镜进行线阵扫描，通过光电转换的方法将光学信息转换为电信号最终生成图像信息，经过图像处理算法获得DNA片段的碱基排列顺序，本发明能够满足高通量DNA片段测序的要求，具有安全稳定、自动化程度高的特点。

Description

一种高通量基因测序碱基荧光图像捕获系统装置及方法

技术领域

本发明属于生物医学设备以及自动控制领域，特别涉及一种高通量基因测序碱基荧光图像捕获系统装置及方法。

背景技术

传统测序技术以末端终止法为核心的Sanger测序法，这种方法费时费力，需要大量的技术人员参与，耗费大量财力。新一代高通量测序方法(也称其为深度测序(deepsequencing)或下一代测序技术(nextgenerationsequencing，NGS)在技术上实现了质的飞跃，是一个里程碑式的生物技术平台，它可以同时将整个基因组在短时间内测序完成。开发高通量、全自动化而且价格便宜的测序仪器目前正在全世界展开激烈的科技和商业竞赛。国际顶尖科技公司都在开发各种高通量并行化的测序技术，以达到降低测序成本，推动广泛应用的目的。高通量基因测序市场也迅速成为整个生物医学领域新的增长点。

目前，针对高通量测序仪中所需的荧光检测方法一直是该设备的关键技术。对于基于生物芯片的荧光成像技术主要有点扫描共聚焦荧光检测方法和面成像荧光检测方法。点扫描共聚焦荧光检测方法采用共聚焦光路去除干扰光，激光会聚成点来激发荧光，具有很高的探测灵敏度；但是，成像需要二维机械扫描，增加了测量的时间和仪器的成本。面成像荧光检测方法使用面阵相机等装置直接探测整个生物芯片的荧光图像，具有探测时间短、设计简单、成本较低的优点；但是，由于激发光照射整个被测面，单位面积的激发功率较小，因此探测灵敏度较低。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种高通量基因测序碱基荧光图像捕获系统装置及方法，能够对基因芯片上高密度的待测DNA片段序列荧光信号进行高效、稳定的捕获并实现仪器自动化，摆脱了人工现场管理，实现了高通量DNA测序仪的安全、稳定、高效的自动化操作，在高通量基因测序技术中，获得的原始图像是由含有碱基位信息的荧光点组成，通过图像处理和数据分析，可以得到所测DNA片段中的碱基位置序列信息。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种高通量基因测序碱基荧光图像捕获系统装置，待测DNA片段样品放置于基因测序仪的基因芯片001中，包括：

激光控制单元，控制激光光源输出Y向的平行线型激光束对基因芯片001进行X向及Y向扫描，激发待测DNA片段样品中核苷酸携带的荧光染料基团发光；

图像捕获单元，对荧光染料基团所发的光进行分离得到几种不同波长的光，并利用TDI相机模块对该几种光成像。

所述基因芯片001中注入四种不同类型的荧光染料，所述激光控制单元包括绿激光器101和红激光器102以及其各自连接的电源，其中绿激光器101的输出光依次经滤光片五103、光闸一105和扩束镜一107后，被半透半反镜四110反射通过柱面镜一111后到达振镜112，红激光器102的输出光依次经滤光片六104、光闸二106和扩束镜二108后，由反射镜五109反射透过半透半反镜四110后通过柱面镜一111到达振镜112，两束光再一起被振镜112反射至位于基因芯片001下表面的偏振分光棱镜114上，由偏振分光棱镜114反射至基因芯片001的下表面。

