CN108395984A - 用于热循环的可密封微流体芯片 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及用于疑似含有目标核酸的水性样品热孵育的微流体芯片的可逆密封。微流体芯片含有流动通道和多个反应室，其中通过可以被密封剂密封的入口接受样品和置换流体的进入，所述密封剂具有高于室温的熔点。

Description

用于热循环的可密封微流体芯片
发明领域
本发明属于进行生物学或生物化学测定的分析系统领域。在该领域中，其涉及用于疑似含有目标核酸的水性样品热孵育的微流体芯片的可逆密封。
背景技术
热孵育已经成为在基础研究和临床诊断中的众多分析过程的先决条件。诸如聚合酶链式反应(PCR)之类的方法依赖于精确定义的一系列加热步骤或者加热和冷却步骤(通常称为热循环)，以便使流体样品经受诱导反应的特定部分的加热条件。例如，大多数双链模板DNA(dsDNA)的单链定量变性通常需要高于90℃的温度，而相应寡核苷酸的退火通常在约50至65℃之间的相当低的温度下进行。
此类反应可以在单一试管中，在多个此类单独的试管中或者在诸如多孔板之类的集成排布中进行。后者通常使得通量增加和工作流程简化，因为可以在单一工作步骤中将给定样品分配到相当多的反应室中。
可以将此类板以微流体芯片的形式排布，其中使用内部流动通道将流体样品分配到多个反应室，例如整合至流动通道内壁的微孔中。
针对各反应室和流动通道对此类微流体芯片进行有效的密封可能是具有挑战性的，其取决于样品和/或应用的类型。存在多种方法，如物理覆盖物、盖子、帽、键合/胶合箔或膜，或者液体密封如PDMS或胶水。
US 6,143,496提供了一种方法，其公开了向流动通道加入置换流体(如油)，从而从中除去水性样品并覆盖位于下方的样品室。
发明概述
在本申请所述的第一个方面中，描述了用于热孵育疑似含有目标核酸的水性样品的方法。
简言之，提供了具有含有多个反应室的内部流动通道的微流体芯片。通过入口将水性样品引入流动通道并最终进入反应室，在该步骤之后，加入置换流体以便从流动通道中除去过量的水性样品，从而将反应室中新形成的样品分隔物彼此之间流体分离。
然后将熔点高于室温的密封剂以液体形式施加到入口，在入口处其能够在低于其熔化温度的温度下固化，以密封端口。
然后将由此制备的微流体芯片转移至热孵育站并进行一系列加热步骤，其中密封剂再次熔化，从而使得在微流体芯片的内部与外部之间的气体交换和压力平衡。
水性样品具有比密封剂更高的密度。
本申请公开的另一个方面是具有含有多个反应室的内部流动通道的微流体芯片。芯片还具有与流动通道连接的入口，其中入口具有熔点高于室温的密封剂，所述密封剂以固体形式附着在内壁上。除非将其熔化再固化以覆盖入口，否则将其设置成不阻碍液体流动通过入口。
本申请还描述了使用微流体芯片的试剂盒和分析系统。
附图简述
图1示出了本申请所述的微流体芯片的透视图。
图2以横截面侧视图示意性描述了本申请所述的微流体芯片(1)针对水性样品和置换流体的装填程序。
图3示出了在入口(6)中施加密封剂的三个不同实施方式的示意性横截面侧视图。
图4提供了本申请所述的分析系统(40)的示意图。
发明详述
本申请所述的第一个方面是一种用于热孵育疑似含有目标核酸的水性样品的方法，所述方法包括步骤：
a.提供微流体芯片，所述微流体芯片包含在上板与下板之间的流动通道，流动通道在上板和/或下板的内壁上与多个反应室流体连接；
b.将水性样品通过入口注射进入微流体芯片的流动通道中，从而将水性样品分配到多个反应室中；
c.将置换溶液通过入口注射进入微流体芯片的流动通道中，从而将水性样品从流动通道中置换出来，并且因此将各反应室中的水性样品分隔物彼此之间流体分离；
d.向微流体芯片的入口施加处于液态的熔点高于室温的密封剂并且随后使密封剂在低于其熔点的温度下固化以便将入口密封；
e.将密封的微流体芯片转移至热孵育站，所述密封的微流体芯片含有在反应室中的水性样品分隔物；
f.对微流体芯片进行一系列加热步骤，其中在一个或更多个步骤中超出了密封剂的熔化温度以使其熔化，从而使通过入口的气体交换和压力平衡；
其中水性样品、置换流体和密封剂彼此之间不混溶，并且密封剂具有比水性样品更低的密度。
本申请所述的方法与本领域此前使用的方法相比具有很多优点。
例如，由于诸如微流体芯片的装置通常需要在分析系统的各单元之间转移，因此密封剂提供了对入口进行溢出保护的方法。置换流体本身通常不足以避免在芯片移动、倾斜、掉落等情况下流体(包括水性样品)的损失。类似地，由于置换流体是液体，因此污染物通过入口进入并且最终进入反应室的样品分隔物中通常基本上无法被单独的置换流体阻止。
物理密封件(如盖或箔)的一个缺点是其是必须单独生产和处理的附加的一次性部件，这增加了工作流程的成本和复杂性以及一次性使用的成本。
