WO2018225577A1 - 反応処理装置 - Google Patents

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福澤　隆
尚文 西澤
久雄 永田
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日本板硝子株式会社
株式会社ゴーフォトン
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence

Definitions

  • the present invention relates to a reaction processing apparatus used for polymerase chain reaction (PCR).
  • Genetic testing is widely used for testing in various medical fields, identification of crops and pathogenic microorganisms, food safety assessment, and testing for pathogenic viruses and various infectious diseases.
  • a method of analyzing a DNA obtained by amplifying a part of the DNA is known.
  • PCR is a technique of attention that selectively amplifies a portion of a very small amount of DNA collected from a living body or the like.
  • PCR a predetermined thermal cycle is applied to a sample obtained by mixing a biological sample containing DNA and a PCR reagent composed of primers, enzymes, etc., and a denaturation, annealing, and extension reaction is repeatedly caused to cause a specific portion of DNA to be generated. It selectively amplifies.
  • PCR it is common to perform a predetermined amount of a target sample in a reaction processing container such as a PCR tube or a microplate (microwell) in which a plurality of holes are formed, but in recent years, it has been formed on a substrate.
  • a reaction processing container also called a chip
  • Patent Document 1 Performing using a reaction processing container (also called a chip) having a fine flow path has been put into practical use (for example, Patent Document 1).
  • PCR using a reciprocating flow channel type reaction vessel in order to give a thermal cycle to a sample, a plurality of temperature regions maintained at different temperatures are set on the flow channel, and a plurality of temperature regions are set in the flow channel. Move back and forth.
  • the sample In order to properly apply a thermal cycle to the sample, the sample needs to stop accurately in each temperature region. If the stop position varies, the reaction may not occur, the progress of the reaction may vary at the location of the sample, the reaction such as DNA amplification may become inaccurate, and this may lead to misjudgment of workers and workers. is there.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object of the present invention is to provide a reaction that can give a thermal cycle to a sample by moving the sample in a reciprocating manner in a flow path in which different temperature regions are set.
  • An object of the present invention is to provide a technique capable of accurately stopping a sample at a predetermined position in a temperature region in a processing apparatus.
  • a reaction processing apparatus includes a reaction processing container in which a flow path for moving a sample is formed, a liquid feeding means for moving and stopping the sample in the flow path, Temperature control means for providing a plurality of temperature regions maintained at different temperatures to the path, wherein the plurality of temperature regions include at least a first temperature region and a second temperature region; A detection means for detecting a sample passing through a detection region set between matching temperature regions, wherein the detection region is set at least between the first temperature region and the second temperature region of the flow path And a control means for controlling the liquid feeding means based on a signal detected by the detection means.
  • the control means stops the sample for a certain time in the first temperature region, moves from the first temperature region through the first detection region to the second temperature region, stops for a certain time, and then returns to the first temperature region.
  • a plurality of cycles of reciprocating movement control is performed on the sample, with one cycle from the arrival to the stop.
  • the control unit moves to the liquid feeding unit from the time when the detection unit detects the passage of the sample through the first detection region.
  • the waiting time until the time of instructing the stop of the sample is t 1 ⁇ 2 d (n), the target stop position of the sample in the second temperature region in the nth cycle is X [2] 0 (n), and the nth
  • the passage time of the sample detection region relating to the movement from the first temperature region to the second temperature region of the cycle is t 1 ⁇ 2 p (n)
  • the length of the sample in the flow path is L
  • the target stop position X [2] 0 (n + 1) of the sample in the second temperature region in the n + 1 cycle is based on the result of the sample stop control in the nth cycle, and the sample in the second temperature region in the nth cycle Is corrected from the target stop position X [2] 0 (n).
  • the target stop position X [2] 0 (n + 1) of the sample in the second temperature region in the (n + 1) th cycle is equal to the stop position X [2] 1 (n) of the sample in the second temperature region in the nth cycle.
  • the target stop position X [2] 0 (n) of the sample in the second temperature region in the nth cycle may be corrected.
  • the target stop position X [2] 0 (n + 1) of the sample in the second temperature region in the (n + 1) th cycle is equal to the stop position X [2] 1 (n) of the sample in the second temperature region in the nth cycle. Based on the difference ⁇ X [2] (n) from the design target stop position X [2] 00 in the two temperature region, the target stop position X [2] 0 (n in the second temperature region in the nth cycle) ) May be corrected.
  • the target stop position X [2] 0 (n + 1) of the sample in the second temperature region in the (n + 1) th cycle corrects the target stop position X [2] 0 (n) of the sample in the second temperature region in the nth cycle. May be determined.
  • the correction term k [2] (n) may be determined with reference to a table in which the relationship between the difference ⁇ X [2] (n) in the n-th cycle and the correction term k [2] (n) is described. Good.
  • t 2 ⁇ nt p (n) is the passage time of the detection region that passes immediately after leaving the second temperature region, regarding the movement from the second temperature region to the next temperature region
  • t 2 ⁇ nt mp (n) reaches the detection region where the head of the sample passes immediately after starting the operation of the liquid feeding means for moving the sample with respect to the movement from the second temperature region to the next temperature region This is the time until the control means recognizes that
  • the sample in a reaction processing apparatus capable of applying a thermal cycle to a sample by reciprocatingly moving the sample in flow paths in which different temperature regions are set, the sample is placed at a predetermined position in the temperature region. It is possible to provide technology that can be stopped accurately.
  • FIG. 1A and FIG. 1B are diagrams for explaining a reaction processing container that can be used in a reaction processing apparatus according to an embodiment of the present invention. It is a schematic diagram for demonstrating the reaction processing apparatus which concerns on embodiment of this invention. It is a figure for demonstrating the stop position of a sample. It is a figure which shows the change of a fluorescence signal. It is a figure which shows the experimental result of the movement control of the sample which concerns on the comparative example 1. FIG. It is a figure which shows the experimental result of the movement control of the sample which concerns on the comparative example 2. FIG. It is a figure which shows the experimental result of the movement control of the sample which concerns on the comparative example 3. It is a figure for demonstrating a thermal cycle.
  • reaction processing apparatus is an apparatus for performing PCR. It should be noted that the same or equivalent components, members, and processes shown in the drawings are denoted by the same reference numerals, and repeated descriptions are omitted as appropriate.
  • the embodiments do not limit the invention but are exemplifications, and all features and combinations thereof described in the embodiments are not necessarily essential to the invention.
  • FIG. 1 (a) and 1 (b) are views for explaining a reaction processing vessel 10 that can be used in a reaction processing apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1A is a plan view of the reaction processing container 10
  • FIG. 1B is a front view of the reaction processing container 10.
  • the reaction processing container 10 includes a substrate 14 and a flow path sealing film 16.
  • the substrate 14 is preferably formed of a material that is stable against temperature changes and hardly corroded by the sample solution used. Furthermore, the substrate 14 is preferably formed of a material having good moldability, good transparency and barrier properties, and low autofluorescence. As such a material, not only inorganic materials such as glass and silicon (Si) but also resins such as acrylic, polyester, and silicone, among which cycloolefin is preferable.
  • An example of the dimensions of the substrate 14 is a long side of 75 mm, a short side of 25 mm, and a thickness of 4 mm.
  • a groove-like flow path 12 is formed on the lower surface 14 a of the substrate 14, and the flow path 12 is sealed with a flow path sealing film 16.
  • An example of the dimensions of the flow path 12 formed on the lower surface 14a of the substrate 14 is a width of 0.7 mm and a depth of 0.7 mm.
  • a first communication port 17 communicating with the outside is formed at one end of the flow path 12 in the substrate 14.
  • a second communication port 18 is formed at the other end of the flow path 12 in the substrate 14.
  • a pair of first communication port 17 and second communication port 18 formed at both ends of the flow path 12 are formed so as to be exposed on the upper surface 14 b of the substrate 14.
  • Such a substrate can be manufactured by injection molding or cutting by an NC processing machine.
  • a flow path sealing film 16 is stuck on the lower surface 14 a of the substrate 14.
  • most of the flow path 12 is formed in a groove shape exposed on the lower surface 14 a of the substrate 14. This is to facilitate molding by injection molding using a mold or the like.
  • a flow path sealing film 16 is pasted on the lower surface 14a of the substrate 14.
  • One main surface of the flow path sealing film 16 may have adhesiveness or adhesiveness, and the functional layer that exhibits adhesiveness or adhesiveness by pressing, energy irradiation such as ultraviolet rays, heating or the like is provided on one side. It may be formed on the main surface and has a function that can be easily brought into close contact with the lower surface 14a of the substrate 14 and integrated.
  • the channel sealing film 16 is preferably formed of a material having low autofluorescence including an adhesive.
  • a transparent film made of a resin such as cycloolefin, polyester, polypropylene, polyethylene, or acrylic is suitable, but not limited thereto.
  • the flow path sealing film 16 may be formed from plate-shaped glass or resin. In this case, since a rigid property can be expected, it is useful for preventing warping and deformation of the reaction processing vessel 10.
  • the flow path 12 includes a reaction region in which a plurality of levels of temperature can be controlled by a reaction processing apparatus described later.
  • a thermal cycle can be given to the sample by moving the sample so as to reciprocate continuously in a reaction region in which a plurality of levels of temperatures are maintained.
  • the reaction region of the flow path 12 includes a connection region that connects the high temperature region and the low temperature region. This connection region may be a straight channel.
  • the effective area of a heater or the like that constitutes a temperature control means described later can be used effectively, and temperature variation within the reaction region
  • the substantial size of the reaction processing container can be reduced and the reaction processing apparatus can be reduced.
  • the sample to be subjected to the thermal cycle is introduced into the flow path 12 from either the first communication port 17 or the second communication port 18.
  • the introduction method is not limited to these, but an appropriate amount of sample may be directly introduced from the communication port using, for example, a pipette, a dropper, or a syringe. Alternatively, it may be an introduction method while preventing contamination through a cone-shaped needle tip in which a filter made of porous PTFE or polyethylene is incorporated. In general, many types of such needle tips are sold and easily available, and can be used by being attached to the tip of a pipette, dropper, syringe or the like. Further, the sample may be moved to a predetermined location in the flow path by discharging and introducing the sample with a pipette, a dropper, a syringe, or the like, and further pushing and pushing.
  • a mixture containing one or two or more kinds of DNA to which a fluorescent probe, a heat-resistant enzyme, and four kinds of deoxyribonucleoside triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) are added as PCR reagents Can be given. Further, a primer that specifically reacts with the DNA to be treated is mixed. Commercially available reagent kits for real-time PCR can also be used.
  • FIG. 2 is a schematic diagram for explaining the reaction processing apparatus 30 according to the embodiment of the present invention.
  • the reaction processing apparatus 30 includes a reaction processing container mounting unit (not shown) on which the reaction processing container 10 is mounted, a temperature control system 32, and a CPU.
  • the temperature control system 32 has a region on the right side of the paper surface in the flow path 12 of the reaction processing container 10 of about 95 ° C. (with respect to the reaction processing container 10 mounted on the reaction processing container mounting portion).
  • the high temperature region) and the region on the left side of the paper can be accurately maintained and controlled at about 55 ° C. (low temperature region).
  • the temperature control system 32 maintains the temperature of each temperature region of the reaction region, and specifically, a high-temperature heater 60 for heating the high-temperature region of the flow path 12 and a low-temperature region of the flow path 12.
  • a low-temperature heater 62 for heating the heater
  • a temperature sensor such as a thermocouple for measuring the actual temperature in each temperature region
  • a high-temperature heater driver 33 for controlling the temperature of the high-temperature heater 60
  • a low-temperature heater driver 35 that controls the temperature of the low-temperature heater 62.
  • the actual temperature information measured by the temperature sensor is sent to the CPU 36. Based on the actual temperature information of each temperature region, the CPU 36 controls each heater driver so that the temperature of each heater becomes a predetermined temperature.
  • Each heater may be, for example, a resistance heating element or a Peltier element.
  • the temperature control system 32 may further include other component parts for improving the temperature controllability of each temperature region.
  • the reaction processing apparatus 30 further includes a liquid feeding system 37 for moving the sample 20 introduced into the flow path 12 of the reaction processing container 10 in the flow path 12.
  • the liquid feeding system 37 includes a first pump 39, a second pump 40, a first pump driver 41 for driving the first pump 39, a second pump driver 42 for driving the second pump 40, A first tube 43 and a second tube 44 are provided.
  • One end of the first tube 43 is connected to the first communication port 17 of the reaction processing container 10. It is preferable that a packing 45 or a seal for ensuring airtightness is disposed at a connection portion between the first communication port 17 and one end of the first tube 43. The other end of the first tube 43 is connected to the output of the first pump 39. Similarly, one end of the second tube 44 is connected to the second communication port 18 of the reaction processing container 10. It is preferable that a packing 46 and a seal for ensuring airtightness are disposed at a connection portion between one end of the second communication port 18 and the second tube 44. The other end of the second tube 44 is connected to the output of the second pump 40.
  • the first pump 39 and the second pump 40 may be micro-blower pumps made of, for example, a diaphragm pump.
  • a micro blower pump model MZB1001T02 manufactured by Murata Manufacturing Co., Ltd. can be used. This micro blower pump can increase the pressure on the secondary side from the primary side during operation, but the pressure on the primary side and the secondary side are equal at the moment of stopping or at the time of stopping.
  • the CPU 36 controls the blowing and pressurization from the first pump 39 and the second pump 40 via the first pump driver 41 and the second pump driver 42.
  • the blowing and pressurization from the first pump 39 and the second pump 40 act on the sample 20 in the flow path through the first communication port 17 and the second communication port 18 to move the sample 20 as a driving force. More specifically, by alternately operating the first pump 39 and the second pump 40, the pressure applied to one of the end surfaces of the sample 20 becomes larger than the pressure applied to the other end. Power is obtained.
  • the sample 20 can be reciprocated in the flow path to pass through each temperature region of the flow path 12 of the reaction processing vessel 10, As a result, the sample 20 can be given a thermal cycle.
  • the target DNA in the sample 20 is selectively amplified by repeatedly applying each step of denaturation in the high temperature region and annealing / extension in the low temperature region.
  • the high temperature region can be regarded as a denaturing temperature region
  • the low temperature region can be regarded as an annealing / elongation temperature region.
  • the time during which the sample 20 stays in each temperature region can be appropriately set by changing the time during which the sample 20 stops at a predetermined position in each temperature region.
  • the reaction processing apparatus 30 further includes a fluorescence detector 50. As described above, a predetermined fluorescent probe is added to the sample 20. As the amplification of DNA progresses, the intensity of the fluorescent signal emitted from the sample 20 increases, so that the intensity value of the fluorescent signal can be used as an index as a determination material for the progress of PCR and the end of the reaction.
  • the fluorescence detector 50 an optical fiber type fluorescence detection manufactured by Nippon Sheet Glass Co., Ltd., which can measure rapidly with a very compact optical system and can detect fluorescence regardless of whether it is a bright place or a dark place.