所述偏振分光棱镜114位于导轨113上，步进电机009连接导轨113带动其沿Y向运动，实现Y向扫描。

所述图像捕获单元包括聚焦模块、半透半反镜模块、滤光片模块、反射镜模块以及TDI相机模块，其中：

所述聚焦模块用于收集所述荧光染料基团所发荧光并调节焦距，经收集后的光束进入半透半反镜模块；

所述半透半反镜模块用于控制特定波段的光束被反射，而其他波段的光束则能通过，反射的光进入滤光片模块；

所述滤光片模块用于筛选通过特定波长的光束，其他波长的光束则被阻断，通过的光束进入反射镜模块；

所述反射镜模块用于将光束进行反射使其对准TDI相机模块；

所述TDI相机模块用于对接收的光束进行成像，并将生成的图片传送至计算机。

所述聚焦模块包括物镜201、柱面镜二202和反射镜二203，所述荧光依次通过物镜201和柱面镜二202后，被反射镜二203反射；

所述半透半反镜模块包括依次设置的半透半反镜一204、半透半反镜二205、半透半反镜三206和全反镜207，其中被反射镜二203反射的光束首先通过半透半反镜一204，使得部分光束被反射，部分透射进入半透半反镜二205，在半透半反镜二205再次使得部分光束被反射，而部分透射进入半透半反镜三206，在半透半反镜三206再次使得部分光束被反射，而部分透射进入全反镜207，最终被全反镜207全部反射；

所述滤光片模块包括滤光片一208、滤光片二209、滤光片三210和滤光片四211，其中所述滤光片一208设置于半透半反镜一204的反射光路上，滤光片二209设置于半透半反镜二205的反射光路上，滤光片三210设置于半透半反镜三206的反射光路上，滤光片四211设置于全反镜207的反射光路上；

所述反射镜模块包括反射镜一212、反射镜二213、反射镜三214和反射镜四215；

所述TDI相机模块包括TDI相机一216、TDI相机二217、TDI相机三218和TDI相机四219；

其中，所述反射镜一212将透过滤光片一208的光束反射至TDI相机一216，反射镜二213将透过滤光片二209的光束反射至TDI相机二217，反射镜三214将透过滤光片三210的光束反射至TDI相机三218，反射镜四215将透过滤光片四211的光束反射至TDI相机四219。

本发明还包括控制器008，所述控制器008与振镜112的驱动器一011连接，由驱动器带动振镜112调整其角度，从而实现X向扫描，其中控制器008给驱动器一011提供一个占空比为K的二角波作为驱动信号。

所述基因芯片001设置于生化反应室中，生化反应室中设置有温度传感器005，温度传感器005与所述控制器008连接，所述控制器008与温控装置006的驱动器二007连接，实现对生化反应室内温度的控制；所述生化反应室中还设置有试剂组003和试剂泵002，其中试剂泵002连接电机012，所述控制器008与电机012的驱动器三013连接，控制相应试剂的试剂泵002工作向基因芯片001完成注入。

所述TDI相机模块获取四幅图片，4种荧光素对一个光点颜色和光强贡献度的4元一次方程如下：

其中，I_红，I_黄，I_浅绿，I_深绿分别是四路相机所捕获的特定波长荧光强度值。a_i,j表示四种不同荧光基团在两种不同激发光照射下所产生的参数因子，1≤i,j≤4，上述公式中A、C、G、T分别是携带有四种不同荧光染料基团的碱基。

所述物镜201为f-theta物镜，其产生负畸变Δx′如下：

Δx′＝f·2θ-f·tg2θ＝f·(2θ-tg2θ)

其中，f为振镜112的转轴到f-theta物镜的距离即焦距，θ为振镜角度，振镜112的转轴置于f-theta物镜的前焦面上；

所述TDI相机模块中各个TDI相机的行扫描速率f_H＝(f/d)·(V_g/H)，其中，f为振镜112的转轴到f-theta物镜的距离即焦距，d为象元尺寸，即一行的象元宽度，V_g为景物即基因芯片中碱基荧光基团所激发的荧光的移动速率，H为摄影距离。

本发明还提供了基于所述高通量基因测序碱基荧光图像捕获系统装置进行图像捕获的方法，将待测DNA片段样品经PCR扩增使每个DNA片段复制成簇并固定在基因芯片001中，将基因芯片001放置于基因测序仪的生化反应室中，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，控制基因测序仪选择不同类型的荧光染料注入基因芯片001中，并调节生化反应室中反应小室的温度满足生化反应所需的环境温度；

步骤2，控制激光控制单元产生特定波长的Y向的平行线型激光束激发待测DNA片段样品中核苷酸携带的荧光染料基团发光，控制振镜扫描装置使线型激光束以速度可控的方式对基因芯片001进行线扫描；

步骤3，在图像捕获单元中捕获荧光图像信号。

与现有技术相比，本发明与传统的共聚焦点扫描荧光检测方法相比，综合了面成像检测法低成本、设计简单和共焦点扫描法灵敏度高的优点，把点激发变成线激发，从而把二维扫描变成了一维扫描，提高了成像的速度，从而更加高效、快速；而与面成像方法相比，会聚成线的激发光光强具有更高的功率，探测灵敏度有所提高，对更低荧光强度的图像捕获能力更好。