化学密封溶液也需要复杂的密封硬件，如分配器、注射器、UV照射等。而且，胶水的保质期较短是一个问题。高反应性的化学物质还往往会堵塞管道、阀门、喷嘴等，这也需要更复杂的仪器设计或额外的手动工作。此外，很多液体胶水显示出比水溶液更高的密度，因此其倾向于下沉到填装了含水样品的入口的底部，这在一些情况下是不希望的。
另一方面，本申请所述方法中使用的密封剂不是单独的一次性部件，不需要复杂的密封硬件，也不会导致待分析的样品发生化学干扰的风险，因为其可逆性密封入口的关键特征是其高于室温的熔点。其仅涉及升高温度而不是例如自由基启动器、UV光等，可以将密封剂熔化并通过入口施加在置换流体的表面上，所述置换流体覆盖反应室中的水性样品分隔物。一旦密封剂在入口中亦或流动通道内的置换流体和/或水性样品上形成漂浮的连续层，则可以将温度降至低于密封剂熔化温度的值。其结果是，熔化的密封剂重新固化，从而将入口密封，并且因此在一些实施方式中微流体芯片除了入口之外不具有其他开口。在一些实施方式中，本申请所述的方法通常可以在室温下进行，如20℃和30℃之间，或约25℃。可以通过加热元件(例如，热空气、Peltier元件等)在步骤d.过程中或步骤d.之前实现将密封剂熔化。可以通过冷却元件的主动冷却(例如，通入冷空气等)实现随后降低的温度，在该温度下密封剂重新固化。在其他实施方式中，未进行主动冷却，而是在环境温度下孵育就足够了。因为置换流体通常比熔化的密封剂冷，所以在熔化的密封剂与置换流体之间的热交换可能有助于或者甚至触发密封剂的重新固化。
适宜的密封剂基本上是化学惰性的，以便不与水性样品的置换流体或组分反应。熔化温度(也称为澄清温度)在一些实施方式中在约25℃和约90℃之间，或者约35℃和约80℃之间，或者约45℃和约75℃之间。在一些实施方式中，密封剂具有约55至71℃的熔点温度。在一些实施方式中，密封剂是蜡，如石蜡。特别是蜡具有很多有益的性质，如确定的熔点、快速熔化和固化、低密度、低成本、低毒、低反应性、化学惰性、具有较低的自发荧光、具有良好的生物相容性等。
例如，US 6,143,496教导了一种作为可固化粘合剂的置换流体，其在填充到流动通道中后硬化。此类固化的化合物(例如，环氧树脂)确实提供了溢出保护，但是同时阻止了通过入口的气体交换和/或压力平衡。特别是在入口是唯一的开口，流动通道通过其与芯片周围环境连通的情况下，这可能会导致反应室内的问题。例如，在PCR过程中通常应用的升高的温度可能导致在反应室内气泡的形成和/或膨胀。此类气泡通常会干扰诸如荧光测量的检测方法，或者甚至导致样品分隔物从一个反应室转移动到相邻的反应室。如此获得的分析或者甚至诊断结果将不被视为有效，使得必需重复实验以及测定样品损失。这在临床样品的情况下尤其令人担忧，因为在很多情况下不容易的或者甚至不可能再获得等同样品以进行进一步的诊断测试。而且，其通常与受累患者的附加应激相关。
在本申请所述方法中使用具有熔点高于室温的密封剂通过在热孵育一个或多个步骤过程中进行熔化解决了这些问题。其低密度确保其保持漂浮在水性样品上，并且在一些实施方式中还在甚至是液态的置换流体上漂浮，但同时允许通过入口的气体交换和压力平衡。
其结果是，固化的密封剂有效降低了在微流体芯片填装后通过入口污染和溢出的风险，并且还确保了在芯片中水性样品分隔物的热孵育不被气体交换受阻或缺乏压力平衡所妨碍。
在本申请所述方法的一些实施方式中，密度从高到低的顺序为水性样品>置换流体>密封剂。在这些实施方式中，熔化的密封剂漂浮在置换流体顶上，置换流体又漂浮在水性样品顶上。
“水性样品”是能够进行诊断测定和在一些实施方式中来自生物来源的基于水的任何流体材料。水性样品能够被吸取。在一些实施方式中，所述水性样品来自人，在一些实施方式中来自人的体液。在本发明的实施方式中，流体样品是或来自人血或血浆、尿液、痰液、汗液、生殖器或颊或鼻拭子、可吸取的粪便或脊髓液。在其他实施方式中，流体样品是人血或血浆。
“微流体芯片”可以由多种材料制成。例如，适宜的材料包括例如玻璃、塑料、石英、硅等。在一些实施方式中，材料是环烯烃聚合物(COP)或共聚物(COC)。其他适宜材料是本领域技术人员公知的。这些材料还具有高透光性和低水平的自发荧光，这例如对于在核酸分析中经常使用的光学检测是有益的。在一些实施方式中，整个微流体芯片由相同材料制成。在其他实施方式中，不透明的区域例如多孔板的边缘可以由不同材料制成，如用于处理和保护目的等的更结实的材料。在一些实施方式中，微流体芯片的尺寸符合ANSI/SLAS标准。这些标准已由实验室自动化和筛选学会(SLAS)发布并且可以在URL:http://www.slas.org/resources/information/industry-standards/中找到。特别地，将底部面积的外部尺寸标准化为长度约127.76mm和宽度85.48mm。
