CN102439177A - 用于对目标核酸进行条形码化的多引物扩增方法 - Google Patents

Abstract

在某些实施方案中，本发明提供了多种扩增方法，其中一个或多个核苷酸标记以及任选地一个条码核苷酸序列被加入到目标核苷酸序列中。在其他实施方案中，本发明提供了一种微流体装置，该装置包括多个第一输入管线以及多个第二输入管线。该微流体装置还包括多组第一室以及多组第二室。每一组第一室都是与这多个第一输入管线之一处于流体连通的。每一组第二室都是与这多个第二输入管线之一处于流体连通的。该微流体装置进一步包括与多个第二输入管线的一个第一部分流体连通的多个第一泵元件，以及与多个第二输入管线的一个第二部分流体连通的多个第二泵元件。

Description

用于对目标核酸进行条形码化的多引物扩增方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年4月2日提交的在先美国临时申请号61/166,181；于2009年4月2日提交的在先美国临时申请号61/166,105；于2009年6月11日提交的在先美国临时申请号61/186,327；以及于2010年2月18日提交的在先美国临时申请号61/305,907的权益，它们都以其全部内容通过引用结合在此。

技术领域

本发明总体上涉及针对特定目标核酸进行检测和/或测序的高通量测定领域。在某些实施方案中，本发明提供了多种扩增方法，其中一个或多个核苷酸标记以及一个条码核苷酸序列被加入到目标核苷酸序列中。

背景技术

在样品中检出特定核酸序列的能力已经导致诊断和预测医学、环境、食品和农业监测，分子生物学研究，以及多种其他领域中多种新方法。此外，新测序方法提供了多种快速高通量核酸测序的手段。

另外的方法，尤其是有助于在样品中横跨宽范围的浓度同时分析多目标和/或分析多样品的方法将是非常有利的。

可以使用多种微流体装置在至今未曾想见的规模上实现分析、制备、计量、以及其他操作功能。微流体装置的优点包括保存珍贵试剂以及样品、高密度以及通量的样品分析或合成、肉眼几乎不可见水平的流体精确度和准确度、以及伴随替换在宏观流体尺度上操作的对应设备而来的空间减少。伴随微流体装置的尺寸减小以及密度增加的是复杂性增加以及与日益增加的复杂的装置构造相关的更高的工程和制造成本。

近年来，已经协同安排了多种努力来开发和制造微流体系统以实现多种化学和生物化学的分析以及合成。另外，微流体装置具有被适配以与多种自动系统一起使用的可能性，由此提供了进一步降低成本以及减少由于减少人员导致的操作错误的额外的益处。已经提出了多种微流体装置用于多种应用中，包括例如毛细管电泳法、气相层析法、以及细胞分离。

然而，由于与迄今已经制造的微流体装置相关的多种复杂因素，这些益处的实现经常被阻碍。例如，许多现有的微流体装置是由基于硅石的基质制造的，这些基质对于机加工而言是困难的并且是复杂的。其结果是，由这类材料制造的许多装置是易碎的。而且，将流体运送通过多个现有微流体装置需要调节复杂的电场从而以控制的方式将流体运送通过该装置。

因此，就上述益处而言(这些益处可以用微流体装置来实现但是受到现有装置当前的限制)，仍然对设计用于进行多种化学以及生物化学分析的多种微流体装置存在一种需要。由于它在现代生物化学中的重要性，对于可以用于进行多种核酸扩增反应、同时对于用于其他类型的分析也具有足够的多样性的装置存在一种特殊的需要。

具有进行核酸扩增能力的装置将具有多种应用性。例如，这类装置可以被用作分析工具来确定样品中是否存在感兴趣的具体目标核酸。因此，可以使用这些装置来针对具体病原体的存在(例如，病毒、细菌、或真菌)、以及针对鉴别目的(例如，亲子关系以及法医应用)进行测试。还可以使用这类装置来检测或表征以前与具体的疾病或遗传障碍相关联的多种特定的核酸。当用作分析工具时，还可以使用这些装置来进行基因分型分析以及基因表达分析(例如，差别基因表达研究)。作为替代方案，能够以制备方式使用这些装置来扩增足够的核酸用于进一步分析，例如对扩增的产物进行测序、细胞分型、DNA指纹图谱等。扩增的产物还可以被用于多种基因工程应用中，例如插入一个载体中，然后可以使用该载体来转化细胞以生产所希望的蛋白产物。

虽然在微流体设计以及应用中有这些进展，降低微流体芯片的复杂性以及简化它们的操作应该是有用的。另外，对于增加从微流体装置中回收反应产物的能力存在一种需要。因此，在本领域中对于与微流体装置相关的改进的方法以及系统存在一种需要。

发明内容

在某些实施方案中，本发明提供了用于在多个样品中扩增、标记、以及条形码化多个目标核酸的一种方法。该方法必须针对每个目标核酸制备一种扩增混合物。每个扩增混合物包括：

一个正向引物，该正向引物包括一个目标特异性部分；

一个反向引物，该反向引物包括一个目标特异性部分，其中该正向引物额外地包括一个第一核苷酸标记和/或该反向引物额外地包括一个第二核苷酸标记；以及

至少一个条形码引物，该条形码引物包括一个条形码核苷酸序列以及一个第一和/或第二核苷酸标记特异性部分，其中对于该一种或多种正向和/或反向引物而言该条形码引物是过量的。

使每个扩增混合物经受扩增作用从而生成多个目标扩增子，其中每个目标扩增子包括一个标记的目标核苷酸序列，其中第一和/或第二核苷酸标记位于目标核苷酸序列侧翼，并且至少一个条形码核苷酸序列位于目标扩增子的5’或3’端上。

在具体实施方案中，该正向引物额外地包括一个第一核苷酸标记。如果希望的话，该反向引物可以额外地包括一个第二核苷酸标记。

在标记/条形码化方法的某些实施方案中，在这些扩增混合物中条形码引物的浓度是该一种或多种正向和/或反向引物的浓度的至少4倍。在这类实施方案多个变体中，在这些扩增混合物中条形码引物的浓度是该一种或多种正向和/或反向引物的浓度的至少50倍。

在条形码化/标记方法的多个具体实施方案中，选择该第一和/或第二核苷酸标记和/或条形码核苷酸序列以便避免实质性地退火到目标核酸上。在多个示意性实施方案中，该条形码核苷酸序列鉴别特定的样品。当在某些实施方案中条形码引物包括一个条形码核苷酸序列以及一个第一核苷酸标记特异性部分时，多个正向引物包括相同的第一核苷酸标记。例如，当在不同样品中多个目标将被扩增时，相应于目标组的正向引物组都可以具有相同的第一核苷酸标记。

在条形码化/标记方法的多个具体实施方案中，针对每个目标的正向和反向引物最初是与样品分开结合的，并且每个条形码引物最初是与它的相应的样品结合的。例如，当在S个样品中T个目标将被扩增时，T和S是大于一的整数，该方法可以额外地包括制备S×T个扩增混合物，其中将最初结合的正向和反向引物加入到最初结合的样品和条形码引物中。

在条形码化/标记方法的某些实施方案中，该扩增作用执行至少3个循环从而引入该第一和第二核苷酸标记以及该条形码核苷酸序列。在这些实施方案的多个变体中，扩增作用被执行5至50个循环。在多个具体实施方案中，扩增作用被执行足够数量的循环从而将目标扩增子拷贝数对这些目标并且对这些样品进行归一化。

在条形码化/标记方法的某些实施方案中，当扩增时所生成的至少50％的目标扩增子是以大于50％目标扩增子的拷贝平均数并且小于2倍的目标扩增子拷贝平均数而存在的

在其他实施方案中，本发明提供了一种方法，在该方法中条形码化任选地被省略并且在扩增之后这些目标核苷酸序列被标记。这种方法必须扩增多个目标核酸(典型地在多个样品中)。针对每个目标核酸制备扩增混合物，其中每个扩增混合物包括：

一个正向引物，该正向引物包括一个目标特异性序列；以及

一个反向引物，该反向引物包括一个目标特异性序列；

每个扩增混合物经受一个扩增作用从而生成多个目标核苷酸序列。然后将这些目标核苷酸序列进行标记(例如，通过将核苷酸标记连接到这些目标核苷酸序列的一个或两个末端上)从而生成多个目标扩增子。每个目标扩增子包括第一和/或第二核苷酸标记，这些标记位于目标核苷酸序列的侧翼。在多个具体实施方案中，至少50％的目标扩增子是以大于50％的目标扩增子的拷贝平均数并且小于2倍的目标扩增子的拷贝平均数而存在的。

在此所述的扩增方法的某些实施方案中，至少70％的目标扩增子是以大于50％的目标扩增子的拷贝平均数并且小于2倍的目标扩增子的拷贝平均数而存在的。在多个示意性实施方案中，至少90％的目标扩增子是以大于50％的目标扩增子的拷贝平均数并且小于2倍的目标扩增子的拷贝平均数而存在的。

在多个实施方案中，目标扩增子的平均长度是至少25个碱基、50个碱基、100个碱基、200个碱基、500个碱基、以及750个碱基。更长的平均长度，例如1千个碱基或更多也是可能的，像，例如当使用长片段PCR进行扩增时。在这类实施方案中，扩增可以产生多个目标扩增子，其中至少70％的目标扩增子是以大于50％的目标扩增子的拷贝平均数并且小于2倍的目标扩增子的拷贝平均数而存在的。

在此所述的方法的一个优点是扩增可以(但不是必需的)在小反应体积中进行。在多个具体实施方案中，扩增混合物的体积是在约1皮升至约50纳升的范围内。在某些实施方案中，扩增混合物的体积是在约5皮升至约25纳升的范围内。

在此所述的这些方法可以任选地包括从这些扩增混合物中回收目标扩增子。在某些实施方案中，以在回收目标扩增子中小于约50％改变的体积和/或拷贝数来回收目标扩增子。这些回收的扩增子可以被用于进一步扩增和/或分析(例如，DNA测序)。在一些实施方案中，可以使用对于该第一和第二核苷酸标记具有特异性的引物使至少一个目标扩增子经受扩增作用从而生成缺少条形码核苷酸序列的一种目标扩增子(如果这是希望的话)。

在此处所述的多个方法的具体实施方案中，目标核酸包括基因组DNA。在这些实施方案的多个变体中，基因组DNA可以是旨在用于DNA测序的DNA(例如自动化的DNA测序)。

在某些实施方案中，正向引物、反向引物、以及条形码引物中的一个或多个可以包括至少一个另外的引物结合位点。例如，如果使用条形码引物，该条形码引物可以包括位于该条形码核苷酸序列的上游的至少一个第一另外的引物结合位点，该条形码核苷酸序列是位于第一核苷酸标记的上游的。在这样一个实施方案中，反向引物可以包括位于第二核苷酸标记的下游的至少一个第二另外引物结合位点。在多个具体实施方案中，当这些目标核苷酸序列将通过自动化的DNA测序进行测序时，该第一和第二另外引物结合位点能够被DNA测序引物所结合。

如果不使用条形码引物，并且在扩增之后将这些目标核苷酸序列进行标记，该第一和第二核苷酸标记可能被DNA测序引物所结合。

因此，在此所述的方法可以任选地包括使至少一个目标扩增子经受DNA测序。

在某些实施方案中，该方法可以任选地包括对扩增混合物中目标扩增子的数量进行定量。这个步骤可以例如在自动化DNA测序之前实现。在具体实施方案中，定量包括回收目标扩增子以及使它们经受数字扩增。在具体实施方案中数字扩增包括

将预扩增的目标扩增子分配到离散的反应混合物中，其中平均而言每个反应混合物包括每个反应混合物不大于一个扩增子；并且

使这些反应混合物经受扩增作用。

可以通过实时PCR和/或终点PCR进行数字扩增的定量。

在此所述的扩增方法可以任选地包括确定每个样品中存在的每种目标核酸的数量。在某些实施方案中，这些方法可以在确定每个样品中目标核酸的拷贝数中得以实现。在多个具体实施方案中，这些方法可以在确定相应于目标核酸的基因座处的基因型中得以实现。在其他多个实施方案中，这些方法可以在确定目标核酸的表达水平中得以实现。

在多个具体实施方案中，本发明涉及多种微流体装置。更具体地说，本发明涉及一种微流体装置，该微流体装置提供了反应产物的回收。仅通过举例，该方法和装置已经被用于一种PCR样品制备系统，该系统用于制备文库，该文库用于下一代测序。然而，应当认识到的是本发明具有广泛的多的可应用性范围。

根据本发明的一个实施方案，提供了一种微流体装置。该微流体装置包括多个第一输入管线以及多个第二输入管线。该微流体装置还包括多组第一室以及多组第二室。每组第一室都与多个第一输入管线之一流体连通，并且每组第二室都与多个第二输入管线之一流体连通。该微流体装置进一步包括与多个第二输入管线的一个第一部分流体连通的多个第一泵元件，以及与多个第二输入管线的一个第二部分流体连通的多个第二泵元件。

根据本发明的另一个实施方案，提供了操作微流体装置的一种方法，该微流体装置具有一个测定室、一个样品室、以及一个收集端口。该方法包括关闭测定室与样品室之间的流体管线，使样品通过样品输入管线流入样品室，并且使测定液通过测定液输入管线流入测定室。该方法还包括开放测定室与样品室之间的流体管线，使样品的至少一部分与测定液的至少一部分相结合从而形成一种混合物，并且使该混合物发生反应从而形成一种反应产物。该方法进一步包括将测定室与样品室之间的流体管线关闭，使收集试剂从收集端口流动到样品室中，并且从微流体装置中取出反应产物。

根据本发明的一个具体实施方案，提供了制备多种反应产物的一种方法。该方法包括提供M个样品并且提供N个测定液。该方法还包括将M个样品与N个测定液混合从而形成M x N配对组合。M x N配对组合的每一个都被包含在一个封闭的体积内。该方法进一步包括从这些M x N个配对组合中形成M x N个反应产物，并且对这些M x N个反应产物进行回收。

与传统技术相比较，通过本发明多种益处得以实现。例如，本发明的多个实施方案提供了M x N个样品和测定液的混合以及反应，紧接着将反应产物回收到样品乘样品集合中。另外，使用膨胀泵以从微流体装置中基本上去除所有反应产物，这在不同反应产物集合之间提供了均匀性。与常规技术相比较，使用在此所述的系统以及方法降低了制备文库所需要时间以及工作强度。与下文以及附图相结合，本发明的这些以及其他实施方案连同它的多个优点以及特征一起将被更详细地予以说明。

附图说明

通过参考下面说明书与说明本发明的某些具体实施方案的附图相结合可以理解本发明。

图1以平面图的方式描绘了一个示例性的基质类型微流体装置。

图2是允许回收反应产物的载体以及微流体装置的一个简化的透视图。

图3是允许回收反应产物的微流体装置的一个简化的示意图。

图4是图3中所示微流体装置的几个单元的一个简化的示意图。

图5A是允许回收反应产物的微流体装置的一个简化的示意图。

图5B是图5A中所示的微流体装置的多个部分的一个简化的示意图。

图6是图5A中所示的微流体装置的几个单元的一个简化的示意图。

图7是操作允许回收反应产物的微流体装置的方法的一个简化的流程图。

图8A-8D是简化的示意图，这些示意图说明了在操作期间流体流动通过允许回收反应物产物的微流体装置的多个单元。

图9A-9D是简化的示意图，这些示意图说明了在操作期间流体流动通过允许回收反应物产物的微流体装置。

图10说明了在测序之前用于将目标核酸条形码化的一个3引物扩增方法的实施方案。

图11显示了实例1中所述的凝胶的一个照片。泳道如下：(2)分子标记、(4)用454尾扩增的样品、(5)用454尾扩增的样品(NTC)、(7)用A5引物对扩增的样品、(8)用A5引物对扩增的样品(NTC)、(10)用3个引物扩增的样品、以及(11)用3个引物扩增的样品(NTC)。

图12显示了在实例4中在Access Array IFC(整合流体电路)上针对每个单独样品运行的从4个Agilent 1K Biolanalyzer芯片中得到的凝胶视图的电泳图。该图中每个柱都显示在各样品中DNA产物的尺寸分布。所有样品都产生类似的产物分布。

图13A-13B显示了来自实例4的结果。A)针对这组目标特异性引物所有PCR产物的预测尺寸。B)从Access Array IFC得到的样品集合之一的电泳图。单一产物集合中产物尺寸分布。所有产物都落在(B)中所示的预测尺寸范围内。

图14A-14C显示了来自实例4的结果。A)在454序列运行上每个条形码计数的序列数。上面水平线表示2x的每个条形码的计数平均数。下面水平线表示50％的每个条形码的计数平均数。B)每个扩增子的计数的序列数。图上每个点表示对于Access Array IFC上单个室的序列在测序仪上测量的次数。三角形的点表示具有大于2x平均表示的PCR反应。暗灰色点表示具有小于0.5x平均表示的PCR反应。C)扩增子表示的频率分布。深灰色线表示在给定表示中存在的扩增子的数目。浅灰色线表示在给定的覆盖率下可以测量到的读取次数(例如，在20x覆盖率下为98％)。在2倍之内扩增子的百分比为平均95.8％；在5倍之内扩增子的百分比为平均99.7％.。

图15A-15B显示了使用具有引物结合位点和核苷酸标记的不同组合的4个外侧引物的多引物反应方案的一个实例。(实例5)。A)两个正向条形码引物(454B-BC-Tag8，454A-BC-Tag8)和两个反向条形码引物(454A-BC-Tag5，454B-BC-Tag8)与一个内侧引物对(Tag8-TSF以及Tag5-TSR)相结合。B)从这个PCR反应形成的两个主要PCR产物。由于PCR抑制，在每个末端上包含454-ATag8以及454A-Tag5或在每个末端上包含454B-Tag8以及454B-Tag5的PCR产物不产生显著的PCR产物。

