CN1657913A - 微阵列芯片检测系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微阵列芯片检测系统，包括有入射光生成系统、反射光收集系统、收集光处理系统以及放置微阵列芯片的载物台，所述入射光生成系统包括有一激光器、一扩束准直镜以及一柱面整形器；所述反射光收集系统包括有一双焦面成像透镜组、一滤色片以及一CCD探测器。与国际上流行的生物芯片检测仪器相比，本发明不但将扫描和数字成像等功能集于一身，而且其结构简单、成本低廉，尤其是对机械加工的精度要求降低，使得本发明更加利于推广和普及。

Description

微阵列芯片检测系统

技术领域

本发明涉及微阵列芯片检测系统，特别是涉及一种成本低廉，而且检测灵敏度和分辨率都比较高的微阵列芯片检测系统。

背景技术

生物芯片技术是二十世纪后期兴起的一门多学科交叉技术，它借助微电子、微机械、光机电软件一体化集成技术等工程技术，将生命科学研究中样品制备、化学反应和分析检测等不连续过程集成到一块小小的芯片中，实现处理过程连续化、集成化和微型化。

生物芯片检测仪器是生物芯片技术走向实际应用不可分割的专用仪器设备，借助显微放大成象、共焦扫描、荧光探测，以及数字图象处理等技术手段，将生物芯片中生化反应引起的基因差异表达结果以图象形式显示出来，便于人们进行医学分析或进行其它研究。

目前，国际上流行的生物芯片检测仪器主要有高档荧光显微镜、共焦扫描仪和制冷CCD成像系统等。高档荧光显微镜是一种手工操作使用的简单生物芯片检测装置，可以进行小范围的生物芯片杂交信号观察，也可以通过荧光显微镜自带的制冷CCD数字化系统将所观察到的荧光信号采集并存储生成数字图象，这种高档荧光显微镜的缺点在于其观察范围比较小，一般只有几个毫米，而且在高分辨率放大倍数下观察视场将小于1毫米，其造价也比较昂贵，一般售价在4～5万美元左右。共焦扫描仪是一种国际上流行的自动化生物芯片检测仪器，可以进行大面积(25毫米×75毫米)、中等分辨率(5微米～50微米)的生物芯片杂交信号检测，并存储生成数字图象。共焦扫描仪的主要缺点在于：1、其检测分辨率由光学系统的成像分辨率、扫描运动平台的机械精度与扫描运动控制精度共同来决定，目前机械精度与扫描运动控制精度在大面积快速扫描检测的应用中达到5微米之后就很难再进行大幅度的提高；2、共焦扫描仪是一种串行工作方式，数据采集传输速度受到扫描运动、A/D转换和数据接口通讯等多方面的限制，大面积(20mm×60mm)检测的时间比较长(20分钟/5微米分辨率)，很难再大幅度提高其速度；3、共焦扫描仪在实际结构中需要增加光栅尺作为反馈部件来保证扫描精度，成本将增加1/8左右；4、共焦扫描仪整体精度依赖扫描运动平台的机械精度，机械加工的成本高。这些因素使得共焦扫描仪的造价十分昂贵，一般售价在5～10万美元左右。制冷CCD成像系统也是一种生物芯片检测仪器，可以进行大面积(几十毫米)、低分辨率(＞50微米)的生物芯片杂交信号检测，并存储生成数字图象，这种系统的主要缺点在于：1、制冷CCD的成本本身就比较高，一般为5000美元～2万美元左右；2、使用制冷CCD后为了提高检测灵敏度，通常采用延长采样暴光积分时间(需要几十秒或几分钟)的方法，这样将大幅度增加检测时间，同时还将加速生物芯片中被测样品的光漂白，大大降低芯片的使用寿命；3、目前广泛使用的制冷CCD成像系统主要采用一次成像方式，对于进行大面积芯片检测其分辨率受到严重的限制，否则检测区域必然减小；4、如果选择大探测面积的CCD芯片，则其成本将成倍成倍地增加。这些因素使得制冷CCD成像系统一般售价在3～4万美元左右。

上述的这些仪器还是存在着这样或那样的缺点的，而且其市场售价也是非常的昂贵的，还不适合进行推广应用。因此，十分需要一种成本低廉，而且检测灵敏度和分辨率都比较高的微阵列芯片检测系统的问世。