  • the instrument FLE-510 can be used.
  • the wavelength characteristics of the excitation light / fluorescence can be tuned so as to be suitable for the fluorescence characteristics emitted by the sample 20, and an optimum optical / detection system for a sample having various characteristics can be obtained.
  • the small diameter of the light beam provided by the optical fiber type fluorescence detector is suitable for detecting fluorescence from a sample existing in a small or narrow area such as a flow path.
  • the optical fiber type fluorescence detector 50 includes an optical head 51, a fluorescence detector driver 52, and an optical fiber 53 that connects the optical head 51 and the fluorescence detector driver 52.
  • the fluorescence detector driver 52 includes an excitation light source (LED, laser or other light source adjusted to emit a specific wavelength), an optical fiber type multiplexer / demultiplexer, and a photoelectric conversion element (PD, APD, photomultiplier, etc.). Photo detector) (none of which are shown) and the like, and includes a driver for controlling them.
  • the optical head 51 includes an optical system such as a lens, and has a function of directing the excitation light to the sample and condensing fluorescence emitted from the sample. The condensed fluorescence is separated from the excitation light by the optical fiber type multiplexer / demultiplexer in the fluorescence detector driver 52 through the optical fiber 53 and converted into an electric signal by the photoelectric conversion element.
  • fluorescence is detected from the sample 20 that passes through a partial region 65 (referred to as “fluorescence detection region 65”) in the connection region that connects the high temperature region and the low temperature region.
  • the optical head 51 is arranged so that it is possible. Since the sample 20 is repeatedly reciprocated in the flow path, the reaction proceeds and a predetermined DNA contained in the sample 20 is amplified. Therefore, by monitoring the variation in the amount of detected fluorescence, the progress of DNA amplification Can be known in real time. Further, in the reaction processing apparatus 30 according to the present embodiment, the output value from the fluorescence detector 50 is used for movement control of the sample 20 as described later.
  • the fluorescence detector is not limited to the optical fiber fluorescence detector as long as it exhibits a function of detecting fluorescence from the sample.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the stop position of the sample.
  • different temperatures are provided on the flow path 12 in order to give the sample 20 a thermal cycle by reciprocating the sample 20 in the flow path 12.
  • a plurality of temperature regions that is, a high-temperature region and a low-temperature region maintained in the above are set.
  • the sample 20 needs to stop accurately in each temperature region. If the stop position varies, the reaction may not occur, the reaction may vary at the location of the sample, or the reaction such as DNA amplification may become inaccurate, which may lead to an error in judgment of workers and business workers.
  • the optical head 51 of the fluorescence detector 50 is provided so as to detect fluorescence from the sample 20 passing through the fluorescence detection region 65 of the flow path 12.
  • the fluorescence detector 50 detects a fluorescence signal from the sample 20 in the fluorescence detection region 65 and transmits the signal to the CPU 36 every 0.01 seconds.
  • the CPU 36 receives the fluorescent signal and performs arithmetic processing such as averaging such as smoothing and moving average of the fluorescent signal value, comparison with a predetermined threshold value (hereinafter sometimes referred to as “evaluation etc.” collectively). And a stop or activation signal is given to the liquid delivery system 37 based on the result.
  • the fluorescence detection region 65 is arranged near the middle between the high temperature region and the low temperature region, but the present invention is not limited to this.
  • the arrangement may be biased toward the high temperature region side or the low temperature region side. Since the low temperature heater 62 disposed in the low temperature region may have a lower output than the high temperature heater 60 disposed in the high temperature region, it is possible to use a smaller or thinner heater component. In that case, the optical head It is also possible to place 51 in a biased position near the low temperature region.
  • FIG. 3 shows a state in which the sample 20 is at the position X.
  • the position X of the sample 20 is the distance between the interface belonging to the end of the sample 20 closest to the fluorescence detection region 65 and the center of the fluorescence detection region 65.
  • the position of the sample 20 is expressed by a distance X from the center of the fluorescence detection region 65, and may be simply expressed as “position X”. Further, the sample is in either the high temperature region or the low temperature region. Even so, it is assumed that the value of X is a scalar distance from the center of the fluorescence detection region 65.
  • Target stop position X the range and position of the temperature regions of the apparatus, determined from the configuration of the reaction process chamber 10.
  • the target stop position on the high temperature region side and the target stop position on the low temperature region side are different.
  • the target stop position is simply referred to as X 0, but that may not be the same from the target stop position of the target stop position and the low-temperature region side of the high-temperature region side, as described above Please note that.
  • a flow for stopping the sample 20 is shown below.
  • the sample 20 passes through the fluorescence detection region 65 (the fluorescence detector 50 transmits a fluorescence signal to the CPU 36).
  • the CPU 36 detects that the sample 20 has passed based on the fluorescence signal from the fluorescence detector 50 (3)
  • the CPU 36 transmits a stop signal for the first pump 39 to the first pump driver 41, or A stop signal for the second pump 40 is transmitted to the second pump driver 42 (4) the first pump 39 or the second pump 40 is stopped (5) the sample 20 is stopped
  • the optical head 51 of the fluorescence detector 50 is disposed near the middle between the high temperature region and the low temperature region, and detects the passage of the sample. Therefore, in order to stop the sample 20 at the target stop position X 0 it is necessary to determine the drive of the pump sample 20 at a degree of time after passing through the fluorescence detection area 65 it is sufficient to stop There is.
  • Td The time from the time when the fluorescence detector 50 detects the passage of the sample 20 through the fluorescence detection region 65 to the time when the CPU 36 instructs the pump to stop the sample 20 via the pump driver (hereinafter referred to as “standby time”). ) Td can be expressed as in the following equation (1).
  • t d X 0 / v ⁇ t c (1)
  • X 0 is a target stop position
  • v is a moving speed when the sample 20 passes through the fluorescence detection region 65
  • t c is a fixed delay time unique to the apparatus.
  • the delay time t c will be described.
  • the passage of the sample 20 is not recognized by the CPU 36 at the same time as it is detected by the fluorescence detector 50.
  • the detected fluorescence signal from the sample 20 is compared with an averaging process or a threshold value (a reference value of the fluorescence signal intensity determined in advance to determine that the sample 20 is present in the fluorescence detection region 65). Etc. are required. Therefore, a predetermined delay time t c occurs until the CPU 36 recognizes it after the sample 20 actually passes through the fluorescence detection region 65.
  • FIG. 4 shows an example of a change in the fluorescence signal detected by the fluorescence detector 50 and obtained as a result of calculation such as moving average processing by the CPU 36.
  • the horizontal axis indicates the time before the sample 20 enters the fluorescence detection region 65 and when the fluorescence signal starts to be detected, and the vertical axis is output from the fluorescence detector driver 52. It represents the intensity of the fluorescent signal. As shown in FIG. 4,
  • the relationship between the time and the detected fluorescence signal is that the sample 20 enters the fluorescence detection region 65 and the fluorescence signal is zero or As the sample 20 increases from the baseline and the sample 20 exits the fluorescence detection region 65, the fluorescence signal decreases to zero or the baseline again.
  • the transit time t p of the fluorescence detection area 65 of the sample 20 Since the transit time t p is the difference in time is not affected by the delay time of the apparatus. For example, 50% of the difference between the baseline and the peak value is set as a threshold value, and a point A in FIG. 4 corresponding to the earliest time among intersection points of a straight line representing a threshold value parallel to the horizontal axis and the fluorescence signal curve is set.
  • the time corresponding to point A and point B is the time corresponding to point B corresponding to the latest time, the time corresponding to point B corresponding to the latest time as the time of exit of sample 20 (rear end). the difference and the transit time t p of the sample 20.
  • the length L of the sample in the flow path is determined from the volume of the sample 20 introduced into the flow path.
  • the inventor adjusted the volume with a pipette or the like so that the length in the flow path becomes 40 mm in the flow path 12 having a width of 0.7 mm and a depth of 0.7 mm of the reaction processing container 10 shown in FIG. (For example, 100 nM (unit [nM] is nanomolar and nanomole / liter)) of FITC solution (fluorescein isothiocyanate: sample emitting fluorescence) is introduced, and a predetermined target stop position X 0 and movement of the sample 20 are introduced.
  • the delay time t c was experimentally determined based on the velocity v (passing time t p ).
  • the passage time t p of the sample 20 (specifically, 0.5 seconds) substantially constant with a predetermined feedback such that, and to adjust the output of the pump as the thrust of the sample 20.
  • the delay time by a 0.175 seconds t c, of the actual sample 20 and the stop position X 1 and a target stop position X 0 It turns out that the difference can be minimized.
  • SpeedSTAR HS DNA Polymerase is a registered trademark
  • this SpeedSTAR HS DNA Polymerase includes compounds necessary for PCR such as a mixture of deoxyribonucleoside triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) and buffers described above, and these were prepared according to the instructions.
  • dATP, dCTP, dGTP, dTTP deoxyribonucleoside triphosphates
  • dGTP deoxyribonucleoside triphosphates
  • dTTP deoxyribonucleoside triphosphates
  • the present inventor prepared two lots by preparing a sample using the above-mentioned SpeedSTAR HS DNA Polymerase as a reaction solution composition, and conducted an experiment of sample movement control.
  • the experimental results for these two lots are shown in FIGS. 5 and 6 as Comparative Examples 1 and 2, respectively.
  • the horizontal axis represents the cycle number n (n is an integer of 1 or more), and the vertical axis represents the actual stop position X 1 (n) corresponding to the cycle number n.
  • One cycle is a period from when the sample moves from the high temperature region to the low temperature region and then returns from the low temperature region to the high temperature region.
  • the solid line indicates the position X [L] 1 (n) stopped in the low temperature region when moving from the high temperature region to the low temperature region (H ⁇ L), and the broken line indicates the high temperature from the low temperature region.
  • the position X [H] 1 (n) stopped in the high temperature region when moving to the region (L ⁇ H) is shown.
  • the actual stop positions X [L] 1 (n) and X [H] 1 (n) of the sample are actually repeatedly reciprocated, and magnified and observed at a predetermined magnification from directly above to detect the fluorescence detection region 65.
  • the distance from the center of the sample to the end of the sample close to the fluorescence detection region 65 of the sample was measured with a ruler.
  • the actual stop positions X [L] 1 (n) and X [H] 1 (n) of the sample tend to decrease as the number of cycles n increases, and in particular X [L] It appears remarkably at 1 (n) (that is, the sample tends to approach the fluorescence detection region 65 as the number of cycles n increases). Since such a phenomenon did not occur even when a sample based only on the FITC solution was introduced, the present inventor found that such a phenomenon occurred due to the presence of a predetermined amount of a surfactant contained in the DNA polymerase as a result of intensive trial and error. I found out.
  • the DNA polymerases used in Comparative Examples 1 and 2 shown in FIG. 5 and FIG. 6 each include non-ionic surfactants Tween 20 and Nonidet P-40 (nonidet is a registered trademark) of 0.01% by weight. It is added to become.
  • the present inventor has improved the sample movement control method based on the above formula (1) in view of the situation in which such a shift in the stop position of the sample (a decrease in the stop distance) occurs.
  • FIG. 8 is a diagram for explaining the thermal cycle. As shown in FIG. 8, one cycle is a period from when the sample moves from the high temperature region to the low temperature region and stops and then returns from the low temperature region to the high temperature region and stops.
  • the CPU 36 of the reaction processing apparatus 30 is configured to perform a plurality of cycles of reciprocation control on the sample.
  • n is an integer of 1 or more
  • the subscript H ⁇ L represents the movement from the high temperature region to the low temperature region.
  • t H ⁇ L d (n) is a standby time when the sample moves from the high temperature region to the low temperature region in the nth cycle, and from the time when the passage of the sample through the fluorescence detection region 65 is detected by the fluorescence detector 50. The time until the time when the CPU 36 instructs the liquid feeding system 37 to stop the sample.
  • X [L] 0 (n) is the target stop position of the sample in the low temperature region in the nth cycle, and is represented by the distance from the center of the fluorescence detection region 65 to the end of the sample (see FIG. 3).
  • t H ⁇ L p (n) is the passage time of the sample in the fluorescence detection region 65 relating to the movement from the high temperature region to the low temperature region in the n-th cycle (see FIG. 4).
  • v H ⁇ L p (n) is the moving speed of the fluorescence detection region 65 of the sample related to the movement from the high temperature region to the low temperature region in the nth cycle.
  • L is the length of the sample in the flow path.
  • t c is a delay time, and is a specific constant based on the specifications of the reaction processing apparatus 30, the reaction processing container 10, and the like.
  • the delay time t c 0.175 seconds obtained experimentally as described above was employed.
  • the CPU 36 starts from the time when the fluorescence detector 50 detects the passage of the sample through the fluorescence detection region 65 during the movement of the sample from the high temperature region to the low temperature region in the nth cycle. 2) At the time when the standby time t H ⁇ L d (n) defined by the equation has elapsed, the liquid feeding system 37 is instructed to stop the sample.
  • the target stop position X [L] 0 (n + 1) of the sample when moving from the high temperature region to the low temperature region in the (n + 1) th cycle following the nth cycle is Based on the result of the sample stop control in the nth cycle, correction is made from the target stop position X [L] 0 (n) of the sample in the nth cycle.
  • the actual stop position X [L] 1 (n) of the sample changes as the number of cycles increases (mainly the fluorescence detection region 65). Tend to be close).
  • the sample can be stopped at a more accurate position by setting the target stop position X [L] 0 (n + 1) of the next n + 1 cycle based on the result of the stop control of the sample in the nth cycle. It becomes possible.
  • the target stop position X [L] 0 (n + 1) of the (n + 1) th cycle is not only the case where the correction results in a value different from the target stop position X [L] 0 (n) of the nth cycle, Note that it may be the same value as the target stop position X [L] 0 (n) of the cycle.
  • the target stop position X [L] 0 (n + 1) of the sample in the (n + 1) th cycle is equal to the actual stop position X [L] 1 (n) of the sample in the nth cycle and the design target stop position X Based on the difference ⁇ X [L] (n) from [L] 00 , the target stop position X [L] 0 (n) of the sample in the nth cycle is corrected.
  • the design target stop position X [L] 00 is a position where the sample should exist in the low temperature region by design.
  • the design target stop position X [L] 00 is a value determined based on the design and configuration of the reaction processing apparatus 30 and the reaction processing container 10. It goes without saying that the actual stop position X [L] 1 (n) of the sample is preferably closer to the design target stop position X [L] 00 .
  • the target stop position X [L] 0 (n + 1) of the sample in the (n + 1) th cycle is corrected to the target stop position X [L] 0 (n) of the sample in the nth cycle as shown in the following equation (3). It may be set by adding k [L] (n). The initial value of the correction term k [L] (n) may be zero.
