WO2022034867A1 - 核酸増幅装置、核酸増幅方法及び試料溶液位置制御方法 - Google Patents

核酸増幅装置、核酸増幅方法及び試料溶液位置制御方法 Download PDF

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WO2022034867A1
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nucleic acid
acid amplification
liquid feeding
sample solution
detection
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圭佑 合田
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杏林製薬株式会社
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
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    • G01N21/03—Cuvette constructions
    • G01N21/0332—Cuvette constructions with temperature control

Definitions

  • the present disclosure relates to a nucleic acid amplification device, a nucleic acid amplification method, and a sample solution position control method.
  • Genetic testing is central to various fields such as clinical testing, identification of crops and types of pathogenic microorganisms.
  • One of the most powerful basic techniques for detecting a small amount of nucleic acid, which is a gene, with high sensitivity is a method of analyzing a product obtained by exponentially replicating or amplifying a part or all of a nucleic acid sequence.
  • the PCR method is a powerful technique for selectively amplifying a specific region of DNA. PCR makes it possible to generate millions of copies of DNA fragments from a single template DNA for the target DNA sequence within the template DNA. PCR repeats a three-phase or two-phase temperature condition called a thermal cycle. As a result, the individual reactions of denaturing the DNA to a single strand, annealing the denatured DNA single strand and the primer, and extending the primer with the thermostable DNA polymerase enzyme are sequentially repeated. This cycle is repeated until sufficient copies are obtained for the analysis. In principle, it is possible to double the number of copies in a single PCR cycle.
  • the PCR method is a powerful method for exponentially amplifying genes by thermal cycle.
  • the general-purpose thermal cycler device used for PCR has slow temperature control due to the huge heat capacity of the aluminum block, which is a heater, and it takes 1 to 2 hours for PCR operation of 30 to 40 cycles, and in some cases, longer. Requires. Therefore, even if the latest genetic testing equipment is used, it usually takes one hour or more for the analysis in total. Therefore, speeding up the PCR operation has been a major issue since the advent of the technology.
  • Patent Document 1 a reciprocal flow type nucleic acid amplification device that uses a microblower or the like as a liquid feeding mechanism to reciprocate a sample solution between two temperature zones.
  • the passage of the sample solution is confirmed by using the fluorescence detector, and the electric signal from the fluorescence detector is sent to the liquid feed control mechanism, so that the cost of the entire device is large. It was influential. Therefore, the range of use of the nucleic acid amplification device may be limited.
  • the materials used for nucleic acid amplification chips provided with microchannels such as selecting a material with less autofluorescence. From the above, it has been required to expand the range of use of the nucleic acid amplification device.
  • the present disclosure has been made to solve such a problem, and an object of the present disclosure is to provide a nucleic acid amplification device, a nucleic acid amplification method, and a sample solution position control method capable of expanding the range of use.
  • the present inventors can irradiate the microchannel with infrared rays having a specific wavelength (for example, 1450 nm) and confirm the passage of the sample solution by the change of the transmitted infrared rays. I found the finding. The present inventors have completed the present disclosure based on this finding.
  • the nucleic acid amplification device is a nucleic acid amplification device on which a nucleic acid amplification chip is placed, and is a temperature control unit that forms a denaturation temperature zone and an extension / annealing temperature zone, and an air suction unit when liquid feeding is stopped. It is equipped with a liquid feeding mechanism in which the pressure of the air discharge unit is equal to that of the nucleic acid amplification unit, a detection unit for detecting the sample solution in the nucleic acid amplification chip, and a control unit for controlling the liquid feeding mechanism based on the detection result of the detection unit.
  • the detection unit includes an infrared light source that emits infrared rays and an infrared detection element that detects infrared rays.
  • a denaturation temperature zone and an extension / annealing temperature zone can be formed on the nucleic acid amplification chip by mounting the nucleic acid amplification chip and adjusting the temperature by the temperature adjusting unit. Therefore, the control unit controls the liquid feeding mechanism based on the detection result of the detection unit to reciprocate each temperature zone to the sample solution in the microchannel of the nucleic acid amplification chip to perform thermal cycling. Can be done.
  • the detection unit has an infrared light source that emits infrared rays and an infrared detection element that detects infrared rays.
  • the cost of the detection unit can be significantly reduced, so that the cost of the entire device can also be significantly reduced.
  • the nucleic acid amplification device can be widely used in each situation.
  • the detection unit performs detection using infrared rays, there is no situation in which a fluorescent substance is required unlike a fluorescence detector, so that the limitation in selecting the material of the nucleic acid amplification chip can be reduced. ..
  • the fluorescence detector has sensitivity in the vicinity of the target fluorescence wavelength.
  • the detector using infrared rays does not affect each other between the detectors because of the mechanism of detecting the absorption at a specific position of the minute flow path. Therefore, it is possible to arrange a plurality of detection units without being restricted by the positional relationship with each other. Since various restrictions can be reduced as described above, the range of use of the nucleic acid amplification device can be expanded.
  • the nucleic acid amplification method according to the present disclosure is a nucleic acid amplification method using a thermal cycle in which a modification temperature zone and an extension / annealing temperature zone are reciprocated in a sample solution, and is a temperature for forming a modification temperature zone and an extension / annealing temperature zone.
  • the sample solution is moved in the minute flow path so as to reciprocate between the modification temperature zone and the elongation / annealing temperature zone by the adjustment step and the liquid feeding mechanism in which the pressures of the air suction part and the air discharge part become equal when the liquid feeding is stopped.
  • It includes a liquid feeding step, a detection step of detecting the sample solution in the nucleic acid amplification chip, and a control step of controlling the liquid feeding mechanism based on the detection result of the detection step.
  • the road is irradiated with infrared rays, and the infrared rays transmitted through the minute flow path are detected by the infrared detection element.
  • nucleic acid amplification method According to this nucleic acid amplification method, the same action / effect as the above-mentioned nucleic acid amplification device can be obtained.
  • the sample solution position control method includes a liquid feeding step of moving a sample solution in a microchannel by a liquid feeding mechanism in which the pressures of the air suction part and the air discharging part become equal when the liquid feeding is stopped, and a microchannel.
  • a liquid feeding step of moving a sample solution in a microchannel by a liquid feeding mechanism in which the pressures of the air suction part and the air discharging part become equal when the liquid feeding is stopped, and a microchannel.
  • this sample solution position control method when controlling the position of a sample in a minute flow path, it is possible to control the drive of the liquid feeding mechanism based on the change in the amount of infrared rays detected in the infrared detection step. can.
  • the detection step is executed using infrared rays, the same effect as the above-mentioned nucleic acid amplification device can be obtained as compared with the case where the fluorescence detector is used. From the above, the range of use of the sample solution position control method can be expanded.
  • nucleic acid amplification device a nucleic acid amplification method
  • a sample solution position control method that can expand the range of use.
  • FIGS. 3 (a) to 3 (c) are schematic views showing how the detection unit detects a sample solution moving in a microchannel
  • FIGS. 3 (d) are FIGS. 3 (a) to 3 (c).
  • It is a graph (image) which shows the change of the infrared ray amount detected by the infrared ray detection element in each scene of.
  • It is a flowchart which shows the content of the nucleic acid amplification method and the sample solution position control method which concerns on embodiment of this disclosure.
  • It is a flowchart which shows the content of the nucleic acid amplification method and the sample solution position control method which concerns on embodiment of this disclosure.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of the nucleic acid amplification device 1 according to the embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 2 is a plan view showing the nucleic acid amplification chip 50.
  • the nucleic acid amplification device 1 according to the present embodiment mounts the nucleic acid amplification chip 50 and reciprocates the sample solution between two temperature zones in the microchannel of the nucleic acid amplification chip 50 to perform thermal cycling. It is an apparatus using the PCR method (Polymerase Chain Reaction) to be performed.
  • PCR method Polymerase Chain Reaction
  • Nucleic acid amplification device 1 utilizes nucleic acid amplification by utilizing denaturation of a plurality of cycles, annealing of primer pairs to relative chains, and extension of primers resulting in an exponential increase in the number of copies of the target nucleic acid sequence.
  • the nucleic acid amplification method using the nucleic acid amplification device 1 according to the present embodiment may use DNA as a template or RNA as a template. When RNA is used as a template, it is preferable to use reverse transcriptase in combination.
  • the nucleic acid amplification device 1 includes a nucleic acid amplification chip mounting unit 2, temperature adjusting units 3A and 3B, liquid feeding mechanisms 4A and 4B, a detection unit 5, and a control unit 10. ..
  • the nucleic acid amplification chip mounting unit 2 is a portion on which the nucleic acid amplification chip 50 is placed.
  • the nucleic acid amplification chip mounting unit 2 has a mounting surface for mounting the nucleic acid amplification chip 50.
  • the mounting surface of the nucleic acid amplification chip mounting unit 2 may be composed of the upper surfaces of the temperature adjusting units 3A and 3B.
  • a substrate for mounting the nucleic acid amplification chip 50 may be provided on the heat source, and the upper surface of the substrate may be used as the mounting surface.
  • the configuration of the nucleic acid amplification chip 50 will be described with reference to FIG. 2.
  • the nucleic acid amplification chip 50 is configured by forming a microchannel 60 in a plate-shaped chip member 51.
