CN113640260A - 一种基因测序方法以及基因测序仪 - Google Patents

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Abstract

本申请的实施例提供了一种基因测序方法以及基因测序仪，涉及基因测序技术领域，该基因测序仪包括：激发光路，用于将激发光源产生的激发光束传导至具有流道的流体芯片上，待测样品流经流道；成像光路，用于收集待测物品经过激发光束的激发产生的荧光，并成像于配置在成像光路的成像相机上；对焦光路，用于将对焦光源产生的对焦光束传导至流体芯片上；其中，在激发光路、成像光路以及对焦光路上配置有物镜，物镜位于流体芯片上方且能够运动以改变物镜和流体芯片之间的距离，通过改变物镜与流体芯片之间的距离，使得对焦光束和激发光束聚焦于流道的上表面或下表面。本申请能够提高基因测序仪的可靠性，提升检测速度。

Description

一种基因测序方法以及基因测序仪
技术领域
本申请涉及基因测序技术领域，尤其是涉及一种基因测序方法以及基因测序仪。
背景技术
目前，在采用荧光检测法对基因进行测序时，一些产品使用线阵相机作为检测器，用电机带动微流体芯片边运动边扫描，这种方式对电机运动速度稳定性要求很高，运动速度不同会使图像形成畸变，影响测试准确度。另外一些产品使用面阵相机作为检测器，检测不同的颜色需要转动滤光片轮，而且物镜对焦系统需要切换反射镜。上述的机械运动装置会使检测过程变长并降低系统可靠性。
发明内容
为了提高基因测序仪的可靠性，提升检测速度，本申请提供一种基因测序方法以及基因测序仪。
本申请在第一方面，提供了一种基因测序仪，包括：
激发光路，用于将激发光源产生的激发光束传导至具有流道的流体芯片上，待测样品流经所述流道；
成像光路，用于收集待测物品经过激发光束的激发产生的荧光，并成像于配置在所述成像光路的成像相机上；
对焦光路，用于将对焦光源产生的对焦光束传导至流体芯片上；
其中，在所述激发光路、所述成像光路以及所述对焦光路上配置有物镜，所述物镜位于所述流体芯片上方且能够运动以改变所述物镜和所述流体芯片之间的距离，通过改变所述物镜与所述流体芯片之间的距离，使得所述对焦光束和所述激发光束聚焦于所述流道的上表面或下表面。
通过采用上述技术方案，对焦光路先将对焦光源产生的对焦光束照射到流体芯片上，流体芯片将对焦光束反射，对焦光束通过成像光路在成像相机上成像，通过图像对比度和物镜的位置确定流道的上下表面，确定检测位置后，激发光路再将激发光源产生的激发光束照射到待测样品上，待测样品经过激发光的激发产生荧光，荧光通过成像光路在成像相机上成像。由于检测前先进行对焦，检测过程中不需要机械切换滤光片，从而提升了检测的可靠性和检测速度。
可选的，在所述对焦光路上沿所述对焦光束的传播方向依次配置有对焦光源、分光片、场镜、第二二向色镜、棱镜以及所述物镜。
可选的，在所述对焦光路上还配置有第一反射镜，所述第一反射镜位于所述分光片和所述场镜之间。
通过采用上述技术方案，第一反射镜将对焦光路折叠，从而节省基因测序仪的空间。
可选的，所述对焦光源包括光源和掩膜板，所述掩膜板上具有特定形状的条纹。
通过采用上述技术方案，对焦光源发出的对焦光束部分透过掩膜板，并聚焦在样品流体芯片上，掩膜板上的图像成像在焦点上，流体芯片上将对焦光束反射，反射的对焦光束通过检测光路照射在成像相机上，且在成像相机上成与掩膜板条纹相同图案的像，方便分辨出对焦光束在成像相机所呈的图像，从而快速找到检测的目标位置。
可选的，在所述激发光路上沿所述激发光束的传播方向依次配置有激发光源、第一二向色镜、视场光阑、以及配置在所述对焦光路上的所述分光片、所述场镜、所述第二二向色镜、所述棱镜和所述物镜；
其中，所述视场光阑和所述流体芯片的流道的上表面共轭，或者所述视场光阑和所述流体芯片的流道的下表面共轭。
通过采用上述技术方案，可通过设计视场光阑的通光孔径来把视场外的光挡掉，从而降低成片底噪，提高了基因测序仪的数据准确率。
可选的，所述激发光源包括LED或激光器，所述激发光源能够发出两种不同波长的光束；所述激发光源上设置有对应波长的第一带通滤光片。