  • X [L] 0 (n + 1) X [L] 0 (n) + k [L] (n) (3)
  • the correction term k [L] (n) is the difference ⁇ X [L] (n) between the actual stop position X [L] 1 (n) of the sample and the design target stop position X [L] 00 in the nth cycle. May be determined based on For example, a table in which the relationship between the difference ⁇ X [L] (n) in the n-th cycle and the correction term k [L] (n) is prepared in advance as shown in Table 1 below is referred to. Then, the correction term k [L] (n) may be determined.
  • Table 1 above defines the following.
  • the expression “farther than a certain position X” means “further away from the position X as seen from the fluorescence detection region 65”, and means that the value of X representing the position is larger.
  • the expression “closer to the position X” means “more closer to the position X as viewed from the fluorescence detection region 65”, and means to make the value of X representing the position smaller.
  • the target stop position X [L] 0 (n + 1) in the (n + 1) th cycle is Set to the same as the target stop position X [L] 0 (n) of the nth cycle.
  • the target stop position X [L] 0 (n + 1) in the (n + 1) th cycle is It is set closer to the target stop position X [L] 0 (n) of the nth cycle.
  • the correction term k [L] (n) is determined as +5 mm from the table.
  • the target stop position X [L] 0 (n + 1) of the sample in the (n + 1) th cycle is set to a value obtained by adding +5 mm to the target stop position X [L] 0 (n) of the sample in the nth cycle.
  • the correction term k [L] (n) is determined to be 0 mm from the table.
  • the target stop position X [L] 0 (n + 1) of the sample in the (n + 1) th cycle is set to the same value as the target stop position X [L] 0 (n) of the sample in the nth cycle.
  • the method for setting the target stop position X [L] 0 (n + 1) of the sample in the (n + 1) th cycle is not limited to this method.
  • a correction term by summation Other correction terms and correction coefficients may be considered or combined.
  • the actual stop position X [L] 1 (n) of the sample is used when determining the correction term k [L] (n), but when the reaction processing apparatus 30 is actually used,
  • the problem is how to obtain the actual stop position X [L] 1 (n) of the sample. This is because the reaction processing device 30 is not provided with a sensor for position detection in each temperature region. Therefore, a method for estimating the actual stop position of the sample in each temperature region is shown.
  • t L ⁇ H mp (n) indicates the movement from the low temperature region to the high temperature region of the n-th cycle, after the start of the operation of the liquid feeding system 37 to move the sample, the head of the sample is the fluorescence detection region This is the time until the CPU 36 recognizes that 65 has been reached.
  • FIG. 9 to 11 show the results of verifying the validity of the above equation (4).
  • the horizontal axis represents the number of cycles n
  • the vertical axis represents the actual stop position X [L] 1 (n) (actual measurement of the sample in the low temperature region when moving from the high temperature region to the low temperature region). Value) and the estimated sample stop position X [L] 11 (n) (estimated value).
  • the solid line indicates the actual measurement value X [L] 1 (n)
  • the ⁇ marker indicates the estimated value X [L] 11 (n) estimated based on the equation (4).
  • FIG. 9 shows the experimental results for the sample used in the experiment shown in FIG.
  • FIG. 10 shows the experimental results for the sample used in the experiment shown in FIG.
  • FIG. 11 shows the experimental results for the sample used in the experiment shown in FIG.
  • the reaction processing apparatus relates to the passage time t H ⁇ L p (n) of the sample fluorescence detection region 65 relating to the movement from the high temperature region to the low temperature region of the nth cycle, Based on the (presumed) stop position X [L] 11 (n) and the target stop position X [L] 0 (n) of the sample, the target stop of the sample related to the movement from the high temperature region to the low temperature region in the (n + 1) th cycle.
  • a so-called kind of feedback control is performed in which the movement of the sample is controlled after obtaining the position X [L] 0 (n + 1).
  • the movement of the sample from the high temperature region to the low temperature region has been mainly described. However, the same applies to the movement of the sample from the low temperature region to the high temperature region.
  • the character [L] is changed to [H]
  • H ⁇ L is changed to L ⁇ H
  • L ⁇ H is changed to H ⁇ L.
  • FIG. 12 is a flowchart for explaining a sample movement control method in the reaction processing apparatus according to the embodiment of the present invention.
  • a control method related to the movement of the sample from the high temperature region to the low temperature region will be described, but the same applies to the movement of the sample from the low temperature region to the high temperature region.
  • the CPU 36 sets a design target stop position X [L] 00 , which is a position where the sample should exist in the low temperature region by design (S10).
  • the CPU 36 sets the value of n to 1 and sets the target stop position X [L] 0 (1) of the first cycle to the design target stop position X [L] 00 (S12).
  • the first pump 39 is operated to start moving the sample from the high temperature region to the low temperature region (S14). Passing through the fluorescence detection region 65, the fluorescence signal intensity is measured, t H ⁇ L p (1) is obtained based on the threshold value, and the waiting time t H ⁇ L d (1) of the first cycle is obtained based on the above equation (2). 1) is calculated and determined (S16).
  • the threshold value may be 50% of the intensity difference between the baseline intensity and the peak intensity in the change in the fluorescence signal intensity.
  • the CPU 36 stops the sample in the low temperature region according to the standby time t H ⁇ L d (1) determined in S 16 (S 18). That is, the CPU 36 transmits the sample to the liquid feeding system 37 at the time when the standby time t H ⁇ L d (1) has elapsed from the time when the fluorescence detector 50 detects the passage of the sample through the fluorescence detection region 65. Instruct to stop.
  • the sample After being heated for a predetermined time while stopped in the low temperature region, the sample moves from the low temperature region to the high temperature region (S20).
  • the same control as the movement from the high temperature region to the low temperature region is performed.
  • the sample passes through the fluorescence detection region 65.
  • the CPU 36 obtains t L ⁇ H p (1) and t L ⁇ H mp (1) after the sample has passed through the fluorescence detection region 65, and based on the above equation (4), The estimated stop position X [L] 11 (1) of the sample is obtained, and the actual stop position X [L] 1 (1) is estimated as X [L] 11 (1) (S22).
  • the CPU 36 obtains a difference ⁇ X [L] (1) between the stop position X [L] 1 (1) of the sample in the first cycle and the design target stop position X [L] 00 and shows in Table 1
  • the correction term k [L] (1) is determined with reference to a table in which the relationship between the difference ⁇ X [L] (n) and the correction term k [L] (n) is described (S24).
  • the CPU 36 determines the target stop position X [L] 0 (2) of the second cycle based on the above equation (3) (S26).
  • the CPU 36 determines whether or not the value of n has reached a predetermined number of cycles (S28).
  • the predetermined number of cycles may be determined in advance by the operator, and the number is 30 to 60 cycles.
  • the above is the content of the control method when the sample 20 moves from the high temperature region to the low temperature region and stops at a predetermined position in the low temperature region.
  • the sample is moved from the low temperature region to the high temperature region.
  • the same can be applied to movement, and the parameters and variables in each process and the subscripts [L] of terms are changed to [H], H ⁇ L is changed to L ⁇ H, and L ⁇ H is changed to H ⁇ L. And read it.
  • FIG. 13 shows an estimated stop position and an actual stop position in the low temperature region when the sample moves from the high temperature region to the low temperature region.
  • the horizontal axis indicates the number of cycles
  • the ⁇ marker indicates the actual stop position X [L] 1 (n) measured every 5 cycles
  • the solid line indicates the estimated stop position X [L] 11 (n).
  • X [L] 1 (n) is in the range of 26 mm to 30 mm
  • the sample stop position X [H] 1 (n) in the high temperature region (not shown) is also in the range of 29.5 mm to 33.5 mm. It can be seen that, compared with Comparative Examples 1 to 3 shown in FIGS. 5 to 7, the sample can be accurately stopped at a predetermined position.
  • the pass in one cycle of the sample 20 in the reaction processing apparatus 30 (two-step method) including the reaction region composed of the two-level temperature regions described here is as follows.
  • the fluorescence detection regions (fluorescence detectors) of (b) and (d) are the same.
  • the waiting time for stopping at a predetermined position in the high temperature region (H) is the above (d) immediately before reaching the high temperature region (H).
  • the estimated stop position in the high temperature region (H) is calculated based on the fluorescence signal from the fluorescence detector in (b) immediately after leaving the high temperature region (H). Is calculated.
  • the standby time for stopping at a predetermined position in the low temperature region (L) is calculated based on the fluorescence signal from the fluorescence detector in (b) immediately before reaching the low temperature region (L).
  • the estimated stop position in (L) is calculated based on the fluorescence signal from the fluorescence detector in (d) immediately after leaving the low temperature region (L).
  • the standby time for stopping at a predetermined position in the high temperature region or the low temperature region is calculated based on the fluorescence signal from the fluorescence detector corresponding to the fluorescence detection region that passes immediately before reaching the region.
  • the estimated stop position in the high temperature region or the low temperature region is calculated based on the fluorescence signal from the fluorescence detector corresponding to the fluorescence detection region that passes immediately after leaving the region.
  • the above equation (4) for obtaining the estimated stop position X [L] 11 (n) of the sample in the low temperature region can be rewritten as the following equation (5).
  • X [L] 11 (n) L / t L ⁇ nt p (n) ⁇ ⁇ t L ⁇ nt mp (n) ⁇ t c ⁇ (5) It becomes.
  • t L ⁇ nt p (n) is a fluorescence detection region that passes immediately after starting from the low temperature region regarding the movement from the low temperature region to the next temperature region (high temperature region in the present embodiment). This is the passage time of the fluorescence detection region 65 in this embodiment.
  • t L ⁇ nt mp (n) is an operation of the liquid feeding system 37 for moving the sample with respect to the movement from the low temperature region to the next temperature region (high temperature region). This is the time until the CPU 36 recognizes that it has reached the passing fluorescence detection region (fluorescence detection region 65).
  • the estimated stop position of the sample in the high temperature region may be read by changing the subscript [L] in equation (5) to [H] and changing L ⁇ nt to H ⁇ nt. Equation (5) can be applied not only to the above-described reaction processing apparatus 30 having the two-level temperature region, but also to the reaction processing vessel 110 having the three-level temperature region described later.
  • FIG. 14 is a view for explaining another embodiment of the reaction processing container.
  • the reaction processing container 10 shown in FIG. 1 (a) performs a thermal cycle on a sample by continuously reciprocating a two-level temperature region, for example, a high temperature region of about 95 ° C. and a low temperature region of about 55 ° C., for example. It was to give.
  • the reaction processing vessel 110 shown in FIG. 14 continuously reciprocates in a three-level temperature region, for example, a high temperature region of about 95 ° C., a medium temperature region of about 65 ° C., and a low temperature region of about 55 ° C., for example.
  • the sample is given a thermal cycle. In this case, denaturation of DNA can be performed in a high temperature region, annealing can be performed in a low temperature region, and elongation can be performed in a medium temperature region.
  • the flow path 12 of the reaction processing vessel 110 includes a first connection region located between the high temperature region and the intermediate temperature region, and a second connection region located between the intermediate temperature region and the low temperature region.
  • the first connection region and the second connection region include linear flow paths.
  • a first fluorescence detection region 165 and a second fluorescence detection region 166 are set in the first connection region and the second connection region, respectively.
  • FIG. 15 is a schematic diagram for explaining another embodiment of the reaction processing apparatus.
  • a reaction processing apparatus 130 shown in FIG. 15 is an apparatus for performing a thermal cycle on the reaction processing container 110 having the three-level temperature region shown in FIG.
  • the temperature control system 32 of the reaction processing apparatus 130 includes a high temperature heater 60, a low temperature heater 62, a high temperature heater driver 33, and a low temperature heater driver 35, and a medium temperature heater for heating the intermediate temperature region of the flow path 12. 61 and an intermediate temperature heater driver 34 for controlling the temperature of the intermediate temperature heater 61.
  • the first fluorescence detector 251 of the reaction processing apparatus 130 includes a first optical head 151 for detecting fluorescence from the sample 20 passing through the first fluorescence detection region 165 of the flow path of the reaction processing container 110, and a first fluorescence.
  • a detector driver 152 and a first optical fiber 153 connecting the first optical head 151 and the first fluorescence detector driver 152 are provided, and the second fluorescence detector 252 is a second channel in the reaction processing vessel 110.
  • the second optical head 154 for detecting fluorescence from the sample 20 passing through the fluorescence detection region 166, the second fluorescence detector driver 155, the second optical head 154, and the second fluorescence detector driver 155 are connected.
  • a second optical fiber 156 for detecting fluorescence from the sample 20 passing through the fluorescence detection region 166, the second fluorescence detector driver 155, the second optical head 154, and the second fluorescence detector driver 155 are connected.
  • the sample 20 in the reaction processing apparatus 130 is given a thermal cycle with one cycle of high temperature region ⁇ low temperature region ⁇ medium temperature region ⁇ high temperature region. It should be noted that in the process from the high temperature region to the low temperature region in the reaction processing apparatus 130, the intermediate temperature region on the way passes without being stopped for a predetermined time.
  • Design target stop positions X [H] 00 , X [M] 00 and X [L] 00 in the high temperature region, medium temperature region and low temperature region are determined in advance. Let these be X [H] 0 (1), X [M] 0 (1), and X [L] 0 (1) as initial values.
  • each threshold value required for calculating the standby times t H ⁇ L d (1), t L ⁇ M d (1), and t M ⁇ H d (1) for each temperature region is set. Predetermined. Note that the subscript M indicates an intermediate temperature region.
  • the first pump 39 of the liquid feeding system 37 is operated to move the sample 20 from the high temperature region (H) to the low temperature region (L). Based on the fluorescence signal from the second fluorescence detector 252 when the sample 20 passes through the second fluorescence detection region 166 on the side close to the low temperature region among the two fluorescence detection regions between these regions, Measurement of passage time t H ⁇ L 2p (n) and calculation of waiting time t H ⁇ L 2d (n) from the above equation (2) (subscripts 1 and 2 of symbol t representing time and time are respectively It means that it was obtained based on the passage of the first fluorescence detection region 165 and the second fluorescence detection region 166. The same applies hereinafter). Then, the stop of the first pump 39 is instructed after the waiting time t H ⁇ L 2d (n) from the passing time of the sample 20 through the second fluorescence detection region 166, and the sample 20 is stopped in the low temperature region.
  • t H ⁇ L 1p (n) based on the fluorescence signal from the first fluorescence detector 251.
  • t H ⁇ L 1mp (n) are calculated, and the estimated stop position X [H] 11 (n) of the sample in the high temperature region is obtained from the above equation (4), and the actual stop position X [H ] 1 (n).
  • the standby time for stopping the sample is calculated based on the fluorescence signal from the fluorescence detector related to the fluorescence detection area closest to the arrival area.
  • the stop position in the departure area is estimated based on the fluorescence signal from the fluorescence detector related to the fluorescence detection area closest to the departure area.
  • the second pump 40 of the liquid feeding system 37 is operated to move the sample 20 from the low temperature region (L) to the intermediate temperature region (M).