如在本申请中所使用的，术语“反应室”代表与本申请中所述的微流体芯片的流动通道连接的位置。反应室可以包含或者是室或孔，每个室或孔具有侧壁、上端和封闭的下端。或者或另外地，反应室可以包含与流动通道壁相比与水性样品具有更高亲和性的亲水性图样，导致水性样品分隔物在反应室中更有效的保留。在一些实施方式中，可以由驻极体或者由外部或内部电极引入亲水性图样以提供与流动通道壁相比具有更高表面能和润湿性的带电表面。对于孔而言，后者内部可以是化学惰性的，使得其不会干扰在内部发生的分析反应。在其他实施方式中，可以使用结合分子(如生物分子)对其进行包被。可以作为例如用于结合目标核酸或其他核酸的捕获分子的生物分子的实例包括序列特异性核酸捕获探针，如DNA或LNA(锁定核酸)探针。另一个实例是与目标核酸的生物素标签相互作用的链霉亲和素。本申请所述的微流体芯片可以具有直径或扳手尺寸在微米至毫米范围的孔，所述直径或扳手尺寸在孔开口处测量，孔开口可以是例如圆形、多边形(如六边形)等，所述范围例如从1μm至1mm、或者从5μm至500μm、或者从10μm至250μm、或者从30μm至200μm、或者从40μm至120μm、或者从60μm至100μm。在一些实施方式中，孔具有约80μm的直径或扳手尺寸。
对于如本申请所述的微流体芯片单个孔的容积而言，孔可以具有皮升至纳升范围的容积，如从1pl至100nl、或者从5pl至50nl、或者从10pl至1nl、或者从50pl至500pl、或者从75pl至250pl。在一些实施方式中，孔的容积为约100pl。
如本申请所述的多孔板透光区的孔数可以是例如从1000至1000000个孔、或者从5000至500000个孔、或者从10000至250000个孔、或者从20000至100000个孔。在一些实施方式中，多孔板的孔数可以是约50000个。
反应室与流动通道流体连通，以使进入流动通道的样品能够到达并保留在反应室中。流动通道包含与水性样品具有第一亲和性的第一材料。第一材料应具有这样的性质以使得水性样品和置换流体通过毛细管作用、压力或其他力进入流动通道。反应室与水性样品具有第二亲和性，并且第二亲和性大于第一亲和性。例如，第二亲和性可以是通过化学、光学、电子或电磁方法在反应室中诱导的性质。永久诱导亲和性的示例性化学方法可以是例如将O2等离子体暴露于硅酮表面的一部分以有效改变表面的亲和性以便在所处理的部分保持水性样品。也可以将在表面上嵌入离子用于在表面的位置上永久诱导亲和性增加或降低。根据一些实施方式，可以暂时性诱导亲和性，例如诱导样品保留或排斥表面上的表面电荷以增加该表面的有效表面张力。在本申请所述方法的一些实施方式中，亲和性的差异使得反应室能够从流动通道收集一部分样品并且保留该部分样品，同时不混溶的置换流体通过入口进入流动通道，分离反应室保留的样品并且置换流动通道中未保留的样品。
置换流体与水性样品以及密封剂基本上不混溶。置换流体可以包括与水或其他密封剂基本上不混溶的树脂、单体、矿物油、硅油、氟化油和其他流体。根据一些实施方式，置换流体可以是透明的，具有与玻璃相似的折射率，具有较低荧光或不具有荧光和/或具有较低粘度。
在本申请所述方法的一些实施方式中，置换流体是油。
可以在毛细管力的作用下通过吸入将待分离的样品和置换溶液引入流动通道。还可以使用加压加载技术，但是如果置换流体是在压力作用下被迫进入微流体芯片，则压力不应该高至从反应室置换样品。可以使用负载水性样品和/或置换流体的其他方法，其包括电动或静电负载技术、温差、离心力、真空或抽吸负载、磁流体的磁性吸引负载、电泳负载等。
促进气体交换和压力平衡的可能的附加措施是从外部积极地向微流体芯片施加压力。
因此，在本申请所述方法的一些实施方式中，在加压室内进行一系列加热步骤。
在这方面，在所述室内保持相对于环境压力增加的压力可能是有利的。加压室内的压力可以在1至10巴之间、或者在1至5巴之间、或者在1至2巴之间。在一些实施方式中，压力是约1.5巴。
通过由熔化密封剂实现通过入口的气体交换和压力平衡向微流体芯片内的液体施加了相对过压，这降低了气泡形成的风险，因为其有助于防止任何气体因为膨胀而进入流动通道和/或反应室。
在进一步的实施方式中，还可以通过向入口预先负载密封剂以进一步简化和促进本申请所述的方法。有利的是，可以将密封剂附着在入口内壁，留下足够宽的空隙，以便在密封剂处于固态时不阻碍液体通过入口。然后可以将这样制备的微流体芯片例如从其生产地点转运至使用其的实验室。与例如使用固体机械塞密封入口销售和分发的微流体芯片不同的是，目前所述的密封剂不是在其目的地实验室将水性样品填充入微流体芯片中之前必需除去并且随后向入口再重新施加的(“去封盖/重新封盖”)，而是一旦使用样品和置换流体适宜地负载芯片，则其熔化就位。此外，与传统塞子不同的时，在如上文所述的热孵育过程中，目前所述的密封剂与压力现象是完全相容的。
因此，在本申请所述方法的一些实施方式中，在步骤a.中的微流体芯片预先装载密封剂，所述密封剂以固态附着在入口的内壁上，从而不阻碍水性样品或置换流体通过入口进入流动通道。