通过采用上述技术方案，激发光源能够发射两种不同波长的激发光束，同时流体芯片上四种核苷酸仅使用两种荧光染料进行标记，激发光束激发两种荧光染料产生两种波长的荧光，通过产生的两种荧光波长的组合，能够区分四种核苷酸，能够高效率实现对待测样品的荧光激发和检测成像，第一带通滤光片将激发光束中不需要的波长进行过滤，从而降低图片的底噪，提高检测的可靠性。
可选的，靠近所述激发光源出光处设置有光电二极管，所述光电二极管用于检测所述激发光源发出的光束的亮度。
通过采用上述技术方案，光电二极管受到激发光源发出光束的照射，并将收集的光信号转化为电信号，光电二极管接收到的光强度越大，则光电二极管输出的反向电压越大，当激发光源发出的光强度低于阈值时，成像相机可以再次拍照，或提醒激发光源达到寿命，从而避免由于激发光源未亮，而产生错误的检测信息。
可选的，所述成像光路包括成像主光路和两个成像子光路；
在所述成像主光路上沿所述荧光的传播方向依次配置有配置在所述对焦光路上的所述物镜、所述棱镜和所述第二二向色镜、第三二向色镜；
在每个所述成像子光路上沿所述荧光的传播方向依次配置有第二带通滤光片、成像透镜和成像相机。
可选的，在其中一个所述成像子光路上还配置有第二反射镜，所述第二反射镜位于所述成像透镜和所述成像相机之间。
通过采用上述技术方案，第二反射镜将成像光路折叠，从而节省基因测序仪的空间。
本申请在第二方面，提供了一种基因测序方法，包括：
将待测样品流入流体芯片的流道内，所述待测样品包括单链DNA和四种核苷酸，其中每种所述核苷酸结合的荧光素的颜色均不相同；
点亮对焦光源并改变物镜和流体芯片之间的距离，使得对焦光束聚焦于所述流道的上表面或下表面；
在对焦光束聚焦于所述流道的上表面或下表面之后，关闭对焦光源并点亮激发光源，通过成像在成像相机上的图像来确定单链DNA中核苷酸的排序。
通过采用上述技术方案，由于盖玻片上表面与空气之间的折射率差异最大，所以反射光强度最大；而试剂和盖玻片的折射率相近，所以反射光强度最小。因此可以改变物镜和流体芯片之间的距离，使对焦光束在流体芯片上形成的焦点移动，通过观察对焦光束在成像相机上成像的图案强度以及物镜位置，快速找到流道的上表面或下表面，对焦完成后，再进行测序，由于检测过程中不需要机械切换滤光片，从而提升了检测的可靠性和检测速度。
附图说明
结合附图并参考以下详细说明，本申请各实施例的上述和其他特征、优点及方面将变得更加明显。在附图中，相同或相似的附图标记表示相同或相似的元素，其中：
图1是本申请实施例基因检测仪的示意图；
图2是本申请实施例中流体芯片的示意图；
图3是本申请实施例中测试循环的示意图；
图4是本申请实施例中基因测序方法的流程图。
附图标记说明：1、激发光源；2、准直透镜；3、第一带通滤光片；4、第一二向色镜；5、光电二极管；6、视场光阑；7、分光片；8、对焦光源；9、掩膜板；10、第一反射镜；11、场镜；12、第二二向色镜；13、棱镜；14、物镜；15、流体芯片；151、盖玻片；152、载玻片；16、第三二向色镜；17、第二带通滤光片；18、成像透镜；19、第二反射镜；20、成像相机。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
目前，一些基因检测仪在检测过程中需要机械切换光路，机械运动会使检测过程变长并降低系统可靠性。
为了提高基因测序仪的可靠性，提升检测速度，本申请提供一种基因测序仪。
参照图1，基因测序仪包括激发光路、成像光路以及对焦光路。
激发光路用于将激发光源1产生的激发光束传导至具有流道的流体芯片15上，待测样品流经所述流道。成像光路用于收集待测物品经过激发光束的激发产生的荧光，并成像于配置在成像光路的成像相机20上。对焦光路用于将对焦光源8产生的对焦光束传导至流体芯片15上。其中，在激发光路、成像光路以及对焦光路上配置有物镜14，物镜14位于流体芯片15上方且能够运动以改变物镜14和流体芯片15之间的距离，通过改变物镜14与流体芯片15之间的距离，使得对焦光束和激发光束聚焦于流道的上表面或下表面。