  • the passage time t L ⁇ M 2p (n) is measured based on the fluorescence signal from the second fluorescence detector 252 and the above equation (2)
  • the standby time t L ⁇ M 2d (n) is calculated.
  • the stop of the second pump 40 is instructed after the waiting time t L ⁇ M 2d (n) from the passage time of the sample 20 through the second fluorescence detection region 166, and the sample 20 is stopped in the intermediate temperature region.
  • the second pump 40 of the liquid feeding system 37 is operated to move the sample 20 from the intermediate temperature region (M) to the high temperature region (H).
  • the passage time t M ⁇ H 1p (n) is measured based on the fluorescence signal from the first fluorescence detector 251 and the above equation (2)
  • the standby time t M ⁇ H 1d (n) is calculated.
  • the stop of the second pump 40 is instructed after the waiting time t M ⁇ H 1d (n) from the passing time of the sample 20 through the first fluorescence detection region 165, and the sample 20 is stopped in the high temperature region.
  • t M ⁇ H 1p (n) is measured and t M ⁇ H 1mp (n) is calculated based on the fluorescence signal, and the estimated stop position X [ M] 11 (n) is obtained and estimated as an actual stop position X [M] 1 (n).
  • the path of the sample 20 in one cycle in the reaction processing apparatus 130 having the reaction region composed of the three-level temperature region described here is as follows.
  • M Medium temperature region
  • M Medium temperature region
  • g First fluorescence detection region (first fluorescence detector) ⁇
  • the standby time for stopping at a predetermined position in the high temperature region (H) is the above (g) immediately before reaching the high temperature region (H).
  • the estimated stop position in the high temperature region (H) is calculated based on the fluorescence signal from the first fluorescence detector in (b) above immediately after leaving the high temperature region (H).
  • the standby time for stopping at a predetermined position in the intermediate temperature region (M) is calculated based on the fluorescence signal from the second fluorescence detector in (e) just before reaching the intermediate temperature region (M).
  • the estimated stop position in the intermediate temperature region (M) is calculated based on the fluorescence signal from the first fluorescence detector in (g) immediately after leaving the intermediate temperature region (M).
  • the standby time for stopping at a predetermined position in the low temperature region (L) is calculated based on the fluorescence signal from the second fluorescence detector in (c) just before reaching the low temperature region (L). . Further, the estimated stop position in the low temperature region (L) is calculated based on the fluorescence signal from the second fluorescence detector in (e) immediately after leaving the low temperature region (L).
  • the waiting time for stopping at a predetermined position in the high temperature, medium temperature or low temperature region is based on the fluorescence signal from the fluorescence detector corresponding to the fluorescence detection region that passes immediately before reaching each region. Calculated.
  • the estimated stop position in each area is calculated based on the fluorescence signal from the fluorescence detector corresponding to the fluorescence detection area that passes immediately after leaving the area. Therefore, the above equation (5) can also be applied to the reaction processing vessel 110 having a three-level temperature region. That is, the estimated stop position of the sample in the high temperature region may be read by changing the subscript [L] in equation (5) to [H] and L ⁇ nt to H ⁇ nt. In addition, the estimated stop position of the sample in the intermediate temperature region may be read by changing the subscript [L] in equation (5) to [M] and changing L ⁇ nt from M to nt.
  • reaction processing apparatus 130 three-step system having a reaction region composed of three levels of temperature regions
  • the fluorescence signal and the position of the sample This is the same as the reaction processing apparatus 30 including the reaction region composed of the two-level temperature region described above.
  • the present invention can be used for polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction

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Abstract

反応処理装置３０は、流路１２が形成された反応処理容器１０と、送液システム３７と、流路１２に高温領域と低温領域を提供する温度制御システム３２と、流路１２の蛍光検出領域を通過する試料２０を検出する蛍光検出器５０と、検出された信号に基づいて送液システム３７を制御するＣＰＵ３６とを備える。第ｎ＋１サイクルにおける低温領域での試料の目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ＋１）は、第ｎサイクルにおける試料２０の停止制御の結果に基づいて、第ｎサイクルにおける低温領域での試料の目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ）から補正される。

Description

反応処理装置
　本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Polymerase Chain Reaction）に使用される反応処理装置に関する。
　遺伝子検査は、各種医学分野における検査、農作物や病原性微生物の同定、食品の安全性評価、さらには病原性ウィルスや各種感染症の検査にも広く活用されている。遺伝子の担体である微小量のＤＮＡを高感度に検出するために、ＤＮＡの一部を増幅して得られたものを分析する方法が知られている。中でもＰＣＲは、生体等から採取されたごく微量のＤＮＡのある部分を選択的に増幅する注目の技術である。
　ＰＣＲは、ＤＮＡを含む生体サンプルと、プライマーや酵素などからなるＰＣＲ試薬とを混合した試料に、所定のサーマルサイクルを与え、変性、アニーリングおよび伸長反応を繰り返し起こさせて、ＤＮＡの特定の部分を選択的に増幅させるものである。
　ＰＣＲにおいては、対象の試料をＰＣＲチューブ又は複数の穴が形成されたマイクロプレート（マイクロウェル）などの反応処理容器に所定量入れて行うことが一般的であるが、近年、基板に形成された微細な流路を備える反応処理容器（チップとも呼ばれる）を用いて行うことが実用化されてきている（例えば特許文献１）。
特開２００９－２３２７００号公報
　往復式流路タイプの反応容器によるＰＣＲでは、試料にサーマルサイクルを与えるために、流路上にそれぞれ異なる温度に維持された複数の温度領域が設定され、その流路中で複数の温度領域間を往復式に移動させる。試料に適切にサーマルサイクルを与えるためには、試料がそれぞれの温度領域に正確に停止する必要がある。停止位置がばらつくと、反応が起こらなかったり、反応の進度が試料の場所でばらついたり、ＤＮＡの増幅等の反応が不正確になり、ひいては作業者や業務従事者の判断ミスを招来するおそれがある。
　本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、異なる温度領域が設定されている流路内で試料を往復式に移動させることにより、試料にサーマルサイクルを与えることができる反応処理装置において、試料を温度領域の所定の位置に正確に停止させることのできる技術を提供することにある。
　上記課題を解決するために、本発明のある態様の反応処理装置は、試料が移動する流路が形成された反応処理容器と、試料を流路内で移動および停止させる送液手段と、流路に、それぞれ異なる温度に維持された複数の温度領域を提供する温度制御手段であって、複数の温度領域が少なくとも第１温度領域および第２温度領域を含む温度制御手段と、流路の隣り合う温度領域の間に設定された検出領域を通過する試料を検出する検出手段であって、検出領域が少なくとも流路の第１温度領域と第２温度領域の間に設定された第１検出領域を含む検出手段と、検出手段によって検出された信号に基づいて、送液手段を制御する制御手段と、を備える。制御手段は、試料が第１温度領域で一定時間停止され、第１温度領域から第１検出領域を通過して第２温度領域に移動して一定時間停止され、その後、第１温度領域に戻ってきて停止するまでを１サイクルとした複数サイクルの往復移動制御を試料に対して行うよう構成される。第ｎサイクル（ｎは１以上の整数）の第１温度領域から第２温度領域への移動に関する、検出手段により試料の第１検出領域の通過が検出された時刻から制御手段が送液手段に試料の停止を指示する時刻までの待機時間をｔ１→２ ｄ（ｎ）とし、第ｎサイクルにおける第２温度領域での試料の目標停止位置をＸ［２］ ０（ｎ）とし、第ｎサイクルの第１温度領域から第２温度領域への移動に関する試料の検出領域の通過時間をｔ１→２ ｐ（ｎ）とし、試料の流路中における長さをＬとし、当該反応処理装置に固有の一定の時間をｔｃとしたときに、待機時間ｔ１→２ ｄ（ｎ）は下記の式：
　ｔ１→２ ｄ（ｎ）＝Ｘ［２］ ０（ｎ）×ｔ１→２ ｐ（ｎ）／Ｌ－ｔｃ
　で規定される。第ｎ＋１サイクルにおける第２温度領域での試料の目標停止位置Ｘ［２］ ０（ｎ＋１）は、第ｎサイクルにおける試料の停止制御の結果に基づいて、第ｎサイクルにおける第２温度領域での試料の目標停止位置Ｘ［２］ ０（ｎ）から補正される。
　第ｎ＋１サイクルにおける第２温度領域での試料の目標停止位置Ｘ［２］ ０（ｎ＋１）は、第ｎサイクルにおける第２温度領域での試料の停止位置Ｘ［２］ １（ｎ）と、第２温度領域での設計目標停止位置Ｘ［２］ ００とに基づいて、第ｎサイクルにおける第２温度領域での試料の目標停止位置Ｘ［２］ ０（ｎ）から補正されてもよい。
　第ｎ＋１サイクルにおける第２温度領域での試料の目標停止位置Ｘ［２］ ０（ｎ＋１）は、第ｎサイクルにおける第２温度領域での試料の停止位置Ｘ［２］ １（ｎ）と、第２温度領域での設計目標停止位置Ｘ［２］ ００との差分ΔＸ［２］（ｎ）に基づいて、第ｎサイクルにおける第２温度領域での試料の目標停止位置Ｘ［２］ ０（ｎ）から補正されてもよい。
　第ｎ＋１サイクルにおける第２温度領域での試料の目標停止位置Ｘ［２］ ０（ｎ＋１）は、第ｎサイクルにおける第２温度領域での試料の目標停止位置Ｘ［２］ ０（ｎ）を補正して決定されてもよい。
　第ｎ＋１サイクルにおける第２温度領域での試料の目標停止位置Ｘ［２］ ０（ｎ＋１）は、下記の式：　Ｘ［２］ ０（ｎ＋１）＝Ｘ［２］ ０（ｎ）＋ｋ［２］（ｎ）　で設定され、補正項ｋ［２］（ｎ）は、第ｎサイクルにおける差分ΔＸ［２］（ｎ）に基づいて決定されてもよい。
　補正項ｋ［２］（ｎ）は、第ｎサイクルにおける差分ΔＸ［２］（ｎ）と、補正項ｋ［２］（ｎ）との関係が記載されたテーブルを参照して決定されてもよい。
　第ｎサイクルにおける第２温度領域での試料の停止位置Ｘ［２］ １（ｎ）は下記の式：