综上，本发明通过对基因测序的测序过程进行自动化控制，提高了测序过程的稳定性和效率，且提高了测序结果的准确性。此外通过控制基因测序仪进行大规模的图像采集，因此保证了足够的测序通量。

附图说明

图1是本发明捕获系统装置的逻辑结构图。

图2是本发明捕获系统装置中激光控制单元结构图。

图3是本发明捕获系统装置中图像捕获单元结构图。

图4是本发明振镜控制线性光束扫描效果图。

图5是本发明光学系统成像方远心光路效果图。

图6是本发明TDI相机同步扫描控制逻辑结构图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。

如图1所示，本发明对基因测序仪的图像捕获过程进行控制的系统逻辑结构，主要包括图像捕获单元、激光控制单元、与其相连的各个基因测序仪功能部件以及实现自动控制的计算机控制系统等，计算机控制系统以控制器008为核心。应当说明的是，本发明所有图示中各设备之间的连接关系是为了清楚阐释其信息交互及控制过程的需要，因此应当视为逻辑上的控制关系，而不应限于物理连接或无线连接。另外需要说明的是，各功能模块之间的通信方式可以采取多种，本发明的保护范围不应限定为某种特定类型的通信方式。其中：

(1)利用各个功能模块分别控制基因测序仪中对应的各个组件，从而控制基因测序仪的测序过程。主要包括：控制基因测序仪将试剂导入基因芯片001中，并调节生化反应室的温度；控制激光光源的形状大小以及扫描方式；激发基因芯片001中待测DNA片段样品中核苷酸携带的荧光基团发光；控制相机捕获荧光图像信号。

(2)基因测序仪由多个组件构成，分别与计算机控制系统中的各个功能模块对应，接受并执行这些功能模块的各项指令，从而协同完成测序。这些组件包括：用于选择试剂并注入生化反应室的组件，用于对生化反应室的温度进行调节的组件，用于产生激发光的组件，用于采集图像信号的组件等。应当说明的是，不同类型的基因测序仪具有不同的内部组件，或者内部组件的外在表现形式有所不同，但所实现的功能是一致的，本发明的保护范围不应受到这些因素的限制。还应当说明的是，各组件之间不一定完全独立，实现不同功能的各组件可能会涉及一个或多个相同的部件。

需要说明的是，在进行测序之前，待测DNA片段样品需要提前制备，并将已经制备完好的基因芯片001放置于生化反应室中。待测DNA片段样品的制备过程是：首先从生物组织、血液、细菌等提取DNA，将已经提取出来的DNA进行PCR扩增，并用超声设备将其打碎筛选长度相等的待测DNA片段，并连接接头序列；然后通过接头序列与基因芯片上引物接头结合，将待测DNA片段结合到基因芯片上；然后对固定于基因芯片上的待测DNA片段进行PCR扩增，使每个待测DNA片段序列生成多个拷贝数目的DNA片段，而这些片段的碱基排列顺序完全相同；再将经过多次PCR过程的基因芯片放置于基因测序仪中生化反应室上。生化反应室中提供有温度控制模块以及试剂传动模块，用于控制室内温度以及对基因芯片提供生化反应所需的试剂种类。其中温度控制模块包括设置于生化反应室中的温度传感器005，温度传感器005与控制器008连接，控制器008与温控装置006的驱动器二007连接，实现对生化反应室内温度的控制。试剂传动模块包括设置于生化反应室中的试剂组003和试剂泵002，其中试剂泵002连接电机012，控制器008与电机012的驱动器三013连接，控制相应试剂的试剂泵002工作向基因芯片001完成注入。试验完毕之后，废液流入废液瓶004。

在本发明中，系统装置的关键在于稳定、高效地捕获待测DNA片段样品中核苷酸携带的荧光基团发光图像。传统技术光源选择多用汞灯、氙灯等作光源，但其有寿命短、光强低、需要滤光片等光学元器件，设计复杂等缺点。而采用激光器或LED作为激发光光源具有功率稳定、可调节，操作简便、使用寿命长、相干性好等优点。更为重要的是发光为冷光源，避免加装隔热光学器件。对待测DNA片段进行图像捕获过程中，传统技术采用面阵相机进行图像进行面扫描方式逐个区域采集，但面阵相机以面扫描方式捕获荧光信号，具有曝光时间长、成像质量差等缺点。