发明内容

本发明的目的是提供一种成本低廉，而且检测灵敏度和分辨率都比较高的微阵列芯片检测系统。

为实现上述目的，本发明提供了一种微阵列芯片检测系统，包括有入射光生成系统、反射光收集系统、收集光处理系统以及放置微阵列芯片的载物台，所述入射光生成系统包括有一激光器、一扩束准直镜以及一柱面整形器；所述反射光收集系统包括有一双焦面成像透镜组、一滤色片以及一CCD探测器。

在实际操作中，所述柱面整形器包括有两个柱面镜和两个透镜，其挨着扩束准直镜依次设置一凹透镜、一凸透镜、一柱面镜和另一柱面镜。所述双焦面成像透镜组包括有12个透镜，其依次设置有包含一个凹面和一个凸面的凹透镜A、包含两个凹面的凹透镜B、包含两个凸面的凸透镜C、包含两个凹面的凹透镜D、包含两个凸面的凸透镜E、包含两个凹面的凹透镜F、包含两个凸面的凸透镜G、包含两个凸面的凸透镜H、包含一个凹面和一个凸面的凹透镜I、包含两个凸面凸透镜J和凸透镜K、包含一个凹面和一个凸面的凹透镜L。

上述的收集光处理系统包括有一计算机，所述CCD探测器的输出端与该计算机连接；CCD探测器获得与芯片几何平面位置对应的一幅幅荧光信号图象，均先在计算机中暂存，当扫描结束后再进行图像自动拼接与位置校正，形成一幅完整的生物芯片荧光信号检测图象。具体来讲，所述扫描结束后进行图像自动拼接与位置校正的方法为：①在图象采集时将检测区域范围沿边缘向外适当扩大50个象素，生成一幅幅原始小图；②在每相邻两幅小图边缘50个象素的区域范围内寻找特征点，计算同一个特征点在相邻两幅小图中的位置偏差；③根据位置偏差调整小图的中心位置，使在两幅相邻小图中的同一个特征点能够完全重合，这种调整的精度可以达到1个象素；④拼图，根据设定的实际拼图尺寸，以第③步中计算获得的小图的中心位置为中心，从原始小图中裁剪出相应的实际拼接小图，然后按照采图顺序一幅一幅拼接起来，形成最终的扫描图象；通过上述方法的调整，可以将实际扫描中位置偏差在±25个象素以内的误差校正到1个象素。

此外，所述载物台包含精密导轨、精密丝杠以及控制平台二维运动的两个步进电机；所述收集光处理系统还包括有一电子线路控制板，所述电子线路控制板连接在计算机和载物台的步进电机之间，计算机通过电子线路控制板控制步进电机运动。

本发明由于采取以上设计，其具有以下优点：

1、本发明中设置了一柱面整形器，它可以将斜入射照明的椭圆形光斑整形成为圆形光斑，保证斜入射照明光斑的均匀性，实现对生物芯片进行直径为5mm的大面积区域同时照明检测。与通常的“椭球镜+积分球”的光束整形方案相比，柱面镜组合斜入射整形结构方案具有结构简单，成本低，容易实现产业化等特点；同时，这种斜入射照明方法可以有效减少激发光的反射光对荧光信号接收端的干扰影响，实现大面积同时激发检测，有效降低背景噪声。

2、本发明提供了一种由12个镜片组成的双焦面成像透镜，这种12个镜片组成的双焦面成像结构，可以最大限度利用物镜的数值孔径，使荧光接收效率达到系统的衍射极限理论值，比普通显微成像获得的荧光信号强度显著提高。

3、本发明中，由于计算机在扫描结束后进行图像自动拼接与位置校正，这样使扫描运动平台的机械加工精度从2um下降到10um，运动控制从2um下降到0.5mm，有效降低生产技术难度与加工成本，可以很方便地找到加工协作单位，容易推广和普及。

4、本发明中，采用多种区域分割方法，结合微阵列芯片图象的网格化特征进行补遗，保证图象的准确识别率＞95％，满足用户同时获取芯片图象并进行数据提取与分析处理等的使用要求。

5、与国际上性能相近的显微镜头相比较，本发明设计的镜头结构简单，镜片数量少，使用的光学玻璃材料种类少，加工工艺性高，生产成本低。

附图说明

图1为本发明的结构示意图；

图2为本发明的柱面整形器光斑整形的示意图；

图3是本发明中宽视场范围的弥散斑示意图；

图4是本发明中不同视场成像的FFT衍射能量分布图。

具体实施方式

如图1所示，为本发明提供的一种微阵列芯片检测系统，包括有入射光生成系统1、反射光收集系统2、收集光处理系统3以及放置微阵列芯片的载物台4。入射光生成系统1包括有一激光器11、一扩束准直镜12以及一柱面整形器13；反射光收集系统2包括有一双焦面成像透镜组21、一滤色片22以及一CCD探测器23。