图16A-16B显示了针对图15B中每个扩增子而言每个引物序列在各自样品中的表示。在样品中将每个扩增子计数的序列数对于每个扩增子计数的平均数进行归一化。在A和B乳液之间将单独扩增子的归一化的计数汇总，其中(A)是乳液A中Tag5扩增子加上乳液B中Tag 8扩增子，并且(B)是乳液B中Tag5扩增子加上乳液A中Tag 8扩增子。中间暗灰色线代表每个扩增子的平均表示。上面的浅灰色线代表2x平均覆盖率。下面浅灰色线代表50％的平均表示。

图17显示了来自实例6的结果：使用设计用于Illumina GA II测序仪上的4引物策略成功地扩增PCR产物。列于表14中的条形码引物被标记为外侧短片段。

图18显示了来自实例8的结果(当这些PCR反应是针对单独的模板特异性引物以及以4引物模式运行时，三个集合的10组PCR引物(A，B，C)的PCR反应)。在该4引物策略中较高分子量产物的存在证明成功的4引物组装。

图19显示了来自实例8的结果(在使用内侧和外侧引物的多重4引物PCR中改变内侧和外侧引物的比率影响了产率)。

具体实施方式

在某些实施方案中，本发明提供了多种扩增方法，其中一个或多个核苷酸标记以及一个条码核苷酸序列被加入到目标核苷酸序列中。然后可以将加入的序列用作引物和/或探针结合位点。条形码核苷酸序列可以编码信息，例如像样品来源、它附连于其上的相关的目标核酸序列。标记和/或条形码化的目标核苷酸序列可以增加可针对在一个单一测定中一个或多个目标进行分析的样品的数量，同时将测定成本的增加降至最低。这些方法是特别适合用于增加微流体装置上进行测定的效率。

在多个具体实施方案中，通过例如针对DNA测序引物添加结合位点，任选地紧接着针对DNA测序进行样品校准，使用这些方法来制备核酸用于DNA测序。在具体的示意性实施方案中，在允许回收反应产物的微流体装置中可以使用这种方法来针对DNA测序引物添加结合位点。在这种类型的示意性装置中，可以使用膨胀泵从微流体装置中基本上去除所有反应产物，这在不同反应产物集合之间提供了均匀性。因此，生成条形码化反应产物的多个集合是可能的，就体积以及拷贝数而言这些产物是均匀的。在不同实施方案中，体积和/或拷贝数均匀性是这样的使得就体积和/或拷贝数而言，从该装置回收的每个集合的变率是小于约100％、小于约90％、小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约17％、或小于约15％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％、或0.5％。本领域普通技术人员应当理解到体积和/或拷贝数变率可以落在由这些值中任何一个所限定的任何范围内(例如约2％至约7％)。在一个示意性实施方案中，从微流体装置中回收的体积样品改变不大于约10％。标准的吸量误差是在5％至10％之间的数量级上。因此，在体积方面观察到的变率主要归因于吸量误差。与常规技术相比较，使用在此所述的系统以及方法降低了制备测序文库所需要时间以及工作强度。

应当理解的是本发明不限于在此所述的这些具体的方法、实验方案、以及试剂等，因为熟练的业内人士可以对这些进行改变。还应当理解的是在此使用的术语是仅用于说明具体的示意性实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围。还应当注意的是如在此以及随附的权利要求中所使用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式的“一种”、“一个”、以及“该”包括复数指示物。因此，例如，提及“一个单元”是提及一个或多个单元以及本领域普通技术人员已知的它们的等效物。

通过参考在附图中描述和/或说明的并且在下面说明书中详细说明的非限制性实施方案以及实例将更全面地说明本发明的实施方案以及它们的不同特征以及有利的细节。应当注意的是在附图中所述的特征不必按比例绘制，并且当熟练的业内人士可以认可时，一个实施方案的特征可以与其他实施方案一起使用，尽管在此没有清楚地说明。熟知的部件以及加工技术的说明可以省略以便不使本发明的实施方案变得不必要地模糊不清。

定义

除非另外说明，权利要求以及说明书中所使用的术语是如下面列出定义的。为了清楚的目的这些术语被专门地定义，但是所有这些定义都符合熟练业内人士如何理解这些术语的情况。

术语“邻近”，当在此使用用于核酸中指两个核苷酸序列时，可以指核苷酸序列分开0至约20个核苷酸、更具体地说，在约1至约10个核苷酸的范围内，或直接地彼此邻接的序列。

术语“核酸”是指核苷酸聚合物，并且除非另外限制，包括天然核苷酸的已知的类似物，这些类似物能够以与天然发生的核苷酸类似方式起作用(例如杂交)。

术语核酸包括任何形式的DNA或RNA，包括例如基因组DNA；互补DNA(cDNA)，互补DNA是mRNA的一种DNA表示，通常通过信使RNA(mRNA)的逆转录、或者通过扩增而得到；合成方式或通过扩增生产的DNA分子；以及mRNA。

术语核酸包括双链或三链核酸，以及单链分子。在双链或三链核酸分子中，核酸链不必共同延伸(即双链核酸不必沿着两个链的整个长度是双链的)。

术语核酸还包括它们的任何化学修饰(例如通过甲基化和/或通过加帽)。核酸修饰可以包括加入化学基团，这些化学基团将额外的电荷、可极化性、氢键、静电作用、以及功能性结合到单独的核酸碱基上或结合到核酸上成为一个整体。这类修饰可以包括碱基修饰，例如2’-位置糖修饰、5-位置嘧啶修饰、8-位置嘌呤修饰、在胞嘧啶环外胺上的修饰、5-溴-尿嘧啶的取代、主链修饰、稀有碱基配对组合，例如异碱基类异胞苷以及异胍等。

更具体地说，在某些实施方案中，核酸可以包括多聚脱氧核糖核苷酸类(包含2-脱氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸类(包含D-核糖)、以及任何其他类型的核酸，该核酸是嘌呤或嘧啶碱的一个N-或C-糖苷、以及其他包含非核苷酸主链的聚合物，例如，聚酰胺(例如，核酸肽类(PNA))以及聚吗啉代(可从俄勒冈州科瓦利斯市的Anti-Virals公司以Neugene名称商购)聚合物、以及其他合成的序列特异性核酸聚合物，其条件是这些聚合物包含处于一种构型的核碱基，该构型允许碱基配对以及碱基堆集，例如在DNA以及RNA中发现的一样。术语核酸还包括锁核酸类(LNA)，在美国专利号6,794,499、6,670,461、6,262,490、以及6,770,748中对这些锁核酸进行了说明，就它们的LNA的披露而言，这些专利通过引用以其全部内容结合在此。

可以从完全化学合成方法(例如固相介导的化学合成)，从生物来源(例如通过从产生核酸的任何物种中分离)，或从涉及通过分子生物学工具(例如DNA复制、PCR扩增、逆转录)处理核酸的方法，或从这些方法的一种组合中得到一种或多种核酸。

在此使用术语“目标核酸”是指在本发明的方法中有待检测的特定核酸。

如在此使用的术语“目标核苷酸序列”是指一种分子，该分子包括一种目标核酸的核苷酸序列，像，例如，通过扩增目标核酸而得到的扩增产物或当将RNA目标核酸逆转录时所生成的cDNA。

如在此使用的术语“互补”是指在两个核苷酸之间精确配对的能力。即，如果在一个给定位置上一个核酸的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸形成氢键，则这两个核酸被认为在该位置上是彼此互补的。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中仅一些核苷酸进行结合，或当单链分子之间存在完全互补性时，它可以是完全的。核酸链之间互补性的程度对于核酸分子之间杂交的效率以及强度具有显著影响。

“特异性杂交”是指在定义的严格条件下一个核酸结合到一个目标核苷酸序列上，不实质性地结合到杂交混合物中存在的其他核苷酸序列上。本领域普通技术人员应当知道放松杂交条件的严格性将允许容忍序列错配。

在多个具体实施方案中，在严格杂交条件下进行杂交。术语“严格杂交条件”总体上是指在定义的离子强度和pH下对于特定序列而言温度在低于解链温度(T_m)从约5℃至约20℃或25℃的范围内。如在此使用的，T_m是一个集合的双链核酸分子被半解离成单链的温度。用于计算核酸的T_m的方法在本领域中是熟知的(参见，例如，Berger and Kimmel(1987)METHODS IN ENZYMOLOGY，VOL.152：GUIDETO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES，San Diego：Academic Press，Inc.和Sambrook et al.(1989)MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2NDED.，VOLS.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory)，两者都通过引用结合在此)。如标准参考文献所指出的，当核酸处于1M NaCl的水溶液中时，可以通过下面等式计算T_m值的简单估计T_m＝81.5+0.41(％G+C)(参见，例如，Anderson and Young，Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(1985))。杂交体的解链温度(以及因此用于严格杂交的条件)被多种因素影响，例如引物或探针的长度以及性质(DNA、RNA、碱基组成)以及目标核酸的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或固定的等)，以及盐和其他组分的浓度(例如，甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在与否)。这些因素的影响是熟知的并且在本领域中在标准参考文献中进行了讨论。适合用于实现大多数序列的特异性杂交的示例性的严格条件是：在pH7至少约60℃的温度以及约0.2摩尔的盐浓度。

使用术语“寡核苷酸”是指一种核酸，该核酸是相对短的，总体上短于200个核苷酸、更特别地短于100个核苷酸、最特别地短于50个核苷酸。典型地，寡核苷酸是单链DNA分子。

术语“引物”是指一种寡核苷酸，在适宜的条件下(即在四种不同核苷三磷酸以及一种聚合反应试剂(例如，DNA或RNA聚合酶或逆转录酶)的存在下)在适宜的缓冲液中并且在适宜的温度下该寡核苷酸能够与一种核酸杂交(也称为“退火”)并且用作核苷酸(RNA或DNA)聚合反应的起始位点。引物的适当的长度取决于引物的预期用途，但是典型地引物是至少7个核苷酸长度，更典型地范围从10个核苷酸至30个核苷酸，或甚至更典型地从15个核苷酸至30个核苷酸长度。其他引物可以是稍微更长的，例如30至50个核苷酸长度。在此上下文中，“引物长度”是指杂交到互补的“目标”序列上并且引发核苷酸合成的寡核苷酸或核酸的部分。短引物分子总体上需要更冷的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合体。引物不必反映模板的确切序列但是必须是足够互补的以与模板杂交。术语“引物位点”或“引物结合位点”是指引物杂交到其上的目标核酸的片段。

如果引物、或它的一部分杂交到核酸中的一个核苷酸序列上，引物被说成退火到另一个核酸上。引物杂交到特定核苷酸序列上的陈述不旨在暗示该引物完全地或唯一地杂交到该核苷酸序列上。例如，在某些实施方案中，在此使用的扩增引物被说成“退火到核苷酸标记上”。这种说明包括完全退火到核苷酸标记上的引物以及部分地退火到核苷酸标记上以及部分地退火到邻近核苷酸序列(例如一个目标核苷酸序列)上的引物。这类杂交引物可以增加扩增反应的特异性。

如在此使用的，选择引物“以便避免实质性地退火到目标核酸上”是指选择引物这样使得在扩增之后检出的大多数扩增子在下面意义上是“全长的”，即它们是从在目标核酸的每个末端上在预期的位点处启动而得到的，与从目标核酸内启动而得到的扩增子相反(它们生成比预期更短的扩增子)。在不同实施方案中，选择引物从而至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是全长的。

术语“引物对”是指一组引物，这组引物包括与有待扩增的DNA序列的5’末端的互补序列杂交的一个5’“上游引物”或“正向引物”，以及与有待扩增的序列的3’末端杂交的一个3’“下游引物”或“反向引物”。如本领域普通技术人员应当了解的，在具体实施方案中术语“上游”和“下游”或“正向”和“反向”不旨在进行限制，而是提供示意性的方向。

“探针”是能够通过一种或多种类型的化学键(通常通过互补碱基配对，经常通过氢键形成)结合到互补序列的目标核酸上的一种核酸，因此形成一种双链结构。探针结合或杂交到“探针结合位点”上。探针可以用可检出的标记物进行标记以允许容易地检出探针，特别是一旦探针杂交到它的互补目标物上时。然而，作为替代方案，探针可以是未标记的，但可以是通过与直接地或间接地标记的配体特异性结合而可以检出的。在尺寸方面探针可以显著地改变。总体上，探针是至少7至15个核苷酸长度。其他的探针是至少20、30、或40个核苷酸长度。而其他探针是稍微更长的，为至少50、60、70、80、或90个核苷酸长度。而其他探针仍然是更长的，并且是至少100、150、200或更多的核苷酸长度。探针还可以是任何长度，该长度在由上述值中任何一项所限定的任何范围内(例如，15至20个核苷酸长度)。

引物或探针可以是与目标核酸序列完全互补的或可以是小于完全互补的。在某些实施方案中，在至少7个核苷酸的序列上，更典型地在10至30个核苷酸范围内的序列上，并且通常在至少14-25个核苷酸的序列上，该引物与目标核酸序列的互补序列具有至少65％一致性，并且更经常地具有至少75％一致性、至少85％一致性、至少90％一致性、或至少95％、96％、97％、98％、或99％一致性。应当理解的是总体上令人希望的是某些碱基(例如引物的3’碱基)是与目标核酸序列的相应的碱基完全互补的。在严格杂交条件下引物和探针典型地退火到目标序列上。

在此使用术语“核苷酸标记”是指一种预定的核苷酸序列，该序列被加入到目标核苷酸序列中。该核苷酸标记可以编码关于该目标核苷酸序列的一项信息，例如目标核苷酸序列的身份或该目标核苷酸序列从中得到的样品的身份。在某些实施方案中，这类信息可以被编码到一个或多个核苷酸标记中，例如两个核苷酸标记的一个组合，在目标核苷酸序列的两个末端之一上的一个可以编码目标核苷酸序列的身份。

如在此使用的术语“条形码引物”是指包括一种特异性条形码核苷酸序列的引物，该核苷酸序列编码了关于当条形码引物被用于扩增反应时所生成的扩增子的信息。例如，可以使用不同的条形码引物以从大量不同样品的每一个中扩增一个或多个目标序列，这样使得条形码核苷酸序列指示得到的扩增子的样品来源。

如在此使用的，术语“编码反应”是指其中至少一种核苷酸标记被加入到目标核苷酸序列中的一种反应。例如可以通过一种“编码PCR”(其中至少一个引物包括一个目标特异性部分以及位于该目标特异性部分的5’末端上的一个核苷酸标记、以及一个第二引物，该第二引物仅包括一个目标特异性部分或一个目标特异性部分和位于该目标特异性部分的5’末端上的一个核苷酸标记)加入核苷酸标记。关于可用于编码PCR的PCR方案的示意性实例，参见未决的WO申请US03/37808以及美国专利号6,605,451。还可以通过一种“编码连接”反应(该反应可以包括一个连接反应，其中至少一个引物包括一个目标特异性部分以及位于该目标特异性部分的5’末端上的一个核苷酸标记，以及一个第二引物，该第二引物仅包括一个目标特异性部分或一个目标特异性部分和位于该目标特异性部分的5’末端上的一个核苷酸标记)来加入核苷酸标记。示意性的编码连接反应被描述于例如美国专利申请号2005/0260640中，该专利通过引用以其全部内容结合在此(并且特别地是针对连接反应)。

如在此所使用的一个“编码反应”生成了一个“标记的目标核苷酸序列”，该核苷酸序列包括连接到一个目标核苷酸序列上的一个核苷酸标记。

如在此使用的，参考引物的一部分，术语“目标特异性”核苷酸序列是指在适当的退火条件下能够特异性退火到一个目标核酸或一个目标核苷酸序列上的序列。

如在此使用的，参考引物的一部分，术语“核苷酸标记特异性核苷酸序列”是指在适当的退火条件下能够特异性地退火到一个核苷酸标记上的序列。

根据本发明传授的内容所述的扩增包括使至少一种目标核酸的至少一部分再生的任何手段，典型地是以模板依赖性方式，包括但不限于，用于线性或指数扩增核酸序列的广泛的技术。用于完成扩增步骤的示意性手段包括连接酶链式反应(LCR)、连接酶检测反应(LDR)、连接紧接着Q-复制酶扩增、PCR、引物延伸、链置换扩增(SDA)、超支化链置换扩增、多重置换扩增(MDA)、基于核酸链的扩增(NASBA)、两步多重扩增、滚环扩增(RCA)、等，包括它们的多种形式以及组合，例如但不限于OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/PCR、PCR/LCR(也称为组合链反应-CCR)，等。除了其他来源之外，这类技术的说明可以在下面各项中找到：Ausbel et al.；PCR Primer：A Laboratory Manual，Diffenbach，Ed.，ColdSpring Harbor Press(1995)；The Electronic Protocol Book，Chang Bioscience(2002)；Msuih et al.，J.Clin.Micro.34：501-07(1996)；The Nucleic Acid Protocols Handbook，R.Rapley，ed.，Humana Press，Totowa，N.J.(2002)；Abramson et al.，Curr Opin Biotechnol.1993Feb.；4(1)：41-7，美国专利号6,027,998；美国专利号6,605,451，Barany et al.，PCT公开号WO97/31256；Wenz et al.，PCT公开号WO01/92579；Day et al.，Genomics，29(1)：152-162(1995)，Ehrlich et al.，Science 252：1643-50(1991)；Innis et al.，PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications，Academic Press(1990)；Favis et al.，Nature Biotechnology 18：561-64(2000)；和Rabenau et al.，Infection 28：97-102(2000)；Belgrader，Barany and Lubin，Development of a Multiplex Ligation Detection ReactionDNA Typing Assay，Sixth International Symposium on Human Identification，1995(在下面的互联网址上可以得到：promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html-)；LCR试剂盒说明书，目录号200520，Rev.#050002，Stratagene，2002；Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：188-93(1991)；Bi and Sambrook，Nucl.Acids Res.25：2924-2951(1997)；Zirvi et al.，Nucl.Acid Res.27：e40i-viii(1999)；Dean et al.，Proc Natl Acad SciUSA 99：5261-66(2002)；Barany and Gelfand，Gene 109：1-11(1991)；Walker et al.，Nucl.Acid Res.20：1691-96(1992)；Polstra et al.，BMC Inf.Dis.2：18-(2002)；Lage et al.，Genome Res.2003Feb.；13(2)：294-307，和Landegren et al.，Science 241：1077-80(1988)，Demidov，V.，Expert Rev Mol Diagn.2002 Nov.；2(6)：542-8.，Cook et al.，J MicrobiolMethods.2003 May；53(2)：165-74，Schweitzer et al.，Curr Opin Biotechnol.2001Feb.；12(1)：21-7，美国专利号5,830,711、美国专利号6,027,889、美国专利号5,686,243、PCT公开号WO0056927A3、以及PCT公开号WO9803673A1。