  • the chip member 51 for forming the microchannel 60 is eroded by (i) an electrolyte solution or an organic solvent, which is (i) relatively high in thermal conductivity, (ii) stable in the temperature range required for PCR, and (iii). It is preferably composed of a material that meets some or all of the requirements such as difficulty and (iv) low adsorptivity of nucleic acids and proteins.
  • the material of the chip member 51 includes, but is not limited to, various plastics such as glass, quartz, silicon, and cycloolefin polymer (COP).
  • a groove is formed on the surface of the chip member 51 by a method such as machining such as cutting by NC processing, injection molding, nanoimprinting, soft lithography, etc., and a seal (preferably made of polyolefin or the like) is formed. It is configured by sealing with a transparent seal).
  • the microchannel 60 can be formed in the chip member 51 by three-dimensional printing.
  • the shape of the cross section of the microchannel 60 is not particularly limited, and may be a semicircular shape, a circular shape, a rectangular shape, a trapezoidal shape, or the like.
  • the cross section of the microchannel 60 can be, for example, a width of about 10 to 1000 ⁇ m and a depth of about 10 to 1000 ⁇ m. Further, the width and the depth of the microchannel 60 can be changed constantly or partially.
  • the microchannel 60 has heated portions 61A and 61B, intermediate portions 62, connecting portions 63A and 63B, and an introduction portion 64.
  • the heated portions 61A and 61B are portions where the temperature of the passing sample solution is adjusted by being heated by the temperature adjusting portions 3A and 3B (see FIG. 1).
  • the heated portion 61A is formed at a position corresponding to the denaturation temperature zone 66A heated by the temperature adjusting portion 3A in the chip member 51.
  • the heated portion 61B is formed in the chip member 51 at a position corresponding to the extension / annealing temperature zone 66B heated by the temperature adjusting portion 3B.
  • the shape of the heated portions 61A and 61B may be a shape that can secure the channel length, that is, the staying region of the sample solution in each of the temperature zones 66A and 66B.
  • the shape of the heated portions 61A and 61B can be the shape of a meandering flow path having a loop shape, a curved flow path such as a spiral shape, or the like.
  • the positions of the denaturation temperature zone 66A and the extension / annealing temperature zone 66B may be reversed.
  • the intermediate portion 62 is a portion connecting the heated portion 61A and the heated portion 61B. That is, the heated portion 61A (denaturation temperature zone 66A) and the heated portion 61B (extension / annealing temperature zone 66B) are arranged so as to be separated from each other in a direction parallel to the surface of the chip member 51. Therefore, the intermediate portion 62 is arranged between the heated portion 61A and the heated portion 61B.
  • the intermediate portion 62 has a shape extending linearly, but may have a shape extending in a curved shape having a loop shape or the like.
  • the connection points between the heated portions 61A and 61B and the intermediate portion 62 are configured as entrances and exits 61a and 61a of the respective temperature zones 66A and 66B.
  • connection portions 63A and 63B are portions that connect the communication ports 52A and 52B for the liquid feeding mechanisms 4A and 4B (see FIG. 1) and the heated portions 61A and 61B. Filters 53A and 53B are provided on the connection portions 63A and 63B.
  • the connection points between the heated portions 61A and 61B and the connecting portions 63A and 63B are configured as entrances and exits 61b and 61b of the respective temperature zones 66A and 66B.
  • the introduction portion 64 is a portion that connects the introduction port 54 of the sample solution and the connection portion 63A. Further, the introduction unit 64 may be designed to connect the introduction port 54 of the sample solution and the connection unit 63B.
  • the introduction port 54 can be sealed by a seal, a valve, or the like, if necessary.
  • the shapes of the connection portions 63A and 63B and the introduction portion 64 can be appropriately changed depending on the positional relationship between the communication ports 52A and 52B and the introduction port 54, and are not limited to the shapes shown in FIG. ..
  • the temperature adjusting units 3A and 3B form a denaturation temperature zone 66A and an extension / annealing temperature zone 66B, respectively. It is preferable that the temperature adjusting units 3A and 3B maintain a constant temperature in each of the denaturation temperature zone 66A and the elongation / annealing temperature zone 66B. In order to maintain such a temperature, it is preferable that the temperature adjusting units 3A and 3B are composed of a heat source such as a cartridge heater. However, the temperature adjusting units 3A and 3B are not particularly limited as long as they are temperature-adjustable devices.
  • the temperature adjusting portions 3A and 3B maintain the temperatures of the denaturation temperature zone 66A and the elongation / annealing temperature zone 66B at constant values, so that the heated portions 61A of the microchannels 60 formed in the respective temperature zones 66A and 66B are heated. , 61B can also be maintained at the corresponding temperature. Therefore, the temperature adjusting units 3A and 3B can change the temperature of the sample solution that has moved to each of the temperature zones 66A and 66B to a desired temperature in each of the temperature zones 66A and 66B.
  • the temperature control unit 3A may maintain the denaturation temperature zone 66A at the temperature required for the DNA denaturation reaction in PCR.
  • the temperature of the denaturation temperature zone 66A is preferably about 90 to 100 ° C, more preferably about 95 ° C.
  • the temperature control unit 3B may maintain the elongation / annealing temperature zone 66B at the temperature required for the DNA annealing reaction and elongation reaction in PCR.
  • the temperature of the elongation / annealing temperature zone 66B is preferably about 40 to 75 ° C, more preferably about 55 to 65 ° C.
  • the temperature adjusting units 3A and 3B are connected to the drivers 21A and 21B and the temperature monitoring units 22A and 22B.
  • the drivers 21A and 21B are devices that control the temperature adjusting units 3A and 3B to generate heat for maintaining the temperature zones 66A and 66B at a desired temperature based on the control signal from the control unit 10.
  • the temperature monitoring units 22A and 22B are devices that monitor the temperatures of the temperature adjusting units 3A and 3B and transmit the monitoring results to the control unit 10.
  • the liquid feeding mechanisms 4A and 4B are mechanisms for moving the sample solution in the minute flow path so as to reciprocate between the denaturation temperature zone 66A and the elongation / annealing temperature zone 66B.
  • a mechanism is used in which the air pressures of the air suction portion and the air discharge portion become equal when the liquid feeding is stopped. That is, as the liquid feeding mechanisms 4A and 4B, those configured to form an open system even during liquid feeding are used instead of using a mechanism that requires the inside of the flow path to be a closed system. ..
  • By adopting such liquid feeding mechanisms 4A and 4B when the liquid feeding mechanisms 4A and 4B stop blowing air, the pressure inside the flow path instantly becomes equal to the pressure outside the flow path.
  • examples of the liquid feeding mechanisms 4A and 4B in which the air pressures of the air suction unit and the air discharge unit become equal when the liquid feeding is stopped include a micro blower and a fan.
  • the micro blower (also referred to as a piezoelectric micro blower) exemplified as the liquid feeding mechanisms 4A and 4B is a known device that sucks and discharges air.
  • the microblower is characterized by not having a closed structure, i.e., having no check valve.
  • a typical microblower can realize suction and discharge of air by bending and deforming the diaphragm by applying a voltage to the piezoelectric element.
  • the microblower for example, one manufactured by Murata Manufacturing Co., Ltd. can be used (MZB1001T02, MZB3004T04).
  • the fan exemplified as the liquid feeding mechanisms 4A and 4B is a device that blows air by the rotational motion of the impeller. Due to the structural characteristics of the impeller, the fan does not have a closed flow path.
  • the liquid feeding mechanisms 4A and 4B are connected to the communication ports 52A and 52B (see FIG. 2) of the nucleic acid amplification chip 50 via the air supply channels 23A and 23B, respectively.
  • the liquid feeding mechanisms 4A and 4B are connected to the drivers 24A and 24B.
  • the drivers 24A and 24B are devices that control the liquid feeding mechanisms 4A and 4B to supply a desired flow rate of air at a desired timing based on a control signal from the control unit 10.
  • the liquid feeding mechanism 4A supplies air
  • the sample solution in the microchannel 60 (see FIG. 2) is fed in the direction from the denaturation temperature zone 66A side toward the extension / annealing temperature zone 66B side.
  • the liquid feeding mechanism 4B supplies air
  • the sample solution in the microchannel 60 is fed in the direction from the extension / annealing temperature zone 66B side to the denaturation temperature zone 66A side.
  • the liquid may be sent by connecting to one communication port.
  • the detection unit 5 is a device for detecting the sample solution in the nucleic acid amplification chip 50.
  • the detection unit 5 detects the sample solution and transmits the detection result to the control unit 10.
  • the detection unit 5 detects the sample solution in the nucleic acid amplification chip 50 between the denaturation temperature zone 66A and the elongation / annealing temperature zone 66B. Specifically, the detection unit 5 detects the sample solution in the detection region 67 near the center of the intermediate portion 62 of the microchannel 60 (see FIG. 2).
  • the detection unit 5 has an infrared light source 30 that emits infrared rays and an infrared detection element 31 that detects infrared rays.
  • the method of detecting the sample solution of the detection unit 5 will be described with reference to FIG. 3 (a) to 3 (c) are schematic views showing how the detection unit 5 detects the sample solution W moving in the microchannel 60.