在本实施例中，柱面整形器包括有两个柱面镜和两个透镜，其挨着扩束准直镜12依次设置为凹平柱面镜131、平凸柱面镜132、凸凸透镜133和凹凸透镜134。本实施例中各镜面的参数，如下表所示：(两个紧贴的镜面，参数相同)

表面序号     曲率半径      顶点间距     玻璃材料    表面半径

1            -18.4         1.1          ZK11        5.4

2            ∞            35.1         空气        6.1

3            ∞            2.9          Z K11       8.2

4            42.2          4.6          空气        10.5

5            64.5          3.7          K9          10.3

6            -50.3         1.2          ZF2         10.4

7            -140.5        105.3        空气        10.4

说明：其中的曲率半径误差为±3.5，顶点间距误差为±0.5，表面半径误差为±1.0。

从图1中可以看出，本发明所提供的柱面整形器是斜射的，作为一个实施例其斜射角度为30°±10°，利用它可以将斜入射照明的椭圆形光斑整形成为圆形光斑，保证斜入射照明光斑的均匀性(如图2所示)，实现对生物芯片进行大面积照明检测。与通常的“椭球镜+积分球”的光束整形方案相比，柱面镜组合斜入射整形结构方案具有结构简单，成本低，容易实现产业化等特点。同时，这种斜入射照明方法可以有效减少激发光的反射光对荧光信号接收端的干扰影响，实现大面积同时激发检测，有效降低背景噪声。选择合适的斜入射角度可以使激发光的反射光进入荧光信号接收光路的强度下降为零。由此可见，这种斜入射柱面整形照明激发荧光方法与共焦扫描仪的反射照明激发荧光方法和荧光显微镜的反射(或透射)照明激发荧光方法相比具有明显的优越性。

在本实施例中，双焦面成像透镜组包括有12个透镜，其依次设置有包含一个凹面和一个凸面的凹透镜A51、包含两个凹面的凹透镜B52、包含两个凸面的凸透镜C53、包含两个凹面的凹透镜D54(其中一个凹面的曲率半径很大)、包含两个凸面的凸透镜E55、包含两个凹面的凹透镜F56(其中一个凹面的曲率半径很大)、包含两个凸面的凸透镜G57、包含两个凸面的凸透镜H58、包含一个凹面和一个凸面的凹透镜I59、包含两个凸面的凸透镜J60、包含两个凸面的凸透镜K61以及包含一个凹面和一个凸面的凹透镜L62。双焦面成像透镜组在本实施例中各镜面的参数，如下表所示：(两个紧贴的镜面，参数相同)

表面序号        曲率半径          顶点间距       玻璃材料      表面半径

1               -6.4              5.1            ZK11          4.4

2               -5.4              0.2            空气          5.4

3               -24.1             1.8            ZF2           6.2

4               50.2              0.5            空气          7.5

5               67.5              5.1            ZK7           8.3

6               -13.3             0.8            空气          9.4

7               -106.0            2.5            ZF2           9.8

8               30.4              5.6            ZK7           10.5

9               -25.5             0.5            空气          10.5

10              -306.5            2.5            ZF2           10.5

11              26.5              4.3            ZK7           10.5

12              -98.2             80             空气          10.5

13              97.5              8.5            ZK7           15.5

14              -31.5             4.4            空气          15.5

15              -21.2             6.1            ZF2           15.5

16              -267.5            0.2            空气          15.5

17              49.3              6.2            ZF7           15.5

18              -215.7            0.21           空气          15.5

19              27.1              8.1            ZK7           15.5

20              -55.3             4.2            ZF2           15.5

21              -160.1            16.7           空气          15.5

说明：其中的曲率半径误差为±1.0，顶点间距误差为±0.5，表面半径误差为±1.0。

经生物芯片激发出的发散荧光，依次通过凹透镜A、凹透镜B、凸透镜C、凹透镜D、凸透镜E、凹透镜F以及凸透镜G后，此时激发荧光被以很大的数值孔径(NA＞0.7)接收并准直成平行光输出，然后，通过滤色片22的滤色，滤掉照明激光和其它杂散光，再依次通过凸透镜H、凹透镜I、凸透镜J、凸透镜K以及凹透镜L，此时激发荧光会聚成像在CCD探测器23的传感器面阵上，最后激发光信号被CCD探测器23收集并进行光电转换输入计算机。