在某些实施方案中，扩增包括至少下面各项的连续步骤的一个循环：将至少一个引物与至少一个目标核酸中互补的或基本上互补的序列一起退火；使用聚合酶以模板依赖性方式合成核苷酸的至少一个链；并且将新形成的核酸双链变性以分离这些链。该循环可以或不可以被重复。扩增可以包括热循环或能以等温方式完成。

在此使用术语“qPCR”是指定量实时聚合酶链式反应(PCR)，该反应还被称为“实时PCR”或“动力学聚合酶链式反应”。

“试剂”广义地是指除了分析物(例如被分析的核酸)之外用于反应中的任何试剂。用于核酸扩增反应的示意性试剂包括但不限于，缓冲剂、金属离子、聚合酶、逆转录酶、引物、模板核酸、核苷酸、标记物、染料、核酸酶、等。用于酶反应的试剂包括例如底物、辅因子、缓冲剂、金属离子、抑制剂、以及活化剂。

在此使用术语“通用检测探针”是指鉴别一种扩增产物存在的任何探针(无论产物中存在的目标核苷酸序列的身份如何)。

在此使用术语“通用qPCR探针”是指在qPCR期间鉴别扩增产物的存在的任何这类探针。在具体实施方案中，根据本发明的核苷酸标记可以包括检测探针(例如通用qPCR探针)结合到其上的一个核苷酸序列。当标记被加到目标核苷酸序列的两个末端上时，如果想要的话每个标记可以包括一个被一个检测探针识别的序列。这类序列的组合可以编码关于标记的目标核苷酸序列的身份或样品来源的信息。在其他实施方案中，一个或多个核苷酸引物可以包括一个检测探针(例如一个通用qPCR探针)结合到其上的一个核苷酸序列。以这种方式，在本发明的方法的扩增步骤期间一个、两个、或多个探针结合位点可以被加到一个扩增产物中。本领域普通技术人员知道在预扩增期间(如果执行的话)引入多个探针结合位点的可能性，并且扩增有助于多重检测，其中可以在一个给定的扩增混合物或它的等分部分中检出两种或更多种不同的扩增产物。

术语“通用检测探针”还旨在包括用可检出标记物(例如，荧光标记物)标记的探针、以及非序列特异性探针，例如DNA结合染料，包括双链DNA(dsDNA)染料，例如SYBR Green。

在此使用术语“目标特异性qPCR探针”是指一种qPCR探针，该探针基于qPCR探针杂交到产物中存在的目标核苷酸序列上来鉴别qPCR期间扩增产物的存在。

总体上“水解探针”描述于美国专利号5,210,015中，该专利通过引用以其全部内容结合在此用于说明其水解探针。水解探针利用典型地用于PCR反应中的耐热的Taq聚合酶中存在的5’核酸酶活性(

probe technology，Applied Biosystems，Foster City CA)。该水解探针用荧光检测器染料(例如二氢荧光素)以及一种接收器染料或猝灭剂进行标记。总体上，荧光染料被共价地附连到探针的5’末端上并且猝灭剂被附连到探针的3’末端上，并且当探针完整时，检测器染料的荧光被荧光共振能量转移(FRET)淬灭。探针退火到多个引物之一的下游，这些引物定义了PCR反应中目标核酸的一个末端。使用Taq酶的聚合酶活性，通过一个引物，该引物位于探针上游，以及一个第二引物，该引物位于探针下游但退火到目标核酸的相反链上，来引导目标核酸的扩增。当上游引物延伸时，Taq聚合酶达到其中标记的探针被退火的区域，将探针-模板杂交体识别为底物，并且将探针的磷酸二酯键水解。水解反应不可撤销地解除了猝灭剂染料在报告染料上的猝灭作用，因此导致随着每个依次的PCR循环检测荧光增加。具体地，适合用于本发明的水解探针可以能够检出8-链节或9链节的基序，这些基序在人类和其他基因组和/或转录子组中是共同的并且具有通过使用锁核酸(LNA)类似物而能够具有约70℃的高T_m。

如在此使用的术语“标记”是指能够用于提供可检出的和/或可定量的信号的任何原子或分子。具体地，可以将标记物直接地或间接地附连到核酸或蛋白上。可以附连到探针上的适合的标记物包括但不限于放射性同位素类、荧光团类、生色团类、质量标记、电子致密颗粒、磁性颗粒、自旋标记、发出化学发光的分子、电化学活性分子类、酶类、辅因子类、以及酶底物类。

如在此所使用的术语“染料”总体上是指在大于或等于340nm的波长处吸收电磁辐射的任何有机的或无机的分子。

如在此使用的术语“荧光染料”总体上是指当通过荧光电磁辐射来源(例如一个灯、一个光电二极管、或一个激光)进行照射时通过荧光机理发出较长波长电磁辐射的任何染料。

术语“弹性体”具有本领域中所使用的一般性含义。因此，例如，Allcock等人(Contemporary Polymer Chemistry，2nd Ed.)说明了弹性体总体上作为聚合物存在于它们的玻璃转化温度与液化温度之间的温度下。弹性材料显示出弹性特性，因为这些聚合物链易于耐受扭转移动从而允许使主链响应于一个力而解螺旋，其中主链解螺旋从而呈现出在缺少该力的情况下先前的形状。总体上，当施加力时弹性体变形，但是然后当去除该力时，它们返回到它们的初始形状。

“多态性标志物”或“多态位点”是一个基因座，在该基因座上出现核苷酸序列趋异。示例性标志物具有至少两个等位基因，每个以大于1％、并且更典型地大于10％或20％的选择集合的频率出现。多态性位点可以是小至一个碱基对。多态性标志物包括限制性片段长度多态性(RFLP)、可变数量串联重复(VNTR)、超可变区、小卫星序列、双核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、简单序列重复、缺失、以及插入元件，例如Alu。首先鉴定的等位基因形式被任意指定为参考形式并且其他等位基因形式被指定为替代的或变体的等位基因。在选择的集合中最频繁出现的等位基因形式有时被称为野生型。对于等位基因形式而言，二倍体生物可以是纯合的或杂合的。双等位基因多态性具有两种形式。三等位基因多态性具有三种形式。

“单核苷酸多态性”出现在被单核苷酸占据的多态性位点，这个位点是等位基因序列之间出现变化的位点。该位点通常在等位基因的高度保守的序列(例如，在这些集合的小于1/100或1/1000的成员中发生变化的序列)之前或之后。由于在多态性位点处一个核苷酸被取代成另一个核苷酸，通常出现SNP。转变是通过另一个嘌呤来替换一个嘌呤或者通过另一个嘧啶来替换一个嘧啶。转换是通过一个嘧啶来替换一个嘌呤或反之亦然。SNP还可以通过相对于参考等位基因缺失一个核苷酸或插入一个核苷酸而产生。

扩增方法

总论

在具体实施方式中，本发明提供了用于将多个(例如至少三个)选择的核苷酸序列引入到一种或多种目标核酸中的一种扩增方法。这种方法必须扩增多个目标核酸(典型地在多个样品中)。在示意性实施方案中，可以在两个或更多个不同样品的每一个中扩增同一组目标核酸。这些样品可以在任何方面彼此不同，例如这些样品可以是来自不同组织、受试者、环境来源等。可以使用至少三个引物来扩增每个目标核酸，即：正向和反向扩增引物，每个引物包括一个目标特异性部分，并且一个或两个引物包括一个核苷酸标记。这些目标特异性部分可以在适当的退火条件下特异性地退火到目标上。用于正向引物的核苷酸标记可以具有与用于反向引物的核苷酸标记相同或不同的序列。总体上，这些核苷酸标记是这些目标特异性部分的5’。第三个引物是一种条形码引物，该条形码引物包括一个条形码核苷酸序列以及一个第一和/或第二核苷酸标记特异性部分。这种条形码核苷酸序列是选择用于编码关于当条形码引物被用于扩增反应时所生成的扩增子信息的一种序列。这种标记特异性部分可以特异性地退火到正向和反向引物中的一个或两个核苷酸标记上。总体上这种条形码引物是目标特异性部分的5’。

这些条形码引物典型地以超过该一种或多种正向和/或反向引物的量存在于扩增混合物中。更确切地说，如果条形码引物退火到正向引物中的核苷酸标记上，总体上该条形码引物以超过正向引物的量存在。如果条形码引物退火到反向引物中的核苷酸标记上，总体上该条形码引物以超过反向引物的量存在。在每种情况中，在扩增混合物中的第三引物(即反向引物或正向引物)对应地能够以大致类似于条形码引物的浓度存在于示意性实施方案中。总体上，条形码引物以实质性地过量形式存在。例如，扩增混合物中条形码引物的浓度可以是相对于该一种或多种正向和/或反向引物的浓度的至少2倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少10³倍、至少5×10³倍、至少10⁴倍、至少5×10⁴倍、至少10⁵倍、至少5×10⁵倍、至少10⁶倍或更高。此外，条形码引物的浓度超过量可以落在以上述数值的任何一项作为端点的任何范围内(例如，2倍至10⁵倍)。在示意性实施方案中，当条形码引物具有对于正向引物上的核苷酸标记具有特异性的一个标记特异性部分时，该正向引物能够以皮摩尔至纳摩尔的浓度存在，例如约5pM至500nM、约5pM至100nM、约5pM至50nM、约5pM至10nM、约5pM至5nM、约10pM至1nM、约50pM至约500pM、约100pM至以这些数值任何一项作为端点的任何其他范围(例如，10pM至50pM)。适当地，当与正向引物的这些浓度中任何一项相组合时可以使用的条形码引物的示例性浓度包括约10nM至约10μM、约25nM至约7.5μM、约50nM至约5μM、约75nM至约2.5μM、约100nM至约1μM、约250nM至约750nM、约500nM或以这些数值中任何一项作为端点的任何其他范围(例如，100nM至500nM)。在使用这类浓度的正向和条形码引物的扩增反应中，反向引物具有与条形码引物处于同一数量级的浓度(例如，在约10倍之内，在约5倍之内，或相等)。

可以使每个扩增混合物经受扩增作用从而生成多个目标扩增子，这些目标扩增子包括标记的目标核苷酸序列，每个序列包括位于该目标核苷酸序列侧翼的第一和第二核苷酸标记，以及位于该目标扩增子的5’或3’端上的至少一个条形码核苷酸序列(相对于目标扩增子的一个链)。在某些实施方案中，选择该第一和第二核苷酸标记和/或条形码核苷酸序列以便避免实质性地退火到目标核酸上。在这类实施方案中，这些标记的目标核苷酸序列可以包括具有下面各项元件的多种分子：5’-(条形码核苷酸序列)-(来自正向引物的第一核苷酸标记)-(目标核苷酸序列)-(来自反向引物的第二核苷酸标记序列)-3’或5’-(来自正向引物的第一核苷酸标记)-(目标核苷酸序列)-(来自反向引物的第二核苷酸标记序列)-(条形码核苷酸序列)-3’。

在多个示意性实施方案中，该条形码核苷酸序列鉴别特定的样品。因此，例如可以在S个样品的每一个中扩增T个目标核苷酸的一个组，其中S和T是整数，典型地大于一。在这类实施方案中，可以分开地对每个样品进行扩增，其中每个样品使用同一组正向和反向引物并且该组正向和反向引物具有至少一个核苷酸标记，该核苷酸标记对于该组中所有引物是共同的。每个样品可以使用不同的条形码引物，其中这些条形码引物具有不同的条形码核苷酸序列，但是可以退火到共同核苷酸标记上的标记特异性部分是相同的。这个实施方案具有减少不同引物的数量的优点，这些引物将需要被合成以将样品来源编码到针对多个目标序列生成的多个扩增子中。作为替代方案，每个样品可以使用不同组的正向和反向引物，其中每个组具有与其他组中的引物不同的核苷酸标记，并且每个样品可以使用不同的条形码引物，其中这些条形码引物具有不同的条形码核苷酸序列以及不同的标记特异性部分。在两种情况之一中，这种扩增作用从携带样品特异性条形码的每个样品中生成了一组T个扩增子。

在实施方案中，其中每个样品使用同一组正向和反向引物，每一组的正向和反向引物最初可以与样品分开结合，并且每个条形码引物最初可以与它的相应的样品相结合。然后可以将最初结合的正向和反向引物的等分部分加入到最初结合的样品和条形码引物的等分部分中从而生成S×T个扩增混合物。然后可以在任何物品中形成这些扩增混合物，可以使该物品经受适合用于扩增的条件。例如，在扩增之前这些扩增混合物可以形成于，或分布于，微流体装置的分离的区室中。在示意性实施方案中适当的微流体装置包括基质类型的微流体装置，例如下面说明的那些。

可以使用任何扩增方法来从多种扩增混合物中生成扩增子。在示例性实施方案中，使用PCR。该扩增作用总体上被执行至少3个循环从而引入该第一和第二核苷酸标记以及该条形码核苷酸序列。在不同实施方案中，扩增作用被执行5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个循环，或落在以这些数值中任何一项作为端点的范围内的任何数量的循环(例如，5-10个循环)。在具体实施方案中，扩增作用被执行足够数量的循环以使目标扩增子拷贝数对于目标并且对于样品进行归一化(例如，15、20、25、30、35、40、45或50个循环，或落在以这些数值的任何一项作为端点的范围内的任何数量的循环)。

上述方法的具体实施方案提供了实质性地均匀扩增，产生了多个目标扩增子，其中大多数扩增子以相对接近于针对多个目标扩增子计算的平均拷贝数的水平存在。因此，在不同实施方案中，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的目标扩增子以大于50％的目标扩增子的拷贝平均数以及小于2倍的目标扩增子的拷贝平均数存在。

在某些实施方案中本发明还提供了用于扩增多个目标核苷酸的一种方法，其中条形码化被任选地省略并且在扩增之后对目标核苷酸序列进行标记。更确切地说，本发明提供了用于扩增多个目标核酸的一种方法(典型地在多个样品中)，该方法必须针对每个目标核酸制备一种扩增混合物。每个扩增混合物包括一个正向引物，该正向引物包括一个目标特异性序列，以及一个反向引物，该反向引物包括一个目标特异性序列。使这些扩增混合物经受扩增作用从而生成多个目标核苷酸序列。然后对这些目标核苷酸序列进行标记从而生成多个目标扩增子，每个扩增子包含位于该目标核苷酸序列侧翼的第一和/或第二核苷酸标记。这种方法生成了多个目标扩增子，其中至少50％的目标扩增子是以大于50％的目标扩增子的拷贝平均数并且小于2倍的目标扩增子的拷贝平均数而存在的。在这种方法的不同实施方案中，至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的目标扩增子是以大于50％的目标扩增子的拷贝平均数以及小于2倍的目标扩增子的拷贝平均数而存在的。

在不同实施方案中，所扩增的目标核苷酸序列可以是例如25个碱基、50个碱基、100个碱基、200个碱基、500个碱基、以及750个碱基。在上述方法的某些实施方案中，可以使用长片段扩增方法，例如长片段PCR，来从扩增混合物中生成扩增子。长片段PCR允许扩增范围从一或数千碱基(kb)至超过50kb的目标核苷酸序列。在不同实施方案中，通过长片段PCR扩增的目标核苷酸序列是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50kb长度。这些目标核苷酸序列还可以落在以这些数值的任何一项作为端点的任何范围内(例如，25个碱基至100个碱基或5-15kb)。在一些实施方案中使用上述方法中的长片段PCR可以产生多个目标扩增子，其中至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少70％的目标扩增子是以大于50％的目标扩增子的拷贝平均数以及小于2倍的目标扩增子的拷贝平均数而存在的。

长片段PCR在本领域中是熟知的。参见，例如，Cheng S，Fockler C，Barnes WM，Higuchi R(June 1994).“Effective amplification of long targets from cloned inserts andhuman genomic DNA”.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91(12)：5695-9。适合用于在此所述方法中的用于长片段PCR的酶、实验方案、以及试剂盒是可以商购的；实例包括SequalPrep^TM Long PCR Ki(Invitrogen，美国)、II Fusion HS DNA聚合酶(Stratagene)、

DNA聚合酶、Flash High Fidelity PCR Master Mix(Finnzymes)。

在某些实施方案中，可以从这些扩增混合物中回收目标扩增子。例如，可以将被适配以允许回收每个反应室的内容物的基质类型微流体装置(见下述)用于扩增从而生成目标扩增子。在这些实施方案的多个变体中，可以使这些目标扩增子经受进一步的扩增和/或分析。例如，可以使用对于该第一和第二核苷酸标记具有特异性的引物使一个或多个目标扩增子经受扩增作用从而生成缺少条形码核苷酸序列的一种目标扩增子。在某些实施方案中，在扩增期间或之后可以对在扩增混合物中生成的目标扩增子的数量进行定量(例如通过定量实时PCR)。