需要说明的是，参照图2，流体芯片15由一片透明的盖玻片151和一片透明的载玻片152组成。载玻片152上开设有凹槽，盖玻片151盖在载玻片152设有凹槽一侧的面上，盖玻片151与载玻片152的凹槽槽底之间为流道。盖玻片151和载玻片152的材质可以是玻璃或透明塑料。流道和泵阀通过管路连接。DNA片段附着在流道的上下表面。
在一些可能的实现方式中，基因测序仪还包括能够带动物镜14移动的移动装置，物镜14设于移动装置上。该移动装置可以是自动化装置，也可以是人工调节装置，如果选用自动化的移动装置则可以提高基因测序仪的自动化程度。移动装置可以选用目前市面上已有的产品，因此文中不再赘述，附图中不再详细示意。
进行基因测序时，通过对焦光路将对焦光源8产生的对焦光束照射到流体芯片15上，流体芯片15将对焦光束反射，对焦光束通过成像光路在成像相机20上成像。成像后，观察此时图案的对比度，若判断此时图案对比度为最大时，再观察物镜14与流体芯片15的距离，若判断此时物镜14与流体芯片15的距离也为最远后，则判断此时焦点与盖玻片151上表面重合，且此位置不是目标位置。再改变物镜14和流体芯片15之间的距离，并观察图案对比度的变化，当判断图案对比度为极大时，则判断此位置为目标位置之一。通过同样的方法找到第二处图案对比度极大的位置，并对比两次物镜14的位置。若物镜14相对流体芯片15的距离较远，则目标位置为流道的上表面；若物镜14相对流体芯片15的距离较近，则目标位置为流道的下表面。
完成对焦后，通过激发光路将激发光束聚焦在流道上下表面，激发待测样品，使待测样品发出荧光，通过成像光路将荧光收集并成像在成像相机20上，来得到待测样品的核苷酸排序。由于检测过程中不需要机械切换滤光片，且通过对焦光路能够快速的找到焦平面，从而提升了检测的可靠性和检测速度。
下面分别对激发光路、成像光路和对焦光路进行介绍。
【激发光路】
参照图1，激发光路上沿所述激发光束的传播方向依次配置有用于发射激发光束的激发光源1、用于收集并准直激发光束的准直透镜2、用于合并激发光束的第一二向色镜4、用于限制物体成像范围的视场光阑6、用于透射激发光束的分光片7、用于增加激发光束光通量的场镜11、用于反射激发光束的第二二向色镜12、用于反射激发光束的棱镜13以及将激发光束聚焦在流体芯片15上的物镜14。
在一些可能的实现方式中，激发光源1可以选择LED或激光器，激发光源1包括两种光源，两种光源能够发出两种不同波长的光束。例如，激发光源1包括绿光源(波长位于520nm～535nm波段范围)和红光源(波长位于635nm～645nm波段范围)，两种光源能够激发荧光染料以产生两种波长的荧光。在一些可能的实现方式中，在每个光源上设置有对应波长的第一带通滤光片3，来将激发光束中不需要的波长进行过滤，从而降低图片的底噪，提高检测数据的准确性。
需要说明的是，第一二向色镜4用于合并上述两种激发光束，第一二向色镜4布置在两束激发光重合位置。第一二向色镜4的一侧将一束激发光束透射出去；另一侧将另一束激发光束反射出去，从而实现两束激发光束的合并。例如，第一二向色镜4布置在绿光源发出光束和红光源发出光束重合处的光路上，第一二向色镜4朝向绿光源一侧的面能反够射绿激光光束，第一二向色镜4朝向红光源一侧的面能够透射红激光光束，红光源光束透过第一二向色镜4后与绿光源光束合束。
在一些实施例中，视场光阑6和流体芯片15的流道的上表面共轭，或者所述视场光阑6和所述流体芯片15的流道的下表面共轭。可通过设计视场光阑6的通光孔径来把视场外的光挡掉，从而降低成片底噪，提高了基因测序仪的数据准确性。
在一些实施例中，为了监测激发光源1发出的光束的亮度，在靠近激发光源1出光处设置有光电二极管5。光电二极管5受到激发光源1发出光束的照射，并将收集的光信号转化为电信号，光电二极管5接收到的光强度越大，则光电二极管5输出的反向电压越大，当激发光源1发出的光强度低于阈值时，成像相机20可以再次拍照，或提醒激发光源1达到寿命，从而避免由于激发光源1未亮，而产生错误的检测信息。
在一些实施例中，为了折叠光路，减小仪器空间，在所述激发光路上还配置有第一反射镜10，第一反射镜10位于分光片7和场镜11之间。
【成像光路】
参照图1，成像光路包括成像主光路和两个成像子光路。
在成像主光路上沿荧光的传播方向依次配置有配置在激发光路上用于将样品发出的荧光和一部分激发光束收集并变为准直光束的物镜14、用于反射荧光的棱镜13和用于透射荧光第二二向色镜12、用于将荧光按波长进行分光的第三二向色镜16。