　Ｘ［２］ １１（ｎ）＝Ｌ／ｔ２→ｎｔ ｐ（ｎ）×｛ｔ２→ｎｔ ｍｐ（ｎ）－ｔｃ｝
　で決定されるＸ［２］ １１（ｎ）として求めてもよい。
　この式において、ｔ２→ｎｔ ｐ（ｎ）は、第２温度領域から次の温度領域への移動に関する、第２温度領域を出発した直後に通過する検出領域の通過時間であり、ｔ２→ｎｔ ｍｐ（ｎ）は、第２温度領域から次の温度領域への移動に関する、試料を移動させるために送液手段の作動を開始してから、試料の先頭が直後に通過する検出領域に到達したと制御手段が認識するまでの時間である。
　本発明によれば、異なる温度領域が設定されている流路内で試料を往復式に移動させることにより、試料にサーマルサイクルを与えることができる反応処理装置において、試料を温度領域の所定の位置に正確に停止させることのできる技術を提供できる。
図１（ａ）および図１（ｂ）は、本発明の実施形態に係る反応処理装置で使用可能な反応処理容器を説明するための図である。 本発明の実施形態に係る反応処理装置を説明するための模式図である。 試料の停止位置について説明するための図である。 蛍光信号の変化を示す図である。 比較例１に係る試料の移動制御の実験結果を示す図である。 比較例２に係る試料の移動制御の実験結果を示す図である。 比較例３に係る試料の移動制御の実験結果を示す図である。 サーマルサイクルを説明するための図である。 図５に示す実験で使用した試料について、試料の実際の停止位置と本発明に基づき推定された停止位置とを比較した図である。 図６に示す実験で使用した試料について、試料の実際の停止位置と本発明に基づき推定された停止位置とを比較した図である。 図７に示す実験で使用した試料について、試料の実際の停止位置と本発明に基づき推定された停止位置とを比較した図である。 本発明の実施形態に係る反応処理装置における試料の移動制御方法を説明するためのフローチャートを示す図である。 本実施形態に係る試料の移動制御方法を用いた移動制御の実験結果を示す図であり低温領域における試料の実際の停止位置と本発明に基づき推定された停止位置とを比較した図である。 反応処理容器の別の実施形態を説明するための図である。 反応処理装置の別の実施形態を説明するための模式図である。
　以下、本発明の実施形態に係る反応処理装置について説明する。この反応処理装置は、ＰＣＲを行うための装置である。なお、各図面に示される同一または同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。
　図１（ａ）および図１（ｂ）は、本発明の実施形態に係る反応処理装置で使用可能な反応処理容器１０を説明するための図である。図１（ａ）は、反応処理容器１０の平面図であり、図１（ｂ）は、反応処理容器１０の正面図である。
　図１（ａ）および図１（ｂ）に示すように、反応処理容器１０は、基板１４と、流路封止フィルム１６とから成る。
　基板１４は、温度変化に対して安定で、使用される試料溶液に対して侵されにくい材質から形成されることが好ましい。さらに、基板１４は、成形性がよく、透明性やバリア性が良好で、且つ、低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが好ましい。このような材質としては、ガラス、シリコン（Ｓｉ）等の無機材料をはじめ、アクリル、ポリエステル、シリコーンなどの樹脂、中でもシクロオレフィンが好適である。基板１４の寸法の一例は、長辺７５ｍｍ、短辺２５ｍｍ、厚み４ｍｍである。
　基板１４の下面１４ａには溝状の流路１２が形成されており、この流路１２は、流路封止フィルム１６により封止されている。基板１４の下面１４ａに形成される流路１２の寸法の一例は、幅０．７ｍｍ、深さ０．７ｍｍである。基板１４における流路１２の一端の位置には、外部と連通する第１連通口１７が形成されている。基板１４における流路１２の他端の位置には、第２連通口１８が形成されている。流路１２の両端に形成された一対の第１連通口１７および第２連通口１８は、基板１４の上面１４ｂに露出するように形成されている。このような基板は射出成形やＮＣ加工機などによる切削加工によって作製することができる。
　図１（ｂ）に示すように、基板１４の下面１４ａ上には、流路封止フィルム１６が貼られている。実施形態に係る反応処理容器１０において、流路１２の大部分は基板１４の下面１４ａに露出した溝状に形成されている。金型等を用いた射出成形により容易に成形できるようにするためである。この溝を封止して流路として活用するために、基板１４の下面１４ａ上に流路封止フィルム１６が貼られる。
　流路封止フィルム１６は、一方の主面が粘着性や接着性を備えていてもよいし、押圧や紫外線などのエネルギー照射、加熱等により粘着性や接着性を発揮する機能層が一方の主面に形成されていてもよく、容易に基板１４の下面１４ａと密着して一体化できる機能を備える。流路封止フィルム１６は、粘着剤も含めて低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが望ましい。この点でシクロオレフィン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンまたはアクリルなどの樹脂からなる透明フィルムが適しているが、これらに限定されない。また、流路封止フィルム１６は、板状のガラスや樹脂から形成されてもよい。この場合はリジッド性が期待できることから、反応処理容器１０の反りや変形防止に役立つ。
　流路１２は、後述する反応処理装置により複数水準の温度の制御が可能な反応領域を備える。複数水準の温度が維持された反応領域を連続的に往復するように試料を移動させることにより、試料にサーマルサイクルを与えることができる。
　図１（ａ）および図１（ｂ）に示す流路１２の反応領域は、曲線部と直線部とを組み合わせた連続的に折り返す蛇行状の流路を含んでいる。後述の反応処理装置に反応処理容器１０が搭載された際に、流路１２の紙面右側が比較的高温（約９５℃）の反応領域（以下、「高温領域」と称する）となり、流路１２の左側がそれより低温（約５５℃）の領域（以下、「低温領域」と称する）となることが予定されている。また流路１２の反応領域は、高温領域と低温領域の間に両者を接続する接続領域を含む。この接続領域は、直線状の流路であってよい。
　本実施形態のように高温領域および低温領域を蛇行状の流路とした場合、後述の温度制御手段を構成するヒータ等の実効面積を有効に使うことができ、反応領域内での温度のばらつきを低減することが容易であるとともに、反応処理容器の実体的な大きさを小さくでき、反応処理装置を小さくできるという利点がある。
　サーマルサイクルに供される試料は、第１連通口１７および第２連通口１８のいずれか一方から流路１２に導入される。導入の方法はこれらに限られないが、例えばピペットやスポイト、シリンジ等で該連通口から適量の試料を直接導入してもよい。あるいは、多孔質のＰＴＦＥやポリエチレンからなるフィルタが内蔵してあるコーン形状のニードルチップを介してコンタミネーションを防止しながらの導入方法であってもよい。このようなニードルチップは一般的に数多くの種類のものが販売され容易に入手でき、ピペットやスポイト、シリンジ等の先端に取り付けて使用することが可能である。さらにピペットやスポイト、シリンジ等による試料の吐出、導入後、さらに加圧して推すことにより流路の所定の場所まで試料を移動させてもよい。
　試料としては、例えば、一または二以上の種類のＤＮＡを含む混合物に、ＰＣＲ試薬として蛍光プローブ、耐熱性酵素および４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を添加したものがあげられる。さらに反応処理対象のＤＮＡに特異的に反応するプライマーを混合する。市販されているリアルタイムＰＣＲ用試薬キット等も使用することができる。
　図２は、本発明の実施形態に係る反応処理装置３０を説明するための模式図である。
　本実施形態に係る反応処理装置３０は、反応処理容器１０が載置される反応処理容器載置部（図示せず）と、温度制御システム３２と、ＣＰＵ３６とを備える。温度制御システム３２は、図２に示すように、反応処理容器載置部に載置される反応処理容器１０に対して、反応処理容器１０の流路１２における紙面右側の領域を約９５℃（高温領域）、紙面左側の領域を約５５℃（低温領域）に精度よく維持、制御できるように構成されている。
　温度制御システム３２は、反応領域の各温度領域の温度を維持するものであって、具体的には、流路１２の高温領域を加熱するための高温用ヒータ６０と、流路１２の低温領域を加熱するための低温用ヒータ６２と、各温度領域の実温度を計測するための例えば熱電対等の温度センサ（図示せず）と、高温用ヒータ６０の温度を制御する高温用ヒータドライバ３３と、低温用ヒータ６２の温度を制御する低温用ヒータドライバ３５とを備える。温度センサによって計測された実温度情報は、ＣＰＵ３６に送られる。ＣＰＵ３６は、各温度領域の実温度情報に基づいて、各ヒータの温度が所定の温度となるよう各ヒータドライバを制御する。各ヒータは例えば抵抗加熱素子やペルチェ素子等であってよい。温度制御システム３２はさらに、各温度領域の温度制御性を向上させるための他の要素部品を備えてもよい。
　本実施形態に係る反応処理装置３０は、さらに、反応処理容器１０の流路１２内に導入された試料２０を流路１２内で移動させるための送液システム３７を備える。送液システム３７は、第１ポンプ３９と、第２ポンプ４０と、第１ポンプ３９を駆動するための第１ポンプドライバ４１と、第２ポンプ４０を駆動するための第２ポンプドライバ４２と、第１チューブ４３と、第２チューブ４４とを備える。
　反応処理容器１０の第１連通口１７には、第１チューブ４３の一端が接続される。第１連通口１７と第１チューブ４３の一端の接続部には、気密性を確保するためのパッキン４５やシールが配置されることが好ましい。第１チューブ４３の他端は、第１ポンプ３９の出力に接続される。同様に、反応処理容器１０の第２連通口１８には、第２チューブ４４の一端が接続される。第２連通口１８と第２チューブ４４の一端の接続部には、気密性を確保するためのパッキン４６やシールが配置されることが好ましい。第２チューブ４４の他端は、第２ポンプ４０の出力に接続される。
　第１ポンプ３９、第２ポンプ４０は、例えばダイアフラムポンプからなるマイクロブロアポンプであってよい。第１ポンプ３９、第２ポンプ４０としては、例えば株式会社村田製作所製のマイクロブロアポンプ（型式ＭＺＢ１００１Ｔ０２）などを使用することができる。このマイクロブロアポンプは、動作時に一次側より二次側の圧力を高めることができるが、停止した瞬間または停止時には一次側と二次側の圧力が等しくなる。
　ＣＰＵ３６は、第１ポンプドライバ４１、第２ポンプドライバ４２を介して、第１ポンプ３９、第２ポンプ４０からの送風や加圧を制御する。第１ポンプ３９、第２ポンプ４０からの送風や加圧は、第１連通口１７、第２連通口１８を通じて流路内の試料２０に作用し、推進力となって試料２０を移動させる。より詳細には、第１ポンプ３９、第２ポンプ４０を交互に動作させることにより、試料２０のいずれかの端面にかかる圧力が他端にかかる圧力より大きくなるため、試料２０の移動に係る推進力が得られる。第１ポンプ３９、第２ポンプ４０を交互に動作させることによって、試料２０を流路内で往復式に移動させて、反応処理容器１０の流路１２の各温度領域を通過させることができ、その結果、試料２０にサーマルサイクルを与えることが可能となる。より具体的には、高温領域において変性、低温領域においてアニーリング・伸長の各工程を繰り返し与えることにより、試料２０中の目的のＤＮＡを選択的に増幅させる。言い換えれば高温領域は変性温度域、低温領域はアニーリング・伸長温度域とみなすことができる。また各温度領域に滞留する時間は、試料２０が各温度領域の所定の位置で停止する時間を変えることによって適宜設定することができる。
　本実施形態に係る反応処理装置３０は、さらに、蛍光検出器５０を備える。上述したように、試料２０には所定の蛍光プローブが添加されている。ＤＮＡの増幅が進むにつれ試料２０から発せられる蛍光信号の強度が増加するので、その蛍光信号の強度値をＰＣＲの進捗や反応の終端の判定材料としての指標とすることができる。
　蛍光検出器５０としては、非常にコンパクトな光学系で、迅速に測定でき、かつ明るい場所か暗い場所かにもかかわらず、蛍光を検出することができる日本板硝子株式会社製の光ファイバ型蛍光検出器ＦＬＥ－５１０を使用することができる。この光ファイバ型蛍光検出器は、その励起光／蛍光の波長特性を試料２０の発する蛍光特性に適するようにチューニングしておくことができ、様々な特性を有する試料について最適な光学・検出系を提供することが可能であり、さらに光ファイバ型蛍光検出器によってもたらされる光線の径の小ささから、流路などの小さいまたは細い領域に存在する試料からの蛍光を検出するのに適している。
　光ファイバ型の蛍光検出器５０は、光学ヘッド５１と、蛍光検出器ドライバ５２と、光学ヘッド５１と蛍光検出器ドライバ５２とを接続する光ファイバ５３とを備える。蛍光検出器ドライバ５２には励起光用光源（ＬＥＤ、レーザその他特定の波長を出射するように調整された光源）、光ファイバ型合分波器及び光電変換素子（ＰＤ，ＡＰＤ又はフォトマル等の光検出器）（いずれも図示せず）等が含まれており、これらを制御するためのドライバ等からなる。光学ヘッド５１はレンズ等の光学系からなり、励起光の試料への指向性照射と試料から発せられる蛍光の集光の機能を担う。集光された蛍光は光ファイバ５３を通じて蛍光検出器ドライバ５２内の光ファイバ型合分波器により励起光と分けられ、光電変換素子によって電気信号に変換される。
　本実施形態に係る反応処理装置３０においては、高温領域と低温領域とを接続する接続領域内の一部の領域６５（「蛍光検出領域６５」と称する）を通過する試料２０から蛍光を検出することができるように光学ヘッド５１が配置される。試料２０は流路内を繰り返し往復移動させられることで反応が進み、試料２０に含まれる所定のＤＮＡが増幅するので、検出された蛍光の量の変動をモニタリングすることで、ＤＮＡの増幅の進度をリアルタイムで知ることができる。また、本実施形態に係る反応処理装置３０においては、後述するように、蛍光検出器５０からの出力値を利用して、試料２０の移動制御に活用する。蛍光検出器は、試料からの蛍光を検出する機能を発揮するものであれば光ファイバ型蛍光検出器に限定されない。
　図３は、試料の停止位置について説明するための図である。上述したように、本実施形態に係る反応処理装置３０においては、試料２０を流路１２中で往復式に移動させることによって試料２０にサーマルサイクルを与えるために、流路１２上にそれぞれ異なる温度に維持された複数の温度領域（すなわち、高温領域および低温領域）が設定される。試料２０に適切にサーマルサイクルを与えるためには、試料２０がそれぞれの温度領域内に正確に停止する必要がある。停止位置がばらつくと、反応が起こらなかったり、反応が試料の場所でばらついたり、ＤＮＡの増幅等の反応が不正確になり、ひいては作業者、業務従事者の判断ミスを招来するおそれがある。
　上述したように、蛍光検出器５０の光学ヘッド５１は、流路１２の蛍光検出領域６５を通過する試料２０から蛍光を検出するように設けられている。蛍光検出器５０は、蛍光検出領域６５にある試料２０からの蛍光信号を検出し、その信号を０．０１秒毎にＣＰＵ３６に送信する。ＣＰＵ３６は、蛍光信号を受信し、蛍光信号値のスムージングや移動平均のような平均化等の演算処理や予め決められた閾値との比較等（以降まとめて「評価等」という場合もある）を行い、その結果に基づいて送液システム３７に停止または作動信号を与える。
　図３では、蛍光検出領域６５を、高温領域と低温領域との中間付近に配置したがこれに限られるものではない。例えば、高温領域側あるいは低温領域側にその配置が偏っていてもよい。低温領域に配される低温用ヒータ６２は高温領域に配される高温用ヒータ６０よりも出力が低くてよいので、その分小型あるいは薄型のヒータ部品を使用することができ、その場合は光学ヘッド５１を低温領域寄りに偏って配置することもできる。
　図３は、試料２０が位置Ｘにある状態を示す。試料２０の位置Ｘは、蛍光検出領域６５に最も近い試料２０の端部に属する界面と蛍光検出領域６５の中心との距離である。試料２０の位置については、この蛍光検出領域６５の中心からの距離Ｘで表すものとし、単に「位置Ｘ」などと表す場合もあり、さらに試料が高温領域もしくは低温領域のいずれの領域にある場合であっても、Ｘの値は蛍光検出領域６５の中心からのスカラー距離であるものとする。