在具体实施方案中，使用上述扩增方法来生成适合用于自动化DNA测序的扩增子。具体地说，如上所述这些方法的提供目标核苷酸序列的实质性地均匀扩增的能力在制备具有良好覆盖率的DNA测序文库中是有用的。在自动DNA测序的上下文背景中，术语“覆盖率”是指当测序时该序列被测量的次数。具有实质均匀覆盖率的DNA测序文库可以生成序列数据，其中覆盖率也是实质性地均匀的。因此，在不同实施方案中，当对如在此所述制备的多个目标扩增子进行自动化测序时，至少50％的目标扩增子的序列是以大于50％的目标扩增子序列的拷贝平均数并且小于2倍的目标扩增子序列的拷贝平均数而存在的。在这种方法的不同实施方案中，至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的目标扩增子序列是以大于50％的目标扩增子序列的拷贝平均数以及小于2倍的目标扩增子序列的拷贝平均数而存在的。

用于DNA测序的核酸制备

多种当前DNA测序技术依赖于“通过合成测序”。这些技术要求创建文库、对文库分子进行大量平行地PCR扩增、并且测序。创建文库起始于将样品核酸转化成适当尺寸的片段、将适配子序列连接到这些片段的末端上，并且选择适当地附加有这些适配子的分子。在文库分子的末端上适配子序列的存在能够扩增随机序列嵌入物。可以用上述的用于标记核苷酸序列的方法取代连接作用以引入适配子序列(更多细节如下所述)。

在具体实施方案中，在大量平行PCR步骤中所生成的文库DNA分子的数量是足够低的使得两个分子与同一底物(例如，同一珠粒(在454DNA测序中)或同一表面小片(在Solexa DNA测序))结合的机会是低的，但是是足够高的使得扩增的序列的产率足以提供高通量。如下面进一步讨论的，在引入适当的适配子序列之后，在通过合成进行测序之前可以使用数字PCR来对文库DNA分子的数量进行校准。

将DNA测序引物加入核酸中

有待测序的DNA可以是任何类型的DNA。在多个具体实施方案中，该DNA是来自生物体的基因组DNA。在这类实施方案的多个变体中，从样品中得到的总基因组DNA被制备用于测序，该样品是从有机体或从DNA文库得到的。

如上所述，使用至少三个引物来制备DNA用于测序：正向、反向、以及条形码引物。然而，该正向引物、反向引物、以及条形码引物中的一个或多个包括至少一个额外的引物结合位点。在具体实施方案中，该条形码引物包括位于该条形码核苷酸序列上游的至少一个第一额外引物结合位点，该条形码核苷酸序列位于该第一核苷酸标记特异性部分的上游。在某些实施方案中，正向引物、反向引物、以及条形码引物中的两项包括至少一个额外引物位点(即，这样使得当扩增时所生成的扩增子包括核苷酸标记序列、条形码核苷酸序列、以及这两个额外的结合位点)。例如，如果在具体实施方案中该条形码引物包括位于条形码核苷酸序列的上游的一个第一额外引物结合位点，该反向引物可以包括位于该第二核苷酸标记下游的至少一个第二额外引物结合位点。然后扩增作用产生具有下面各项元件的一种分子：5’-(第一额外引物结合位点)-(条形码核苷酸序列)-(来自正向引物的第一核苷酸标记)-(目标核苷酸序列)-(来自反向引物的第二核苷酸标记)-(第二额外引物结合位点)-3’。在具体实施方案中，该第一和第二额外引物结合位点能够被DNA测序引物结合以有助于对包括条形码的整个扩增子进行测序，如上讨论的，该条形码可以指示样品来源。

在一些实施方案中，可以使用多于三个引物以将希望的元件加入目标核苷酸序列中。例如，可以使用四个引物来生成具有如上讨论的相同的五个元件的分子，加上一个任选的额外的条形码，例如5’-(第一额外引物结合位点)-(条形码核苷酸序列)-(来自正向引物的第一核苷酸标记)-(目标核苷酸序列)-(来自反向引物的第二核苷酸标记)-(额外的条形码核苷酸序列)-(第二额外引物结合位点)-3’。在一个示例性四引物实例中，正向引物包括一个目标特异性部分以及第一核苷酸标记，并且反向引物包括一个目标特异性部分以及一个第二核苷酸标记。总之，这两种引物构成“内侧引物”。剩下的两个引物是“外侧引物”，这些引物退火到存在于内侧引物中的第一和第二核苷酸标记上。一个外侧引物是条形码引物，该条形码引物可以包含位于条形码核苷酸序列上游的至少一个第一额外引物结合位点，它是在第一核苷酸标记特异性部分的上游(即，前面段落中所讨论的同一条形码引物)。该第二外侧引物可以包括一个第二标记特异性部分、一个额外条形码核苷酸序列、以及位于该序列的下游的一个第二额外引物结合位点。

在一个或多个扩增反应中可以进行扩增以结合来自超过三个引物的元件。例如，可以在其中存在所有四个引物的一个扩增反应中进行一个四引物扩增。作为替代方案，可以例如在两个扩增反应中进行一个四引物扩增作用：一个用来结合内侧引物并且一个分离的扩增反应用于结合外侧引物。当所有四个引物都存在于一个扩增反应中时，这些外侧引物总体上是以过量形式存在与反应混合物中。在一步、四引物扩增反应中，对于条形码引物而言相对于正向和/或反向引物的如上给出的相对浓度值还应用到外侧引物相对于内侧引物的相对浓度上。

在四引物扩增反应的一个示例性实施方案中，这些外侧引物的每一个包含一个独特的条形码。例如，一个条形码引物可以由下面这些元件构成：5’-(第一额外引物结合位点)-(第一条形码核苷酸序列)-(第一核苷酸标记)-3’，并且该第二条形码引物可以由下面这些元件构成：5’-(第二额外引物结合位点)-(第二条形码核苷酸序列)-(第二核苷酸标记)-3’。在这个实施方案中，可以使一定数量(J)的第一条形码引物与一定数量(K)的第二条形码引物相结合从而生成J x K个独特的扩增产物。

在本发明的进一步示例性实施方案中，可以将多于4个引物结合到一个单一反应中从而附加额外引物结合位点、条形码序列、以及核苷酸标记的不同组合。例如，如上所述可以使包含下面这些元件的这些外侧条形码引物：5’-(第一额外引物结合位点)-(第一条形码核苷酸序列)-(第一核苷酸标记)-3’、5’-(第一额外引物结合位点)-(第一条形码核苷酸序列)-(第二核苷酸标记)-3’、5’-(第二额外引物结合位点)-(第一条形码核苷酸序列)-(第一核苷酸标记)-3’、5’-(第二额外引物结合位点)-(第一条形码核苷酸序列)-(第二核苷酸标记)-3’，与内侧目标特异性引物相结合从而生成包含具有所希望的扩增子序列的条形码引物的所有组合的扩增产物集合。

在本发明的其他示例性实施方案中，可以使上述组合或对于本领域普通技术人员而言是清楚的其他组合中任何一项中的外侧条形码引物与多于一对的具有相同第一和第二核苷酸标记序列的目标引物序列相结合。例如，如上所述，可以使包含与同一第一核苷酸标记相结合的高达十个不同目标特异性正向引物序列以及与同一第二核苷酸标记相结合的高达十个不同目标特异性反向引物序列的内侧引物与高达2个或高达4个外侧条形码引物相结合从而生成多个扩增产物。在不同实施方案中，可以使携带相同第一核苷酸标记以及第二核苷酸标记的至少10个、至少20个、至少50个、至少100个、至少200个、至少500个、至少1000个、至少2000个、至少5000个或至少10000个不同目标特异性引物对与高达2个或高达4个外侧条形码引物相结合从而生成多种扩增产物。

本发明的方法可以包括使用任何可用的DNA测序方法使至少一个目标扩增子经受DNA测序。在具体实施方案中，使用高通量测序方法对多个目标扩增子进行测序。这些方法典型地使用一个体外克隆步骤来扩增单独的DNA分子。乳液PCR(emPCR)将单独的DNA分子连同引物涂覆的珠粒一起分离到位于油相中的水滴中。PCR生成了DNA分子的多个拷贝，这些DNA分子连接到珠粒上的引物上，紧接着进行固定用于后续测序。emPCR被用于由Marguilis等人(由康涅狄格州布兰福德市的454Life Sciences公司商品化)、Shendure以及Porreca等人(也称为“聚合酶克隆测序”)以及SOLiD测序(加拿大福斯特市Applied Biosystems公司)提供的方法中。参见M.Margulies，et al.(2005)“Genome sequencing in microfabricated high-densitypicolitre reactors”Nature 437：376-380；J.Shendure，et al.(2005)“Accurate MultiplexPolony Sequencing of an Evolved Bacterial Genome”Science 309(5741)：1728-1732。还可以通过“桥式PCR”进行体外克隆扩增，其中当引物附连到固体表面上时，这些片段被扩增。Braslavsky等人开发了一种单分子方法(由马萨诸塞州剑桥市HelicosBiosciences公司商品化)，该方法省略了这个扩增步骤，直接地将DNA分子固定到一个表面上。I.Braslavsky，et al.(2003)“Sequence information can be obtained fromsingle DNA molecules”Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 100：3960-3964。

被物理结合到一个表面上的DNA分子可以被平行地测序。“通过合成测序”，像染料终止电泳测序一样，使用一种DNA聚合酶来确定碱基序列。可逆的终止剂方法(由加利福尼亚州圣地亚哥市的Illumina公司以及马萨诸塞州剑桥市的HelicosBiosciences公司商品化)通过反复去除封闭基团以允许聚合另一个核苷酸使用可逆形式的染料终止剂，一次加入一个核苷酸，并且实时地对各位置上的荧光进行检测。“焦磷酸测序”也使用DNA聚合作用，一次加入一个核苷酸并且通过附连的焦磷酸盐的释放所发出的光对被加入到给定位置的核苷酸的数量进行检测和定量(由康涅狄格州布兰福德市的454Life Sciences公司商品化)。参见M.Ronaghi，et al.(1996).“Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release”AnalyticalBiochemistry 242：84-89.

通过数字PCR的样品制备

在一些实施方案中，以平均包含每个孔或室小于一个扩增模板的样品浓度将样品载入扩增装置中，例如一个PCR板或一个微流体装置。这样制备了装置中每个孔或室使得它包含适当的标记的目标特异性引物以及正向和反向条形码引物的一个独特的组合。例如，一个孔可以包含多个条形码引物，这些条形码引物包含下面这些元件：5’-(第一额外引物结合位点)-(第一条形码序列)-(第一核苷酸标记)-3’，5’-(第二额外引物结合位点)-(第二条形码序列)-(第二核苷酸标记)-3’。一个第二孔或室可以包含多个条形码引物，这些条形码引物包含下面这些元件：5’-(第一额外引物结合位点)-(第三条形码序列)-(第一核苷酸标记)-3’、5’-(第二额外引物结合位点)-(第四条形码序列)-(第二核苷酸标记)-3’。可以用被载入这些孔中的条形码序列的组合对每个孔中生成的扩增产物进行独特地标记。

通过数字PCR的样品校准

在具体实施方案中，例如从DNA文库使用上述方法生成的目标扩增子的数量可以使用数字扩增方法进行校准。这个步骤在制备DNA用于通过合成进行测序中找到具体应用。关于“数字PCR”的讨论，参见例如Vogelstein and Kinzler，1999，Proc NatlAcad Sci USA 96：9236-41；McBride等人的美国专利申请公开号20050252773，尤其是实例5(这些出版物的每一项都以其全部内容通过引用结合在此，并且特别地用于它们的数字扩增的披露)。这些数字扩增方法可以使用适合用于数字PCR的某种高通量装置，例如典型地包括大量的和/或高密度的小体积反应位点的微流体装置(例如，纳体积反应位点或反应室)。在示例性实施方案中，使用一种微流体装置(例如下面所述的Digital Array微流体装置)进行数字扩增。数字扩增可以要求将样品分布或分配于数百至数千个被布置在一个反应/测定平台或微流体装置中的反应混合物中。在这类实施方案中，横跨大量的分离的扩增反应对样品进行有限稀释这样使得大多数反应不具有模板分子并且给出阴性的扩增结果。在对阳性扩增结果的数量进行计数中(例如在反应终点时)，一种方式是一个接一个地对输入样品中存在的单独的模板分子进行计数。数字扩增的一个主要优点是定量是不依赖于扩增效率的改变-不依赖与产物的实际数量，成功的扩增被计数为一个分子。

在某些实施方案中，在对样品核酸进行预扩增之后可以执行数字扩增。典型地，在数字扩增之前预扩增被执行有限数量的热循环(例如，5个循环，或10个循环)。在某些实施方案中，在预扩增期间热循环的数量可以是范围从约4至15个热循环，或约4-10个热循环。在某些实施方案中，热循环的数量可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或大于15。可以用上述的用于生成包含适配子序列的扩增子以进行DNA测序的扩增取代典型的预扩增步骤。

数字扩增方法被描述于2009年9月24日公开的美国公开号20090239308中，该专利通过应用以其全部内容结合在此，特别地用于它们的数字扩增方法以及装置的披露。总体上，在数字扩增中，在核酸样品(例如基因组DNA)上运行相同的(或基本上类似的)扩增反应。对于给定的核酸样品而言单独反应的数量可以从约2至超过1,000,000而改变。典型地，在样品上进行反应的数量是约100或更大，更典型地是约200或更大，并且甚至更典型地是约300或更大。还可以进行更大规模的数字扩增，其中在样品上进行反应的数量是约500或更大，约700或更大，约765或更大，约1,000或更大，约2,500或更大、约5,000或更大、约7,500或更大、或约10,000或更大。所进行的反应数量还可以是显著地更大的，例如高达每个基因组样品约25,000个测定、高达约50,000个测定、高达约75,000个测定、高达约100,000个测定、高达约250,000个测定、高达约500,000个测定、高达约750,000个测定、高达约1,000,000个测定或甚至大于1,000,000个测定。

在具体实施方案中，核酸经受数字扩增的定量总体上是这样选择的使得当被分布到分离的反应混合物中时每个单独的扩增反应被预期包括一个或更少的可扩增的核酸。本领域普通技术人员可以确定如上所述生成的一个或多个目标扩增子的浓度并且计算用于数字扩增的适当的量。更方便地，可以对该一个或多个目标扩增子的连续稀释的一个组进行测试。例如，可以从Fluidigm公司作为12.765Digital Array微流体装置商购的装置允许同时测试12个不同的稀释液。任选地，可以通过产生一个线性回归图来确定适当的稀释。为了最佳稀释，该线应当是直线并且通过原点。随后可以从该图中计算出初始样品的浓度。

可以将适当数量的一种或多种扩增子分布到分散的位置或反应孔或室中这样使得每个反应包括例如每个体积平均不大于约一个扩增子。在分布之前或之后，可以使该一种或多种扩增子与选择用于定量或非定量扩增的试剂相结合。

在分布之后，可以使这些反应混合物经受扩增作用以鉴别出包含目标扩增子的那些反应混合物。可以使用任何扩增方法，但是方便而言，使用PCR，例如实时PCR或终点PCR。这种扩增可以使用能够扩增该一种或多种目标扩增子的任何引物。因此，在具体实施方案中，这些引物可以是DNA测序引物，这些DNA测序引物退火到在全面扩增步骤中被引入的引物结合位点上。

任何目标扩增子的浓度(拷贝/μL)是与阳性(即包含扩增产物)反应混合物的数量相关联的。参见共同未决的标题为“Method and Apparatus for Determining CopyNumber Variation Using Digital PCR，”的美国申请号12/170,414，出于所有的目的，并且特别地为了分析数字PCR的结果，该专利通过引用结合在此。还参见Dube et al.，2008，“Mathematical Analysis of Copy Number Variation in a DNA Sample Using DigitalPCR on a Nanofluidic Device”PLoS ONE 3(8)：e2876.doi：10.1371/journal.pone.0002876，出于所有的目的，并且特别地为了分析数字PCR的结果，该文献通过引用结合在此。

在样品校准用于通过数字PCR进行DNA测序的示例性实施方案中，可以将包含大致100-360个扩增子/μl的一种PCR反应混合物加载到一个Digital Array微流体装置上(例如下面所述的Fluidigm公司的(加利福尼亚州南旧金山市)12.765DigitalArray微流体装置)。该微流体芯片具有12个板，并且每个板包含765个室。可以对数字芯片上的这些复制板进行测定以得到文库的初始浓度的绝对定量。可以使用稀释的具有典型的相对变异系数在9％至12％(或更低)之内的样品(在多个复制之间)来进行测序。参见，例如，White III RA，Blainey PC，Fan CH，Quake SR.“DigitalPCR provides sensitive and absolute calibration for high throughput sequencing”BMCGenomics 10：116doi：10.1186/1471-2164-10-116。

样品核酸

核酸(“样品”)的制备可以从生物来源得到并且使用本领域已知的常规方法进行制备。具体地说，可以从任何来源提取和/或扩增在本文中所述的方法中有用的DNA或RNA，包括细菌、原生动物、真菌、病毒、细胞器、以及高等生物例如植物类或动物类，具体地是哺乳动物类，并且更具体地是人类。还可以从环境来源(例如，池塘水)，从人造产物(例如，食物)，从法医样品等中得到适当的核酸。可以通过多种标准技术中任何一项从细胞、体液(例如，血液、一种血液部分、尿液等)、组织样品中提取或扩增核酸。示例性样品包括血浆、血清、脊髓液、淋巴液、腹膜液、胸膜液、口腔液、以及皮肤的外切片的样品；来自呼吸道、肠道生殖道、以及尿道的样品；眼泪、唾液、血小板、干细胞、或肿瘤的样品。例如，可以从胚胎中或从母体血液中得到胎儿DNA的样品。可以从活的或死的生物体中或从体外培养物中得到样品。示例性样品可以包括单细胞、石蜡包埋的组织样品、以及针吸活组织检查。本发明中有用的核酸还可以是从一个或多个核酸文库(包括cDNA、黏粒、YAC、BAC、P1、PAC文库等)中衍生的。