TDI扫描优点：1、扫描速度非常快，从基因芯片一头扫描到另一头不到不到20秒，使得扫描成像时间大为缩短，提高测序仪的工作效率。缩短测序工作时间；2、扫描精度非常高，换言之，成像时，荧光光点大小可以更小，光点密度更高。密度可以更大使得在基因芯片上可以固定更多的待测DNA片段，密度可达每平方毫米100万个点，同时前期制备样品时PCR次数也可相应减少；3、这种扫描方式采用共聚焦的方式，确定聚焦光源的位置于一条线上，避免周围环境的影响。可以调节聚焦的位置扫描不同层次的待测对象。

在图像捕获过程中，控制器008控制基因测序仪对基因芯片001中待测DNA片段样品上通过TDI线扫描的方式进行循环生成DNA样品的荧光图像。激光控制单元控制激光光路在待测DNA样品上逐次移动，同时确定每次移动后反应小室中待测DNA片段样品的图像位置信息；激光控制单元控制激光光源产生特定的波谱光源激发待测DNA片段样品中核苷酸携带的荧光染料基团发光，并在每次激光扫描过程中确定待测DNA片段样品的成像位置处以图像捕获单元获取图像信号。

其中，激光控制单元主要包括激光触发模块、光源调节模块、振镜扫描模块等。激光触发模块用于控制产生特定波长的激发光照射生化反应小室中基因芯片，使基因芯片001中的待测DNA片段样品中核苷酸携带的荧光基团发光；光源调节模块调节激光的光强分布，使光斑光强分布均匀，避免产生光强呈高斯分布的光斑，同时可以调节光斑大小形状，使输出平行光强均匀的形状可控的光源；振镜扫描模块控制线型光源扫描基因芯片，使基因芯片中的待测DNA片段样品中核苷酸携带的荧光基团发光。

具体地，本发明激光控制单元如图2所示，包括绿激光器101和红激光器102以及其各自连接的电源，其中绿激光器101的输出光依次经滤光片五103、光闸一105和扩束镜一107后，被半透半反镜四110反射通过柱面镜一111后到达振镜112，红激光器102的输出光依次经滤光片六104、光闸二106和扩束镜二108后，由反射镜五109反射透过半透半反镜四110后通过柱面镜一111到达振镜112，两束光再一起被振镜112反射至位于基因芯片001下表面的偏振分光棱镜114上，由偏振分光棱镜114反射至基因芯片001的下表面。

其工作过程为：

由绿激光器101发射出来的绿激光532nm穿过滤光片五103得到特定波长的光源，再经光闸一105和扩束镜一107后，实现对光束整形消除激光器光源光强成高斯分布的影响并扩束，光束直径约5mm，被半透半反镜四110反射到达振镜112，由红激光器102发射出来的红激光635nm穿过滤光片六104得到特定波长的光源，再经光闸二106和扩束镜二108实现对光束整形消除激光器光源光强成高斯分布的影响并扩束，光束直径约5mm，被反射镜五109反射透过半透半反镜四110后到达振镜112，此后红绿激光的光路重合。振镜112将重合后的激光束以某一角度反射至柱面镜柱面镜一111，再由柱面镜一111将激光聚焦在基因芯片001下表面的某一位置，此位置与振镜112的角度相互对应。基因芯片001上附着待测DNA单链片段序列进行互补配对而新添加的碱基携带有荧光基团在前述特定激光下发射荧光。偏振分光棱镜114位于导轨113上，步进电机009连接导轨113带动其沿Y向运动，实现Y向扫描；而控制器008与振镜112的驱动器一011连接，由驱动器带动振镜112调整其角度，从而实现X向扫描，其中控制器008给驱动器一011提供一个占空比为K的二角波作为驱动信号。