  • FIG. 3D is a graph (image) showing changes in the amount of infrared rays detected by the infrared detection element 31 in each of the scenes of FIGS. 3A to 3C. As shown in FIGS.
  • the infrared light source 30 and the infrared detection element 31 are arranged so as to face each other with the minute flow path 60 interposed therebetween.
  • the infrared light source 30 irradiates the infrared detection element 31 with infrared L so as to pass through the detection region 67 of the minute flow path 60.
  • the infrared detection element 31 detects infrared rays (electromagnetic waves having a wavelength of 0.78 ⁇ m or more) transmitted through the minute flow path 60, converts them into electric signals, and transmits them to the control unit 10 (see FIG. 1).
  • FIG. 3A shows the state of the pre-stage in which the sample solution W passes through the detection region 67 of the microchannel 60.
  • the amount of infrared rays detected by the infrared ray detecting element 31 at this time does not decrease almost as shown by "A" in FIG. 3 (d).
  • FIG. 3B shows a stage in which the sample solution W is passing through the detection region 67 of the microchannel 60. In this state, the infrared ray L is absorbed by the sample solution W.
  • the amount of infrared rays detected by the infrared ray detecting element 31 at this time is smaller than that in the region of "A” as shown by "B” in FIG. 3 (d).
  • FIG. 3A shows the state of the pre-stage in which the sample solution W passes through the detection region 67 of the microchannel 60.
  • the amount of infrared rays detected by the infrared ray detecting element 31 at this time is smaller than that in the region of "A” as shown by
  • 3C shows the state after the sample solution W has passed through the detection region 67 of the microchannel 60.
  • the amount of infrared rays detected by the infrared ray detecting element 31 at this time increases again as shown by “C” in FIG. 3 (d). From such a relationship, it is possible to detect that the sample solution W has passed through the detection region 67 based on the fact that the amount of infrared rays detected by the infrared detection element 31 is equal to or less than a predetermined threshold value.
  • an infrared light emitting diode an infrared laser light source, a xenon lamp, a tungsten lamp, a halogen lamp, or the like is adopted.
  • an infrared light emitting diode or an infrared laser light source is preferably adopted.
  • the infrared light emitting diode is a diode that emits an electromagnetic wave having a peak emission wavelength of 800 to 4400 nm.
  • the infrared laser light source include solid-state lasers such as fiber lasers, liquid lasers, gas lasers, and semiconductor lasers.
  • the preferred peak emission wavelength of the infrared light emitting diode or the infrared laser light source is 920 to 970 nm, 1300 to 1550 nm, 1900 to 2000 nm, and the more preferable peak emission wavelength is 1400 to 1500 nm.
  • Examples of the infrared light source 30 having a preferable peak emission wavelength include an infrared light emitting diode or a laser light source having a peak emission wavelength of 950 nm, 965 nm, 970 nm, 1450 nm, 1950 nm, 2000 nm, and 3300 nm.
  • Specific examples of the infrared light source 30 include EOLS-950-843 (KELV Co., Ltd.), EOLS-965-525 (KELV Co., Ltd.), EOLS-970-195 (KELV Co., Ltd.), and EOLD-1450-015 (KELV Co., Ltd.).
  • the infrared detection element 31 is roughly classified into a thermal type detection element having no wavelength dependence and a quantum type detection element having wavelength dependence according to the operating principle.
  • the thermal detection element is an element that converts the temperature change of the light receiving surface into an electric signal when radiant energy is incident.
  • thermal type detection elements thermopile, which is a thermoelectromotive force type detection element in which thermocouples are connected in series to increase the thermoelectromotive force
  • thermista borometer which is a heat conduction type detection element that utilizes the change in resistance due to heat, and a strong dielectric material.
  • pyroelectric element which is an element utilizing the pyroelectric effect which spontaneously polarizes and generates an electric charge when the temperature rises with a strong dielectric.
  • the quantum detection element is an element in which an incident photon (photon) directly interacts with an electron to obtain an electric signal proportional to the number of photons.
  • Quantum type detection elements include photoelectron emission (photomultiplier tube, image converter), photoelectromotive power element (photo diode), photoconductive element (photoconducting detector, photoconducting detector), photoelectromagnetic effect (PEM).
  • Type detector photoelectronic detector or the like is used.
  • KPDE086S-H8 manufactured by Kyoto Semiconductor Co., Ltd. can be mentioned.
  • the quantum type detection element when used as the infrared detection element 31 of the detection unit 5 of the nucleic acid amplification device 1, the quantum type detection element may be preferable to the thermal type detection element. Specifically, this is because the quantum type detection element has an advantage of a high response speed.
  • the control unit 10 includes, for example, a processor, a memory, a storage, and a communication interface, and may be configured as a computer.
  • the processor is an arithmetic unit such as a CPU (Central Processing Unit).
  • the memory is a storage unit such as a ROM (Read Only Memory) or a RAM (Random Access Memory).
  • the storage is a storage unit (storage medium) such as an HDD (Hard Disk Drive).
  • a communication interface is a communication device that realizes data communication.
  • the processor controls the memory, the storage, and the communication interface, and realizes the function as the control unit 10 described later.
  • the control unit 10 realizes various functions by, for example, loading a program stored in the ROM into the RAM and executing the program loaded in the RAM in the CPU.
  • the number of computers constituting the control unit 10 may be singular or plural.
  • the control unit 10 includes a heating control unit 11, a signal detection unit 12, and a liquid feeding mechanism control unit 13.
  • the heating control unit 11 controls the temperature control units 3A and 3B so that the temperatures of the denaturation temperature zone 66A and the extension / annealing temperature zone 66B are constant at a desired temperature.
  • the signal detection unit 12 receives the detection result from the detection unit 5, that is, the electric signal corresponding to the amount of infrared rays detected by the infrared detection element 31. Further, the signal detection unit 12 grasps the amount of infrared rays from the received electric signal, and detects the presence of the sample solution in the detection region 67 (see FIGS. 2 and 3) based on the degree of decrease in the amount of infrared rays.
  • the liquid feed mechanism control unit 13 controls the liquid feed mechanisms 4A and 4B so that the sample solution in the microchannel 60 makes a desired movement.
  • the liquid feed mechanism control unit 13 controls the position of the sample solution in the microchannel 60 by controlling the drive of the liquid feed mechanisms 4A and 4B based on the change in the amount of infrared rays detected by the signal detection unit 12. do.
  • the liquid feed mechanism control unit 13 stops the supply of air by the liquid feed mechanism 4A or the liquid feed mechanism 4B at the timing when a certain waiting time elapses after the sample solution is detected by the detection unit 5, and the sample solution is stopped.
  • the position may be controlled so as to stop the device on the spot.
  • FIGS. 4 and 5 are flowcharts showing the contents of the nucleic acid amplification method and the sample solution position control method according to the embodiment of the present disclosure.
  • the processes shown in FIGS. 4 and 5 are repeatedly executed by the control unit 10 at predetermined timings.
  • the heating control unit 11 controls the temperature adjustment units 3A and 3B so as to form the denaturation temperature zone 66A and the extension / annealing temperature zone 66B, and performs the temperature adjustment process (step S100: Temperature adjustment process).
  • step S100 Temperature adjustment process
  • step S110 detection unit adjustment step
  • step S110 detection unit adjustment step
  • step S120 Liquid feeding step 1).
  • the infrared light source 30 irradiates the minute flow path 60 with infrared rays, and the infrared detection element 31 detects the infrared rays transmitted through the minute flow path 60, whereby the sample in the nucleic acid amplification chip is detected.
  • a detection process for detecting the solution is performed (step S130: infrared detection step 1).
  • step S140 determines whether or not there has been a change (decrease) in the amount of infrared rays.
  • step S140 when the sample solution is detected in step S130 and it is determined that it is the timing to stop the liquid feeding mechanism A (YES in step S140), the liquid feeding mechanism control unit 13 is in step S130. Based on the detection result (change in the amount of detected infrared rays), the liquid feeding mechanism 4A is turned off and stopped (step S150: position control step 1). Next, the liquid feeding mechanism control unit 13 keeps the sample solution in the stretching / annealing temperature zone 66B for a certain period of time (step S160). If NO is determined in step S140, the process is repeated from step S130.
  • the liquid feed mechanism control unit 13 turns on the liquid feed mechanism 4B and moves the sample solution from the elongation / annealing temperature zone 66B to the denaturation temperature zone 66A in the microchannel 60.
  • the liquid feeding process is performed (step S170: liquid feeding step 2).
  • the infrared light source 30 irradiates the minute flow path 60 with infrared rays, and the infrared detection element 31 detects the infrared rays transmitted through the minute flow path 60, whereby the sample in the nucleic acid amplification chip is detected.
  • a detection process for detecting the solution is performed (step S180: infrared detection step 2).
  • the control unit 10 determines whether or not there has been a change (decrease) in the amount of infrared rays (step S190).
  • step S190 when the sample solution is detected in step S180 and it is determined that it is the timing to stop the liquid feeding mechanism B (YES in step S190), the liquid feeding mechanism control unit 13 is in step S180. Based on the detection result (change in the amount of detected infrared rays), the liquid feeding mechanism 4B is turned off and stopped (step S200: position control step 2). Next, the liquid feeding mechanism control unit 13 keeps the sample solution in the denaturation temperature zone 66A for a certain period of time (step S210). If NO is determined in step S190, the process is repeated from step S180.