可以使用本领域熟知的方法分离感兴趣的核酸，其中具体方法的选择取决于来源、核酸的性质、以及类似因素。这些样品核酸不必是纯的形式，但是典型地是足够纯的以允许本发明的方法的扩增步骤得以实施。当目标核酸是RNA时，该RNA可以通过本领域中已知的并且在例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，Vol.1，2，3(1989)中进行说明的标准方法被逆转录成为cDNA。然后可以根据本发明的方法对cDNA进行分析。

目标核酸

在本发明的编码反应中(在此所述的)可以被标记的任何目标核酸可以使用本发明的方法进行检测。在典型的实施方案中，对于目标核酸而言，至少一些核苷酸序列信息应该是已知的。例如，如果使用的编码反应是PCR，总体上对于给定的目标核酸的每个末端而言可以得到足够的序列信息以允许设计适当的扩增引物。在替代实施方案中，引物中目标特异性序列可以用随机或简并的核苷酸序列来替换。

这些目标物可以包括例如与病原体(例如病毒类、细菌类、原生动物类、或真菌类)相关联的核酸；RNA，例如，过表达或低表达指示疾病的那些，以组织特异性或发育特异性形式表达的那些；或由特定的刺激物诱导的那些；基因组DNA，该基因组DNA可以被分析特异性多态性(例如SNP)、等位基因、或单元型(例如，在基因分型中)。特别感兴趣的是在遗传疾病或其他病理学中发生改变的(例如，扩增、缺失、和/或突变)基因组DNA；与希望的或不希望的性状相关联的序列；和/或独特地识别一个个体的序列(例如，在法医或亲子鉴定中)。

引物设计

适合用于核酸扩增的引物是足够长的以在用于聚合的试剂存在下引起延伸产物的合成。引物的确切长度以及构成将取决于多种因素，包括例如退火反应的温度、引物的来源以及构成，以及探针被使用的位置，探针退火位点与引物退火位点的接近程度以及引物：探针浓度的比率。例如，取决于目标核酸序列的复杂性，寡核苷酸引物典型地包含在约15至约30个核苷酸的范围内，虽然它可以包含更多或更少的核苷酸。引物应当是足够互补的以选择性地退火到它们相应的链上并且形成稳定的双链体。本领域普通技术人员知道如何选择适当的引物对来扩增感兴趣的目标核酸。

例如，可以通过使用任何可商购的软件或开发软件或者通过访问Roche UPL网址来设计PCR引物，例如Primer3(参见，例如，Rozen and Skaletsky(2000)Meth.Mol.Biol.，132：365-386；www.broad.mit.edu/node/1060，等)。将扩增子序列输入Primer3程序中(其中UPL探针序列在括号中)以确保Primer3程序将在被括起来的探针序列的两侧之一上设计引物。

可以通过任何适当的方法来制备引物，包括例如，适当序列的克隆以及限制性酶切或通过多种方法的直接化学合成(例如Narang等人的磷酸三酯法(1979)Meth.Enzymol.68：90-99；Brown等人的磷酸二酯法(1979)Meth.Enzymol.68：109-151；Beaucage等人的二乙基磷酰胺酸法(1981)Tetra.Lett.，22：1859-1862；美国专利号4,458,066的固体载体法等)，或可以从商业来源提供。

可以通过使用Sephadex(新泽西州皮斯卡特维市Amersham Biosciences公司)柱子或本领域普通技术人员已知的其他方法对引物进行纯化。引物纯化可以提高本发明方法的灵敏度。

微流体装置

在某些实施方案中，可以使用一种微流体装置来实现本发明的这些方法中任何一种。在示例性实施方案中，该装置是一种基质类型的微流体装置是允许同时将多个基质溶液与多个试剂溶液组合在分开分离的反应室中的一种装置。应当理解的是一个基质溶液可以包含一种或多种基质并且一个试剂溶液可以包含一种或多种试剂。例如，该微流体装置可以允许同时配对地结合多个不同扩增引物和样品。在某些实施方案中，该装置被配置以在这些不同室的每一个中包含不同组合的引物和样品。在不同实施方案中，分离的反应室的数量可以是大于50个、通常地大于100个、更经常地大于500个、甚至更经常地大于1000个、并且时常大于5000个、或大于10,000个。

在具体实施方案中，该基质类型的微流体装置是一种Dynamic Array(“DA”)微流体装置，它的一个实例示于图1中。DA微流体装置是被设计用于分离配对组合的样品和试剂(例如，扩增引物、检测探针、等)并且适合用于进行定性以及定量PCR反应(包括实时定量PCR分析)的一种基质型微流体装置。在一些实施方案中，这种DA微流体装置至少部分是由一种弹性体制造的。DA微流体装置被描述于PCT公开WO05107938A2(Thermal Reaction Device and Method For Using The Same)以及美国专利公开US20050252773A1中，出于它们的DA微流体装置的说明的目的，这两者都通过引用以其全部内容结合在此。DA微流体装置可以结合多种高密度基质设计，这些设计使用该微流体装置的多个层之间的流体连通通路来编织穿过该装置并且在多个层之间的多个控制管线以及流体管线。通过弹性体块的多个层中的多个流体管线，高密度反应单元安排是可能的。作为替代方案，可以这样设计DA微流体装置使得所有试剂以及样品通道都位于同一弹性体层中，其中控制管道在不同的层中。

美国专利公开号2008/0223721和PCT公开号WO05/107938A2说明了示例性基质类型装置，这些装置可以用于实践在此所述的方法。后者的图21被重新绘制为图1并且显示了一个示例性基质设计，该设计具有一个第一弹性体层2110(第一层)以及一个第二弹性体层2120(第二层)，每个层具有形成于其中的多个流体通道。例如，第一层2110中的试剂流体通道通过一个通路2130被连接到第二层2120中的一个试剂流体通道上，而第二层2120在其中还具有多个样品通道，这些样品通道和试剂通道对应地在样品和试剂室2180中终止。样品和试剂室2180通过一个接口通道2150彼此处于流体连通，该接口通道使用与其结合的一个接口阀2140来控制反应单元2160的多个室2180的每一个之间的流体连通。当使用时，该接口首先被关闭，然后将试剂从试剂入口引入试剂通道中并且通过样品入口将样品引入样品通道中；然后关闭封闭阀2170从而使每个反应单元2160与其他反应单元2160分离。一旦将反应单元2160分离，将接口阀2140开放从而引起样品室和试剂室彼此流体连通这样使得可以发生希望的反应。从这一点(以及WO05/107938A2中的说明)可以清楚的是可以使用DA微流体装置来使M数量的不同样品与N数量的不同试剂进行反应。

虽然WO05/107938中上所述的DA微流体装置是非常适合用于进行在此所述的方法的，本发明不限于任何具体的装置或设计。可以使用分配样品和/或运行独立的配对组合试剂和样品的任何装置。美国专利申请号20080108063(该专利通过引用以其全部内容结合在此)包括一个图表，该图表说明了48.48Dynamic Array IFC(整合的流体电路)，可以从Fluidigm公司(加利福尼亚州南旧金山市)得到的一种可商购的装置。应当理解的是其他构型是可能的并且是被考虑的，例如像48×96、96×96、30×120、等。

在具体实施方案中，该微流体装置可以是一个Digital Array微流体装置，该装置被适配以进行数字扩增。这类装置可以具有将样品和试剂的混合物分配到纳升体积反应室中的整合的通道以及阀。在一些实施方案中，这种Digital Array微流体装置至少部分是由一种弹性体制造的。示例性的Digital Array微流体装置被描述于共同未决的属于Fluidigm公司的美国申请中，例如标题为“Method and Apparatus forDetermining Copy Number Variaation Using Digital PCR.”的美国申请号12/170,414。一个示例性实施方案具有12个输入端口，这些端口相应于12个单独的样品输入该装置中。该装置可以具有12个板，并且这12个板的每一个可以包含765个6nL的反应室，其中每个板总体积为4.59μL。这些微流体通道可以将这些板上的不同的反应室连接到多个流体来源上。可以将压力施加到一个累加器以开放和关闭将反应室连接到流体来源上的这些阀。在示例性实施方案中，可以提供12个入口用于载入样品试剂混合物。可以使用48个入口来为多个试剂提供一个来源，当将压力施加到累计器上时，这些试剂被供应到生物芯片上。另外地，可以提供两个或更多个入口以将水合作用提供到生物芯片上。水合作用入口与该装置处于流体连通以有助于控制与这些反应室相关联的湿度。如本领域中普通技术人员应当理解的，可以用于制造该装置的一些弹性体材料是气体可渗透的，这允许来自反应室的蒸发的气体或蒸汽通过该弹性体材料进入周围大气中。在一个具体实施方案中，位于该装置的外周部分的流体管线在反应室的板周围生物芯片的外周部分提供了对水化液体(例如一种缓冲剂或预混合液)的一个屏蔽，因此减少或防止了反应室中存在的液体的蒸发。因此，可以通过将一种挥发性液体(例如水)加入水化入口来增加该装置的外周部分的湿度。在一个具体实施方案中，一个第一入口与该生物芯片的一个第一侧面上的板附近的水化流体管线处于流体连通，并且该第二入口是与该生物芯片的另一侧上的板周围的水化流体管线处于流体连通。

当Digital Array微流体装置是非常适合用于实现在此所述的数字扩增方法时，本领域普通技术人员应当理解对于这些装置的多种变更和替代方案。这种微流体装置(该装置是可以从Fluidigm公司(加利福尼亚州南旧金山市)商购的12.765Dynamic Array)包括12个板，每个板具有765个反应室，其中每个反应室具有6nL的体积。然而，对于在此所述的数字扩增方法而言，这种几何形状不是必需的。给定的Digital Array微流体装置的几何形状将取决于具体应用。与适合用于在此所述方法中的装置相关的另外的说明被提供于美国专利申请公开号2005/0252773中，处于它的披露Digital Array微流体装置的目的，通过引用将其结合在此。

在某些实施方案中，可以使用一种微流体装置来实现在此所述的方法，该装置提供了反应产物的回收。这类装置被详细描述于2009年4月2日提交的共同未决的美国申请号61/166,105中，该专利通过引用以其全部内容结合在此并且特别地是出于它的说明允许反应产物回收的微流体装置以及相关方法的目的。例如，在测序之前用于校准DNA样品的数字PCR方法可以在这类装置上执行，这允许对扩增产物进行回收，然后这些扩增产物可以用作模板用于DNA测序。

图2是根据本发明的一个实施方案的一个支架和一个微流体装置的一个简化的透视图。如图2中所示，支架100支持一个微流体装置110，该装置还可以被称为Digital Array微流体装置。支架100可以由多种材料制成，这些材料为该支架的不同元件提供了适当的机械支持。作为一个实例，该支架是用一种塑料或其他适合的材料制造的。该支架的外侧部分具有与标准384微孔板相同的覆盖区并且能够单独地进行阀操作。另外地，支架100是与常规的独立式热循环仪相容的。如下面所述，有48个样品输入端口120位于支架100的一个第一侧面上，并且有48个测定液输入端口122位于该支架的相对侧面上。样品输入端口120和测定液输入端口122的存储体相对于该支架的顶部是凹陷的。使用这些凹陷的特征，可以将压力同时施加到所有这些样品输入端口或测定液输入端口上，驱使相应的端口中存在的流体通过存在于微流体装置110上的连接这些输入端口的流体管线140以及两个通道之一、流体输入管线、或它们的组合。这些样品可以包括编码的引物并且测定液还可以被称为扩增子特异性的(AS)引物。

支架100还包括四个来源130、132、134、以及136，可以使用它们来致动该微流体装置中存在的控制管线。在一个实施方案中，使用来源130、132、以及134来对可操作开放和关闭该微流体装置中存在的多个阀的控制管线施加压力。例如，将大于大气压的压力施加到来源132上将导致来源132中存在的流体流入在该微流体装置上存在的控制管线中，由此使多个阀可操作以防止流动通过也存在于该微流体装置上的一个或多个流体输入管线。在一个实施方案中，来源130被用作包含收集试剂的流体孔。可以将压力施加到来源130上，迫使收集的试剂流动通过被提供在支架上的流体管线至被提供在该微流体装置上的流体管线。因此，将压力施加到来源130上导致收集试剂或其他适合的流体流动通过该微流体装置。与来源130-136处于流体连通的控制管线可以包括用于接口阀、封闭阀、用于膨胀泵的阀、用于收集试剂流动的流体管线，或类似物的控制管线。在一个具体实施方案中，阀1是由来源132控制的，阀2是由来源134控制的，收集试剂被提供于来源130中，并且水化试剂被提供于来源136中。在这个具体实施方案中，接口阀是由来源150控制的并且封闭阀是由来源152控制的。这个具体实施方案不旨在限制本发明，而仅用于提供一种构型的一个实例。当对于具体应用适当时，可以使用其他构型。

如关于图3更全面地说明的，存在于支架100上的流体管线140是与存在于该微流体装置110上的一种或多种流体管线处于流体连通。这些流体管线可以用于将流体带入和带出该微流体装置或可以用作控制管线来致动存在于该微流体装置中的多个阀。因此，在样品输入端口120或测定液输入端口122中提供的流体可以被载入适当的流体输入管线以及微流体装置的室中。还可以将来源130-136中提供的其他流体(例如液体)载入流体输入管线或微流体装置的控制管线中。当将来自微流体装置的多个室的反应产物泵送通过该微流体装置上的流体管线，返回进入存在于该支架上的流体管线140中并且进入样品和测定液输入端口120或122中时，可以对它们进行回收。

可以使用压力累加器150和152来对其他控制管线加压，为该微流体装置提供水化作用，或它们不可以被用于一些实施方案中。虽然48个样品输入端口和48个测定液输入端口被显示在图2中所示的本发明的实施方案中，这不是本发明所必须的。其他实施方案使用不同数量的样品和测定液，这取决于具体应用。本领域普通技术人员应当理解多种变更、修饰、以及替代方案。

图3是根据本发明的一个实施方案的一个微流体装置的一个简化的示意图。微流体装置200包括连接到流体输入管线212上的多个通道210，这些流体输入管线被用来为24个不同样品提供流体流动路径。这24个样品(它们可以被载入样品输入图1中所示的端口120的一个亚组中)流动通过通道210以及流体输入管线212至样品输入管线312并且最终至样品室310中(如图4中所示)。微流体装置200还包括连接到流体输入管线222上的多个通道220，这些流体输入管线被用来为21个不同测定液提供流体流动路径。与测定液输入流体管线相对的微流体装置的这个侧面上的通道250提供了水化作用、对一个控制管线致动、或其他适合的操作。在图4中说明了微流体装置的阵列端口230(部分地)。在阵列端口230中，样品和测定液被载入样品和测定液室中并且然后可以被混合以形成配对组合。

如贯穿本说明书更全面说明的，在将样品和测定液混合和反应之后，可以通过使回收液体流动通过流体输入管线212，通过微流体装置的阵列端口230(如图4中所示)、并且通过输出流体管线240以及通道242，从微流体装置中回收反应产物。这些输出流体管线是与提供于支架上的输出端口处于流体连通的。因此，通过独立的输出流体管线240的每一个分别提供了从样品与不同测定液的每一种的组合收集的反应产物。

图3中所示的特定数量的样品以及测定液输入管线仅作为举例进行提供并且具体实现方式不限于这些特定数量。在其他实施方案中，提供了额外的样品以及测定液输入管线以有助于该微流体装置中样品和测定液的额外的配对组合。

图4是图3中所示微流体装置的几个单元的一个简化的示意图。在图4中，为了清楚的目的，说明了来自阵列端口230的四个单元。样品输入管线316是与流体输入管线212处于流体连通的，并且测定液输入管线318是与测定液输入管线222处于流体连通的(如图3中所示)。微流体装置的单元界面包括样品室310以及测定液室312。当接口阀330处于开放位置时，流体管线314在样品室与测定液室之间提供流体连通。在一个具体实施方案中，样品输入管线316被提供在位于包含样品室的层下面的微流体装置的一个层中。以类似方式，测定液输入管线318被提供在位于包含测定液室的层下面的微流体装置的一个层中。样品从样品输入管线212(图3中所示)流到样品输入管线316并且向上通过一个或多个通道(未显示)从样品输入管线316通过到达样品室310。虽然当流体通到样品室时，样品输入管线316被绘制成分支成三个输入管线，这个特定数目不是本发明必须的并且可以使用其他数目的样品输入管线，例如1个输入管线、2个、4个、或大于4个样品输入管线。类似的设计标准适用于连接样品室以及相应的测定液室的三个流体管线314。样品输入管线316在该图的行方向上提供了一个连续流体通道，这使得单一样品能够被均匀分布在多个样品室之间，例如顶行的样品室或底行的样品室。

使用接口阀330以及封闭阀340，这些样品室的每一个可以与其他样品室以及测定室的每一个相分离。可以使用封闭阀使测定室与其他测定室分离通过将压力施加到存在于支架上的相应的控制管线上或通过其他手段，例如静电致动，使分离和封闭阀两者致动。

图4说明了测定液输入管线318，该输入管线提供使测定液从测定液输入管线222(图3中所示)流动到测定室312。当封闭阀处于开放位置时，测定液能够从测定液输入管线流动到测定室312中。在一个具体实施方案中，这些测定液以类似与填充样品室的方式流动通过连接这些输入管线以及测定室的多个通道。将测定液沿着微流体装置的列方向载入为样品的每一行提供了一种不同的测定法，这导致了Mx N个配对组合。

开放接口阀330可能使样品和测定液通过自由界面扩散以配对组合形式相混合。在将样品和测定液混合之后，可以进行热循环以形成反应产物。通过开放收集阀350从微流体装置中回收反应产物，该阀能够使反应产物流到样品室附近的样品输入管线的部分360中。使用样品输入管线316以及芯片上的泵(未显示)，反应产物流动通过样品输入管线进入支架上的回收端口。