图像捕获单元主要包括聚焦模块、半透半反镜模块、滤光片模块、反射镜模块以及TDI相机模块等。聚焦模块用于收集荧光染料基团所发荧光并调节焦距，经收集后的光束进入半透半反镜模块；半透半反镜模块用于控制特定波段的光束被反射，而其他波段的光束则能通过，反射的光进入滤光片模块；滤光片模块用于筛选通过特定波长的光束，其他波长的光束则被阻断，通过的光束进入反射镜模块；反射镜模块用于将光束进行反射使其对准TDI相机模块；TDI相机模块用于对接收的光束进行成像，并将生成的图片传送至计算机控制系统，进行后期处理。

具体地，本发明图像捕获单元如图3所示，聚焦模块包括物镜201、柱面镜二202和反射镜二203，荧光依次通过物镜201和柱面镜二202后，被反射镜二203反射；半透半反镜模块包括依次设置的半透半反镜一204、半透半反镜二205、半透半反镜三206和全反镜207，其中被反射镜二203反射的光束首先通过半透半反镜一204，使得部分光束被反射，部分透射进入半透半反镜二205，在半透半反镜二205再次使得部分光束被反射，而部分透射进入半透半反镜三206，在半透半反镜三206再次使得部分光束被反射，而部分透射进入全反镜207，最终被全反镜207全部反射；滤光片模块包括滤光片一208、滤光片二209、滤光片三210和滤光片四211，其中滤光片一208设置于半透半反镜一204的反射光路上，滤光片二209设置于半透半反镜二205的反射光路上，滤光片三210设置于半透半反镜三206的反射光路上，滤光片四211设置于全反镜207的反射光路上；反射镜模块包括反射镜一212、反射镜二213、反射镜三214和反射镜四215；TDI相机模块包括TDI相机一216、TDI相机二217、TDI相机三218和TDI相机四219；其中，反射镜一212将透过滤光片一208的光束反射至TDI相机一216，反射镜二213将透过滤光片二209的光束反射至TDI相机二217，反射镜三214将透过滤光片三210的光束反射至TDI相机三218，反射镜四215将透过滤光片四211的光束反射至TDI相机四219。

其工作过程为：

前述产生的荧光由物镜201(显微物镜，此处选择f-theta物镜)收集后通过柱面镜二202变成平行光束，光束由反射镜二203反射，通过半透半反镜一204，有一部分荧光光束被反射，反射光束穿过窄带干涉滤光片一208获得一个特定波长的荧光光束，再经由反射镜一212反射使荧光对准TDI相机一216的镜头聚焦成像。穿过半透半反镜一204的荧光光束到达半透半反镜二205时，有一部分荧光光束被反射，反射光经由窄带干涉滤光片二209筛选后得到特定波长的荧光光束，再经反射镜二213反射后使荧光对准TDI相机二217的镜头聚焦成像。穿过半透半反镜二205的荧光光束到达半透半反镜三206时，有一部分荧光光束被反射，反射光经由窄带干涉滤光片三210筛选后得到特定波长的荧光光束，再经由反射镜三214反射后使荧光对准TDI相机三218的镜头聚焦成像。穿过半透半反镜三206的荧光光束遇全反镜207时，最后一部分荧光光束被反射，经由窄带干涉滤光片四211筛选后得到特定波长的荧光光束，再经由反射镜四215反射后使荧光对准TDI相机四219的镜头聚焦成像。

本发明中，两路激光光束重合后，经光学元件正确聚焦在基因芯片001下表面，激发待测碱基携带的荧光染料基团发出荧光，荧光进入相机成像，而基因芯片001其他部分的荧光或杂散光将被一系列滤光元件所阻挡，不能通过相机成像，大大减少了片基和灰尘所产生的背景荧光和杂散光而造成的影响。激光对基因芯片X方向的扫描动作由振镜112和f-theta物镜共同实现，Y方向的移动动作由步进电机009驱动导轨113平台沿Y方向移动实现。

红绿激光对荧光染料的扫描检测成像是同步进行的，红绿两路激光经反射后重合共同作用于四种类型的荧光染料，使之发射出强度不同波段荧光，经过四种不同的窄带滤光片分别对应四种TDI相机捕获不同波段的荧光，得到在四种不同波段下的荧光灰度成像图片。由于红绿激光组以及四种TDI相机是协同同步进行的，故能高效的省时的扫描基因芯片。并能根据四幅图片的光斑灰度值计算出对应出的荧光染料的种类。