  • step S220 determines whether or not the setting cycle has been completed. If NO is determined in step S220, the process is repeated again from step S120 in FIG. If YES is determined in step S220, the processes shown in FIGS. 4 and 5 are terminated. When the processing shown in FIGS. 4 and 5 is completed, the processing is restarted from step S100 as necessary.
  • a plurality of detectors can be arranged side by side in close proximity to accurately measure the length of the sample solution in the microchannel.
  • the flow velocity can be measured in a short section by using two detectors arranged close to each other, and by preparing a plurality of these, it is possible to measure the change in the flow velocity in the minute flow path. Using this result, it is possible to realize a control system that accurately stops the sample solution at an arbitrary position in the microchannel.
  • the nucleic acid amplification chip 50 is placed and the temperature is adjusted by the temperature adjusting units 3A and 3B, whereby the nucleic acid amplification chip 50 has a denaturation temperature zone 66A and an extension / annealing temperature.
  • the band 66B can be formed. Therefore, the control unit 10 reciprocates each temperature zone 66A and 66B to the sample solution in the microchannel 60 of the nucleic acid amplification chip 50 by controlling the liquid feeding mechanisms 4A and 4B based on the detection result of the detection unit 5. By moving it, thermal cycling can be performed.
  • the detection unit 5 has an infrared light source 30 that emits infrared rays and an infrared detection element 31 that detects infrared rays. Therefore, since the cost of the detection unit 5 can be significantly reduced as compared with the case of using the fluorescence detector, the cost of the entire device can also be significantly reduced. Therefore, the nucleic acid amplification device 1 can be widely used in each situation.
  • the detection unit 5 performs detection using infrared rays, there is no reason to select a material having low autofluorescence as in the case of using a fluorescence detector, so that when selecting a material for the nucleic acid amplification chip 50, Limits can be reduced.
  • a fluorescence detector when a fluorescence detector was used, it could not be used as a material for the chip member 51, but by using infrared rays, PMMA, PP, and others (because the wavelength of infrared rays passes through most resins) are opaque. Materials can also be used. This means that it is also useful for sample solutions that are degraded by visible light.
  • the detection unit 5 using infrared rays is not a detection method accompanied by light emission unlike the fluorescence detector, it is possible to arrange a plurality of detection units 5 without being restricted by the positional relationship with each other.
  • the detection unit 5 instead of arranging the detection unit 5 in the detection area 67, additional parts 61a, 61B to be heated are added near the entrances 61a, 61a or the entrances 61b, 61b, respectively.
  • the detection unit 5 may be arranged.
  • a plurality of detection units 5 may be arranged in the intermediate unit 62.
  • the detection unit 5 may be arranged at the same time as the detection area 67 at the entrance / exit 61a, 61a of the heated units 61A, 61B, or near the entrance / exit 61b, 61b. Further, for example, by making a minute hole in the heater of the temperature adjusting units 3A and 3B, the detection unit 5 may perform detection on the heater (heated units 61A and 61B).
  • the range of use of the nucleic acid amplification device can be expanded.
  • the nucleic acid amplification method according to the present embodiment is a nucleic acid amplification method using a thermal cycle in which a modification temperature zone 66A and an extension / annealing temperature zone 66B are reciprocated in a sample solution, and is a modification temperature zone 66A and an extension / annealing temperature zone.
  • a liquid feeding step of moving the sample solution in the microchannel 60 a detection step of detecting the sample solution in the nucleic acid amplification chip 50, and a control step of controlling the liquid feeding mechanism based on the detection result of the detection step.
  • the microchannel 60 is irradiated with infrared rays with an infrared light source, and the infrared rays transmitted through the microchannel 60 are detected by the infrared detection element.