在图4中所示的实施方案中，样品从该微流体装置的一个第一侧面中载入。测定液从该微流体装置的邻近侧面中载入。在处理之后，使用样品输入管线将收集的试剂从该装置的第一侧面输入并且反应产物离开该微流体装置离开流体管线朝向相对于该第一侧面的微流体装置的这个侧面流动。在这个实施方案中，微流体装置的剩余的侧面不用于样品或测定液的加载或反应产物的卸载。其他的构型被包括在本发明的范围内并且图4中所示的实例构型仅作为举例来提供。本领域普通技术人员应当理解多种变更、修饰、以及替代方案。

由在此所述的系统提供的一个优点是这些反应中所使用的样品和测定液的体积是固定的，与被分配到样品输入和测定液输入端口的吸液体积无关。如果样品和/或测定液输入端口中的体积超过足以填充样品/测定液输入管线以及样品/测定室的预定阈值，则将压力施加到这些样品/测定液输入端口上将导致完全该样品/测定室的填充。因此这些完全填充的室提供了一个固体的反应体积，这是用常规的微孔板技术所得不到的。

虽然本受让人已经开发出多种系统来进行多种同时结合测定，包括但不限于免疫实验(例如ELISA测定法)，本发明的实施方案提供了“芯片上”膨胀泵以及分离的样品和测定室。因此，使用在此所述的实施方案，样品和测定液的配对组合是可能的(使用先前开发的技术这是不可能的)。结合测定的额外的说明被提供于2006年9月13日提交美国专利申请公开号2007/0074972中，出于所有目的，该专利披露的内容通过引用以其全部内容结合在此。

本发明的实施方案提供了适合用于PCR样品制备的一个系统，其特征是在从输入DNA模板制备扩增子文库中降低成本、时间和工作强度。在典型使用的情况中，该第一扩增将被用于产生文库用于下一代测序。使用本发明的实施方案，使样品和编码的引物与扩增子特异性(AS)引物相结合从而生成一种混合物，该混合物适合用于希望的反应。基于微流体装置的M x N构造，M个样品中每一个与N个AS引物(即测定液)中每一个相结合从而形成M x N个配对组合。即，为每个样品和测定液对提供一个反应位点。在反应完成之后(例如PCR)，从该系统中回收反应产物(典型地使用一种收集试剂，该试剂流动通过该微流体装置)。在一个具体实施方案中，与每个样品相关的反应产物被回收到一个分离的反应集合中，这使得能够进一步对包含给定的与不同测定液中每一项反应的样品的集合进行处理或研究。

因此，在此处所述的实施方案中，提供了一种微流体装置，其中独立的样品输入与引物输入以M x N阵列构型相结合。因此，每个反应是一个特定样品与一个特定引物的一个独特组合。如贯穿本说明书更全面地说明的，通过以列的方式安排在一个实现方式中的样品输入管线将样品载入微流体装置的样品室中。通过以行的形式横过这些列安排的测定液输入管线将AS引物或测定液载入微流体装置的测定室中。在加载期间样品室和测定室是处于流体分离的。在加载过程完成之后，将可操作以防止流体管线通过样品和测定室的多个对之间的一个接口阀开放以使样品和测定液的配对组合能够自由地界面间扩散。样品和测定液的精确混合使不同配对组合之间能够发生反应，这生成了一种反应产物，该产物包括一种特异性PCR反应，其中已经使用一个独特的条形码为每个样品进行了有效地编码。收集反应产物并且然后用于随后的测序过程。在某些实施方案中，如在此使用的术语“测定液”和“样品”是这些装置的具体用途的说明。然而，在所有实施方案中这些装置的用途不限于使用“一种或多种样品”以及“一种或多种测定液”。例如，在其他实施方案中，“一种或多种样品”可以指“一个第一试剂”或多个“第一试剂”并且“一种或多种测定液”可以指“一个第二试剂”或多个“第二试剂”。这些装置的M x N特征使有待组合的第一试剂的任何一组能够与第二试剂的任何一组相组合。

根据使用本发明的一个实施方案实现的一个具体方法，在PCR的25个循环之后，可以将来自M x N个配对组合的反应产物从微流体装置回收到多个分离的集合中，这些M个样品的每一个对应一个集合。典型地，这些分离的集合被包含在提供于支架上的一个样品输入端口中。在一些方法中，出于归一化的目的，可以在“每个扩增子”的基础上收集这些反应产物。使用本发明的实施方案，有可能实现多个结果(针对从样品和测定液的同一输入溶液组装的重复实验)，其中扩增产物的拷贝数在一个样品中改变不大于±25％并且在样品间不大于±25％。因此，当测量特定已知基因型分布时，从微流体装置中回收的扩增产物将是输入样品的代表。优选地，输出样品浓度将是大于2,000个拷贝/扩增子/微升，并且反应产物的回收将在小于两小时内完成。

其中可以使用本发明的多个实施方案的应用包括测序仪准备好的扩增子制备以及长片段PCR扩增子文库生成。对于测序仪准备好的扩增子制备而言，可以使用多正向引物和3引物组合实验方案。

图5A是根据本发明的另一个实施方案的一个微流体装置的一个简化的示意图。图5A中所示的微流体装置与图2中所示的微流体装置享有共同特征以及差异。样品通过48个通道和相应的提供在该微流体装置的一个边缘上(即，图5A中的底部边缘)的样品输入管线被加载到微流体装置中。样品流动通过这些样品输入管线进入微流体装置的阵列部分430中。测定液从多个通道以及位于该微流体装置的两侧上的(即图5A中的左侧和右侧)测定液输入管线被载入。与图6相关联，提供了阵列部分430中存在的多个单元的额外的讨论。通过样品输入管线将反应产物移开并且回收到提供于支架100上的样品输入端口120中。因此，在图5A中，加载样品和回收反应产物被描绘成流动通过该微流体装置的底部侧面。

图5B是图5A中所示的微流体装置的多个部分的一个简化的示意图。图5B中所示的部分包括样品输入管线410、用于偶数测定的测定液输入管线(测定液输入管线420)、用于奇数测定的测定液输入管线(测定液输入管线422)、以及一个收集试剂输入管线430。在一个实施方案中，样品输入管线410是与多个通道412处于流体连通的，这些通道与多个样品输入管线140对齐，这些样品输入管线是与样品输入端口120处于流体连通的(如图2中所示)。在其他实施方案中，提供了额外的样品输入管线(未显示)以使样品输入端口120与样品输入管线410之间能够流体连通。因此，对样品输入端口的组进行增压将导致不同样品流如所示的样品输入管线410中。

如下面与图6相关联所讨论的，样品输入管线410是与存在于微流体装置中的样品输入管线516以及样品室510处于流体连通的。对于具有48个样品室以及48个测定室的阵列而言，图5B中所示的48个样品输入管线410可以将样品提供到48个分离列的样品室中，这些样品室中的两个被示于图6中。应当注意到的是图5B中所示的不同流体管线可以被整合到支架100中，整合到微流体装置110中，或存在于一个或多个其他结构中，这取决于具体实现方式。因此，图5B中样品输入管线410的说明不旨在限制本发明的范围而仅用于说明流体管线适合用于将控制的流体流提供到微流体装置的不同室中。

在一个实施方案中，偶数测定液输入管线420和奇数测定液输入管线422是与通道424处于流体连通的，这些通道与测定液输入管线140对齐，这些测定液输入管线是与测定液输入端口122处于流体连通的(如图2中所示)。在其他实施方案中，提供了额外的测定液输入管线(未显示)以使测定液输入端口122与测定液输入管线420和422之间能够流体连通。因此，对测定液输入端口122的组进行增压将导致不同测定液流入所示的测定液输入管线中。在流动通过图5B中所示的输入管线之后，最终不同的流体将进入图6中所示的单元中。

如上面讨论的，不同流体管线可以被整合到支架、微流体装置、或其他适当结构中。在48个样品x48个测定液阵列构型中，这24个偶数测定液输入管线420可以将多个输入提供到图6中所示的测定液输入管线518的一半的行上。这24个奇数测定液输入管线422可以将多个输入提供到图6中所示的测定液输入管线518的一半的行上。因此，虽然加载测定液仅从图6中阵列的右侧进行说明，实际的实现方式可以典型地将测定液以偶数/奇数构型从两侧加载。在一些实施方案中，为加载水化流体或类似物提供了额外的通道。而且，在一些实施方案中，为了提供与现有支架的相容性，一些流体管线不被使用或被改造以提供这样的相容性。

收集试剂输入管线430提供了用于从微流体装置中回收反应产物的收集试剂。图5B中所示的收集试剂输入管线430是与图2中所示的收集试剂输入端口136处于流体连通的并且沿着该偶数测定液输入管线附近的微流体装置通到该装置的顶部部分并且然后分支成多个收集试剂输入管线。收集试剂多路复用器具有对于每个样品输入管线而言实质上相等体积以在反应产物回收操作期间提供均匀泵送。应当注意的是图5B中所示的特定分支系统仅作为举例来提供并且其他分支系统被包括在本发明的范围内。收集试剂输入管线430是与样品输入管线516(与图6相关联所讨论的)处于流体连通的。如与图9A-D相关联所讨论的，这些实施方案对于每列的样品室使用一个单独的收集试剂输入管线，例如48个收集试剂输入管线用于具有48x 48阵列构型的微流体装置。另外地，虽然收获试剂输入管线在偶数测定液输入管线420附近的位置处进入微流体装置，这不是本发明的实施方案所必须的，并且其他构型是在本发明的范围内的。本领域普通技术人员应当理解多种变更、修饰、以及替代方案。

如与图8C相关联所说明的，收集试剂从支架上的收集试剂输入端口流动通过收集试剂输入管线430并且进入样品输入管线516的一个末端中。如贯穿本说明书更全面讨论的，这些样品输入管线作为输入管线以及反应产物回收管线两者起作用。为了加载，样品流动路径是从样品输入端口120，通过输入管线140，通过通道412，通过样品输入管线410，通过样品输入管线516，进入反应室510以及并且进入加载凹钵830中。为了反应产物回收，产物流动路径是从收集试剂输入端口136，通过收集试剂输入管线430，通过样品输入管线516，通过样品输入管线410，通过通道412，并且进入样品输入端口120，这些样品输入端口在收集期间用作流体回收孔。因此，使用术语“输入”在具体过程的背景中应当被认为是完成的，因为“输入”管线可以用于加载样品以及从微流体装置和支架中回收或移开反应产物两者。

通过将压力施加到样品输入端口120的组以及测定液输入端口122的组上，可以将样品和试剂通过所示的样品和测定液输入管线加载到微流体装置中存在的样品和测定室中。通过将压力施加到收集试剂输入端口136上，可以从样品室中回收反应产物并且递送到样品输入端口中。如贯穿本说明书更全面地说明的，使用该微流体装置是存在的阀来控制样品、测定液、以及反应产物的流动。图5B仅说明样品输入管线、测定液输入管线、以及收集试剂输入管线的一部分并且这些输入管线的额外部分在图5A以及图6中进行说明。

图6是图5A中所示微流体装置的几个单元的一个简化的示意图。在图6中，为了清楚的目的，说明了来自图5A中所示的阵列端口430的四个单元。微流体装置的单元界面包括样品室510以及测定液室512。当接口阀530处于开放位置时，流体管线514在样品室与测定液室之间提供流体连通。在一个具体实施方案中，样品输入管线516被提供在位于包含样品室的层下面的微流体装置的一个层中。以类似方式，测定液输入管线518被提供在位于包含测定液室的层下面的微流体装置的一个层中。样品从样品输入管线410(图5B中所示)流到样品输入管线516并且向上通过一个或多个通道从样品输入管线通过到达样品室.虽然针对每个样品室绘出了两个样品管线，这个具体数目不是本发明所必须的并且可以使用其他数目的样品输入管线，例如1个输入管线、3、4、或大于4个样品输入管线。样品输入管线516在该图的列方向上提供了一个连续流动路径，使单一样品能够被均匀分布到多个样品室之中。

图6说明了测定液输入管线518，该输入管线提供使测定液从测定液输入管线420以及422(图5B中所示)流动到测定室512中。虽然图6仅说明测定输入管线从该图的右侧进入这些单元，本领域普通技术人员应当清楚的是在图5B中所说明的实现方式中，偶数和奇数测定液从该微流体装置的相对侧被加载。图6中提供的说明只是为了清楚的目的进行简化。在一个具体实施方案中，这些测定液以类似与填充样品室的方式载入通过连接这些输入管线以及测定室的多个通道。将测定液沿着微流体装置的行方向载入为每个样品提供了一种不同的测定液，这导致了适合用于M x N个测定的一定数量的配对组合。

如贯穿本说明书更全面地说明的，使用样品输入管线516以及泵(未显示)从该微流体装置中回收反应产物。封闭阀540为每一行中不同样品和测定室之间提供封闭。使用接口阀530以及封闭阀540，这些样品室的每一个可以与其他样品室以及测定室的每一个相分离。可以使用封闭阀使测定室与其他测定室分离通过将压力施加到与来源130-134处于流体连通的相应的控制管线上或通过其他手段，例如静电致动，使分离和封闭阀两者致动。

在图6中，以一种阵列构型说明了四个样品室510。这四个说明的室是仅通过举例来显示并且本发明的实现方式不限于这四个说明的室，而典型地提供了处于48x48阵列构型的2,304个室，处于64x64阵列构型的4,096个室，处于96x96个阵列构型的9,216个室，或类似物。

本发明的实施方案提供了具有数百微米数量级尺寸的单元，例如具有如下尺寸的单元：500x500μm、525x525μm、550x550μm、575x575μm、600x600μm、625x625μm、650x650μm、675x675μm、700x700μm或类似尺寸。选择样品室和测定室的尺寸以提供当减少样品和测定液用量时足以完成希望过程的样品量。作为举例，样品室可以具有100-400μm数量级宽度x200-600μm长度x100-500μm高度的尺寸。例如，该宽度可以是100μm、125μm、150μm、175μm、200μm、225μm、250μm、275μm、300μm、325μm、350μm、375μm、400μm或类似尺寸。例如，长度可以是200μm、225μm、250μm、275μm、300μm、325μm、350μm、375μm、400μm、425μm、450μm、475μm、500μm、525μm、550μm、575μm、600μm或类似尺寸。例如，高度可以是100μm、125μm、150μm、175μm、200μm、225μm、250μm、275μm、300μm、325μm、350μm、375μm、400μm、425μm、450μm、475μm、500μm、525μm、550μm、575μm、600μm或类似尺寸。测定室可以具有类似尺寸范围，这典型地提供了类似的步长远小于较小的室体积的范围。在一些实施方案中，样品室体积对于测定室体积的比率是约5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1或30∶1。比列出的范围更小的室体积被包括在本发明的范围内并且易于使用微流体装置制造技术来制造。

更高密度的微流体装置典型地将使用更小的室体积以减少单元的覆盖区。在其中可以得到非常小样品尺寸的应用中，减少室体积将有助于对相当小的样品进行测试。

选择接口阀530的尺寸以提供连接样品和测定室的流体管线514的完全阻止。在一些实施方案中，这些阀尺寸范围从约10-200μm x10-200μm，例如50x50μm、50x65μm、50x80μm、50x100μm、65x50μm、65x65μm、65x80μm、65x100μm、80x50μm、80x65μm、80x80μm、80x100μm、100x50μm、100x65μm、100x80μm、100x100μm或类似尺寸。这些样品输入管线可以具有不同宽度，这取决于样品输入管线的数量以及样品室的体积、以及用于加载和产物回收希望的流速。作为举例，这些样品输入管线可以具有1-20μm高度和50-100μm宽度的横截面。例如，这些样品输入管线可以具有1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、或20μm的高度以及50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm或100μm的宽度。

选择其他装置参数，包括层到层对齐，范围从20-100μm，以及通道尺寸，范围从50-200微米，来提供希望的系统性能特征。本领域普通技术人员应当理解多种变更、修饰、以及替代方案。

在一些实施方案中，在收集试剂输入管线附近微流体装置的侧面处提供了一个额外的测定液入口。另外地，在支架上样品输入端口附近该微流体装置的侧面上未提供测定液入口。以这种构型，可以使用额外的测定液入口来加载脱水室。典型地，脱水室的加载将使用大于5μl的测定溶液。作为替代方案，可以使用一种单独的脱水溶液以保持横过该微流体装置测定液体积一致。

图7是根据本发明的一个实施方案操作一个微流体装置的方法的一个简化的流程图。在所说明的实施方案中，该微流体装置包括至少一个测定室、至少一个样品室、以及至少一个收集端口。在一个具体实施方案中，该微流体装置包括多个测定室以及多个样品室。方法600包括关闭测定室与样品室(610)之间的流体管线。参考图6，接口阀530是可操作的以关闭通过样品室510至测定室512之间的流体管线514。在一些实施方案中，接口阀530是“上推式”阀(更全面地说明如下)。这些接口阀是由控制管线532或至少部分地包含在该微流体装置的一个第一层中的控制通道的交叉形成的。这些流体管线至少部分地包含在该微流体装置的一个第二层中。控制管线532是与一个或多个压力致动器或累加器处于流体连通的(如图2中所示)。

控制管线532与流体管线514的交叉在交叉处形成了一个阀，称为接口阀530，因为该阀防止在样品和测定液之间的界面处发生混合。接口阀530响应于控制管线中的流体压力而致动并且操作以防止流体流通过这些流体管线。总体上，在此讨论的多层微流体装置包括多个弹性体层并且阀530包括该第一层和第二层之间的一个可偏转的薄膜。在“上推式”构型中，该阀的可偏转薄膜可偏转进入位于与控制管线532交叉之上的流体管线514中。在这种构型中，该可偏转薄膜向上偏转进入流体管道中以在该阀的位置处关闭流体管线，因此称为“上推式”阀。释放控制管线中压力将导致该可偏转薄膜返回到未偏转的位置并且由此使关闭的阀开放。包括这些阀的微流体装置的额外的说明被提供于美国专利申请号2005/0226742中，出于所有目的，该专利整个披露的内容通过引用以其全部内容结合在此。