尤其是，在目前描述的实施方式中，密封剂的使用，特别是在其中入口预先负载有密封剂的情况下，还具有如下优点：不需要与微流体芯片一起生产、分配和最终操作诸如塞子的单独部件。例如，在装填微流体芯片之前取下预先加上的塞子，然后再将其放在入口上或放入其中通常使交叉污染的风险增加，特别是在手工进行的方法中。例如，塞子可能会被例如临床工作人员无意中碰到或碰掉。而且，传统的塞子是微流体芯片的单独部分，因此必须单独生产，这也可能会增加相应的微流体芯片的成本。在微流体芯片是一次性的且应尽可能便宜的实施方式中，财务方面的考虑是特别重要的。
在本申请所使用的背景下“一次性的”涉及在被丢弃前仅使用几次(在一些实施方式中仅使用一次)的装置或产品。涉及扩增的核酸分析(如PCR)通常比其他技术对污染物更加敏感，因为可能在无意中将微量的污染物(如不需要的核酸序列)扩增。在这种情况下，一次性微流体芯片降低了实验之间携带污染的风险。
在本申请所述方法的一些实施方式中，处于固态的密封剂由以入口内壁的凹槽或凸起形式形成的注入通道保持，其中注入通道和入口流体连接。注入通道可以在下端或在两端开口，从而将该通道与入口流体连接。换言之，一旦密封剂熔化，其可以通过通道开口中的一个流入入口，在置换流体上形成液层并通过将温度降至密封剂的熔点以下重新固化。
类似的实施方式对本领域技术人员而言可能是有用的，例如其中入口具有圆柱形或圆锥形形状并且密封剂以固体环的形式预先施加在入口的圆形内壁上。在此类实施方式中，施加的密封剂在熔化后可能是特别均匀的，因为其围绕入口的开口并且可以沿整个圆周从其外部界限向下流到置换流体的表面上。
如果微流体芯片具有一个以上的端口，则在本申请所述的背景下可能是有利的。特别地，在一些实施方式中，微流体芯片还包含出口。后者可有利地位于流动通道入口的相对末端。因此，入口和出口可以通过流动通道流体连通。在一些实施方式中，然后水性样品通过入口进入流动通道，填入与流动通道流体连接的反应室，同时过量的水性样品从出口排出流动通道，或者由来自流动通道的水性样品排出的空气可以通过出口排出流动通道，在这种情况下，将出口作为出风口，以防止由空气聚集引起的压力增加。在微流体芯片也具有出口的实施方式中，对后者进行与入口同样的处理或预先负载。换言之，向出口也施加步骤d.中的密封剂，以使得入口和出口均被固化的密封剂所密封。在入口预先负载处于固态的密封剂的实施方式中，出口同样预先负载处于固态的密封剂，在一些实施方式中是以完全相同的方式。
上文所述的与入口和具有高于室温的熔化温度的密封剂相关的优点同样适用于出口(如果存在的话)。例如，在热循环过程中，在至少一个步骤中将在入口和出口的密封剂熔化，这两个端口随后提供气体交换和压力平衡。
在本申请所述方法的一些实施方式中，在填充站将水性样品、置换流体和密封剂装填进入流动通道，同时将一系列加热步骤应用于与填充站在空间上分离的热孵育站。
在此类实施方式中，由固化的密封剂起到的溢出保护作用在从填充站向热孵育站转运过程中起着特别重要的作用。将热孵育站与其他分析模块(如填充站)在空间上分离通常是有意义的，因为特定方法(如PCR)很容易被不需要的核酸污染，所述核酸甚至可以通过气溶胶散布。
如在本申请中所使用的，“填充站”包含将水性样品、置换流体和熔化形式的密封剂分配到微流体芯片中所需的元件。此类元件可以包含具有或不具有一次性移液管吸头的移液管。移液管也可以是由钢或类似适宜材料制成的针。而且，在一些实施方式中，填充站包含适于熔化密封剂的加热元件。例如，移液针可以是可加热的，以便在接触时熔化处于固态的密封剂，将其吸入针中空的内部，并将其分配到入口或入口中。在进一步的实施方式中，填充站可以包含施加压力的方法，如泵等。
如在本申请中所使用的，术语“热孵育站”表示包含加热和在一些实施方式中还包含冷却元件的仪器或模块。此类元件包括例如Peltier元件。在一些实施方式中，热孵育站是热循环仪(如PCR循环仪)，其上预先设定的温度曲线是可编程的，以管理协调的加热步骤或加热和冷却步骤循环。在一些实施方式中，不涉及主动冷却。在进一步的实施方式中，热孵育站可以包含具有本申请所述优点的加压室。
在本申请所述方法的一些实施方式中，一系列加热步骤在含有水性样品分隔物的反应室内驱动聚合酶链式反应。
如在本申请中所使用的，术语“聚合酶链式反应(PCR)”指本领域熟知的用于增加样品中目标多核苷酸区段浓度的扩增方法，其中样品可以是单一多核苷酸种类或多种多核苷酸。在通常情况下，PCR过程包括向包含所需目标序列的反应混合物中引入摩尔过量的两种或多种可延伸的寡核苷酸引物，其中引物与双链目标序列的相反链互补。在存在DNA聚合酶的条件下，对反应混合物应用热循环程序，从而导致翼侧为DNA引物的所需目标序列的扩增。逆转录酶PCR(RT-PCR)是使用RNA模板和逆转录酶或具有逆转录酶活性的酶，在DNA依赖性DNA聚合酶引物延伸的多个循环之前先产生单链DNA分子的PCR反应。多重PCR指在单一反应中产生一个以上扩增产物的PCR反应，通常通过在单一反应中包含两个以上引物进行。在通常情况下，PCR循环包括通常在90℃以上进行的变性步骤，其中双链模板核酸的每条链彼此之间分离。在显著降低的温度下，通常在50℃至65℃之间，引物与其在各自模板链上的互补目标位置退火，随后温度再次升高至大部分在70℃至80℃之间，此时热稳定性核酸聚合酶显示出其最大酶活性。用于各种PCR应用的方法在本领域中是广泛公知的，并且在很多来源中进行了描述，例如Ausubel等(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，第15章，John Wiley&Sons,Inc.,New York(1994)。