　ここで、試料２０を目標停止位置Ｘ０に停止させることを考える。この目標停止位置Ｘ０に試料２０があるときに、試料２０が最も適切に所定の温度に加熱、維持される。目標停止位置Ｘ０は、装置の温度領域の範囲や位置、反応処理容器１０の構成から定まる。
　先述のように、蛍光検出領域６５の位置が、高温領域あるいは低温領域のいずれかの側に偏っている場合などは、高温領域側の目標停止位置と低温領域側の目標停止位置とは異なる。以下、一般的に目標停止位置について検討する場合は単にＸ０と記載するが、上記のように高温領域側の目標停止位置と低温領域側の目標停止位置とは同じでなくてもよいということに留意されたい。
　試料２０を停止させる際のフローを以下に示す。
（１）試料２０が蛍光検出領域６５を通過する（蛍光検出器５０は蛍光信号をＣＰＵ３６に送信している）
（２）蛍光検出器５０からの蛍光信号に基づきＣＰＵ３６が試料２０の通過したことを検知する
（３）ＣＰＵ３６が、第１ポンプドライバ４１に対して第１ポンプ３９の停止信号を送信する、または第２ポンプドライバ４２に対して第２ポンプ４０の停止信号を送信する
（４）第１ポンプ３９または第２ポンプ４０が停止する
（５）試料２０が停止する
　本実施形態に係る反応処理容器１０においては、蛍光検出器５０の光学ヘッド５１は、高温領域と低温領域の中間付近に配置されていて、試料の通過を検出する。そのため、試料２０を目標停止位置Ｘ０に停止させるためには、試料２０が蛍光検出領域６５を通過してからどの程度の時間をおいてポンプの駆動を停止させればよいかを決定する必要がある。
　蛍光検出器５０により試料２０の蛍光検出領域６５の通過が検出された時刻から、ＣＰＵ３６がポンプドライバを介してポンプに試料２０の停止を指示する時刻までの時間（以下、「待機時間」と呼ぶ）ｔｄは、以下の（１）式のように表すことができる。
　ｔｄ＝Ｘ０／ｖ－ｔｃ　・・・（１）
　（１）式において、Ｘ０は目標停止位置であり、ｖは試料２０が蛍光検出領域６５を通過するときの移動速度であり、ｔｃは装置固有の一定の遅れ時間である。
　遅れ時間ｔｃについて説明する。試料２０の通過は、蛍光検出器５０によって検出されるのと同時にＣＰＵ３６に認知されるわけではない。検出された試料２０からの蛍光信号は、それらの平均化処理や閾値（試料２０が蛍光検出領域６５に存在すると判断するために予め決めておく蛍光信号強度の基準値）と比較判断する演算処理等を必要とする。従って、実際に試料２０が蛍光検出領域６５を通過してから、ＣＰＵ３６がそれを認識するまで所定の遅れ時間ｔｃが生じる。
　次に、試料の移動速度ｖについて説明する。図４は、蛍光検出器５０で検出され、ＣＰＵ３６による移動平均化処理等の演算の結果得られた蛍光信号の変化の一例を示す。図４において、横軸は試料２０が蛍光検出領域６５に進入する前であって、蛍光信号を検出し始めたときを０とした時刻を示し、縦軸は蛍光検出器ドライバ５２から出力される蛍光信号の強度を表している。図４に示すように、蛍光検出領域６５を試料２０が通過する場合、時間と検出される蛍光信号との関係は、試料２０が蛍光検出領域６５に進入してくるとともに、蛍光信号がゼロ又はベースラインから増加し、試料２０が蛍光検出領域６５から退出するとともに、蛍光信号が再びゼロ又はベースラインに低下する。
　図４に示すグラフから、試料２０の蛍光検出領域６５の通過時間ｔｐを求める。通過時間ｔｐは時刻の差であるので、装置の遅れ時間には影響されない。例えば、ベースラインとピーク値との差の５０％を閾値とし、横軸に平行である閾値を表す直線と蛍光信号曲線との交点のうち、最も早い時刻に対応する図４中の点Ａに相当する時刻を試料２０（の先端部）の進入時刻、最も遅い時刻に対応する点Ｂに相当する時刻を試料２０（の後端部）の退出時刻とし、点Ａと点Ｂに相当する時刻の差を、試料２０の通過時間ｔｐとする。なお、蛍光信号のピーク値とベースラインとの差の何％を閾値とするかは、当業者が適宜自由に設定できる。流路に導入される試料２０のボリュームから、流路中の試料の長さＬが決まる。ＣＰＵ３６は、既知の試料２０の長さＬと、試料２０の通過時間ｔｐとから、ｖ＝Ｌ／ｔｐとして試料２０の移動速度ｖを算出することができる。
　目標停止位置Ｘ０と、試料の移動速度ｖとによって、仮の待機時間ｔｄを設定して（最初は０（秒）でも構わない）、試料２０の往復移動をさせたうえで、実際の試料２０の停止位置Ｘ１と目標停止位置Ｘ０との差を把握し、これをできるだけ最小にする試行錯誤によって、遅れ時間ｔｃを実験的に求めることができる。
　本発明者は、図１に示す反応処理容器１０の幅０．７ｍｍ、深さ０．７ｍｍの流路１２に、流路中の長さが４０ｍｍとなるようにピペット等でボリュームを調節した所定の濃度（例えば１００ｎＭ（単位［ｎＭ］はナノモラーでありナノモル／リットルである））のＦＩＴＣ溶液（fluorescein isothiocyanate：蛍光を発する試料）を導入し、所定の目標停止位置Ｘ０と、試料２０の移動速度ｖ（通過時間ｔｐ）に基づいて実験的に遅れ時間ｔｃを求めた。ここで、試料２０の通過時間ｔｐについては、所定のフィードバックによって略一定（具体的には０．５秒）になるように、試料２０の推力となるポンプの出力を調整するようにした。その結果、実験に使用した反応処理容器１０および反応処理装置３０においては、遅れ時間ｔｃを０．１７５秒とすることによって、実際の試料２０の停止位置Ｘ１と目標停止位置Ｘ０との差を最小にできることがわかった。
　次に本発明者は、ＰＣＲ試薬のＤＮＡポリメラーゼとしてタカラバイオ株式会社製ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳｐｅｅｄＳＴＡＲは登録商標）を反応液組成にしたものを試料とした。なお、このＳｐｅｅｄＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅには、先述のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合物やバッファ等ＰＣＲに必要な化合物が付属しており、それらを説明書通りに調整したものを試料とした。この結果、反応処理装置３０において、上記（１）式に基づいて試料の移動の制御を行うと、試料の実際の停止位置Ｘ１と目標停止位置Ｘ０との差が徐々に大きくなることに気づいた。試料の実際の停止位置Ｘ１と目標停止位置Ｘ０との差が大きくなると、試料の温度制御を精度よく行うことができない可能性がある。
　本発明者は、上記のＳｐｅｅｄＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを反応液組成にした試料を調整して２ロット作製し、試料の移動制御の実験を行った。この２ロットについての実験結果を、比較例１および２としてそれぞれ図５および図６に示す。
　図５および図６において、横軸はサイクル数ｎ（ｎは１以上の整数）を表し、縦軸はサイクル数ｎに対応した実際の停止位置Ｘ１（ｎ）を表す。試料が高温領域から低温領域に移動し、その後低温領域から高温領域に戻ってくるまでが１サイクルである。図５および図６において、実線は、高温領域から低温領域（Ｈ→Ｌ）への移動の際に低温領域で停止した位置Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）を示し、破線は、低温領域から高温領域（Ｌ→Ｈ）への移動の際に高温領域で停止した位置Ｘ［Ｈ］ １（ｎ）を示す。
　試料の実際の停止位置Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）およびＸ［Ｈ］ １（ｎ）は、実際に試料を繰り返し往復移動させ、それを直上から所定の倍率で拡大観察し、蛍光検出領域６５の中心から、試料の蛍光検出領域６５に近い試料の末端までの距離をものさし（ルーラ）で計測した。
　図５および図６から分かるように、試料の実際の停止位置Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）およびＸ［Ｈ］ １（ｎ）は、サイクル数ｎの増加とともに低下傾向にあり特にＸ［Ｌ］ １（ｎ）でそれが顕著に現れる（すなわちサイクル数ｎの増加とともに試料が蛍光検出領域６５に近づく傾向となる）。ＦＩＴＣ溶液のみに基づく試料を導入してもこのような現象は生じなかったため、本発明者は、鋭意試行錯誤の結果、ＤＮＡポリメラーゼに所定量含まれる界面活性剤の存在によりこのような現象が生じることを見出した。図５および図６に示す比較例１および２で使用したＤＮＡポリメラーゼには、いずれも非イオン系界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０とＮｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０（Ｎｏｎｉｄｅｔは登録商標）が各０．０１重量％となるように添加されている。
　実際に、上記のＤＮＡポリメラーゼに含まれる界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０を、その濃度が０．０１重量％となるように濃度１００ｎＭのＦＩＴＣ溶液に添加して試料を作製し、該試料について実験を行ったところ、サイクル数ｎの増加とともに試料の実際の停止位置Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）およびＸ［Ｈ］ １（ｎ）が低下傾向となり、特に高温領域から低温領域に移動（Ｈ→Ｌ）する際の低温領域における停止位置Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）の低下する傾向が顕著であることが分かった。この実験結果を比較例３として図７に示す。
　本発明者は、このような試料の停止位置のずれ（停止距離の低下）が生じる状況を鑑み、上記（１）式に基づく試料の移動制御方法の改善を行った。
　以下、本実施形態に係る移動制御方法について説明する。ここでは、試料が高温領域から低温領域へ移動（Ｈ→Ｌ）する場合について検討するが、低温領域から高温領域へ移動（Ｌ→Ｈ）する場合も同様に考えることができる。
　まず、待機時間を求めるための上記（１）式を、添え字を用いて以下の（２）式のように書き換える。
　ｔＨ→Ｌ ｄ（ｎ）＝Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ）／ｖＨ→Ｌ ｐ（ｎ）－ｔｃ
＝Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ）×ｔＨ→Ｌ ｐ（ｎ）／Ｌ－ｔｃ　・・・（２）
　図８は、サーマルサイクルを説明するための図である。図８に示すように、試料が高温領域から低温領域に移動して停止し、その後低温領域から高温領域に戻ってきて停止するまでを１サイクルとする。反応処理装置３０のＣＰＵ３６は、複数サイクルの往復移動制御を試料に対して行うよう構成される。
　以下、上記の（２）式における各項について詳細に説明する。下記の説明において、ｎは１以上の整数であり、各記号の添え字であるＨ→Ｌは高温領域から低温領域への移動を表す。
　ｔＨ→Ｌ ｄ（ｎ）は、第ｎサイクルにおいて試料が高温領域から低温領域に移動する際の待機時間であり、蛍光検出器５０により試料の蛍光検出領域６５の通過が検出された時刻から、ＣＰＵ３６が送液システム３７に試料の停止を指示する時刻までの時間である。
　Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ）は、第ｎサイクルにおける低温領域での試料の目標停止位置であり、蛍光検出領域６５の中心から試料の端部までの距離で表される（図３参照）。
　ｔＨ→Ｌ ｐ（ｎ）は、第ｎサイクルの高温領域から低温領域への移動に関する、試料の蛍光検出領域６５の通過時間である（図４参照）。ｖＨ→Ｌ ｐ（ｎ）は、第ｎサイクルの高温領域から低温領域への移動に関する、試料の蛍光検出領域６５の移動速度である。
　Ｌは、流路中における試料の長さである。ｔｃは遅れ時間であり、反応処理装置３０や反応処理容器１０等の仕様に基づく固有の定数である。ここでは、上記のように実験的に求めた遅れ時間ｔｃ＝０．１７５秒を採用した。
　反応処理装置３０において、ＣＰＵ３６は、第ｎサイクルの高温領域から低温領域への試料の移動の際に、蛍光検出器５０により試料の蛍光検出領域６５の通過が検出された時刻から、上記の（２）式で規定される待機時間ｔＨ→Ｌ ｄ（ｎ）が経過した時刻に、送液システム３７に対して試料の停止を指示する。
　ここで、本実施形態に係る反応処理装置３０においては、第ｎサイクルの次の第ｎ＋１サイクルにおける高温領域から低温領域への移動の際の試料の目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ＋１）は、第ｎサイクルにおける試料の停止制御の結果に基づいて、第ｎサイクルにおける試料の目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ）から補正される。図５乃至図７で示したように、試料に界面活性剤が含まれる場合、サイクル数の増加とともに試料の実際の停止位置Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）が変化する（主に蛍光検出領域６５に近づく）傾向がある。従って、第ｎサイクルの試料の停止制御の結果に基づいて、次の第ｎ＋１サイクルの目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ＋１）を設定することにより、試料をより正確な位置に停止させることが可能となる。なお、第ｎ＋１サイクルの目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ＋１）は、補正の結果、第ｎサイクルの目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ）と異なる値になる場合だけでなく、第ｎサイクルの目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ）と同じ値になる場合もあることに留意する。
　より具体的には、第ｎ＋１サイクルにおける試料の目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ＋１）は、第ｎサイクルにおける試料の実際の停止位置Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）と、設計目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ００との差分ΔＸ［Ｌ］（ｎ）に基づいて、第ｎサイクルにおける試料の目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ）から補正される。設計目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ００とは、設計上、低温領域において試料が存在すべき位置である。設計目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ００は、反応処理装置３０や反応処理容器１０の設計や構成に基づいて定められる値である。試料の実際の停止位置Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）は設計目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ００に近いほど望ましいことはいうまでもない。
　第ｎ＋１サイクルにおける試料の目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ＋１）は、以下の（３）式に示すように、第ｎサイクルにおける試料の目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ）に補正項ｋ［Ｌ］（ｎ）を加えることにより設定されてもよい。補正項ｋ［Ｌ］（ｎ）の初期値は０であってもよい。
　Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ＋１）＝Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ）＋ｋ［Ｌ］（ｎ）　・・・（３）