  • nucleic acid amplification method According to this nucleic acid amplification method, the same actions and effects as those of the nucleic acid amplification device 1 described above can be obtained.
  • the sample solution position control method is a liquid feeding step in which the sample solution is moved in the minute flow path 60 by the liquid feeding mechanisms 4A and 4B in which the pressures of the air suction part and the air discharging part become equal when the liquid feeding is stopped.
  • the liquid feeding mechanism 4A based on the change in the amount of infrared rays detected in the infrared detection step of irradiating the microchannel 60 with infrared rays and detecting the infrared rays transmitted through the microchannel 60, and the infrared detection step.
  • a position control step of stopping the sample solution in the microchannel 60 at a predetermined position by controlling the drive of 4B is provided.
  • the liquid feeding mechanisms 4A and 4B are driven based on the change in the amount of infrared rays detected in the infrared detection step. Can be controlled.
  • the detection step is executed using infrared rays, the same effect as that of the nucleic acid amplification device 1 described above can be obtained as compared with the case where the fluorescence detector is used. From the above, the range of use of the sample solution position control method can be expanded.
  • the shape of the microchannel shown in FIG. 2 and the positional relationship of each component of the nucleic acid amplification chip are merely examples, and may be appropriately changed.
  • the configuration of the nucleic acid amplification device shown in FIG. 1 is only an example, and the positional relationship of each component may be appropriately changed, some components may be omitted, and other components may be added. You may.

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Abstract

核酸増幅装置は、核酸増幅チップを載置する核酸増幅装置であって、変性温度帯、及び伸長・アニーリング温度帯を形成する温度調整部と、送液停止時に空気吸入部と空気吐出部の気圧が等しくなる送液機構と、核酸増幅チップ内の試料溶液を検出するための検出部と、検出部の検出結果に基づいて送液機構を制御する制御部と、を備え、検出部は、赤外線を発光する赤外線光源、及び赤外線を検出する赤外線検出素子を有する。

Description

核酸増幅装置、核酸増幅方法及び試料溶液位置制御方法
本開示は、核酸増幅装置、核酸増幅方法及び試料溶液位置制御方法に関する。
　遺伝子検査は、臨床検査、農作物や病原性微生物の種類の同定など、様々な分野において中核をなすものである。癌を含む種々の疾患、微生物の感染、分子系統解析に基づいた遺伝子マーカーなどを検出する能力は、疾患および発症リスク診断、マーカーの探索、食品や環境中の安全性評価、犯罪の立証、および他の多くの技術にとって普遍的技術となっている。
　遺伝子である少量の核酸を高感度に検出する最も強力な基礎技術の１つは、核酸配列の一部または全部を指数関数的に複製し増幅した産物を分析する手法である。
　ＰＣＲ法は、ＤＮＡのある特定領域を選択的に増幅する強力な技術である。ＰＣＲは、テンプレートＤＮＡの中の標的とするＤＮＡ配列について、単一のテンプレートＤＮＡから数百万コピーのＤＮＡ断片を生成することを可能とする。ＰＣＲは、サーマルサイクルと呼ばれる三相もしくは二相の温度条件を繰り返す。これにより、単一鎖へのＤＮＡの変性、変性されたＤＮＡ一本鎖とプライマーのアニーリング、および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によるプライマーの伸長という個々の反応が順次繰り返される。このサイクルは、分析に必要な十分なコピー数が得られるまで繰り返し行われる。原理上、ＰＣＲの1回のサイクルで、コピー数を倍にすることが可能である。
　ＰＣＲ法は、サーマルサイクルにより遺伝子を指数関数的に増幅する強力な手法である。しかし、ＰＣＲに使用される汎用のサーマルサイクラー装置は、ヒーターであるアルミブロック部の巨大な熱容量のため温度制御が遅く、３０～４０サイクルのＰＣＲ操作に従来１～２時間、場合によってはそれ以上を要する。そのため、最新の遺伝子検査装置を用いても分析にはトータルで、通常１時間以上を要している。従って、ＰＣＲ操作の高速化は、技術登場以来の大きな課題であった。
　このような課題を解決する手段としてマイクロブロア等を送液用機構として使用し、試料溶液を２つの温度帯間を往復送液させるレシプロカルフロー型の核酸増幅装置が報告されている（特許文献１）。
国際公開第２０１６／００６６１２号
　しかしながら、特許文献１に記載の核酸増幅装置は、蛍光検出器を用いて試料溶液の通過を確認し、蛍光検出器からの電気信号を送液制御機構に送っていたため、装置全体のコストに大きく影響していた。そのため、核酸増幅装置の利用範囲が限定される場合があった。また、微小流路を備えた核酸増幅チップも、自家蛍光の少ない材料を選択するなど使用材料に制限があった。以上より、核酸増幅装置の利用範囲を拡大することが求められていた。
　本開示は、このような課題を解決するためになされたものであり、利用範囲を拡大することができる核酸増幅装置、核酸増幅方法及び試料溶液位置制御方法を提供することを目的とする。
　ここで、本発明者らは、鋭意研究の結果、微小流路に特定の波長の赤外線（例えば、１４５０ｎｍ）を照射し、透過する赤外線の変化により試料溶液の通過を確認することが可能であるという知見を見出した。本発明者らは、この知見に基づき本開示を完成させるに至った。
　すなわち、本開示に係る核酸増幅装置は、核酸増幅チップを載置する核酸増幅装置であって、変性温度帯、及び伸長・アニーリング温度帯を形成する温度調整部と、送液停止時に空気吸入部と空気吐出部の気圧が等しくなる送液機構と、核酸増幅チップ内の試料溶液を検出するための検出部と、検出部の検出結果に基づいて送液機構を制御する制御部と、を備え、検出部は、赤外線を発光する赤外線光源、及び赤外線を検出する赤外線検出素子を有する。
　本開示に係る核酸増幅装置では、核酸増幅チップを載置して、温度調整部によって温度調整を行うことで、核酸増幅チップに変性温度帯、及び伸長・アニーリング温度帯を形成することができる。従って、制御部は、検出部の検出結果に基づいて送液機構を制御することで、核酸増幅チップの微小流路内の試料溶液に各温度帯を往復移動させることにより、サーマルサイクリングを行うことができる。ここで、検出部は、赤外線を発光する赤外線光源、及び赤外線を検出する赤外線検出素子を有する。従って、蛍光検出器を用いる場合に比して、検出部のコストを大幅に低減することができるため、装置全体のコストも大幅に低減できる。その結果、各場面において幅広く核酸増幅装置を利用することが可能となる。更に、検出部が赤外線を用いて検出を行う場合、蛍光検出器のように蛍光物質が必要となるような事情がないため、核酸増幅チップの材料の選択の際の制限を低減することができる。また、蛍光検出器は目的の蛍光波長近傍に感度を有する。従って、複数の蛍光検出器を使用する場合、異なる波長間で蛍光強度が影響を及ぼしあうことを避けるため、蛍光波長の選択と蛍光検出器の配置を慎重に検討する必要がある。これに対し、赤外線を用いた検出器は微小流路の特定位置での吸光を検出する仕組み上、検出器間で影響を及ぼしあうことは無い。そのため、複数の検出部を互いの位置関係の制約を受けることなく配置することが可能となる。以上のように各種制約を低減することができるため、核酸増幅装置の利用範囲を拡大することができる。
　本開示に係る核酸増幅方法は、試料溶液に変性温度帯と伸長・アニーリング温度帯とを往復させるサーマルサイクルを用いる核酸増幅方法であって、変性温度帯、及び伸長・アニーリング温度帯を形成する温度調整工程と、送液停止時に空気吸入部と空気吐出部の気圧が等しくなる送液機構によって、変性温度帯と伸長・アニーリング温度帯とを往復するように、試料溶液を微小流路内で移動させる送液工程と、核酸増幅チップ内の試料溶液を検出する検出工程と、検出工程の検出結果に基づいて送液機構を制御する制御工程と、を備え、検出工程では、赤外線光源で微小流路へ赤外線を照射し、微小流路を透過した赤外線を赤外線検出素子で検出する。