这种12个镜片组成的双焦面成像结构，可以最大限度利用物镜的数值孔径，使荧光接收效率达到系统的衍射极限理论值，比普通显微成像获得的荧光信号强度显著提高；在这些镜片加工后采用多层增透膜的膜系数设计方案进行高透过率的镀膜工艺处理，单个镜片的透过率＞99.9％，系统整体透过效率达到90％以上。这样使系统的荧光信号检测灵敏度比常规成像系统提高2个数量级，因此可以采用普通型低照度CCD代替制冷CCD，制冷CCD的售价近十万元，而且还需要进行数分钟的长时间积分才能获得一幅高灵敏度图象，从而有效降低了仪器的生产成本同时提高了扫描速度(普通视频采集速度，25帧(或25幅图象)/秒)。

此外，这种12个镜片组成的生物芯片扫描检测的镜片组，视场范围达到2mm，这样可以实现一次检测2毫米的芯片区域，有效地减少扫描次数，缩短检测时间。同时，其结构简单，工艺性好且成本低，并能提高生物芯片扫描检测系统的检测灵敏度、扫描分辨率，使其具有较长的工作距离。本实施例中，数值孔径为0.72，工作距离为3.22mm。

在本实施例中，收集光处理系统3包括有一计算机31以及一电子线路控制板32，所述CCD探测器23的输出端与计算机31连接；CCD探测器23获得与芯片几何平面位置对应的一幅幅荧光信号图象，均先在计算机31中暂存，当扫描结束后再进行图像自动拼接与位置校正，形成一幅完整的生物芯片荧光信号检测图象。值得一提的是，扫描结束后进行图像自动拼接与位置校正的方法为在宽度为50个象素以内的图象边缘重叠区内寻找特征位置，计算位置偏差，然后通过软件在拼图时加以修正。具体实施方法为：①在图象采集时将检测区域范围沿边缘向外适当扩大50个象素，生成一幅幅原始小图；②在每相邻两幅小图边缘50个象素的区域范围内寻找特征点，计算同一个特征点在相邻两幅小图中的位置偏差；③根据位置偏差调整小图的中心位置，使在两幅相邻小图中的同一个特征点能够完全重合，这种调整的精度可以达到1个象素；④拼图，根据设定的实际拼图尺寸，以第③步中计算获得的小图的中心位置为中心，从原始小图中裁剪出相应的实际拼接小图，然后按照采图顺序一幅一幅拼接起来，形成最终的扫描图象；通过上述的方法进行调整，可以将实际扫描中位置偏差在±25个象素以内的误差校正到1个象素。

放置微阵列芯片的载物台4包含精密导轨、精密丝杠以及控制平台二维运动的两个步进电机，这些都可以直接从市场购得，在此不作赘述。

上述的收集光处理系统3中的电子线路控制板32包含电机驱动控制器、单片机芯片(或DSP芯片)、CPLD芯片、光耦隔离器和若干导线端子等(图中未示)。电机驱动控制器用于管理步进电机的运动；单片机芯片(或DSP芯片)用于存储控制指令，管理控制流程；CPLD芯片用于存储系统初始化处理的一些基本参数与变量；光耦隔离器用于分隔板卡的强电与弱电控制；导线端子用于传输电流与信号，提供输入输出接口。当然，上述的电机驱动控制器、单片机芯片(或DSP芯片)、CPLD芯片、光耦隔离器和若干导线端子等都属于现有技术的范畴，其可以在市场直接购得，在此便不做过多的赘述。

电子线路控制板32连接在计算机31和载物台4的步进电机之间，计算机便可以通过电子线路控制板控制步进电机运动，从而控制载物台运动，对芯片不同的位置进行扫描。

本发明中，由于计算机在扫描结束后进行图像自动拼接与位置校正，这样使扫描运动平台的机械加工精度从2um下降到10um，运动控制从2um下降到0.5mm，有效降低生产技术难度与加工成本，可以很方便地找到加工协作单位，容易推广和普及。