　補正項ｋ［Ｌ］（ｎ）は、第ｎサイクルにおける試料の実際の停止位置Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）と、設計目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ００との差分ΔＸ［Ｌ］（ｎ）に基づいて決定されてよい。例えば、下記の表１に示すような第ｎサイクルにおける差分ΔＸ［Ｌ］（ｎ）と、補正項ｋ［Ｌ］（ｎ）との関係が記載されたテーブルを予め用意し、該テーブルを参照して補正項ｋ［Ｌ］（ｎ）が決定されてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　上記表１のテーブルは、以下のことを規定している。なお、以下において「ある位置Ｘより遠く」という表現は、「蛍光検出領域６５からみて位置Ｘよりさらに離れて」という意味であり、位置を表すＸの値をより大きくする意味であり、「ある位置Ｘより近く」という表現は、「蛍光検出領域６５からみて位置Ｘよりさらに近づいて」という意味であり、位置を表すＸの値をより小さくする意味である。
・第ｎサイクルにおける実際の停止位置Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）が設計目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ００よりも近い場合には、第ｎ＋１サイクルの目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ＋１）を第ｎサイクルの目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ）よりも遠くに設定する。
・第ｎサイクルにおける実際の停止位置Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）が設計目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ００とほぼ同じ場合には、第ｎ＋１サイクルの目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ＋１）を第ｎサイクルの目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ）と同じに設定する。
・第ｎサイクルにおける実際の停止位置Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）が設計目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ００よりも遠い場合には、第ｎ＋１サイクルの目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ＋１）を第ｎサイクルの目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ）よりも近くに設定する。
　例えば第ｎサイクルにおける差分ΔＸ［Ｌ］（ｎ）が－７ｍｍの場合、テーブルから補正項ｋ［Ｌ］（ｎ）は＋５ｍｍと決定される。この場合、第ｎ＋１サイクルにおける試料の目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ＋１）は、第ｎサイクルにおける試料の目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ）に＋５ｍｍを加えた値に設定される。また、例えば第ｎサイクルにおける差分ΔＸ［Ｌ］（ｎ）が－２ｍｍの場合、テーブルから補正項ｋ［Ｌ］（ｎ）は０ｍｍと決定される。この場合、第ｎ＋１サイクルにおける試料の目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ＋１）は、第ｎサイクルにおける試料の目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ）と同じ値に設定される。
　上記では、第ｎサイクルにおける試料の目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ）に補正項ｋ［Ｌ］（ｎ）を加えることにより第ｎ＋１サイクルにおける試料の目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ＋１）を求めたが、第ｎ＋１サイクルにおける試料の目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ＋１）の設定方法はこの方法に限定されず、ＰＩＤ制御等の周知の制御方法のほか、和算による補正項以外の補正項や補正係数が考慮され、または組み合わされてもよい。
　上記では、補正項ｋ［Ｌ］（ｎ）を決定する際に、試料の実際の停止位置Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）を用いたが、実際に反応処理装置３０を使用する際には、試料の実際の停止位置Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）をどのように求めるかが課題となる。反応処理装置３０においては、各温度領域には位置検出のためのセンサを配置していないためである。そこで、各温度領域における実際の試料の停止位置を推定する方法を示す。
　第ｎサイクルにおける低温領域での試料の実際の停止位置Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）は、以下の（４）式で推定することができる。推定した試料の停止位置をＸ［Ｌ］ １１（ｎ）とすると、
　Ｘ［Ｌ］ １１（ｎ）＝Ｌ／ｔＬ→Ｈ ｐ（ｎ）×｛ｔＬ→Ｈ ｍｐ（ｎ）－ｔｃ｝　・・・（４）
となる。
（４）式において、ｔＬ→Ｈ ｐ（ｎ）は、第ｎサイクルの低温領域から高温領域への移動に関する試料の蛍光検出領域６５の通過時間である。またｔＬ→Ｈ ｍｐ（ｎ）は、第ｎサイクルの低温領域から高温領域への移動に関する、試料を移動させるために送液システム３７の作動を開始してから、試料の先頭が蛍光検出領域６５に到達したとＣＰＵ３６が認識するまでの時間である。
　図９乃至図１１は、上記の（４）式の妥当性を検証した結果を示す。図９乃至図１１において、横軸は、サイクル数ｎを表し、縦軸は、高温領域から低温領域に移動したときの低温領域における試料の実際の停止位置Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）（実測値）および推定した試料の停止位置Ｘ［Ｌ］ １１（ｎ）（推定値）を表す。図９乃至図１１において、実線は実測値Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）を示し、○マーカーは（４）式に基づいて推定した推定値Ｘ［Ｌ］ １１（ｎ）を示す。図９は、上記の図５に示す実験で使用した試料についての実験結果である。図１０は、上記の図６に示す実験で使用した試料についての実験結果である。図１１は、上記の図７に示す実験で使用した試料についての実験結果である。
　図９乃至図１１から、実測値Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）と推定値Ｘ［Ｌ］ １１（ｎ）はほぼ等しい（その差の絶対値は最大３ｍｍである）と判定できるので、（４）式に基づく停止位置の推定はほぼ確からしく、Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）≒Ｘ［Ｌ］ １１（ｎ）と見なしてよいことが分かる。
　以上説明したように、本実施形態に係る反応処理装置は、第ｎサイクルの高温領域から低温領域への移動に関する、試料の蛍光検出領域６５の通過時間ｔＨ→Ｌ ｐ（ｎ）、試料の（推定される）停止位置Ｘ［Ｌ］ １１（ｎ）、試料の目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ）に基づいて、第ｎ＋１サイクルの高温領域から低温領域への移動に関する試料の目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（ｎ＋１）を求めたうえで、試料の移動制御を行うという、いわゆる一種のフィードバック制御を行うものである。上記では、主に高温領域から低温領域への試料の移動に関して説明したが、低温領域から高温領域への試料の移動に関しても同様に適用することができ、（２）乃至（４）式における添え字［Ｌ］を［Ｈ］、Ｈ→ＬをＬ→Ｈ、Ｌ→ＨをＨ→Ｌに変更して読み替えればよい。
　図１２は、本発明の実施形態に係る反応処理装置における試料の移動制御方法を説明するためのフローチャートである。本フローチャートでは、高温領域から低温領域への試料の移動に関する制御方法について説明するが、低温領域から高温領域への試料の移動に関しても同様である。
　まず、ＣＰＵ３６は、設計上、低温領域において試料が存在すべき位置である設計目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ００を設定する（Ｓ１０）。Ｘ［Ｌ］ ００は蛍光検出領域６５の中心からの距離で表し、例えばＸ［Ｌ］ ００＝３０ｍｍといったように設定される。
　続いて、ＣＰＵ３６は、ｎの値を１に設定し、第１サイクルの目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（１）を設計目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ００に設定する（Ｓ１２）。
　送液システム３７のうち、第１ポンプ３９を作動させて、試料を高温領域から低温領域に移動を開始させる（Ｓ１４）。蛍光検出領域６５を通過し、蛍光信号強度を測定し閾値に基づいてｔＨ→Ｌ ｐ（１）を求め、上記の（２）式に基づいて第１サイクルの待機時間ｔＨ→Ｌ ｄ（１）を算出し決定する（Ｓ１６）。ｔＨ→Ｌ ｐ（１）を測定する際の閾値は、ｎ＝１（第１サイクル）のときは、初期値として経験に基づいて推定し、それに基づいた値を定めてもよい。ｎ＝２（第２サイクル）のときは、ｎ＝１のときの高温領域から低温領域の移動する際において測定された蛍光信号強度と閾値に基づいてｔＨ→Ｌ ｐ（２）を求めてもよい。閾値は先述の通り、蛍光信号強度の変化においてベースラインの強度とピーク強度の強度差の５０％としてもよい。
　閾値については、ｎ＝ｎ’（第ｎ’サイクル（ｎ’は２以上の整数））のときの高温領域から低温領域の移動する際において測定された蛍光信号強度に基づいて、ｎ＝ｎ’＋１（第（ｎ’＋１）サイクル）における高温領域から低温領域の移動する際の閾値、およびｎ＝ｎ’＋１（第（ｎ’＋１）サイクル）における低温領域から高温領域の移動する際の閾値を求めてもよい。
　さらに、ｎ＝ｎ’（第ｎ’サイクル）のときの低温領域から高温領域の移動する際において測定された蛍光信号強度に基づいて、ｎ＝ｎ’＋１（第（ｎ’＋１）サイクル）における高温領域から低温領域の移動する際の閾値、およびｎ＝ｎ’＋１（第（ｎ’＋１）サイクル）における低温領域から高温領域の移動する際の閾値を求めてもよい。
　実際のＤＮＡ等からなる検体を用いたＰＣＲのサーマルサイクルの当初は、検体のＤＮＡ等はまだ十分に増幅はされていない。しかしながら、サーマルサイクルの当初であっても、蛍光プローブを含む試料からは蛍光が発せられ、測定された蛍光信号強度の変化から、ベースラインとピークとを区別することや閾値を求めることは容易であるので、ｔＨ→Ｌ ｐ（ｎ）の測定およびｔＨ→Ｌ ｄ（ｎ）（ｎは２以上の整数）の演算に問題はない。
　その後、ＣＰＵ３６は、Ｓ１６で決定した待機時間ｔＨ→Ｌ ｄ（１）に従って、試料を低温領域で停止する（Ｓ１８）。すなわち、ＣＰＵ３６は、蛍光検出器５０により試料の蛍光検出領域６５の通過が検出された時刻から、待機時間ｔＨ→Ｌ ｄ（１）が経過した時刻に、送液システム３７に対して試料の停止を指示する。
　低温領域で停止した状態で所定時間加熱された後、試料は低温領域から高温領域に移動する（Ｓ２０）。ここでは、高温領域から低温領域への移動と同様の制御が行われる。
　低温領域から高温領域への移動の間に、試料は蛍光検出領域６５を通過する。ＣＰＵ３６は、試料が蛍光検出領域６５を通過後、ｔＬ→Ｈ ｐ（１）およびｔＬ→Ｈ ｍｐ（１）を求め、上記の（４）式に基づいて第１サイクルにおける低温領域での試料の推定停止位置Ｘ［Ｌ］ １１（１）を求め、実際の停止位置Ｘ［Ｌ］ １（１）をＸ［Ｌ］ １１（１）と推定する（Ｓ２２）。
　次に、ＣＰＵ３６は、第１サイクルにおける試料の停止位置Ｘ［Ｌ］ １（１）と、設計目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ００との差分ΔＸ［Ｌ］（１）を求め、表１に示すような差分ΔＸ［Ｌ］（ｎ）と補正項ｋ［Ｌ］（ｎ）との関係が記載されたテーブルを参照して、補正項ｋ［Ｌ］（１）を決定する（Ｓ２４）。
　続いて、ＣＰＵ３６は、上記の（３）式に基づいて、第２サイクルの目標停止位置Ｘ［Ｌ］ ０（２）を決定する（Ｓ２６）。
　その後、ＣＰＵ３６は、ｎの値が所定のサイクル数に到達しているか否か判定する（Ｓ２８）。所定のサイクル数は予め作業者が決めておいてもよく、その数は３０～６０サイクルである。
　ｎの値が所定のサイクル数に到達していない場合（Ｓ２８のＮｏ）、ｎの値を１増やしてｎ＝２とする（Ｓ３０）。その後、Ｓ１４に戻り、Ｓ１６において上記の（２）式に基づいて、第２サイクルの待機時間ｔＨ→Ｌ ｄ（２）が決定される。Ｓ１４～Ｓ２６は、ｎの値が所定のサイクル数に到達するまで実行される。ｎの値が所定のサイクル数に到達した場合（Ｓ２８のＹｅｓ）、制御は終了する。
　以上は、試料２０の高温領域から低温領域に移動し、低温領域の所定の位置に停止するときの制御方法の内容であるが、先にも述べたように低温領域から高温領域への試料の移動に関しても同様に適用することができ、各工程におけるパラメータや各式における変数や項の添え字［Ｌ］を［Ｈ］、Ｈ→ＬをＬ→Ｈ、Ｌ→ＨをＨ→Ｌに変更して読み替えればよい。
　本実施形態に係る試料の移動制御方法を用いて、試料の推定停止位置と実際の停止位置がサイクル数とともにどのように変化したかについて実験を行った。試料は比較例１および比較例２と同じく、ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを調整したものを使用した。
　図１３は、試料が高温領域から低温領域に移動したときの低温領域における推定停止位置と実際の停止位置を示す。横軸はサイクル数であり、○のマーカーは５サイクル毎に測定した実際の停止位置Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）を示し、実線は推定停止位置Ｘ［Ｌ］ １１（ｎ）を示す。図１３に示すように、推定停止位置と実際の停止位置との良好な一致性が得られているとともに、サイクル数が５０に達しても本実施形態に係る制御方法が奏功し、低温領域におけるＸ［Ｌ］ １（ｎ）は、２６ｍｍ～３０ｍｍの範囲内、（図示しないが）高温領域における試料の停止位置Ｘ［Ｈ］ １（ｎ）も、２９．５ｍｍ～３３．５ｍｍの範囲内に収まっており、図５乃至図７に示す比較例１乃至３と比べて、試料を所定の位置により正確に停止させることができていることが分かる。
　一方で、ここで説明した２水準の温度領域からなる反応領域を備える反応処理装置３０（２ステップ方式）における試料２０の１サイクルでのパスは次のようになる。
　（ａ）高温領域（Ｈ）→（ｂ）蛍光検出領域（蛍光検出器）→（ｃ）低温領域（Ｌ）→（ｄ）蛍光検出領域（蛍光検出器）→（ａ）高温領域（Ｈ）→・・・以降繰り返し
　ただし（ｂ）と（ｄ）の蛍光検出領域（蛍光検出器）は同一である。
　このようなパスの各要素と、上述したパラメータとの根拠について表すと、高温領域（Ｈ）の所定の位置に停止するための待機時間は、高温領域（Ｈ）に到達する直前の上記（ｄ）における蛍光検出器からの蛍光信号に基づいて算出され、高温領域（Ｈ）における推定停止位置は、高温領域（Ｈ）を出発した直後の上記（ｂ）における蛍光検出器からの蛍光信号に基づいて算出される。
　また、低温領域（Ｌ）の所定の位置に停止するための待機時間は、低温領域（Ｌ）に到達する直前の上記（ｂ）における蛍光検出器からの蛍光信号に基づいて算出され、低温領域（Ｌ）における推定停止位置は、低温領域（Ｌ）を出発した直後の上記（ｄ）における蛍光検出器からの蛍光信号に基づいて算出される。
　すなわち、高温領域または低温領域において所定の位置に停止するための待機時間は、その領域に到達する直前に通過する蛍光検出領域に対応する蛍光検出器からの蛍光信号に基づいて算出される。
　また、高温領域または低温領域における推定停止位置は、その領域を出発した直後に通過する蛍光検出領域に対応する蛍光検出器からの蛍光信号に基づいて算出される。この考察に基づくと、低温領域での試料の推定停止位置Ｘ［Ｌ］ １１（ｎ）を求める上記の（４）式は、以下の（５）式のように書き換えることができる。