　この核酸増幅方法によれば、上述の核酸増幅装置と同様な作用・効果を得ることができる。
　本開示に係る試料溶液位置制御方法は、送液停止時に空気吸入部と空気吐出部の気圧が等しくなる送液機構によって、微小流路内で試料溶液を移動させる送液工程と、微小流路に対して赤外線を照射し、微小流路を透過した赤外線を検出する赤外線検出工程と、赤外線検出工程で検出された赤外線量の変化に基づいて、送液機構の駆動を制御することで、微小流路内の試料溶液の位置を制御する位置制御工程と、を備える。
　この試料溶液位置制御方法によれば、微小流路内の試料の位置の制御を行う際に、赤外線検出工程で検出された赤外線量の変化に基づいて、送液機構の駆動を制御することができる。この場合、検出工程が赤外線を用いて実行されるため、蛍光検出器を用いた場合に比べ、上述の核酸増幅装置と同様な効果を得ることができる。以上より、試料溶液位置制御方法の利用範囲を拡大することができる。
　本開示によれば、利用範囲を拡大することができる核酸増幅装置、核酸増幅方法及び試料溶液位置制御方法を提供することができる。
本開示の実施形態に係る核酸増幅装置の概略構成図である。 核酸増幅チップを示す平面図である。 図３（ａ）～（ｃ）は、検出部が微小流路内を移動する試料溶液を検出する様子を示す模式図であり、図３（ｄ）は、図３（ａ）～（ｃ）の各場面において、赤外線検出素子によって検出される赤外線量の変化を示すグラフ（イメージ）である。 本開示の実施形態に係る核酸増幅方法、及び試料溶液位置制御方法の内容を示すフローチャートである。 本開示の実施形態に係る核酸増幅方法、及び試料溶液位置制御方法の内容を示すフローチャートである。
　以下、添付図面を参照しながら本開示の一実施形態に係る核酸増幅装置について説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
　図１は、本開示の実施形態に係る核酸増幅装置１の概略構成図である。図２は、核酸増幅チップ５０を示す平面図である。本実施形態に係る核酸増幅装置１は、核酸増幅チップ５０を載置すると共に、当該核酸増幅チップ５０の微小流路内で試料溶液を二つの温度帯間を往復移動させることにより、サーマルサイクリングを行うＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応：Polymerase Chain Reaction）を用いた装置である。核酸増幅装置１は、複数回のサイクルの変性、プライマー対の相対鎖へのアニーリング、ターゲット核酸配列のコピー数の指数関数的な増加をもたらすプライマーの伸長を利用し、核酸の増幅を行う。本実施形態に係る核酸増幅装置１を用いた核酸増幅方法は、ＤＮＡを鋳型とするものであっても、ＲＮＡを鋳型とするものであってもよい。ＲＮＡを鋳型とする場合は、逆転写酵素を併用することが好ましい。
　図１に示すように、核酸増幅装置１は、核酸増幅チップ載置部２と、温度調整部３Ａ，３Ｂと、送液機構４Ａ，４Ｂと、検出部５と、制御部１０と、を備える。
　核酸増幅チップ載置部２は、核酸増幅チップ５０を載置する部分である。核酸増幅チップ載置部２は、核酸増幅チップ５０を載置するための載置面を有する。なお、核酸増幅チップ載置部２の載置面は、温度調整部３Ａ，３Ｂの上面によって構成されてよい。あるいは、熱源上に核酸増幅チップ５０を載置するための基板を設け、当該基板の上面を載置面としてもよい。
　ここで、図２を参照して、核酸増幅チップ５０の構成について説明する。図２に示すように、核酸増幅チップ５０は、板状のチップ部材５１に微小流路６０を形成することによって、構成される。
　微小流路６０を形成するためのチップ部材５１は、（ｉ）熱伝導性が比較的高い、（ｉｉ）ＰＣＲに必要な温度範囲において安定である、（ｉｉｉ）電解質溶液や有機溶媒に侵食されにくい、（ｉｖ）核酸やタンパク質の吸着性が低いなどの要件の一部又は全部を満たす材料から構成されることが好ましい。具体的には、チップ部材５１の材料は、ガラス、石英、シリコン、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などの各種プラスチックが例示されるが、これらに限定されるものではない。
　微小流路６０は、例えば、ＮＣ加工による切削などの機械加工、射出成形、ナノインプリンティング、ソフトリソグラフィーなどの方法により溝がチップ部材５１の表面に形成され、シール（好ましくは、例えばポリオレフィン製などの透明シール）により密閉することによって構成される。あるいは、三次元プリンティングによりチップ部材５１中に微小流路６０を形成することもできる。微小流路６０の断面の形状は、特に限定されず、半円形状、円形状、直方形状、台形形状などとすることができる。また、微小流路６０の断面は、例えば、幅１０～１０００μｍ程度、深さ１０～１０００μｍ程度とすることができる。また、微小流路６０の幅及び深さのそれぞれは、一定、または、部分的に幅若しくは深さが変化するものとすることができる。
　図２に示す例においては、微小流路６０は、被加熱部６１Ａ，６１Ｂと、中間部６２と、接続部６３Ａ，６３Ｂと、導入部６４と、を有する。
　被加熱部６１Ａ，６１Ｂは、温度調整部３Ａ，３Ｂ（図１参照）によって加熱されることで、通過する試料溶液の温度調整がなされる部分である。被加熱部６１Ａは、チップ部材５１のうち、温度調整部３Ａで加熱される変性温度帯６６Ａに対応する位置に形成される。被加熱部６１Ｂは、チップ部材５１のうち、温度調整部３Ｂで加熱される伸長・アニーリング温度帯６６Ｂに対応する位置に形成される。被加熱部６１Ａ，６１Ｂの形状は、流路長、すなわち各温度帯６６Ａ，６６Ｂにおける試料溶液の滞在領域を確保できる形状としてよい。そのため、被加熱部６１Ａ，６１Ｂの形状は、ループ形状を有する蛇行流路、渦巻き状などの曲線流路の形状とすることができる。なお、変性温度帯６６Ａと伸長・アニーリング温度帯６６Ｂの位置は、逆であってもよい。
　中間部６２は、被加熱部６１Ａと被加熱部６１Ｂとを接続する部分である。すなわち、被加熱部６１Ａ（変性温度帯６６Ａ）と、被加熱部６１Ｂ（伸長・アニーリング温度帯６６Ｂ）とは、互いにチップ部材５１の表面と平行な方向において互いに離間するように配置されている。従って、中間部６２は、被加熱部６１Ａと被加熱部６１Ｂとの間に配置される。図２に示す例では、中間部６２は、直線状に延びる形状を有するが、ループ形状等を有する曲線状に延びる形状を有してもよい。なお、被加熱部６１Ａ，６１Ｂと中間部６２との連結点は、各温度帯６６Ａ，６６Ｂの出入口６１ａ，６１ａとして構成される。
　接続部６３Ａ，６３Ｂは、送液機構４Ａ，４Ｂ（図１参照）に対する連通口５２Ａ，５２Ｂと、被加熱部６１Ａ，６１Ｂとを接続する部分である。接続部６３Ａ，６３Ｂには、フィルタ５３Ａ，５３Ｂが設けられる。なお、被加熱部６１Ａ，６１Ｂと接続部６３Ａ，６３Ｂとの連結点は、各温度帯６６Ａ，６６Ｂの出入口６１ｂ，６１ｂとして構成される。導入部６４は、試料溶液の導入口５４と接続部６３Ａとを接続する部分である。また、導入部６４は、試料溶液の導入口５４と接続部６３Ｂとを接続するように設計されてもよい。導入口５４は、必要に応じてシールや弁等により密閉可能とすることができる。なお、接続部６３Ａ，６３Ｂ、及び導入部６４の形状は、連通口５２Ａ，５２Ｂ、及び導入口５４の位置関係などによって適宜変更可能であり、図２に示される形状に限定されるものではない。
　図１に戻り、温度調整部３Ａ，３Ｂは、変性温度帯６６Ａ、及び伸長・アニーリング温度帯６６Ｂをそれぞれ形成する。温度調整部３Ａ，３Ｂは、変性温度帯６６Ａ、及び伸長・アニーリング温度帯６６Ｂのそれぞれを一定の温度に維持することが好ましい。このような温度維持を行うために、温度調整部３Ａ，３Ｂは、カートリッジヒーター等の熱源によって構成されることが好ましい。ただし、温度調整部３Ａ，３Ｂは、温度調整可能な機器であれば特に限定されない。
　温度調整部３Ａ，３Ｂは、変性温度帯６６Ａ、及び伸長・アニーリング温度帯６６Ｂの温度をそれぞれ一定に維持することで、各温度帯６６Ａ，６６Ｂに形成される微小流路６０の被加熱部６１Ａ，６１Ｂも、対応する温度に維持することができる。従って、温度調整部３Ａ，３Ｂは、各温度帯６６Ａ，６６Ｂに移動してきた試料溶液の温度を、各温度帯６６Ａ，６６Ｂにおける所望の温度に変化させることができる。
　例えば、温度調整部３Ａは、変性温度帯６６ＡをＰＣＲにおけるＤＮＡ変性反応に必要な温度に維持してよい。変性温度帯６６Ａの温度は９０～１００℃程度が好ましく、９５℃程度がより好ましい。温度調整部３Ｂは、伸長・アニーリング温度帯６６ＢをＰＣＲにおけるＤＮＡのアニーリング反応及び伸長反応のために必要な温度に維持してよい。伸長・アニーリング温度帯６６Ｂの温度は４０～７５℃程度が好ましく、５５～６５℃程度がより好ましい。
　なお、温度調整部３Ａ，３Ｂは、ドライバ２１Ａ，２１Ｂ、及び温度監視部２２Ａ，２２Ｂと接続される。ドライバ２１Ａ，２１Ｂは、制御部１０からの制御信号に基づいて温度調整部３Ａ，３Ｂが各温度帯６６Ａ，６６Ｂを所望の温度に維持するための熱を発生するように制御する機器である。温度監視部２２Ａ，２２Ｂは、温度調整部３Ａ，３Ｂの温度を監視して、制御部１０へ監視結果を送信する機器である。
　送液機構４Ａ，４Ｂは、変性温度帯６６Ａと伸長・アニーリング温度帯６６Ｂとを往復するように、試料溶液を微小流路内で移動させる機構である。送液機構４Ａ，４Ｂとして、送液停止時に空気吸入部と空気吐出部の気圧が等しくなる機構が使用される。すなわち、送液機構４Ａ，４Ｂとして、流路内部を閉鎖系とする必要がある機構を用いるのではなく、送液時であっても開放系を形成するように構成されるものが使用される。このような送液機構４Ａ，４Ｂを採用することで、送液機構４Ａ，４Ｂが送風を停止させると、流路内部の圧力が瞬時に流路外部の圧と等しくなる。従って、プラグ状試料溶液へ作用する圧力が失われるため、送液はすぐに停止する。そのため、試料溶液の位置制御を行うための圧力開放用の複数の弁がなくても、正確な位置制御が可能となる。このように、送液停止時に空気吸入部と空気吐出部の気圧が等しくなる送液機構４Ａ，４Ｂの例としては、マイクロブロア、ファンを挙げることができる。