如图6中所示，控制管线532的致动将阻塞流体管线514.典型地，通过将压力施加到一个压力累积器上时，控制管线532被同时致动。再一次参考图7，在关闭接口阀530之后，样品通过样品输入管线516(612)流入样品室510中。如图6中所示，每个样品室510与多个(例如两个)样品输入管线516处于流体连通。在其他实施方案中，可以使用其他数量的样品输入管线。本领域普通技术人员应当理解多种变更、修饰、以及替代方案。典型地，这些样品输入管线(它们至少部分地被包含在该微流体装置的一个第二层中)在样品室下通过，这些样品室至少部分地被包含在该微流体装置的一个第三层中。从样品输入管线向上通到样品室的通道(未显示)提供了从样品输入管线至样品室的流体流动。如图6中所示，样品流入例如，向上经过这些列，经过封闭阀540(它们是开放的)，穿过延伸到该图的平面之外的通道，并且进入不同的样品室中。在加载样品期间，由于用于制造该微流体装置的弹性体材料的通透性，流体(例如样品室中存在的空气)被排出。

再次参考图7，测定液通过测定液输入管线518(614)流入测定室512中。测定液流动通过测定液输入管线518，经过封闭阀540(这些阀是开放的)，并且穿过从测定输入管线通到测定室的多个通道(未显示)。关闭接口阀530防止样品室中的样品和测定室中的测定液发生混合。一旦加载了样品和测定液，测定室与样品室之间的流体管线被开放(616)。在本发明的实施方案中，通过开放接口阀530，多个流体管线514被同时开放。至少一部分样品以及至少一部分测定液被结合从而形成一种混合物(618)。贯穿这些样品和测定室以及连接这些室的流体管线形成了样品和测定液的混合物。自由界面扩增是一个过程，其中混合是慢的并且物种平衡的速率取决于物种的扩散常数。小分子例如盐具有大的扩散常数，并且因此快速地平衡。大分子(例如蛋白)具有小的扩散常数，并且更慢地平衡。

该混合物发生反应从而形成一种反应产物(620)。包括在本发明的范围内的一种典型的反应是PCR，它包括使微流体装置进行多个循环的热循环操作，这对于本领域普通技术人员而言应当是清楚的。通过将接口阀530致动，将测定室和样品室之间的流体管线关闭(622)。关闭接口阀室样品室中存在的反应产物与测定室中存在的反应产物分开。另外地，在热循环期间可以将封闭阀540关闭以防止在该热循环过程期间发生沉淀。收集试剂从收集端口流动到样品室中(624)以开始收集样品室中存在的反应产物的过程。收集端口136是在收集过程中有用的一个流体输入端口的实例。如图4中所示，反应产物向下流动通过样品输入管线516至样品输入端口，其中这些样品最初是从这些端口提供的。因此，在所说明的方法中，从微流体装置中移开反应产物包括使这些反应产物流动通过至少一部分样品输入管线，该样品输入管线被用于将这些样品加载到样品输入端口上。因此，从微流体装置(626)中移开反应产物并且输出到样品输入端口中，例如图2中所示的样品输入端口120。

如与图9A-D相关联地另外详细讨论的，在示意性实施方案中使用膨胀泵以从微流体装置中移开反应产物。再次参考图2，可以使用控制端口130以及132或压力累加器150以及152来致动用于膨胀泵的这些阀。因此，这些实施方案为微流体装置上的膨胀泵提供了多个阀，这提供了从微流体装置的中移开反应产物。这与常规设计相反，在常规设计中这类阀未作为微流体装置的部件进行提供。

应当理解的是图7中所示的具体步骤提供了根据本发明的一个实施方案操作微流体装置的一种具体方法。根据替代的实施方案还可以实现其他顺序的步骤。例如，本发明的替代实施方案能够以不同顺序实现上述步骤。而且，图7中所示的单独步骤可以包括多个小步骤，当对于单独步骤适宜时，这些小步骤能够以不同顺序来实现。而且，可以增加或去除额外的步骤，这取决于具体应用。本领域普通技术人员应当理解多种变更、修饰、以及替代方案。

图8A-8D是简化的示意图，这些示意图说明在根据本发明的一个实施方案操作期间，流体流动通过微流体装置的多个单元。参考图8A，说明了样品和测定液加载过期期间的微流体装置。封闭阀540是开放的，这允许流体沿着样品输入管线516流动到不同的样品室510中。封闭阀的开放状态还使测定液能够流动进入穿过这些测定液输入管线518到达不同的测定室512中。对于每一组样品输入管线使用一个单一样品(M个样品m个)使得能够将一个单一样品载入每一列的样品室中。另外，对于每个测定液输入管线使用一个单一测定液(N个测定液n个)使得能够将一个单一测定液加载到每行的测定室中。接口阀530的关闭状态防止样品和测定液发生混合。

图8B说明了样品和测定液混合过程以及随后的反应过程(例如扩增)期间的微流体装置。封闭阀540被关闭，这防止了流体沿着样品输入管线516流动。因此关闭封闭阀使样品室沿着列彼此分离(其中每个列可能包含不同样品)。另外，关闭封闭阀540使每一行中测定室与其他测定室分离。在提供了这种室分离之后，将接口阀530开放，这使样品和测定液能够通过自由界面扩散(FID)而混合并且形成M xN个配对组合。虽然在图8B中样品/测定室的多个对中的物质是用相同的阴影来说明的，应当理解的是说明了四个不同配对组合，每对样品/测定室一个。涉及这些样品和测定液混合，然后进行PCR扩增的多个步骤是通过图8B中一个单个的图来表示的，虽然对于本领域普通技术人员而言应当清楚的是这些方法中包括多个步骤，例如多个热循环步骤。

图8C说明了样品室分离以及最初加载收集试剂期间的微流体装置。接口阀530被关闭以保持样品室与测定室之间分离。因此，将样品室中存在的反应产物进行回收而不将测定室中的反应产物进行回收。将封闭阀540开放以允许收集溶液从收集溶液输入管线430流入样品输出管线516中(图5B中所示)。收集试剂流动通过样品输入管线，并且进入样品室中。在示例性实施方案中，当收集试剂响应于膨胀泵送过程(与图9A-9D相关联另外详细说明)流动通过样品输入管线以及样品室时，反应产物被移开。如图8C中所示，收集试剂仅到达上部反应室的中间区域。当膨胀泵送过程继续时，收集溶液将被不断地引入随后的样品室中，由此替换反应产物。最后，与每个样品相关联的反应产物将被回收成为一种收集流体，该流体包括反应混合物以及样品输入端口中的收集试剂，其中该样品最初是从该端口分配的。

当注意的是表示收集溶液和反应产物之间界面的直线仅出于简化的目的而显示，并且对于本领域普通技术人员而言应当清楚的是在实践中应当存在更复杂的界面。

图8D说明了最终加载收集试剂以及回收反应产物期间的微流体装置。当膨胀泵送过程继续时，收集试剂被逐步引入距离收集试剂输入管线更远的额外的样品室中。图8D中所示的收集过程的状态表明反应产物已经与样品室平齐，现在这些样品室充满收集试剂。虽然在图8D中仅说明了四个样品室，应当理解的是通过在此所述的实施方案提供了从该阵列中的所有样品室中回收反应产物。

图9A-9D是简化的示意图，这些示意图说明在根据本发明的一个实施方案操作期间，流体流动通过一个微流体装置。图9A说明了在加载样品和测定液期间根据本发明的一个实施方案的一个微流体装置的一部分。所说明的部分包括一个收集试剂输入管线810，排气孔以及加载钵体部分830，以及分离阀840。如贯穿本说明书更全面地说明的，使用阀820和822来膨胀泵送样品室510中存在的反应产物。如图9A中所示，阀820被关闭并且阀822被开放。阀820和822是典型的“上推式”阀(在本说明书中其他地方进行说明)。

将样品加载到样品室510中并且将测定液加载到测定室512中(如与图6相关联说明的)。接口阀530被关闭，这防止了样品和测定液发生混合。在一些实施方案中提供了多个排气孔以及加载钵体以允许降低与贫化前端相关的影响。诸位发明人已经观察到在将样品加载到微流体装置(例如，通过图9A中所示的垂直样品输入管线)中，流动路径的前沿处存在的样品的一部分结合到微流体装置的材料上将产生一个贫化前端，其中由于这个结合过程该样品的一个或多个组分被贫化。提供排气孔和加载钵体830使使用者能够推动该贫化前端通过微流体装置的不同样品室并且将贫化的样品材料储存在加载钵体830中。最后，当贫化的样品物质通过该装置被注入加载钵体中时，包含在该微流体装置中的样品将是基本上未贫化的。

在样品和测定液加载过程期间分离阀840是开放的以使贫化前端能够流动进入加载钵体830中。阀822是开放的，这允许样品流动通过样品输入管线到达不同样品室中。因为阀820被关闭，将不允许样品通过进入收集试剂输入管线810中。应当注意的是封闭阀540是以封闭状态被绘制于图9A中的。在样品和测定液加载期间封闭阀是开放的，并且然后如所示在样品和测定液加载完成之后这些阀被关闭。这些封闭阀将不同对的反应和测定室与包含不同配对组合的其他对相分离。

在图9A中，为了清楚的目的仅绘制了一个单一列的微流体装置。应当理解的是如例如图6中所示这些微流体装置提供了多个额外的列。而且，为了清楚的目的该列的大部分没有绘出。所绘制的两组样品/测定液室对应地是图4A的顶部和底部的那些。这组邻近阀820在最顶部的组，并且这组邻近阀822是最底部的组。因此，这些图仅是代表性的并不旨在限制本发明的范围。

图9B说明了样品和测定液的混合以及一个随后的反应(例如扩增)过程。为了将这些样品和试剂混合，接口阀530被置于开放位置(如所示)。关闭封闭阀540将反应产物连同密封在样品和测定室中(连同连接流体管线一起)。如图9B中所示，分离阀840被关闭，这防止了流体在样品输入管线与加载钵体830之间流动。在一些实施方案中将阀840致动以将它置于开放或关闭位置是使用一个压力累加器(未显示)来实现的，并且在其他实施方案中使用其他致动技术，例如机械的、静电的、电机的、热力学的、压电的、或类似技术。这类额外技术还可以适用于在此说明的其他的阀。本领域普通技术人员应当理解多种变更、修饰、以及替代方案。

虽然图9B使用一个单一的图说明了混合和反应，本领域普通技术人员应当理解的是可以使用多个热循环使用PCR方法来扩增DNA。因此，这个单一图形是旨在显示混合以及随后可能发生在微流体装置中的反应。

图9C说明了反应产物收集过程的一个第一阶段中的微流体装置的一部分。如图5A中所示收集试剂从收集端口流动通过收集试剂输入管线810到达样品室。如图9A中所示，阀820是开放的，这允许收集试剂流动进入最顶部样品室中。关闭接口阀530防止了收集试剂流动进入测定室中，这些测定室也包含反应产物。收集试剂最初填充样品输入管线以及样品输入室的程度是被阀822的关闭限制的。如所说明的，收集试剂仅部分地填充该第一样品室的一部分。被填充有收集试剂的样品室的侧面的图示仅作为举例来提供，因为收集试剂流动进入样品室实际上通过从该图的平面延伸的通道。关闭分离阀840防止收集试剂流入加载钵体中，虽然其他实施方案可以使这样的流动成为可能(如果希望的话)。

由收集试剂流入微流体装置的阵列部分引起的流体压力导致阀822之上样品输入管线和样品室的膨胀。通过对这些样品室增压启动泵循环。如下所述，关闭阀820并且开放阀822将使得当它流动通过微流体装置时能够从微流体装置中回收加压的收集试剂以及反应产物。

图9D说明了反应产物收集过程的一个第二阶段中的微流体装置的一部分。虽然绘制了一个第二阶段，这并不旨在暗指该第二阶段是紧接着该第一阶段。如下说明的，该第二阶段典型地是通过一个或多个膨胀泵送的中间阶段与第一阶段分开的。

膨胀泵送(也称为体积容量泵送)是操作适当配置的整合流体电路(微流体装置)以得到精确的、低速的、低体积泵送通过微流体装置的所有配置元件的一种方法。膨胀泵送对于使用多个通道的微流体电路是独特的，这些通道具有从弹性体材料形成的一个或多个通道壁。作为举例，收集试剂流动通过样品输入管线以及样品室被认为是体积容量泵送。通过关闭阀822并且开放阀820推进泵送。如上讨论的，对收集试剂端口(未显示)加压以将收集试剂引入最顶部样品输入管线和样品室中(这可以被认为是一个通道)。对具有由一种弹性体材料形成至少一个通道壁的微流体通道进行加压导致一个或多个弹性体壁向通道外膨胀，结果造成通道体积增加，该增加与通道内流体压力(或在替代实施方案中的气体压力)、弹性体通道壁材料弹性特性(例如杨氏模量)、以及通道的长度和横截面积成正比。允许对样品输入管线和样品室加压并且然后将阀820关闭(如图9D中所示)。在关闭阀820之后，将阀822开放。通过样品输入管线以及样品室的泵送体积等于当负压时通道的膨胀体积减去氮压力被释放时通道的天然体积，并且允许一个或多个膨胀的弹性体通道壁放松。通过反复循环以下操作连续进行膨胀泵送：关闭822、开放820、对样品输入管线和样品室加压、关闭820、以及开放822。以这种方式，能够以精确控制流速的方式实现连续或不连续低体积泵送。

因此，这些实施方案提供了膨胀泵送的一种方法，该方法包括关闭布置在样品室和样品输入端口之间的一个第一阀(即阀822)、开放布置在收集端口与样品室之间的一个第二阀(即阀820)、关闭该第二阀、开放该第一阀、并且将这些步骤重复一个预定数量的次数。在开放第二阀和关闭第二阀的步骤之间，收集试剂流入样品输入管线和样品室中，如上所述对该通道进行加压。在膨胀泵送过程完成之后，收集试剂基本上充满了这些样品输入管线以及样品室(例如，回收率＞95％)，由此将与给定样品相关联的反应产物收集到一个样品输入端口中，其中该给定样品最初是从这个端口分配的。

膨胀泵送提供了多个益处，典型地使用常规技术不能得到这些益处。例如，膨胀泵送使得能够缓慢地从微流体装置中移开反应产物。在一个示例性实施方案中，以小于100μl/小时的流体流速回收反应产物。在这个实施方案中，为了将48个反应产物分布到每一列中的反应室中，其中每个反应产物的体积是约1.5μl，在约30分钟的时间期间内移开反应产物将导致72μl/小时的流体流动速率(即48*1.5/0.5小时)。在其他实施方案中，反应产物的移开速率是以下面各项的速率来实现的：小于90μl/hr、80μl/hr、70μl/hr、60μl/hr、50μl/hr、40μl/hr、30μl/hr、20μl/hr、10μl/hr、9μl/hr、小于8μl/hr、小于7μl/hr、小于6μl/hr、小于5μl/hr、小于4μl/hr、小于3μl/hr、小于2μl/hr、小于1μl/hr或小于0.5μl/hr。

膨胀泵送导致清除了实质上高百分比的以及可能地所有的微流体装置中存在的反应产物。一些实施方案去微流体装置的除反应室(例如，样品室)中存在的大于75％的反应产物。作为举例，一些实施方案移开反应室中存在的大于80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的反应产物。

在一些实施方案中，将一个收集阀提供在微流体装置上以阻塞收集试剂流动通过该装置。将一个压力来源应用到一个收集输入端口上导致收集流体(例如一种收集液体)流动通过收集试剂输入管线向上进入收集阀中。用于制造该微流体装置的材料的通透性使这样一种收集流体能够填充这些收集试剂输入管线，典型地将最初存在于这类管线中的气体排出。收集阀的存在将阻碍收集试剂在收集阀的位置处流动。致动(例如开放)该收集阀将导致收集流体流动通过该收集阀下游的收集试剂输入管线。在其他实施方案中，当对于具体应用适当时，用一个或多个其他适合的阀来替换收集阀。例如，在图9A-9D中所说明的实施方案中，阀820用于防止收集试剂的流动直至膨胀泵送过程被启动。

使用弹性体材料的制造方法以及用于设计装置以及它们的部件的方法已经详细地描述于科学以及专利文献中。参见，例如，Unger et al.(2000)Science 288：113-116；美国专利号US6,960,437(Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices)；6,899,137(Microfabricated elastomeric valve and pump systems)；6,767,706(Integratedactive flux microfluidic devices and methods)；6,752,922(Microfluidicchromatography)；6,408,878(Microfabricated elastomeric valve and pump systems)；6,645,432(Microfluidic systems including three-dimensionally arrayed channelnetworks)；美国专利申请公开号2004/0115838；2005/0072946；2005/0000900；2002/0127736；2002/0109114；2004/0115838；2003/0138829；2002/0164816；2002/0127736；以及2002/0109114；PCT公开号WO2005/084191；WO05/030822A2；以及WO01/01025；Quake&Scherer，2000，“From micro to nanofabrication with softmaterials”Science 290：1536-40；Unger et al.，2000，“Monolithic microfabricated valvesand pumps by multilayer soft lithography”Science 288：113-116；Thorsen et al.，2002，“Microfluidic large-scale integration”Science 298：580-584；Chou et al.，2000，“Microfabricated Rotary Pump”Biomedical Microdevices 3：323-330；Liu et al.，2003，“Solving the“world-to-chip”interface problem with a microfluidic matrix”AnalyticalChemistry 75，4718-23，Hong et al，2004，“A nanoliter-scale nucleic acid processor withparallel architecture”Nature Biotechnology 22：435-39。