　Ｘ［Ｌ］ １１（ｎ）＝Ｌ／ｔＬ→ｎｔ ｐ（ｎ）×｛ｔＬ→ｎｔ ｍｐ（ｎ）－ｔｃ｝　・・・（５）
となる。
　（５）式において、ｔＬ→ｎｔ ｐ（ｎ）は、低温領域から次の温度領域（本実施形態の場合は高温領域）への移動に関する、低温領域を出発した直後に通過する蛍光検出領域（本実施形態の場合は蛍光検出領域６５）の通過時間である。ｔＬ→ｎｔ ｍｐ（ｎ）は、低温領域から次の温度領域（高温領域）への移動に関する、試料を移動させるために送液システム３７の作動を開始してから、試料の先頭が直後に通過する蛍光検出領域（蛍光検出領域６５）に到達したとＣＰＵ３６が認識するまでの時間である。高温領域での試料の推定停止位置に関しては、（５）式における添え字［Ｌ］を［Ｈ］、Ｌ→ｎｔをＨ→ｎｔに変更して読み替えればよい。（５）式は、上述した２水準の温度領域を備える反応処理装置３０だけでなく、後述する３水準の温度領域を備える反応処理容器１１０にも適用できる。
　図１４は、反応処理容器の別の実施形態を説明するための図である。図１（ａ）に示す反応処理容器１０は、例えば約９５℃の高温領域と、例えば約５５℃の低温領域の２水準の温度領域を連続的に往復移動させることによって、試料にサーマルサイクルを与えるものであった。図１４に示す反応処理容器１１０は、例えば約９５℃の高温領域と、例えば約６５℃の中温領域と、例えば約５５℃の低温領域の３水準の温度領域を連続的に往復移動させることによって、試料にサーマルサイクルを与えるものである。この場合、高温領域ではＤＮＡの変性、低温領域ではアニーリング、中温領域では伸長を行わせることが可能である。
　図１４に示す反応処理容器１１０の流路１２は、高温領域と低温領域の間に中温領域を備える。この中温領域の流路も、高温領域および低温領域と同様に、曲線部と直線部とを組み合わせた連続的に折り返す蛇行状の流路から構成されている。また、反応処理容器１１０の流路１２は、高温領域と中温領域の間に位置する第１接続領域と、中温領域と低温領域の間に位置する第２接続領域とを備える。第１接続領域および第２接続領域は、直線状の流路を含む。第１接続領域、第２接続領域には、それぞれ、第１蛍光検出領域１６５、第２蛍光検出領域１６６が設定される。
　図１５は、反応処理装置の別の実施形態を説明するための模式図である。図１５に示す反応処理装置１３０は、図１４に示す３水準の温度領域を備える反応処理容器１１０に対してサーマルサイクルを行うための装置である。
　反応処理装置１３０の温度制御システム３２は、高温用ヒータ６０、低温用ヒータ６２、高温用ヒータドライバ３３、低温用ヒータドライバ３５に加えて、流路１２の中温領域を加熱するための中温用ヒータ６１と、中温用ヒータ６１の温度を制御する中温用ヒータドライバ３４とをさらに備える。
　反応処理装置１３０の第１蛍光検出器２５１は、反応処理容器１１０の流路の第１蛍光検出領域１６５を通過する試料２０からの蛍光を検出するための第１光学ヘッド１５１と、第１蛍光検出器ドライバ１５２と、第１光学ヘッド１５１と第１蛍光検出器ドライバ１５２とを接続する第１光ファイバ１５３とを備え、第２蛍光検出器２５２は、反応処理容器１１０の流路の第２蛍光検出領域１６６を通過する試料２０からの蛍光を検出するための第２光学ヘッド１５４と、第２蛍光検出器ドライバ１５５と、第２光学ヘッド１５４と第２蛍光検出器ドライバ１５５とを接続する第２光ファイバ１５６とを備える。
　反応処理装置１３０における試料２０には、高温領域→低温領域→中温領域→高温領域を１サイクルとしてサーマルサイクルが与えられる。反応処理装置１３０において高温領域→低温領域の工程では、途中の中温領域では所定時間停止されず通過することに留意する。
　以下、反応処理装置１３０による試料の動作を説明する。
　高温領域、中温領域および低温領域における設計目標停止位置Ｘ［Ｈ］ ００、Ｘ［Ｍ］ ００およびＸ［Ｌ］ ００を予め定める。これらを初期値としてＸ［Ｈ］ ０（１）、Ｘ［Ｍ］ ０（１）およびＸ［Ｌ］ ０（１）とする。また、上述の２ステップ方式と同様に、各温度領域に対する待機時間ｔＨ→Ｌ ｄ（１）、ｔＬ→Ｍ ｄ（１）およびｔＭ→Ｈ ｄ（１）の算出に要する各閾値を予め定める。なお、添え字のＭは中温領域を示すものとする。
　送液システム３７のうち第１ポンプ３９を作動させて、試料２０の高温領域（Ｈ）→低温領域（Ｌ）の移動をさせる。これらの領域間にある２箇所の蛍光検出領域のうち、低温領域に近い側の第２蛍光検出領域１６６を試料２０が通過する際に、第２蛍光検出器２５２からの蛍光信号に基づいて、通過時間ｔＨ→Ｌ ２ｐ（ｎ）の測定および上記の（２）式から待機時間ｔＨ→Ｌ ２ｄ（ｎ）の算出を行う（時間、時刻を表す記号ｔの添え字１および２はそれぞれ第１蛍光検出領域１６５および第２蛍光検出領域１６６の通過に基づいて求められたことを意味する。以下同じ）。そして試料２０の第２蛍光検出領域１６６の通過時刻から待機時間ｔＨ→Ｌ ２ｄ（ｎ）後に第１ポンプ３９の停止を指示し、試料２０を低温領域内で停止させる。
　また、２箇所の蛍光検出領域のうち、高温領域に近い側の第１蛍光検出領域１６５を通過する際に、第１蛍光検出器２５１からの蛍光信号に基づいてｔＨ→Ｌ １ｐ（ｎ）の測定およびｔＨ→Ｌ １ｍｐ（ｎ）の算出を行い、上記の（４）式から高温領域での試料の推定停止位置Ｘ［Ｈ］ １１（ｎ）を求め、実際の停止位置Ｘ［Ｈ］ １（ｎ）と推定をする。なお、移動領域間に２以上の蛍光検出領域が存在する場合は、到達領域に最も近い蛍光検出領域に係る蛍光検出器からの蛍光信号に基づいて試料を停止するための待機時間の算出を行い、出発領域に最も近い蛍光検出領域に係る蛍光検出器からの蛍光信号に基づいて出発領域における停止位置の推定をする。
　試料２０を低温領域で一定時間停止させた後、送液システム３７のうち第２ポンプ４０を作動させて、試料２０の低温領域（Ｌ）→中温領域（Ｍ）の移動をさせる。これらの領域間にある第２蛍光検出領域１６６を通過する際に、第２蛍光検出器２５２からの蛍光信号に基づいて通過時間ｔＬ→Ｍ ２ｐ（ｎ）の測定および上記の（２）式から待機時間ｔＬ→Ｍ ２ｄ（ｎ）の算出を行う。そして試料２０の第２蛍光検出領域１６６の通過時刻から待機時間ｔＬ→Ｍ ２ｄ（ｎ）後に第２ポンプ４０の停止を指示し、試料２０を中温領域内で停止させる。また、同蛍光信号に基づいてｔＬ→Ｍ ２ｐ（ｎ）の測定およびｔＬ→Ｍ ２ｍｐ（ｎ）の算出を行い、上記の（４）式から低温領域での試料２０の推定停止位置Ｘ［Ｌ］ １１（ｎ）を求め、実際の停止位置Ｘ［Ｌ］ １（ｎ）と推定をする。
　試料２０を中温領域で一定時間停止させた後、送液システム３７のうち第２ポンプ４０を作動させて、試料２０の中温領域（Ｍ）→高温領域（Ｈ）の移動をさせる。これらの領域間にある第１蛍光検出領域１６５を通過する際に、第１蛍光検出器２５１からの蛍光信号に基づいて通過時間ｔＭ→Ｈ １ｐ（ｎ）の測定および上記の（２）式から待機時間ｔＭ→Ｈ １ｄ（ｎ）の算出を行う。そして試料２０の第１蛍光検出領域１６５の通過時刻から待機時間ｔＭ→Ｈ １ｄ（ｎ）後に第２ポンプ４０の停止を指示し、試料２０を高温領域内で停止させる。また、同蛍光信号に基づいてｔＭ→Ｈ １ｐ（ｎ）の測定およびｔＭ→Ｈ １ｍｐ（ｎ）の算出を行い、上記の（４）式から中温領域での試料の推定停止位置Ｘ［Ｍ］ １１（ｎ）を求め、実際の停止位置Ｘ［Ｍ］ １（ｎ）と推定をする。
　一方で、ここで説明した３水準の温度領域からなる反応領域を備える反応処理装置１３０（３ステップ方式）における試料２０の１サイクルでのパスは次のようになる。
　（ａ）高温領域（Ｈ）→（ｂ）第１蛍光検出領域（第１蛍光検出器）→（ｃ）第２蛍光検出領域（第２蛍光検出器）→（ｄ）低温領域（Ｌ）→（ｅ）第２蛍光検出領域（第２蛍光検出器）→（ｆ）中温領域（Ｍ）→（ｇ）第１蛍光検出領域（第１蛍光検出器）→（ａ）高温領域（Ｈ）・・・以降繰り返し
　なお、（ｂ）と（ｃ）の間には中温領域（Ｍ）が存在するが、停止されずに通過するのみであるのでパスには含めない。
　このようなパスの各要素と、上述したパラメータとの根拠について表すと、高温領域（Ｈ）の所定の位置に停止するための待機時間は、高温領域（Ｈ）に到達する直前の上記（ｇ）における第１蛍光検出器からの蛍光信号に基づいて算出される。また高温領域（Ｈ）における推定停止位置は、高温領域（Ｈ）を出発した直後の上記（ｂ）における第１蛍光検出器からの蛍光信号に基づいて算出される。
　同様に、中温領域（Ｍ）の所定の位置に停止するための待機時間は、中温領域（Ｍ）に到達する直前の上記（ｅ）における第２蛍光検出器からの蛍光信号に基づいて算出される。また中温領域（Ｍ）における推定停止位置は、中温領域（Ｍ）を出発した直後の上記（ｇ）における第１蛍光検出器からの蛍光信号に基づいて算出される。
　さらに、低温領域（Ｌ）の所定の位置に停止するための待機時間は、低温領域（Ｌ）に到達する直前の上記（ｃ）における第２蛍光検出器からの蛍光信号に基づいて算出される。また低温領域（Ｌ）における推定停止位置は、低温領域（Ｌ）を出発した直後の上記（ｅ）における第２蛍光検出器からの蛍光信号に基づいて算出される。
　以上のことから、高温、中温もしくは低温領域において所定の位置に停止するための待機時間は、その各領域に到達する直前に通過する蛍光検出領域に対応する蛍光検出器からの蛍光信号に基づいて算出される。
　また、各領域における推定停止位置は、その領域を出発した直後に通過する蛍光検出領域に対応する蛍光検出器からの蛍光信号に基づいて算出される。従って、３水準の温度領域を備える反応処理容器１１０にも、上記の（５）式を適用できる。すなわち、高温領域での試料の推定停止位置に関しては、（５）式における添え字［Ｌ］を［Ｈ］、Ｌ→ｎｔをＨ→ｎｔに変更して読み替えればよい。また、中温領域での試料の推定停止位置に関しては、（５）式における添え字［Ｌ］を［Ｍ］、Ｌ→ｎｔをＭ→ｎｔに変更して読み替えればよい。
　このように、３水準の温度領域からなる反応領域を備える反応処理装置１３０（３ステップ方式）であっても、考慮すべきは、該当する温度領域の直前または直後に備えられた蛍光検出器からの蛍光信号と試料の位置である。これは、上述した２水準の温度領域からなる反応領域を備える反応処理装置３０と同様である。
　以上、本発明を実施の形態をもとに説明した。この実施の形態は例示であり、それらの各構成要素や各処理プロセスの組合せにいろいろな変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
　１０、１１０　反応処理容器、　１２　流路、　１４　基板、　１６　流路封止フィルム、　１７　第１連通口、　１８　第２連通口、　２０　試料、　３０、１３０　反応処理装置、　３２　温度制御システム、　３３　高温用ヒータドライバ、　３４　中温用ヒータドライバ、　３５　低温用ヒータドライバ、　３６　ＣＰＵ、　３７　送液システム、　３９　第１ポンプ、　４０　第２ポンプ、　４１　第１ポンプドライバ、　４２　第２ポンプドライバ、　４３　第１チューブ、　４４　第２チューブ、　４５，４６　パッキン、　５０　蛍光検出器、　５１　光学ヘッド、　５２　蛍光検出器ドライバ、　５３　光ファイバ、　６０　高温用ヒータ、　６１　中温用ヒータ、　６２　低温用ヒータ、　６５　蛍光検出領域、　１５１　第１光学ヘッド、　１５２　第１蛍光検出器ドライバ、　１５３　第１光ファイバ、　１５４　第２光学ヘッド、１５５　第２蛍光検出器ドライバ、　１５６　第２光ファイバ、　１６５　第１蛍光検出領域、　１６６　第２蛍光検出領域、　２５１　第１蛍光検出器、　２５２　第２蛍光検出器。
　本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に利用できる。

Claims (7)

  1. 　試料が移動する流路が形成された反応処理容器と、
    　試料を前記流路内で移動および停止させる送液手段と、
    　前記流路に、それぞれ異なる温度に維持された複数の温度領域を提供する温度制御手段であって、前記複数の温度領域が少なくとも第１温度領域および第２温度領域を含む温度制御手段と、
    　前記流路の隣り合う温度領域の間に設定された検出領域を通過する試料を検出する検出手段であって、前記検出領域が少なくとも前記流路の前記第１温度領域と前記第２温度領域の間に設定された第１検出領域を含む検出手段と、
    　前記検出手段によって検出された信号に基づいて、前記送液手段を制御する制御手段と、
    　を備える反応処理装置であって、
    　前記制御手段は、試料が前記第１温度領域で一定時間停止され、前記第１温度領域から前記第１検出領域を通過して前記第２温度領域に移動して一定時間停止され、その後、前記第１温度領域に戻ってきて停止するまでを１サイクルとした複数サイクルの往復移動制御を試料に対して行うよう構成され、
    　第ｎサイクル（ｎは１以上の整数）の前記第１温度領域から前記第２温度領域への移動に関する、前記検出手段により試料の前記第１検出領域の通過が検出された時刻から前記制御手段が前記送液手段に試料の停止を指示する時刻までの待機時間をｔ１→２ ｄ（ｎ）とし、
    　第ｎサイクルにおける前記第２温度領域での試料の目標停止位置をＸ［２］ ０（ｎ）とし、
    　第ｎサイクルの前記第１温度領域から前記第２温度領域への移動に関する試料の前記検出領域の通過時間をｔ１→２ ｐ（ｎ）とし、
    　試料の前記流路中における長さをＬとし、
    　当該反応処理装置に固有の一定の時間をｔｃとしたときに、
    　待機時間ｔ１→２ ｄ（ｎ）は下記の式：
    　ｔ１→２ ｄ（ｎ）＝Ｘ［２］ ０（ｎ）×ｔ１→２ ｐ（ｎ）／Ｌ－ｔｃ
    　で規定され、
    　第ｎ＋１サイクルにおける前記第２温度領域での試料の目標停止位置Ｘ［２］ ０（ｎ＋１）は、第ｎサイクルにおける試料の停止制御の結果に基づいて、第ｎサイクルにおける前記第２温度領域での試料の目標停止位置Ｘ［２］ ０（ｎ）から補正されることを特徴とする反応処理装置。
  2. 　第ｎ＋１サイクルにおける前記第２温度領域での試料の目標停止位置Ｘ［２］ ０（ｎ＋１）は、第ｎサイクルにおける前記第２温度領域での試料の停止位置Ｘ［２］ １（ｎ）と、前記第２温度領域での設計目標停止位置Ｘ［２］ ００とに基づいて、第ｎサイクルにおける前記第２温度領域での試料の目標停止位置Ｘ［２］ ０（ｎ）から補正されることを特徴とする請求項１に記載の反応処理装置。
  3. 　第ｎ＋１サイクルにおける前記第２温度領域での試料の目標停止位置Ｘ［２］ ０（ｎ＋１）は、第ｎサイクルにおける前記第２温度領域での試料の停止位置Ｘ［２］ １（ｎ）と、前記第２温度領域での設計目標停止位置Ｘ［２］ ００との差分ΔＸ［２］（ｎ）に基づいて、第ｎサイクルにおける前記第２温度領域での試料の目標停止位置Ｘ［２］ ０（ｎ）から補正されることを特徴とする請求項１または２に記載の反応処理装置。
  4. 　第ｎ＋１サイクルにおける前記第２温度領域での試料の目標停止位置Ｘ［２］ ０（ｎ＋１）は、第ｎサイクルにおける前記第２温度領域での試料の目標停止位置Ｘ［２］ ０（ｎ）を補正して決定されることを特徴とする請求項３に記載の反応処理装置。
  5. 　第ｎ＋１サイクルにおける前記第２温度領域での試料の目標停止位置Ｘ［２］ ０（ｎ＋１）は、下記の式：
    　Ｘ［２］ ０（ｎ＋１）＝Ｘ［２］ ０（ｎ）＋ｋ［２］（ｎ）
    　で設定され、
    　補正項ｋ［２］（ｎ）は、第ｎサイクルにおける差分ΔＸ［２］（ｎ）との関係に基づいて決定されることを特徴とする請求項４に記載の反応処理装置。
  6. 　補正項ｋ［２］（ｎ）は、第ｎサイクルにおける差分ΔＸ［２］（ｎ）と、補正項ｋ［２］（ｎ）との関係が記載されたテーブルを参照して決定されることを特徴とする請求項５に記載の反応処理装置。
  7. 　第ｎサイクルにおける前記第２温度領域での試料の停止位置Ｘ［２］ １（ｎ）は下記の式：
    　Ｘ［２］ １１（ｎ）＝Ｌ／ｔ２→ｎｔ ｐ（ｎ）×｛ｔ２→ｎｔ ｍｐ（ｎ）－ｔｃ｝
    　で決定されるＸ［２］ １１（ｎ）として求められ、
    　この式において、ｔ２→ｎｔ ｐ（ｎ）は、前記第２温度領域から次の温度領域への移動に関する、前記第２温度領域を出発した直後に通過する検出領域の通過時間であり、
    　ｔ２→ｎｔ ｍｐ（ｎ）は、前記第２温度領域から前記次の温度領域への移動に関する、試料を移動させるために前記送液手段の作動を開始してから、試料の先頭が前記直後に通過する検出領域に到達したと前記制御手段が認識するまでの時間であることを特徴とする請求項２から６のいずれかに記載の反応処理装置。
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