其中，I_红，I_黄，I_浅绿，I_深绿分别是四路相机所捕获的特定波长荧光强度值。a_i,j(1≤i,j≤4)表示四种不同荧光基团在两种不同激发光照射下所产生的参数因子。

高通量测序图像中的亮点是由激光激发碱基上的荧光物质发光得到的，但四种碱基(A、C、G、T)上的荧光染料基团发出的光并不单一，会造成交叉影响。碱基荧光基团信号解耦是通过对不同碱基图像的碱基荧光强度作统计分析，得到校正因子并对原强度信息进行有效的校正。假设某一碱基簇在一轮合成反应后得到的为A碱基，在A碱基荧光图像中有荧光亮点，但在其它三种碱基C、G、T图像中也有亮点，只是荧光强度表现不同。因此最终图像中光斑强度值是四种碱基荧光基团所激发的不同荧光强度之和。由于碱基荧光基团在不同波长下激发的相同波长的荧光强度不同，在本专利中所选用的红、绿激光波长是532nm和635nm，本专利保护范围不限此波长，在两种激光激发下，四种碱基荧光激发出一系列波长的荧光光谱，但本专利对四种碱基基团荧光分别选取对应的四种不同的单一波长荧光(由四种滤光片以及半透半反镜滤波筛选出)进行相机捕获成像，保证这四种不同波长的荧光成像出的图片能够通过上述公式(1-1)反解出来，并且不会造成交叉影响。上述公式(1-1)a_i,j(1≤i,j≤4)代表四种不同碱基荧光基团受激发出的并进行筛选下单一波长下荧光的荧光强度因子之和。I_红，I_黄，I_浅绿，I_深绿分别是四路相机捕获成像时，总的荧光强度值。

上面是计算4种荧光素对一个光点颜色和光强贡献度的4元一次方程，解这个方程，就可以计算出原来一个光点中4种荧光素的占比。

振镜扫描速度比直线电机或步进电机快，线性度高。惯性小。易操控。因此光学扫描比机械扫描更加优异。

振镜转轴到f-theta物镜的距离为其焦距f，此时，激光光斑在生物芯片x方向扫描的位移量

Δx＝f·2θ

但是，一般的光学系统，Δx和振镜角度θ的关系为：

Δx＝f·tg2θ

即以等角速度偏转的入射光束在光学系统焦平面上的扫描速度不是常数。为了实现等速扫描，应使f-theta物镜产生一定的负畸变，此畸变为：

Δx′＝f·2θ-f·tg2θ＝f·(2θ-tg2θ)

图4、以及图5为本发明将光学系统设计成像方远心光路，振镜的转轴置于f-theta物镜的前焦面上，使得像方主光线始终垂直于基因芯片的下表面，保证了每一扫描点的荧光发射角都相同，消除了不同荧光发射角度所造成的误差。

公式Δx＝f·2θ表明在理想f-theta物镜的聚焦作用下，扫描激光束在生物芯片X方向的位移量与振镜转角成线性关系。因此，只要振镜转角成线性变化，就能保证激光光束沿生物芯片的X方向作线性扫描运动。因为振镜的转角与驱动信号的电压成线性关系，而且在一个振动周期中，只有正程为有效扫描行程，故要给振镜驱动电路提供一个占空比为K的二角波作为驱动信号。

由于TDI相机的特殊工作方式，要求同一列上的每一个象元都对同一目标曝光积分，才能保证成像质量。这就给相机的驱动系统带来了新的要求，即要求相机的行扫速率与景物的运动速率要严格同步，也就是要求经过相机的一个行周期(曝光积分周期)时间，景物的像恰好移动一行。把景物的像移动一行的时间Δt称为延迟积分时间.则有

Δt＝d/V_i

式中d为象元尺寸(即一行的象元宽度)，V_i为像移速率.对于一个焦距为f的图像采集系统来讲有

V_i＝(V_g/H)·f

式中，V_g为景物的移动速率，H为摄影距离。因此

Δt＝(d/f)·(H/V_g)

为了保证成像质量，要求CCD的行周期T与延迟积分时间相等，即

T＝Δt＝(d/f)·(H/V_g)