　送液機構４Ａ，４Ｂとして例示されるマイクロブロア（圧電マイクロブロアともいう）とは、空気を吸引及び吐出する公知の装置である。マイクロブロアは、密閉構造でないこと、すなわち逆止弁を有しないことを特徴とする。代表的なマイクロブロアは、圧電素子への電圧印加によりダイヤフラムを屈曲変形させることで、空気の吸引及び吐出を実現することができる。マイクロブロアとしては、例えば、株式会社村田製作所が製造したものを使用することができる（ＭＺＢ１００１Ｔ０２，ＭＺＢ３００４Ｔ０４)。送液機構４Ａ，４Ｂとして例示されるファンとは、羽根車の回転運動によって送風を行う装置である。ファンは、羽根車の構造上の特性上、流路を閉鎖系としない。
　送液機構４Ａ，４Ｂは、空気供給流路２３Ａ，２３Ｂを介して、核酸増幅チップ５０の連通口５２Ａ，５２Ｂ（図２参照）にそれぞれ接続される。送液機構４Ａ，４Ｂは、ドライバ２４Ａ，２４Ｂと接続されている。ドライバ２４Ａ，２４Ｂは、制御部１０からの制御信号に基づいて、送液機構４Ａ，４Ｂが所望のタイミングで所望の流量の空気を供給するように制御する機器である。送液機構４Ａが空気を供給すると、微小流路６０（図２参照）内の試料溶液は、変性温度帯６６Ａ側から伸長・アニーリング温度帯６６Ｂ側へ向かう方向へ送液される。送液機構４Ｂが空気を供給すると、微小流路６０（図２参照）内の試料溶液は、伸長・アニーリング温度帯６６Ｂ側から変性温度帯６６Ａ側へ向かう方向へ送液される。
　なお、空気の供給と吸引を１つの送液機構で行う場合、１つの連通口に接続して送液してもよい。
　検出部５は、核酸増幅チップ５０内の試料溶液を検出するための機器である。検出部５は、試料溶液を検出して、当該検出結果を制御部１０へ送信する。検出部５は、核酸増幅チップ５０のうち、変性温度帯６６Ａと伸長・アニーリング温度帯６６Ｂとの間において、試料溶液を検出する。具体的には、検出部５は、微小流路６０の中間部６２の中央付近における検出領域６７において、試料溶液を検出する（図２参照）。
　本実施形態では、検出部５は、赤外線を発光する赤外線光源３０、及び赤外線を検出する赤外線検出素子３１を有する。検出部５の試料溶液の検出方法について、図３を参照して説明する。図３（ａ）～（ｃ）は、検出部５が微小流路６０内を移動する試料溶液Ｗを検出する様子を示す模式図である。図３（ｄ）は、図３（ａ）～（ｃ）の各場面において、赤外線検出素子３１によって検出される赤外線量の変化を示すグラフ（イメージ）である。図３（ａ）～（ｃ）に示すように、赤外線光源３０と赤外線検出素子３１とは、微小流路６０を挟んで互いに対向するように配置される。赤外線光源３０は、微小流路６０の検出領域６７を通過するように、赤外線検出素子３１へ赤外線Ｌを照射する。赤外線検出素子３１は、微小流路６０を透過した赤外線（０．７８μｍ以上の波長の電磁波）を検出して電気信号に変換し、制御部１０（図１参照）へ送信する。
　ここで、図３（ａ）は、試料溶液Ｗが、微小流路６０の検出領域６７を通過する前段階の様子を示している。このときの赤外線検出素子３１が検出する赤外線量は、図３（ｄ）において「Ａ」で示されるように、ほぼ減少しない。図３（ｂ）は、試料溶液Ｗが、微小流路６０の検出領域６７を通過している段階の様子を示している。当該状態では、赤外線Ｌが試料溶液Ｗに吸収される。このときの赤外線検出素子３１が検出する赤外線量は、図３（ｄ）において「Ｂ」で示されるように、「Ａ」の領域に比して減少する。図３（ｃ）は、試料溶液Ｗが、微小流路６０の検出領域６７を通過した後の様子を示している。このときの赤外線検出素子３１が検出する赤外線量は、図３（ｄ）において「Ｃ」で示されるように、再び多くなる。このような関係より、赤外線検出素子３１によって検出された赤外線量が所定の閾値以下となったことに基づいて、試料溶液Ｗが検出領域６７を通過したことを検出可能となる。
　本実施形態では、赤外線光源３０として、赤外線発光ダイオード、赤外線レーザー光源、クセノンランプ、タングステンランプ、ハロゲンランプ等が採用される。赤外線光源３０として、好ましくは、赤外線発光ダイオード、又は赤外線レーザー光源が採用される。赤外線発光ダイオードは、ピーク発光波長が８００～４４００ｎｍの電磁波を放つダイオードである。赤外線レーザー光源として、例えば、ファイバーレーザーなどの固体レーザー、液体レーザー、気体レーザー、半導体レーザー等が挙げられる。赤外線発光ダイオードや赤外線レーザー光源の好ましいピーク発光波長としては、９２０～９７０ｎｍ、１３００～１５５０ｎｍ、１９００～２０００ｎｍであり、より好ましいピーク発光波長は１４００～１５００ｎｍである。
　好ましいピーク発光波長の赤外線光源３０として、９５０ｎｍ、９６５ｎｍ、９７０ｎｍ、１４５０ｎｍ、１９５０ｎｍ、２０００ｎｍ、３３００ｎｍの赤外線発光ダイオード又はレーザー光源を挙げることができる。赤外線光源３０として、具体的には、ＥＯＬＳ－９５０－８４３（ケイエルブイ株式会社）、ＥＯＬＳ－９６５－５２５（ケイエルブイ株式会社）、ＥＯＬＳ－９７０－１９５（ケイエルブイ株式会社）ＥＯＬＤ－１４５０－０１５（ケイエルブイ株式会社）、ＥＯＬＳ－１４５０－９９５（ケイエルブイ株式会社）、ＥＯＬＳ－１４５０－１９９（ケイエルブイ株式会社）、ＥＯＬＳ－１４５０－８４３（ケイエルブイ株式会社）、ＥＯＬＣ－１４５０－１７－１（ケイエルブイ株式会社）、Ｌ１３８９５－０１４５Ｐ（浜松ホトニクス株式会社）、Ｌ１３８９５－０１４５Ｇ（浜松ホトニクス株式会社）、Ｌ１０６６０（浜松ホトニクス株式会社）、Ｌ１０６６０－０１（浜松ホトニクス株式会社）、ＯＩＳ－１５０－１４５０ｐ－Ｘ－Ｔ（ＯＳＡ　Ｏｐｔｏ）、ＫＥＤＥ１４５２Ｈ（京都セミコンダクター）、ＫＥＤＥ１４５４Ｈ、（京都セミコンダクター）、ＫＥＤＥ１４５８Ｋ（京都セミコンダクター）、ＦＰＬ１９４０Ｓ（ＴＨＯＲＬＡＢＳ）、ＦＰＬ２０００Ｓ（ＴＨＯＲＬＡＢＳ）、ＦＰＬ２０００Ｃ（ＴＨＯＲＬＡＢＳ）、Ｌ１３７７１－０３３０Ｃ（浜松ホトニクス株式会社）、Ｌ１３７７１－０３３０Ｍ（浜松ホトニクス株式会社）を挙げることができる。
　赤外線検出素子３１は、動作原理によって波長依存性のない熱型の検出素子と波長依存性のある量子型の検出素子に大別される。
　熱型検出素子は、放射エネルギーが入射することにより受光面の温度変化を電気信号に変換する素子である。熱型検出素子として、熱電対を直列に接続して熱起電力を高めた熱起電力形検出素子であるサーモパイル、熱による抵抗変化を利用した熱伝導形検出素子であるサーミスタボロメータ、強誘電体で、強誘電体で温度が上がると自発分極して電荷を生じる焦電効果を利用した素子である焦電素子が挙げられる。
　量子型検出素子は、入射した光子（ｐｈｏｔｏｎ）が電子と直接相互作用して、光子数に比例した電気信号が得られる素子である。量子型検出素子として、光電子放出（光電子増倍管、イメージコンバータ）、光起電力素子（フォトダイオード）、光導電素子（光伝導型検出器、光導電型検出器）、光電気磁気効果（ＰＥＭ型検出器： ｐｈｏｔｏ　ｅｌｅｃｔｒｏ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ）などが利用される。なお、量子型検出素子の一例として、京都セミコンダクター社製ＫＰＤＥ０８６Ｓ－Ｈ８が挙げられる。
　ここで、核酸増幅装置１の検出部５の赤外線検出素子３１として用いる場合、熱型検出素子に比して、量子型検出素子の方が好ましい場合がある。具体的には、量子型検出素子には、応答速度が速いというメリットがあるためである。
　制御部１０は、例えば、プロセッサ、メモリ、ストレージ及び通信インタフェースを備え、コンピュータとして構成されていてもよい。プロセッサは、ＣＰＵ（Central Processing Unit）等の演算器である。メモリは、ＲＯＭ（Read Only Memory）又はＲＡＭ（Random Access Memory）等の記憶部である。ストレージは、ＨＤＤ（Hard Disk Drive）等の記憶部（記憶媒体）である。通信インタフェースは、データ通信を実現する通信機器である。プロセッサは、メモリ、ストレージ及び通信インタフェースを制御し、後述する制御部１０としての機能を実現する。制御部１０では、例えば、ＲＯＭに記憶されているプログラムをＲＡＭにロードし、ＲＡＭにロードされたプログラムをＣＰＵで実行することにより各種機能を実現する。制御部１０を構成するコンピュータの数は、単数であってもよいし、複数であってもよい。
　制御部１０は、加熱制御部１１と、信号検出部１２と、送液機構制御部１３と、を備える。加熱制御部１１は、変性温度帯６６Ａ及び伸長・アニーリング温度帯６６Ｂの温度が所望の温度にて一定となるように温度調整部３Ａ，３Ｂを制御する。信号検出部１２は、検出部５からの検出結果、すなわち赤外線検出素子３１で検出された赤外線量に対応する電気信号を受信する。また、信号検出部１２は、受信した電気信号から赤外線量を把握し、当該赤外線量の減少具合に基づいて、検出領域６７（図２，３参照）に試料溶液が存在することを検出する。
　送液機構制御部１３は、微小流路６０内の試料溶液が所望の移動を行うように、送液機構４Ａ，４Ｂを制御する。送液機構制御部１３は、信号検出部１２で検出された赤外線量の変化に基づいて、送液機構４Ａ，４Ｂの駆動を制御することで、微小流路６０内の試料溶液の位置を制御する。例えば、送液機構制御部１３は、検出部５で試料溶液が検出後、一定の待機時間が経過したタイミングで、送液機構４Ａ又は送液機構４Ｂによる空気の供給を停止して、試料溶液をその場で停止させるように位置制御を行ってよい。
　次に、図４及び図５を参照して、本開示の実施形態に係る核酸増幅方法、及び試料溶液位置制御方法の内容について説明する。図４及び図５は、本開示の実施形態に係る核酸増幅方法、及び試料溶液位置制御方法の内容を示すフローチャートである。図４及び図５に示す処理は、制御部１０において所定のタイミングで繰り返し実行される。
　図４に示すように、加熱制御部１１は、変性温度帯６６Ａ、及び伸長・アニーリング温度帯６６Ｂを形成するように温度調整部３Ａ，３Ｂを制御して、温度調整処理を行う（ステップＳ１００：温度調整工程）。次に、検出部５をＯＮとすることで、赤外線光源３０を点灯させ、赤外線検出素子３１にて赤外線量を計測できる状態にする（ステップＳ１１０：検出部調節工程）。次に、送液機構制御部１３は、送液機構４ＡをＯＮにして、試料溶液を変性温度帯６６Ａから伸長・アニーリング温度帯６６Ｂへと微小流路６０内で移動させる送液処理を行う（ステップＳ１２０：送液工程１）。次に、信号検出部１２は、赤外線光源３０が微小流路６０に対して赤外線を照射し、赤外線検出素子３１が微小流路６０を透過した赤外線を検出することで、核酸増幅チップ内の試料溶液を検出する検出処理を行う（ステップＳ１３０：赤外線検出工程１）。