本发明通过上述的设计，其可以达到的具体性能指标如下：

1、系统的检测分辨率小于2微米(大于550线对/mm)，这样可以实现对被检测对象的精细扫描。

2、系统物镜的工作距离能够达到3.22毫米，适合对生物芯片的特殊三维结构检测要求。

3、系统荧光收集物镜的数值孔径(NA)为0.72，有利于收集更多的荧光信号。

4、系统在一个比较大的视场范围内对四种可见光(激光波长λ₁＝532纳米和它对应的荧光λ₂＝570纳米，激光λ₃＝633纳米和它对应的荧光λ₄＝670纳米)消色差、球差，适合多种激光激发荧光的应用需要，宽视场范围的弥散斑如图5所示。

5、系统能够最大限度利用物镜的数值孔径，荧光接收效率达到系统的衍射极限理论值，不同视场成像的FFT衍射能量分布如图6所示，比普通显微成像获得的荧光信号强度显著提高。

6、系统物镜前焦距为13.37毫米，系统成像放大镜后焦距为29.75毫米。

Claims (8)

1、一种微阵列芯片检测系统，包括有入射光生成系统、反射光收集系统、收集光处理系统以及放置微阵列芯片的载物台，其特征在于：所述入射光生成系统包括有一激光器、一扩束准直镜以及一柱面整形器；所述反射光收集系统包括有一双焦面成像透镜组、一滤色片以及一CCD探测器。

2、根据权利要求1所述的微阵列芯片检测系统，其特征在于：所述柱面整形器包括有两个柱面镜和两个透镜，其挨着扩束准直镜依次设置一凹透镜、一凸透镜、一柱面镜和另一柱面镜。

3、根据权利要求1所述的微阵列芯片检测系统，其特征在于：所述双焦面成像透镜组包括有12个透镜，其依次设置有包含一个凹面和一个凸面的凹透镜A、包含两个凹面的凹透镜B、包含两个凸面的凸透镜C、包含两个凹面的凹透镜D、包含两个凸面的凸透镜E、包含两个凹面的凹透镜F、包含两个凸面的凸透镜G、包含两个凸面的凸透镜H、包含一个凹面和一个凸面的凹透镜I、包含两个凸面的凸透镜J和凸透镜K、包含一个凹面和一个凸面的凹透镜L。

4、根据权利要求2所述的微阵列芯片检测系统，其特征在于：所述双焦面成像透镜组包括有12个透镜，其依次设置有包含一个凹面和一个凸面的凹透镜A、包含两个凹面的凹透镜B、包含两个凸面的凸透镜C、包含两个凹面的凹透镜D、包含两个凸面的凸透镜E、包含两个凹面的凹透镜F、包含两个凸面的凸透镜G、包含两个凸面的凸透镜H、包含一个凹面和一个凸面的凹透镜I、包含两个凸面的凸透镜J和凸透镜K、包含一个凹面和一个凸面的凹透镜L。

5、根据权利要求1或2或3或4所述的微阵列芯片检测系统，其特征在于：所述收集光处理系统包括有一计算机，所述CCD探测器的输出端与该计算机连接；CCD探测器获得与芯片几何平面位置对应的一幅幅荧光信号图象，均先在计算机中暂存，当扫描结束后再进行图像自动拼接与位置校正，形成一幅完整的生物芯片荧光信号检测图象。

6、根据权利要求5所述的微阵列芯片检测系统，其特征在于：所述扫描结束后进行图像自动拼接与位置校正的方法为：①在图象采集时将检测区域范围沿边缘向外适当扩大50个象素，生成一幅幅原始小图；②在每相邻两幅小图边缘50个象素的区域范围内寻找特征点，计算同一个特征点在相邻两幅小图中的位置偏差；③根据位置偏差调整小图的中心位置，使在两幅相邻小图中的同一个特征点能够完全重合；④拼图，根据设定的实际拼图尺寸，以第③步中计算获得的小图的中心位置为中心，从原始小图中裁剪出相应的实际拼接小图，然后按照采图顺序一幅一幅拼接起来，形成最终的扫描图象。

7、根据权利要求5所述的微阵列芯片检测系统，其特征在于：所述载物台包含精密导轨、精密丝杠以及控制平台二维运动的两个步进电机；所述收集光处理系统还包括有一电子线路控制板，所述电子线路控制板连接在计算机和载物台的步进电机之间，计算机通过电子线路控制板控制步进电机运动。

8、根据权利要求6所述的微阵列芯片检测系统，其特征在于：所述载物台包含精密导轨、精密丝杠以及控制平台二维运动的两个步进电机；所述收集光处理系统还包括有一电子线路控制板，所述电子线路控制板连接在计算机和载物台的步进电机之间，计算机通过电子线路控制板控制步进电机运动。

Images