则行扫描速率为

f_H＝1/T＝(f/d)·(V_g/H)＝d·V_i

可见，在焦距和象元尺寸一定时，行扫描速率与景物的运动速度和摄影距离有关。V_g/H称之为速高比，速高比变化必然会引起像移速率的变化。

速高比变化时，像移速度改变，TDI相机的工作频率也要随着改变。由于TDI相机驱动时序电路精度高，工作频率误差很小，而像移速度的误差由引人速高比决定，所以速高比误差影响同步控制精度，从而影响成像质量。M值越大，对同步控制精度要求越高。

为了叙述方便，把行扫描速率与像移速率间的匹配控制简称为行扫描速率的同步控制。

对于低光强、高速移动的小目标，常规的线阵相机或面阵相机基本上抓不到目标的任何信息，而TDI相机在低照度下可以捕获到目标的相关信息。但它和普通线阵相机的工作原理不同，在对高速动态目标成像时，要求行扫描速率和目标像移速率严格同步，否则难以正确提取目标的图像信息。这是因为TDI相机在对运动目标成像时，由于在光积分时间内成像目标的快速变化。

导致目标图像与相机感光元器件像元之间存在着相对运动，相应地引起光敏面上成像点的变化。如果速度失配较大，将会降低相机的调制传递函数和分辨率，使相机的输出图像模糊。

由上文可知，扫描芯片的运动速率是线性的，摄影距离的变化造成了像移速率的变化。像移速率变化造成延迟积分时间的变化，因此要调整相机的行周期的长短来实现同步控制。因此可以通过调节TDI相机积分时间实现。

由TDI相机的时序要求可知，一个行周期可分为成正程时间(主要是象元读出时间)和逆程时间。正程时间所占的脉冲数是固定的.当主频不变时，增加或减少逆程脉冲的个数，即可降低或提高行扫速率，达到同步控制的目的。

本发明对TDI相机控制成像同步实现如图6所示。

为了达到同步的目的，需要预留一定数量的逆程脉冲，才能提高行扫速率，为此要适当提高主时钟频率，此方法的特点是不需要增加频外的电路，减少了重量、降低功耗和成本。

Claims (8)

1.一种高通量基因测序碱基荧光图像捕获系统装置，待测DNA片段样品放置于基因测序仪的基因芯片(001)中，包括：

激光控制单元，控制激光光源输出Y向的平行线型激光束对基因芯片(001)进行X向及Y向扫描，激发待测DNA片段样品中核苷酸携带的荧光染料基团发光；

图像捕获单元，对荧光染料基团所发的光进行分离得到几种不同波长的光，并利用TDI相机模块对该几种光成像；

其特征在于，

所述基因芯片(001)中注入四种不同类型的荧光染料，所述激光控制单元包括绿激光器(101)和红激光器(102)以及其各自连接的电源，其中绿激光器(101)的输出光依次经滤光片五(103)、光闸一(105)和扩束镜一(107)后，被半透半反镜四(110)反射通过柱面镜一(111)后到达振镜(112)，红激光器(102)的输出光依次经滤光片六(104)、光闸二(106)和扩束镜二(108)后，由反射镜五(109)反射透过半透半反镜四(110)后通过柱面镜一(111)到达振镜(112)，两束光再一起被振镜(112)反射至位于基因芯片(001)下表面的偏振分光棱镜(114)上，由偏振分光棱镜(114)反射至基因芯片(001)的下表面。

2.根据权利要求1所述高通量基因测序碱基荧光图像捕获系统装置，其特征在于，所述偏振分光棱镜(114)位于导轨(113)上，步进电机(009)连接导轨(113)带动其沿Y向运动，实现Y向扫描。

3.根据权利要求1或2所述高通量基因测序碱基荧光图像捕获系统装置，其特征在于，所述图像捕获单元包括聚焦模块、半透半反镜模块、滤光片模块、反射镜模块以及TDI相机模块，其中：