在此类实施方式中，密封剂的熔化温度例如至少要超出循环变性步骤的温度，该步骤通常在90℃以上进行，例如在约94℃。
本申请所述的另一个方面是用于热孵育疑似含有目标核酸的水性样品的微流体芯片，所述微流体芯片包含：
-在上板与下板之间的流动通道，流动通道在上板和/或下板的内壁上与多个反应室流体连接；
-与流动通道流体连通的入口；
-处于固态的具有高于室温的熔点的密封剂，所述密封剂以固态附着在入口的内壁上，从而不阻碍水性样品通过，其中密封剂与水性样品不混溶且具有比水性样品更低的密度。
此类微流体芯片具有在本申请所述方法的背景下在其中入口使用处于固态的密封剂预先负载的实施方式中描述的优点。
在本申请所述微流体芯片的一些实施方式中，密封剂由以入口内壁的凹槽或凸起形式形成的注入通道保持，其中注入通道和入口流体连接，如在本申请所述方法部分所述。
而且，在本申请所述微流体芯片的一些实施方式中，密封剂跨过入口的内圆周，以包绕入口中的开口。这能够使得熔化的密封剂在置换流体表面上特别均匀的分布，如在本申请所述方法部分所详述的。
在进一步的实施方式中，本申请所述的微流体芯片还包含与流动通道流体连通的出口，其中密封剂还以固态附着在出口的内壁上，从而不阻碍水性样品通过。
这些实施方式的优点与涉及本申请所述方法的出口的实施方式的优点一致。
因为获取和使用用于分析或诊断的集成解决方案通常是有利的，所以本申请所述的另一个方面是用于热孵育疑似含有目标核酸的水性样品的试剂盒，所述试剂盒包含：
-本申请所述的微流体芯片；
-与水性样品和密封剂两者不混溶的置换流体。
在一些实施方式中，密度由高到低的顺序为水性样品>置换流体>密封剂。
置换流体与密封剂的规格与本申请所述方法部分相同。
如本领域技术人员公知的，此类试剂盒可以包含其他组分。例如，试剂盒可以包含用于如本申请所述的热孵育反应的试剂。
本申请所述的试剂盒本身可以作为用于热孵育疑似含有目标核酸的水性样品的分析系统的一部分，所述分析系统包含：
-本申请所述的试剂盒；
-填充站，所述填充站构造成将水性样品、置换流体和密封剂以液态装填进入微流体芯片的流动通道中；
-热孵育站，所述热孵育站构造成对微流体芯片进行一系列加热步骤，其中在一个或更多个步骤中超出了密封剂的熔化温度以使其熔化，从而使通过入口的气体交换和压力平衡。
附图详述
图1的示意图以从上方的透视图描述了本申请所述的微流体芯片(1)的一个实施方式。该实施方式的上板(3)是由透明材料制成的，以使得流动通道(2)是可见的。透明的上板(3)具有多个优点，例如可以实现从上方对反应室(5)内的分析物进行光学检测。在下板(4)也是透明的实施方式中，基于光透射的光学检测也是可能的。在该实施方式中，可以通过与流动通道(2)流体连通的入口(6)使用水性样品(10)填充反应室(5)，所述反应室(5)是在下板(4)的上表面中形成为空腔的六边形形状的孔。出口(7)提供了排出空气的出风口或者甚至是过量水性样品(10)或置换流体(20)的出口。在该实施方式中的两个端口呈圆柱形并且形成为上板(3)向上的凸起。其他适宜的端口几何形状也是可能的。
在该实施方式中所述的微流体芯片(1)具有在入口(6)和出口(7)之间延伸的线性流动通道(2)。其他几何形状的流动通道(2)也是可以想到的。例如，流动通道(2)可以是弯曲的。根据本申请所述的方法，向入口(6)和出口(7)施加密封剂(30)，以便将流动通道(2)的所有开口密封，从而保护微流体芯片(1)中的水性样品使其免于溢出和污染。为了清楚起见，在该图中没有示出水性样品(10)、置换流体(20)和密封剂(30)。
在图2的横截面侧视图中示意性描述了微流体芯片(1)的填充程序的顺序。这三个附图的每一个示出了具有反应室(5)的入口(6)和流动通道(2)的一部分的横截面。左侧的图片显示了已通过入口(6)填充进入反应室(5)和流动通道(2)的水性样品(10)。后者具有圆柱形的主体并且朝向其与流动通道(2)的流体连接呈锥形，以使得入口(6)可以在其主体内容纳合理体积的液体，而通过在入口(6)与流动通道(2)之间较窄的流体界面(8)提供了使相应液体相对缓慢和受控的流入流动通道(2)。
在该实施方式中的反应室(5)是在上板(3)而不是下板(4)中形成的孔，使得其开口朝下进入流动通道(2)。通过毛细管作用和/或从入口(6)施加压力将水性样品(10)吸入孔(5)中。