在每个成像子光路上沿所述荧光的传播方向依次配置有用于滤除激发光束来降低图片底噪的第二带通滤光片17、将荧光聚焦在成像相机20上的成像透镜18和收集荧光信号并成像的成像相机20。
在一些实施例中，为了折叠光路，减小仪器空间，在其中一个成像子光路上还配置有第二反射镜19，第二反射镜19位于成像透镜18和成像相机20之间。
【对焦光路】
参照图1，对焦光路上沿对焦光束的传播方向依次配置有用于发出对焦光束的对焦光源8、配置在激发光路上用于反射对焦光束并将对焦光束与激发光束合束的分光片7、用于增加对焦光束光通量的场镜11、用于反射对焦光束的第二二向色镜12、用于反射对焦光束的棱镜13以及将对焦光束聚焦在流体芯片15上的物镜14。
在一些实施例中，对焦光源8可以包括光源和掩膜板9，且掩膜板9上具有特定形状的条纹。光源发出对焦光束，对焦光束部分透过掩膜板9上特定形状的条纹，其他部分被黑色背景挡掉，对焦光束透过掩膜板9并聚焦在样品流体芯片15上，掩膜板9上的图像能够成像在焦点上，流体芯片15再将对焦光束反射，最后通过检测光路将对焦光束照射在成像相机20上，且在成像相机20上呈现出与掩膜板9条纹相同图案的光斑。方便分辨出对焦光束在成像相机20所呈的图像，从而能够快速找到检测的目标位置。
在另一方面，本申请实施例还提供了一种基因测序方法，可应用于上述基因测序仪。
参照图4，在一些实施例中，基因测序方法包括以下步骤：
步骤S01，将待测样品进行前处理形成单链DNA后流入流体芯片15的流道内。
需要说明的是，参照图2，流体芯片15包括一片透明盖玻片151和一片透明载玻片152，盖玻片151与载玻片152之间为流道。流道和泵阀通过管路连接。DNA片段流入流道后，附着在流道的上下表面。通过扩增形成微米级大小的簇，每个簇的基因序列相同。
步骤S02，将含有结合了不同荧光染料的四种核苷酸的试剂依次流过流道。
需要说明的是，DNA是由A、T、C、G四种核苷酸组成，其中，A和T，C和G可以互补配对。参照图3，将单链DNA每成功配对一个核苷酸看做为一个测序循环，每个测序循环流过含有一种核苷酸的试剂，如果此时单链DNA上的核苷酸是A，那么只有试剂T流过时才会和A结合。
在本实施例中，采用被激发后能产生不同颜色荧光的第一荧光染料和第二荧光染料。A结合第一荧光染料，T结合第二荧光染料，C结合第一荧光染料和第二荧光染料，G上没有荧光染料。测序开始后，将含有结合了不同荧光染料的四种核苷酸的试剂依次流过流道，每个测序循环与四种核苷酸中的一种结合。
步骤S03，点亮对焦光源8并改变物镜14和流体芯片15之间的距离，使得对焦光束聚焦于流道的上表面或下表面。
需要说明的是，物镜14可以在流体芯片15上方移动，物镜14移动时带动焦点移动，当对焦光束聚焦在流体芯片15的某一位置时，流体芯片15将对焦光束反射，反射的对焦光束经过成像光路在成像相机20上成像。其中，盖玻片151上表面与空气之间的折射率差异最大，所以反射光强度最大；而试剂和盖玻片151的折射率相近，所以反射光强度最小。因此可以通过观察对焦光束在成像相机20上成像的图案对比度以及物镜14位置，判断对焦光束是否聚焦于流道的上表面或下表面。
示例地，点亮对焦光源8，对焦光源8发射的对焦光束在流体芯片15上聚焦，并反射，通过成像光路在成像相机20上成像。成像后，移动物镜14，移动物镜14的同时观察图案的对比度。若物镜14在某一位置，观察到成像相机20显示的图案对比度为最大时，再观察物镜14与流体芯片15的距离，若判断此时的距离也为最远后，则判断此时焦点与盖玻片151上表面重合，且此位置不是目标位置。然后将物镜14向下移动，并观察图案对比度的变化，当判断图案对比度为极大值时，则判断此位置为目标位置之一。继续移动物镜14，通过相同方法找到第二处图案对比度极大位置，并对比两次的物镜14位置，即可判断为流道的上表面或下表面。
步骤S04，在对焦光束聚焦于所述流道的上表面或下表面之后，关闭对焦光源8并点亮激发光源1，通过成像在成像相机20上的图像来确定单链DNA中核苷酸的排序。