　次に、制御部１０は、赤外線量の変化（減少）があったか否かを判定する（ステップＳ１４０）。ステップＳ１４０では、ステップＳ１３０で試料溶液の検出がなされ、且つ、送液機構Ａを停止させるタイミングであると判定された場合（ステップＳ１４０におけるＹＥＳ）、送液機構制御部１３は、ステップＳ１３０での検出結果（検出された赤外線量の変化）に基づいて、送液機構４ＡをＯＦＦとして停止する（ステップＳ１５０：位置制御工程１）。次に、送液機構制御部１３は、試料溶液を伸長・アニーリング温度帯６６Ｂに一定時間保持させる（ステップＳ１６０）。なお、ステップＳ１４０においてＮＯと判定された場合、ステップＳ１３０から再び処理が繰り返される。
　次に、図５に示すように、送液機構制御部１３は、送液機構４ＢをＯＮにして、試料溶液を伸長・アニーリング温度帯６６Ｂから変性温度帯６６Ａへと微小流路６０内で移動させる送液処理を行う（ステップＳ１７０：送液工程２）。次に、信号検出部１２は、赤外線光源３０が微小流路６０に対して赤外線を照射し、赤外線検出素子３１が微小流路６０を透過した赤外線を検出することで、核酸増幅チップ内の試料溶液を検出する検出処理を行う（ステップＳ１８０：赤外線検出工程２）。次に、制御部１０は、赤外線量の変化（減少）があったか否かを判定する（ステップＳ１９０）。
　ステップＳ１９０では、ステップＳ１８０で試料溶液の検出がなされ、且つ、送液機構Ｂを停止させるタイミングであると判定された場合（ステップＳ１９０におけるＹＥＳ）、送液機構制御部１３は、ステップＳ１８０での検出結果（検出された赤外線量の変化）に基づいて、送液機構４ＢをＯＦＦとして停止する（ステップＳ２００：位置制御工程２）。次に、送液機構制御部１３は、試料溶液を変性温度帯６６Ａに一定時間保持させる（ステップＳ２１０）。なお、ステップＳ１９０においてＮＯと判定された場合、ステップＳ１８０から再び処理が繰り返される。
　次に、制御部１０は、設定サイクルを完了したか否か判定する（ステップＳ２２０）。ステップＳ２２０においてＮＯと判定された場合、図４のステップＳ１２０から再び処理が繰り返される。ステップＳ２２０においてＹＥＳと判定された場合、図４及び図５に示す処理を終了させる。図４及び図５に示す処理が終了したら、必要に応じてステップＳ１００から処理を再開する。
　本実施形態に係る核酸増幅装置１を用いてＰＣＲの検査を行う際の運用の一例について例示する。赤外線を用いた核酸増幅装置１によってＰＣＲの検査を行う場合、蛍光検出器を用いた核酸増幅装置では行うことができなかった運用例として、次のようなものが挙げられる。まず、複数の検出器を近接して並べて配置し、微小流路中の試料溶液の長さを正確に計測することができる。また、近接して配置した２つの検出器を用いて、短区間で流速を測定することができ、更にこれを複数用意することで微小流路内での流速変化を計測することができる。この結果を利用して、微小流路中で試料溶液を任意の位置に正確に停止させる制御系を実現できる。
　次に、本実施形態に係る核酸増幅装置１、核酸増幅方法、及び試料溶液位置制御方法の作用・効果について説明する。
　本実施形態に係る核酸増幅装置１では、核酸増幅チップ５０を載置して、温度調整部３Ａ，３Ｂによって温度調整を行うことで、核酸増幅チップ５０に変性温度帯６６Ａ、及び伸長・アニーリング温度帯６６Ｂを形成することができる。従って、制御部１０は、検出部５の検出結果に基づいて送液機構４Ａ，４Ｂを制御することで、核酸増幅チップ５０の微小流路６０内の試料溶液に各温度帯６６Ａ，６６Ｂを往復移動させることにより、サーマルサイクリングを行うことができる。ここで、検出部５は、赤外線を発光する赤外線光源３０、及び赤外線を検出する赤外線検出素子３１を有する。従って、蛍光検出器を用いる場合に比して、検出部５のコストを大幅に低減することができるため、装置全体のコストも大幅に低減できる。従って、各場面において幅広く核酸増幅装置１を利用することが可能となる。
　更に、検出部５が赤外線を用いて検出を行う場合、蛍光検出器を用いたときのように低自家蛍光の材料を選択するような事情がないため、核酸増幅チップ５０の材料の選択の際の制限を低減することができる。例えば、蛍光検出器を用いた場合はチップ部材５１の材料として採用する事が出来なかったが、赤外線を用いることで、ＰＭＭＡ、ＰＰ、その他（赤外線の波長はほとんどの樹脂を透過するため）不透明材料も使用可能となる。このことは可視光線で劣化するような試料溶液にも有用であることを意味する。
　また、赤外線を用いた検出部５は、蛍光検出器のように発光を伴う検出方法ではないため、複数の検出部５を互いの位置関係の制約を受けることなく配置することが可能となる。例えば、図２に示す微小流路６０のうち、検出領域６７に検出部５を配置することに変えて、被加熱部６１Ａ，６１Ｂの出入口６１ａ，６１ａ、又は出入口６１ｂ，６１ｂ付近にそれぞれ追加の検出部５を配置してもよい。あるいは、中間部６２に複数の検出部５を配置してもよい。このように、近くに検出部５を配置しても、蛍光検出器の蛍光とは異なり、一方の検出部５の赤外線が、他方の検出部５の検出精度に悪影響を及ぼすことはない。その他、検出部５を検出領域６７と同時に被加熱部６１Ａ，６１Ｂの出入口６１ａ，６１ａ、又は出入口６１ｂ，６１ｂ付近に配置してもよい。また、例えば，温度調整部３Ａ，３Ｂのヒーターに微小孔を開けることで、ヒーター上（被加熱部６１Ａ、６１Ｂ）にて、検出部５による検出を行ってもよい。
　以上のように各種制約を低減することができるため、核酸増幅装置の利用範囲を拡大することができる。
　本実施形態に係る核酸増幅方法は、試料溶液に変性温度帯６６Ａと伸長・アニーリング温度帯６６Ｂとを往復させるサーマルサイクルを用いる核酸増幅方法であって、変性温度帯６６Ａ、及び伸長・アニーリング温度帯６６Ｂを形成する温度調整工程と、送液停止時に空気吸入部と空気吐出部の気圧が等しくなる送液機構４Ａ，４Ｂによって、変性温度帯６６Ａと伸長・アニーリング温度帯６６Ｂとを往復するように、試料溶液を微小流路６０内で移動させる送液工程と、核酸増幅チップ５０内の試料溶液を検出する検出工程と、検出工程の検出結果に基づいて送液機構を制御する制御工程と、を備え、検出工程では、赤外線光源で微小流路６０へ赤外線を照射し、微小流路６０を透過した赤外線を赤外線検出素子で検出する。
　この核酸増幅方法によれば、上述の核酸増幅装置１と同様な作用・効果を得ることができる。
　本実施形態に係る試料溶液位置制御方法は、送液停止時に空気吸入部と空気吐出部の気圧が等しくなる送液機構４Ａ，４Ｂによって、微小流路６０内で試料溶液を移動させる送液工程と、微小流路６０に対して赤外線を照射し、微小流路６０を透過した赤外線を検出する赤外線検出工程と、赤外線検出工程で検出された赤外線量の変化に基づいて、送液機構４Ａ，４Ｂの駆動を制御することで、微小流路６０内の試料溶液を所定の位置で停止させる位置制御工程と、を備える。
　この試料溶液位置制御方法によれば、微小流路６０内の試料の位置の制御を行う際に、赤外線検出工程で検出された赤外線量の変化に基づいて、送液機構４Ａ，４Ｂの駆動を制御することができる。この場合、検出工程が赤外線を用いて実行されるため、蛍光検出器を用いた場合に比べ、上述の核酸増幅装置１と同様な効果を得ることができる。以上より、試料溶液位置制御方法の利用範囲を拡大することができる。
　本開示は、上述の実施形態に限定されるものではない。
　例えば、図２に示す微小流路の形状や、核酸増幅チップの各構成要素の位置関係などは一例に過ぎず、適宜変更してもよい。
　また、図１に示す核酸増幅装置の構成も一例に過ぎず、各構成要素の位置関係は適宜変更してもよく、一部の構成要素を省略してもよく、他の構成要素を追加してもよい。
　１…核酸増幅装置、３Ａ，３Ｂ…温度調整部、４Ａ，４Ｂ…送液機構、５…検出部、１０…制御部、３０…赤外線光源、３１…赤外線検出素子、５０…核酸増幅チップ、６６Ａ…変性温度帯、６６Ｂ…伸長・アニーリング温度帯。

Claims (3)

  1. 　核酸増幅チップを載置する核酸増幅装置であって、
    　変性温度帯、及び伸長・アニーリング温度帯を形成する温度調整部と、
    　送液停止時に空気吸入部と空気吐出部の気圧が等しくなる送液機構と、
    　前記核酸増幅チップ内の試料溶液を検出するための検出部と、
    　前記検出部の検出結果に基づいて前記送液機構を制御する制御部と、を備え、
    　前記検出部は、赤外線を発光する赤外線光源、及び赤外線を検出する赤外線検出素子を有する、核酸増幅装置。
  2. 　試料溶液に変性温度帯と伸長・アニーリング温度帯とを往復させるサーマルサイクルを用いる核酸増幅方法であって、
    　前記変性温度帯、及び伸長・アニーリング温度帯を形成する温度調整工程と、
    　送液停止時に空気吸入部と空気吐出部の気圧が等しくなる送液機構によって、前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯とを往復するように、前記試料溶液を微小流路内で移動させる送液工程と、
    　核酸増幅チップ内の前記試料溶液を検出する検出工程と、
    　前記検出工程の検出結果に基づいて前記送液機構を制御する制御工程と、を備え、
    　前記検出工程では、赤外線光源で前記微小流路へ赤外線を照射し、前記微小流路を透過した赤外線を赤外線検出素子で検出する、核酸増幅方法。
  3. 　送液停止時に空気吸入部と空気吐出部の気圧が等しくなる送液機構によって、微小流路内で試料溶液を移動させる送液工程と、
    　前記微小流路に対して赤外線を照射し、前記微小流路を透過した赤外線を検出する赤外線検出工程と、
    　前記赤外線検出工程で検出された赤外線量の変化に基づいて、前記送液機構の駆動を制御することで、前記微小流路内の前記試料溶液の位置を制御する位置制御工程と、を備える、試料溶液位置制御方法。
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