中间的图片表示将置换流体(20)分配进入入口(6)以便从流动通道(2)置换水性样品(10)，而不是从反应室(5)置换水性样品(10)分隔物的步骤。其相互不混溶性防止了水性样品(10)与置换流体(20)结合形成混合物。目前的描述显示了一种瞬时状态，其中置换流体(20)已经部分地将水性样品(10)从流动通道(2)中置换出来。
图2右侧的第三幅图片显示了该过程随后的状态，其中置换流体(20)已将水性样品(10)完全从流动通道(2)中置换出来，并且从而封闭了在各反应室(5)内的水性样品(10)的分隔物。
图3的附图显示了使用密封剂(30)对如此制备的微流体芯片(1)进行密封的不同实施方式。
变体a)显示了具有附着在其左侧和右侧内壁的处于固态的两部分密封剂(30)的入口(6)，在其间留有空隙以便不阻碍水性样品(10)的流体或置换流体(20)通过。因为该附图是横截面侧视图，所以密封剂(30)也可以沿着入口(6)内壁形成连续的环。
变体b)表示一个实施方式，其中处于固态的密封剂(30)由凹槽(31)形状的储液池保持，所述凹槽由入口内壁的一部分的细长半圆形凹陷形成(6)，如可在左侧更详细地看出，其显示了入口(6)的横截面俯视图。
变体c)举例说明了本申请所述方法的一个实施方式，其中入口(6)没有预先装载处于固态的密封剂(30)，但是通过移液针(32)将熔化形式的后者分配进入入口(6)。
如在d)下面的图3中的右图所示，箭头表示使温度高于密封剂(30)熔化温度的加热过程，以使得后者熔化并可以流入就位以便在入口内的置换流体(20)的表面上形成不混溶的层。在这一阶段，通过冷却主动降温或通过在室温下孵育被动降温使得密封剂(30)重新固化。现在将在其反应室(5)中具有分离的水性样品(10)的微流体芯片(1)密封并进行适当的准备，以用于处理、转运等。例如，可以将其从填充站转运至热孵育站。
图4中所示的路线描述了本申请所述分析系统(40)的一个实施方式的典型工作流程。首先，在包含填充站(42)的第一位置使用水性样品(10)填充微流体芯片(1)。在所描述的实施方式中，通过移液器(41)手动加入水性样品(10)。用于水性样品(10)的其他适宜分配方法也是可能的。所提出的实施方式还具有用于置换流体(20)的自动分配器(44)以及用于密封剂(30)的自动分配器(45)。在一些实施方式中，分配器(45)可以替代地或附加地包含或者是加热元件。一旦通过加入水性样品(10)、置换流体(20)和密封剂(30)制备了微流体芯片(1)，以及密封剂(30)已经或已经被重新固化以密封微流体芯片(1)，则将后者转运(下箭头)至包含加热元件(46)(如Peltier元件等)的热孵育站(43)。在热孵育站(43)中，可以进行诸如PCR的反应，在此期间密封剂(30)暂时熔化并因此提供气体交换和压力平衡。
实施例
以下实施方式旨在说明可以在其中实施本发明的某些实施方式。
实施例1：石蜡作为溢出保护的端口密封剂的适用性
目的：
如果芯片意外翻转或掉在地上，则将使用密封剂进行入口密封作为溢出保护。
材料：
1.具有入口和出口的微流体芯片适于容纳体积为45μl的分离流体和45μl的密封剂。微流体芯片具有总体积为10μl的流动通道和包含10μl总体积的在流动室内部的多个隔室。
2.通用PCR Mastermix：ROCHEMultiplex DNA Master,07339585001。
3.密封剂：石蜡。Fisher Chemical，CAS:8002-74-2，EC:232-315-6，清凉点约55-71℃。
4.置换流体：硅酮流体Xiameter PMX-200,50CS,Credimex AG,Alpnach,瑞士。
5.熔化20g石蜡的加热板和容器。
进行的实验：
1.使用10μl(等于芯片内隔室体积之和)PCR反应混合物(1份5x Mastermix和4份水)填充微流体芯片。
2.通过以轻柔的压力，使用吸头与入口形成压力密封将置换流体吸入芯片，使用置换流体填充微流体芯片。使用110μl体积，从而将微流体芯片的流动通道填充，以及将芯片的入口和出口填充约一半(45μl)。
3.在60℃的加热板上的容器(铝箔)中熔化石蜡。使用具有较大开口的吸头吸取蜡。将45μl体积轻轻吸入吸头，从而让吸头适应熔化的蜡的温度。
4.将石蜡吸入微流体芯片的入口和出口。
5.测量时间直至熔化过程结束。
6.在加入石蜡1分钟后测试溢出(跌落测试)保护。使芯片从1.5m高跌落到地上并且在与地面撞击后观察任何液体可能的流出或溢出。
7.在跌落测试后通过将微流体芯片倒置并在3分钟时间段内观察任何液体的流出情况检测溢出(流出)保护。
观察结果：
使用石蜡作为密封剂和硅酮流体PMX 200作为置换流体进行实验。处理了24个芯片。在室温下等待1分钟后蜡固化就足够了。所有研究的芯片均通过了跌落测试，即未观察到液体溢出或流出。
实施例2：作为端口密封剂的石蜡的低自发荧光性
目的：
自发荧光是在包括基于荧光读取的生物分子测定的微流体设置内不需要的材料性质。必须对成像区域内的所有材料对总荧光信号的贡献进行评估。即使入口和出口不在微流体芯片上成像的主要焦点上，散射光也可能与密封剂相互作用并导致不需要的信号。