在本实施例中，激发光源1包括两种光源，一种为能够激发第一荧光染料的绿光源，另一种为能够激发第二荧光染料红光源。需要说明的是，两种荧光染料激发出的荧光波长不同。将绿光源和红光源点亮，激发光源1发出的激发光照射到待测样品上，使待测样品发出荧光，两个成像相机20分别将波长不同的两束荧光收集。参见表1，通过观察两个成像相机20上的亮暗次序，对比判断此测试循环结合的是那种核苷酸。循环往复就可以得到DNA上的序列信息。
表1核苷酸亮暗对比
核苷酸 第一荧光染料 第一荧光染料
A 亮 暗
T 暗 亮
C 亮 亮
G 暗 暗
以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基因测序仪，其特征在于：包括：
激发光路，用于将激发光源(1)产生的激发光束传导至具有流道的流体芯片(15)上，待测样品流经所述流道；
成像光路，用于收集待测物品经过激发光束的激发产生的荧光，并成像于配置在所述成像光路的成像相机(20)上；
对焦光路，用于将对焦光源(8)产生的对焦光束传导至流体芯片(15)上；
其中，在所述激发光路、所述成像光路以及所述对焦光路上配置有物镜(14)，所述物镜(14)位于所述流体芯片(15)上方且能够运动以改变所述物镜(14)和所述流体芯片(15)之间的距离，通过改变所述物镜(14)与所述流体芯片(15)之间的距离，使得所述对焦光束和所述激发光束聚焦于所述流道的上表面或下表面。
2.根据权利要求1所述的基因测序仪，其特征在于：在所述对焦光路上沿所述对焦光束的传播方向依次配置有对焦光源(8)、分光片(7)、场镜(11)、第二二向色镜(12)、棱镜(13)以及所述物镜(14)。
3.根据权利要求2所述的基因测序仪，其特征在于：在所述对焦光路上还配置有第一反射镜(10)，所述第一反射镜(10)位于所述分光片(7)和所述场镜(11)之间。
4.根据权利要求2所述的基因测序仪，其特征在于：所述对焦光源(8)包括光源和掩膜板(9)，所述掩膜板(9)上具有特定形状的条纹。
5.根据权利要求2所述的基因测序仪，其特征在于：在所述激发光路上沿所述激发光束的传播方向依次配置有激发光源(1)、第一二向色镜(4)、视场光阑(6)、以及配置在所述对焦光路上的所述分光片(7)、所述场镜(11)、所述第二二向色镜(12)、所述棱镜(13)和所述物镜(14)；
其中，所述视场光阑(6)和所述流体芯片(15)的流道的上表面共轭，或者所述视场光阑(6)和所述流体芯片(15)的流道的下表面共轭。
6.根据权利要求5所述的基因测序仪，其特征在于：所述激发光源(1)包括LED或激光器，所述激发光源(1)能够发出两种不同波长的光束；所述激发光源(1)上设置有对应波长的第一带通滤光片(3)。
7.根据权利要求5所述的基因测序仪，其特征在于：靠近所述激发光源(1)出光处设置有光电二极管(5)，所述光电二极管(5)用于检测所述激发光源(1)发出的光束的亮度。
8.根据权利要求2所述的基因测序仪，其特征在于：所述成像光路包括成像主光路和两个成像子光路；
在所述成像主光路上沿所述荧光的传播方向依次配置有配置在所述对焦光路上的所述物镜(14)、所述棱镜(13)和所述第二二向色镜(12)、第三二向色镜(16)；
在每个所述成像子光路上沿所述荧光的传播方向依次配置有第二带通滤光片(17)、成像透镜(18)和成像相机(20)。
9.根据权利要求8所述的基因测序仪，其特征在于：在其中一个所述成像子光路上还配置有第二反射镜(19)，所述第二反射镜(19)位于所述成像透镜(18)和所述成像相机(20)之间。
10.一种基因测序仪的基因测序方法，应用于如权利要求1至9任一项所述的基因测序仪，其特征在于，包括：
将待测样品流入流体芯片的流道内，所述待测样品包括单链DNA和四种核苷酸，其中每种所述核苷酸结合的荧光素的颜色均不相同；
点亮对焦光源并改变物镜和流体芯片之间的距离，使得对焦光束聚焦于所述流道的上表面或下表面；
在对焦光束聚焦于所述流道的上表面或下表面之后，关闭对焦光源并点亮激发光源，通过成像在成像相机上的图像来确定单链DNA中核苷酸的排序。
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