所述聚焦模块用于收集所述荧光染料基团所发荧光并调节焦距，经收集后的光束进入半透半反镜模块；

所述半透半反镜模块用于控制特定波段的光束被反射，而其他波段的光束则能通过，反射的光进入滤光片模块；

所述滤光片模块用于筛选通过特定波长的光束，其他波长的光束则被阻断，通过的光束进入反射镜模块；

所述反射镜模块用于将光束进行反射使其对准TDI相机模块；

所述TDI相机模块用于对接收的光束进行成像，并将生成的图片传送至计算机。

4.根据权利要求3所述高通量基因测序碱基荧光图像捕获系统装置，其特征在于，

所述聚焦模块包括物镜(201)、柱面镜二(202)和反射镜二(203)，所述荧光依次通过物镜(201)和柱面镜二(202)后，被反射镜二(203)反射；

所述半透半反镜模块包括依次设置的半透半反镜一(204)、半透半反镜二(205)、半透半反镜三(206)和全反镜(207)，其中被反射镜二(203)反射的光束首先通过半透半反镜一(204)，使得部分光束被反射，部分透射进入半透半反镜二(205)，在半透半反镜二(205)再次使得部分光束被反射，而部分透射进入半透半反镜三(206)，在半透半反镜三(206)再次使得部分光束被反射，而部分透射进入全反镜(207)，最终被全反镜(207)全部反射；

所述滤光片模块包括滤光片一(208)、滤光片二(209)、滤光片三(210)和滤光片四(211)，其中所述滤光片一(208)设置于半透半反镜一(204)的反射光路上，滤光片二(209)设置于半透半反镜二(205)的反射光路上，滤光片三(210)设置于半透半反镜三(206)的反射光路上，滤光片四(211)设置于全反镜(207)的反射光路上；

所述反射镜模块包括反射镜一(212)、反射镜二(213)、反射镜三(214)和反射镜四(215)；

所述TDI相机模块包括TDI相机一(216)、TDI相机二(217)、TDI相机三(218)和TDI相机四(219)；

其中，所述反射镜一(212)将透过滤光片一(208)的光束反射至TDI相机一(216)，反射镜二(213)将透过滤光片二(209)的光束反射至TDI相机二(217)，反射镜三(214)将透过滤光片三(210)的光束反射至TDI相机三(218)，反射镜四(215)将透过滤光片四(211)的光束反射至TDI相机四(219)。

5.根据权利要求4所述高通量基因测序碱基荧光图像捕获系统装置，其特征在于，还包括控制器(008)，所述控制器(008)与振镜(112)的驱动器一(011)连接，由驱动器带动振镜(112)调整其角度，从而实现X向扫描，其中控制器(008)给驱动器一(011)提供一个占空比为K的二角波作为驱动信号。

6.根据权利要求5所述高通量基因测序碱基荧光图像捕获系统装置，其特征在于，所述基因芯片(001)设置于生化反应室中，生化反应室中设置有温度传感器(005)，温度传感器(005)与所述控制器(008)连接，所述控制器(008)与温控装置(006)的驱动器二(007)连接，实现对生化反应室内温度的控制；所述生化反应室中还设置有试剂组(003)和试剂泵(002)，其中试剂泵(002)连接电机(012)，所述控制器(008)与电机(012)的驱动器三(013)连接，控制相应试剂的试剂泵(002)工作向基因芯片(001)完成注入。

7.根据权利要求5所述高通量基因测序碱基荧光图像捕获系统装置，其特征在于，所述TDI相机模块获取四幅图片，4种荧光素对一个光点颜色和光强贡献度的4元一次方程如下：

其中，I_红，I_黄，I_浅绿，I_深绿分别是四路相机所捕获的特定波长荧光强度值，a_i,j表示四种不同荧光基团在两种不同激发光照射下所产生的参数因子，1≤i,j≤4，上述公式中A、C、G、T分别是携带有四种不同荧光染料基团的碱基。

8.根据权利要求5所述高通量基因测序碱基荧光图像捕获系统装置，其特征在于，所述物镜(201)为f-theta物镜，其产生负畸变Δx′如下：

Δx′＝f·2θ-f·tg2θ＝f·(2θ-tg2θ)

其中，f为振镜(112)的转轴到f-theta物镜的距离即焦距，θ为振镜角度，振镜(112)的转轴置于f-theta物镜的前焦面上；

所述TDI相机模块中各个TDI相机的行扫描速率f_H＝(f/d)·(V_g/H)，其中，f为振镜(112)的转轴到f-theta物镜的距离即焦距，d为象元尺寸，即一行的象元宽度，V_g为景物即基因芯片中碱基荧光基团所激发的荧光的移动速率，H为摄影距离。