材料：
1.在实施例1中描述的微流体芯片和石蜡。
2.含有1微摩FAM(6-羧基荧光素)染料溶液的来自实施例1的PCR Mastermix。
3.适用于含有荧光缓冲溶液的微流体芯片荧光成像的成像装置，例如具有适当的滤光片组的落射荧光显微镜。
进行的实验：
1.使用含有荧光染料的如实施例1中所述的PCR反应溶液填充微流体芯片。
2.将石蜡液滴施加在微流体芯片的反应室区域(即，成像区)上。将液滴的厚度调整至约2mm。
3.对在反应室内含有荧光溶液并且在芯片上的一部分覆盖蜡层的微流体芯片进行荧光成像。
4.测量在隔室区域以及被石蜡覆盖区域中芯片图像上的荧光强度。
观察结果：
隔室内测量的荧光(在扣除背景之后)为31250±3562RFU(相对荧光单位)。由石蜡点发射的荧光信号仅占所关注信号的35％。由于这项实验描述了极端情况，因为所选择的点的厚度非常大，并且在目标应用中，石蜡在成像区域以外，所检测到的自发荧光水平对于目标应用可以忽略不计。
实施例3：在具有石蜡密封的入口和出口的微流体芯片中的数字PCR性能目的：
在具有和不具有入口和出口密封的微流体芯片中对数字PCR实验的性能进行比较：通过使用石蜡作为密封剂不应对生物化学定量测定(如数字PCR)的性能产生负面影响。
材料：
1.实施例1中所述的微流体芯片、置换和密封流体以及通用PCR Mastermix。
2.通用内部对照：使用在FAM和HEX通道上的PCR引物和探针集合，以及已知浓度的目标核酸进行PCR并对结果进行比较。
3.使用热循环仪和成像仪对微流体芯片进行PCR，并且在对微流体芯片中的内部隔室进行热循环后测量荧光信号。热循环仪能够使微流体芯片在室温与98℃之间进行热循环。而且，该仪器能够在1.5巴的加压设置下进行循环。
进行的实验：
1.根据Mastermix试剂盒说明书中的描述由Mastermix、引物/探针集合和靶点制备PCR反应混合物。使用蜡作为密封剂总共进行三次实验，以及不对入口和出口进行密封作为对照总共进行三次实验。
2.每次实验将PCR反应混合物(10μl)吸入微流体芯片中。
3.通过轻柔加压将置换流体(110μl)吸入流动通道中。
4.如实施例1中所述，将石蜡加入入口和出口(分别为45μl)。在对照实验中，未加入密封剂。
5.将微流体芯片加入热循环仪。将微流体芯片设置在1.5巴加压下并且随后进行热循环：在95℃下预孵育2分钟并进行40个循环：95℃下10秒和58℃下20秒。最终冷却至40℃，持续30秒。加热和冷却的热倾斜温度：每秒1.2℃。热循环仪的盖子保持在恒定温度58℃。
6.在荧光读数仪器上读取在FAM和HEX通道中每个隔室的荧光强度。应用固定的阈值，使用荧光值确定隔室中的阳性PCR反应数，随后使用泊松统计计算目标分子的初始数量(拷贝数)。将使用石蜡密封的微流体芯片的定量结果与未密封的对照芯片进行比较。还比较了在密封的和未密封的对照芯片之间的阳性和阴性隔室的荧光强度。
7.对热循环后入口和出口蜡密封的状态与循环前的状态进行光学比较。观察结果：
对于对照实验而言，在FAM通道和HEX通道中确定的每μl的拷贝数为1239±30和6246±299。对于使用石蜡作为密封剂的实验而言，在FAM通道和HEX通道中确定的每μl的拷贝数为1188±72和6213±210。使用石蜡密封的微流体芯片与对照实验在拷贝数计数方面的差异不是具有统计学意义的差异(未配对t-检验，对于FAM P＝0.3207和对于HEX P＝0.8833)。而且，对于阳性和阴性信号而言，三次密封和非密封实验的平均荧光强度[RFU]不是具有统计学意义的差异。Welch t-检验，针对FAM[阳性信号]：不含(w/o)蜡：4885±12对比含蜡(w/wax)：4883±29：P＝0.9215。FAM[阴性信号]：不含蜡：760±2对比含蜡：749±4:P＝0.0554。HEX[阳性信号]：不含蜡：11411±30对比含蜡11333±42：P＝0.2140。HEX[阴性信号]：不含蜡：2465±11对比2448±39：P＝0.5414。
微流体芯片的目测观察结果表明循环后入口和出口密封仍完好，在密封顶部发现最小量的分离流体，将其认为是非关键性的。

Claims (15)

1.用于热孵育疑似含有目标核酸的水性样品(10)的方法，所述方法包括步骤：
a.提供微流体芯片(1)，所述微流体芯片(1)包含在上板(3)与下板(4)之间的流动通道(2)，所述流动通道(2)在所述上板(3)和/或所述下板(4)的内壁上与多个反应室(5)流体连接；
b.将所述水性样品(10)通过入口(6)注射进入所述微流体芯片(1)的所述流动通道(2)中，从而将所述水性样品(10)分配到所述多个反应室(5)中；
c.将置换溶液(20)通过入口(6)注射进入所述微流体芯片(1)的所述流动通道(2)中，从而将所述水性样品(10)从所述流动通道(2)中置换出来，并且因此将各反应室(5)中的所述水性样品(10)分隔物(partition)彼此之间流体分离；
d.向所述微流体芯片(2)的所述入口(6)施加处于液态的熔点高于室温的密封剂(30)并且随后使所述密封剂(30)在低于其熔点的温度下固化以便将所述入口(6)密封；
e.将所述密封的微流体芯片(1)转移至热孵育站(43)，所述密封的微流体芯片含有在所述反应室(5)中的所述水性样品(10)分隔物；
f.对所述微流体芯片(1)进行一系列加热步骤，其中在一个或更多个步骤中超出了所述密封剂(30)的熔化温度以使其熔化，从而使通过所述入口(6)的气体交换和压力平衡；
其中所述水性样品(10)、所述置换流体(20)和所述密封剂(30)彼此之间不混溶，并且所述密封剂(30)具有比所述水性样品(10)更低的密度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中密度从高到低的顺序为水性样品(10)>置换流体(20)>密封剂(30)。
3.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述一系列加热步骤发生在加压室中。
4.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中在步骤a.中的所述微流体芯片(1)预先装载所述密封剂(30)，所述密封剂(30)以固态附着在所述入口(6)的内壁上，从而不阻碍所述水性样品(10)或所述置换流体(20)通过所述入口(6)进入所述流动通道(2)。
5.根据权利要求4所述的方法，其中处于固态的所述密封剂(30)由以所述入口(6)内壁的凹槽或凸起形式形成的注入通道(31)保持，其中所述注入通道(31)和所述入口(6)流体连接。
6.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述密封剂(30)是蜡。
7.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述微流体芯片(1)还包含出口(7)，所述出口(7)使用与所述入口(6)相同的所述密封剂(30)处理或预先装载。
8.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中将所述水性样品(10)、所述置换流体(20)和所述密封剂(30)在填充站(42)装填进入所述流动通道(2)，同时在与所述填充站在空间上分离的热孵育站(43)施加所述一系列加热步骤。
9.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述一系列加热步骤驱动在所述反应室(5)中的聚合酶链式反应，所述反应室(5)含有所述水性样品(10)分隔物。
10.用于热孵育疑似含有目标核酸的水性样品(10)的微流体芯片(1)，所述微流体芯片(1)含有：
-在上板(3)与下板(4)之间的流动通道(2)，所述流动通道(2)在所述上板(3)和/或所述下板(4)的内壁上与多个反应室(5)流体连接；
-与所述流动通道(2)流体连通的入口(6)；
-处于固态的具有高于室温的熔点的密封剂(30)，所述密封剂(30)以固态附着在所述入口(6)的内壁上，从而不阻碍所述水性样品(10)通过，其中所述密封剂(30)与所述水性样品(10)不混溶且具有比所述水性样品(10)更低的密度。
11.根据权利要求10所述的微流体芯片(1)，其中所述密封剂(30)由以所述入口(6)内壁的凹槽或凸起形式形成的注入通道(31)保持，其中所述注入通道(31)和所述入口(6)流体连接。
12.根据权利要求10所述的微流体芯片(1)，其中所述密封剂(30)跨过所述入口(6)的内圆周，以包绕所述入口(6)中的开口。
13.根据权利要求10至12的任意一项所述的微流体芯片(1)，还包含与所述流动通道(2)流体连通的出口(7)，其中所述密封剂(30)还以固态附着在所述出口(7)的内壁上，从而不阻碍所述水性样品(10)通过。
14.一种用于热孵育疑似含有目标核酸的水性样品(10)的试剂盒，所述试剂盒含有：
-权利要求10至13的任意一项所述的微流体芯片(1)；
-与所述水性样品(10)和所述密封剂(30)两者不混溶的置换流体(20)。
15.用于热孵育疑似含有目标核酸的水性样品(10)的分析系统，所述分析系统含有：
-权利要求14所述的试剂盒；
-填充站(42)，所述填充站(42)构造成将所述水性样品(10)、所述置换流体(20)和所述密封剂(30)以液态装填进入所述微流体芯片(1)的所述流动通道(2)中；
-热孵育站(43)，所述热孵育站(43)构造成对所述微流体芯片(1)进行一系列加热步骤，其中在一个或更多个步骤中超出了所述密封剂(30)的熔化温度以使其熔化，从而使通过所述入口(6)的气体交换和压力平衡。
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