根据在此所述的某些实施方案，对来自一个或多个样品的一种或多种目标核酸进行检测和/或定量总体上可以在一个微流体装置上通过得到一个样品，任选地预扩增该样品，并且将该任选地预扩增的样品或其等分部分分配到包含适当的缓冲剂、引物、任选地一种或多种探针、以及一种或多种酶的微流体装置的多个反应室中，使这些混合物经受扩增、并且针对扩增的目标核酸的存在对这些等分部分进行查询来实现。在不同实施方案中，样品等分部分可以具有下面各项的体积：小于1皮升或，在约1皮升至约500纳升是范围内、在约2皮升至约50皮升的范围内、在约5皮升至约25皮升的范围内、在约100皮升至约20纳升的范围内、在约1纳升至约20纳升的范围内、以及在约5纳升至约15纳升的范围内。在多个实施方案中，样品等分部分占扩增混合物的体积的大部分。在不同实施方案中，因此，扩增混合物可以具有下面各项的体积：小于1皮升或约2皮升、约5皮升、约7皮升、约10皮升、约15皮升、约20皮升、约25皮升、约50皮升、约100皮升、约250皮升、约500皮升、以及约750皮升；或约1纳升、约2纳升、约5纳升、约7纳升、约15纳升、约20纳升、约25纳升、约50纳升、约250、以及约500纳升。这些扩增混合物还可以使用在以这些值中任何一项为边界的任何范围内的体积(例如约2皮升至约50纳升)。

在某些实施方案中，在单独扩增混合物中实现多重检测，例如在微流体装置的多个单独的反应室中，这可以用于进一步增加在一个单一测定中可以分析的样品和/或目标的数量或用于实现比较方法，例如比较基因组杂交(CGH)。在不同实施方案中，在每个单独的反应室中实现高达2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、50个、100个、500个、1000个、5000个、10000个或更多个扩增反应。

在具体实施方案中，该测定法通常具有下面各项的动态范围：至少3个数量级、更经常是至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个数量级。

定量实时PCR以及其他测定和定量方法

在本发明中可以使用核酸检测和/或定量的任何方法以检测扩增产物。在一个实施方案中，使用PCR(聚合酶链式反应)来对目标核酸进行扩增和/或定量。在其他实施方案中，使用其他扩增系统或检测系统，包括例如美国专利号7,118,910中所述的系统(出于它的说明扩增/检测系统的目的，该专利通过引用以其全部内容结合在此)以及Invader测定法(PE BioSystems)。在具体实施方案中，使用实时定量的方法。例如可以使用“定量实时PCR”方法通过测量在扩增过程本身期间形成的扩增产物的数量来确定样品中存在的目标核酸的量。

荧光生核酸酶测定法是实时定量方法的一个特定的实例，该方法可以被成功地用于在此所述的方法中。监测扩增产物形成的方法包括使用双标记的荧光生成寡核苷酸探针(文献中通常称为“

方法”的一种方法)对PCR产物累积进行连续测量。参见美国专利号5,723,591；Heid et al.，1996，Real-time quantitative PCR GenomeRes.6：986-94，出于它们的说明荧光生成核酸酶测定的目的，每个文件都通过引用以其全部内容结合在此。应当理解的是虽然对于qPCR而言“

探针”是最广泛使用的，本发明不限于使用这些探针；可以使用任何适合的探针。

可以用于本发明的其他检测/定量方法包括FRET以及模板延伸反应、分子信标检测、蝎型探针检测(scorpion detection)、侵入物检测、以及锁式探针检测。

FRET和模板延伸反应使用用供体/受体对的一个成员标记的引物以及用该供体/受体对的另一个成员标记的一个核苷酸。在模板依赖性延伸反应期间在将标记的核苷酸结合到引物中之前，该供体和受体被间隔足够开这样使得能量转移不会发生。然而，如果标记的核苷酸被结合到引物中并且该间距是足够近的化，则发生能量转移并且可以被检出。这些方法在检测单核苷酸多态性中在进行单碱基对延伸反应中是特别有用的，并且在美国专利号5,945,283以及PCT公开WO97/22719中进行了说明。

关于分子信标，当探针杂交到扩增产物的互补区上时，它的构象改变导致形成可检出的信号。该探针本身包括两个区段：一个区段在5’端并且另一个区段在3’端。这些区段位于探针区段的侧翼，该探针区段退火到探针结合位点，并且彼此互补。一个末端区段被典型地附连到一个报告基因染料上，并且另一个末端区段通常被附连到一个猝灭剂染料上。在溶液中，两个末端区段可以彼此杂交从而形成一个发夹环。在这种构象中，该报告基因和猝灭剂染料是足够近的接近这样使得来自报告基因染料的荧光被猝灭剂染料有效地猝灭。相反，杂交的探针导致一种线性构象，其中淬火程度被降低。因此，通过监测这两种染料的发射变化，有可能间接地监测扩增产物的形成。这种类型的探针以及它们的使用方法都例如通过Piatek et al.，1998，Nat.Biotechnol.16：359-63；Tyagi和Kramer，1996，Nat.Biotechnology 14：303-308；以及Tyagi et al.，1998，Nat.Biotechnol.16：49-53(1998)进行进一步说明。

例如通过Thelwell et al.2000，Nucleic Acids Research，28：3752-3761和Solinas etal.，2001，“Duplex Scorpion primers in SNP analysis and FRET applications”NucleicAcids Research 29：20说明了蝎型探针检测方法。蝎型引物是荧光PCR引物，其中经由一个PCR终止剂探针元件被附连到5’端上。它们被用于均匀溶液中PCR产物的实时扩增子特异性检测。两种不同形式是可能的，即“茎环”形式和“双链体”形式。在两种情况中，探查机理是分子内的。在所有形式中蝎型探针检测的基本元件是：(i)一种PCR引物；(ii)用于防止PCR读通该探针元件的一种PCR终止剂；(iii)一种特异性探针序列；以及(iv)包含至少一个荧光团以及猝灭剂的一种荧光检测系统。在蝎型引物PCR延伸之后，得到的扩增子包含与该探针互补的一个序列，这导致了每个PCR循环的变性阶段形成单链。当冷却时，探针是游离的以结合到这种互补序列上，造成荧光增加，因为淬灭剂不再位于该荧光团的附近。这种PCR终止剂防止探针被Taq DNA聚合酶不希望地读通。

使用侵入物测定法(威斯康辛州麦迪逊室Third Wave Technologies公司)特别地用于SNP基因分型并且使用一种寡核苷酸(指定的信号探针)，该寡核苷酸是与目标核酸(DNA或RNA)或多态性位点互补的。一个第二寡核苷酸(指定的InvaderOligo)，包含相同的5’核苷酸序列，但是3’核苷酸序列包含一个核苷酸多态性。该Invader Oligo干扰信号探针结合到目标核酸上这样使得信号探针的5’端在包含该多态性的核苷酸上形成一个“片”。这种复合体被一种结构特异性内切核酸酶(称为切割酶)所识别。切割酶切割这些核苷酸的5’片。释放的片与携带FRET标记的一个第三探针相结合，由此形成被该切割酶所识别的另一种双链结构。这次该切割酶切割荧光团远离猝灭剂并且生成一种荧光信号。对于SNP基因分型而言，可以设计信号探针以与参考(野生型)等位基因或变异体(突变体)等位基因之一相杂交。与PCR不同，存在信号的线性扩增而没有核酸的扩增。通过下面各项提供了足以指导本领域普通技术人员的进一步的细节，例如Neri，B.P.，et al.，Advances in Nucleic Acidand Protein Analysis 3826：117-125，2000)以及美国专利号6,706,471。

锁式探针(PLP)是长的(例如，约100个碱基)线性寡核苷酸。在探针的3’和5’末端上的序列是与目标核酸中邻近序列互补的。在中央的PLP的非互补区中，存在荧光“标记”序列，该序列可以被用于识别特异性PLP。这些标记序列位于通用启动位点侧翼，这允许PCR扩增该标记。当杂交到目标物上时，该PLP寡核苷酸的两个末端变成紧密接近并且可以通过酶连接作用进行连接。得到的产物是连锁到该目标DNA链上的一种环形探针分子。通过核酸外切酶的作用去除任何未连接的探针(即没有杂交到目标物上的探针)。PLP的杂交作用和连接作用要求两个末端片段都识别该目标序列。以这种方式，PLP提供了极其特异性的目标识别。

然后可以将环化PLP的标记区扩增并且对得到的扩增子进行检测。例如，可以进行

实时PCR以对扩增子进行检测和定量。扩增子的存在和数量可能与样品中目标序列的存在和数量相关联。关于PLP的说明，参见例如，Landegren et al.，2003，Padlock and proximity probes for in situ and array-based analyses：tools for thepost-genomic era，Comparative and Functional Genomics 4：525-30；Nilsson et al.，2006，Analyzing genes using closing and replicating circles Trends Biotechnol.24：83-8；Nilssonet al.，1994，Padlock probes：circularizing oligonucleotides for localized DNA detection，Science 265：2085-8。

在具体实施方案中，可以用作针对探针的检测标记的荧光团包括但不限于碱性玫瑰精、菁蓝3(Cy 3)、菁蓝5(Cy 5)、荧光黄素、Vic^TM、Liz^TM.、Tamra^TM、5-Fam^TM、6-Fam^TM、以及德克萨斯红(分子探针)。(Vic^TM、Liz^TM、Tamra^TM、5-Fam^TM、6-Fam^TM都可以从加利福尼亚州福斯特市Applied Biosystems公司得到)。

已经开发了多种装置，这些装置可以实现与包含荧光指示剂的组合物进行热循环反应，发生特异性波长的一种光束，读取该荧光染料的强度，并且在每个循环之后显示荧光强度。已经例如在美国专利号5,928,907；6,015,674；以及6,174,670中说明了包括荧光热循环仪、光束发射器、以及荧光荧光信号检测器的装置。

在一些实施方案中，这些功能的每一项都可以通过单独的装置来实现。例如，如果人们使用Q-β复制酶反应进行扩增，在热循环仪中该反应将不会发生，但是可能包括在特定波长下发射一个光束、对荧光信号进行检测、并且对扩增产物的数量进行计算和显示。

在具体实施方案中，可以使用组合的热循环和荧光检测装置来对目标核酸进行精确定量。在一些实施方案中，在一个或多个热循环期间和/或之后可以检出并且显示荧光信号，因此允许当“实时”发生反应时，对扩增产物进行监测。在某些实施方案中，人们可以使用扩增产物的数量以及扩增循环的数量来计算扩增之前样品中有多少目标核酸序列。

根据一些实施方案，在足以表明样品中存在目标核酸序列的预定数量的循环之后人们可以简单地进行对扩增产物的量监测。对于任何给定的样品类型，本领域普通技术人员可以容易地确定引物序列、以及反应条件、对于确定给定目标核酸的存在多少个循环是足够的。

根据某些实施方案，人们可以使用一种内标来对通过荧光信号指示的扩增产物进行定量。参见例如美国专利号5,736,333。

在不同实施方案中，使用预扩增，预扩增循环的数量足以将荧光或多个核苷酸标记加到目标核苷酸序列上这样使得标记的目标核苷酸序列的相对拷贝数是样品中目标核酸的相对拷贝数的实质性代表。例如，可以预扩增可以被执行2至20个循环以引入样品特异性或组特异性核苷酸标记。在其他实施方案中，在指数扩增结束时进行检测，例如在“平台”期期间，或进行终点PCR。在这种情况中，预扩增将针对目标物并且针对样品对扩增子拷贝数进行归一化。在不同实施方案中，预扩增和/或扩增可以被执行约：2个、4个、10个、15个、20个、25个、30个、35个或40个循环或落在由这些值的任何一项界定的任何范围内的数量的循环。

标记策略

可以将任何适合的标记策略用于本发明的方法中。当测定混合物被等分，并且针对一个单一扩增产物的存在对每个等分部分进行分析时，可以将一种通用检测探针用于扩增混合物中。在具体实施方案中，可以使用一种通用qPCR探针来进行实时PCR检测。适当的通用qPCR探针包括双链DNA染料，例如SYBR Green、PicoGreen(俄勒冈州尤金市Molecular Probes公司)、Eva Green(Biotinum)、溴化乙锭、以及类似物(参见Zhu et al.，1994，Anal.Chem.66：1941-48)。适当的通用qPCR探针还包括序列特异性探针，这些探针结合到所有扩增产物中存在的一种核苷酸序列上。在扩增期间，这类探针的结合位点可以被方便地引入到标记的目标核酸中。

作为替代方案，可以将一种或多种目标特异性qPCR探针(即对于有待检测的目标核苷酸序列具有特异性的)用于扩增混合物中以对扩增产物进行检测。目标特异性探针可能是有用的，例如当在大量的样品中仅少量目标核酸有待检测时。例如，如果仅目标有待检测时，可以使用对于每种目标具有不同荧光标记的目标特异性探针。通过正确地选择标记，可以进行分析，其中在荧光单一反应中在不同波长下不同标记被激发和/或检测。参见，例如Fluorescence Spectroscopy(Pesce et al.，Eds.)Marcel Dekker，New York，(1971)；White et al.，Fluorescence Analysis：A PracticalApproach，Marcel Dekker，New York，(1970)；Berlman，Handbook of FluorescenceSpectra of Aromatic Molecules，2nd ed.，Academic Press，New York，(1971)；Griffiths，Colour and Constitution of organic Molecules，Academic Press，New York，(1976)；Indicators(Bishop，Ed.).Pergamon Press，Oxford，19723；以及Haugland，Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals，Molecular Probes，Eugene(1992)。

去除不想要的反应组分

应当理解的是涉及其中使用多个反应步骤的核酸的复杂混合物的反应可能导致多种未结合的反应组分，并且通过多种提纯步骤中任何一项去除这类未结合的反应组分或降低它们的浓度可以提高随后发生反应的效率和特异性。例如，在一些实施方案中，在进行在此所述的扩增步骤之前，去除、或降低预扩增引物的浓度可能是令人希望的。

在某些实施方案中，可以通过简单地稀释来降低不希望的组分的浓度。例如，在进行扩增之前可以将预扩增的样品稀释约2倍、5倍、10倍、100倍、500倍、1000倍从而提高随后扩增步骤的特异性。

在一些实施方案中，可以通过不同的酶学方法来去除不想要的组分。作为替代方案，或除了上述方法之外，可以通过纯化来去除不想要的组分。例如，可以将一种纯化标记结合到上述引物的任何一种中(例如条形码核苷酸序列中)以有助于对标记的目标核苷酸进行纯化。

在具体实施方案中，提纯包括选择性地固定希望的核酸。例如，可以优选地将希望的核酸固定到固相支持体上。在一个示例性实施方案中，一个亲和性部分，例如生物素(例如，光-生物素)被附连到希望的核酸上，并且得到的生物素标记的核酸被固定在固体支撑物上，该固体支持物包括一种亲和部分-粘合剂，例如链亲和素。可以用多种探针对固定的核酸进行查询，并且将未杂交的和/或未连接的探针通过洗涤去除(参见，例如，公开的P.C.T.申请WO03/006677以及USSN09/931,285)。作为替代方案，可以对固定的核酸进行洗涤以去除其他组分并且任何从该固体支持物中进行释放用于进一步分析。这种方法可以被用于例如在加入用于DNA测序的引物结合位点之后从扩增混合物中回收目标扩增子。在具体实施方案中，可以将一种亲和性部分(例如生物素)附连到一个扩增引物上这样使得扩增生成一种亲和性部分标记的(例如生物素标记的)扩增子。因此，例如当使用三个引物以将条形码和核苷酸标记元件加入到目标核苷酸序列中时(如上所述)，该条形码或反向引物中至少一个可以包括一个亲和性部分。当使用四个引物(两个内侧引物以及两个外侧引物)来将希望的元件加入到目标核苷酸序列中时，这些外侧引物中至少一个可以包括一个亲和性部分。

数据输出以及分析

在某些实施方案中，当在基质类型的微流体装置上执行本发明的方法时，这些数据能够以热基质的形式输出(也称为“热图”)。在热基质中，每个正方形(代表DA基质上的一个反应室)已经被指定一种颜色值，该颜色值能够以灰度形式显示，或更典型地以颜色显示。在灰度中，黑色正方形指示未检测出扩增产物，而白色正方形指示扩增生产的最高水平，其中灰度阴影指示其间扩增产物的水平。在一个进一步方面中，可以使用一种软件程序来对将热基质中生成的数据编译成读者更友好的形式。

应用

本发明的方法可用于针对检测核酸样品中一种或多种目标核酸的存在或数量的任何技术。因此，例如，这些方法适用于鉴别特定多态性(例如SNP)、等位基因、或单元型、或染色体异常(例如扩增、缺失、或非整倍性)的存在。这些方法可以被用于基因分型中，基因分型可以在多种背景中实现，这些背景包括对遗传疾病或障碍进行诊断、物基因组研究(个体化用药)、农业中质量控制(例如用于种子或家畜)、对植物或动物的种群进行研究和管理(例如，水产养殖或渔业管理中或确定种群多样性中)、或亲子或法医鉴定。本发明的方法可以用于在生物或环境样品中鉴别指示特定条件或生物体的序列。例如，这些方法可以用于测定中以鉴别多种病原体(例如，病毒类、细菌类、以及真菌类)。这些方法还可以被用于针对表征环境或微环境的研究中，例如表征人肠中微生物物种。

这些方法还可以用于确定DNA或RNA拷贝数。确定基因组DNA中异常DNA拷贝数是有用的，例如，在诊断和/或预测遗传缺陷和疾病，例如癌中。对于感兴趣的基因(例如在不同条件下(例如，不同外部刺激或疾病状态)和/或在不同发育阶段下，不同个体、组织、或细胞中)的表达监控而言，确定RNA“拷贝数”，即表示水平，是有用的。

此外，可以使用这些方法来制备核酸样品用于进一步分析，例如像DNA测序。

最后，在随后分析之前，可以将核酸样品标记作为一个第一步骤，从而降低这种风险，即样品的错误标记或交叉污染将损害这些结果。例如，在收集之后任何医师办公室、实验室、或医院可以立即对这些样品进行标记，并且在分析时可以对这些标记进行确认。类似地，只要可行即可以对包含在犯罪现场收集的核酸的样品进行标记，以确保这些样品不被错误标记或被篡改。当样品每一次从一组人员传递到另一组人员时，可以使用标记的检测来建立样品的保管链。

试剂盒

根据本发明的试剂盒包括对于实践本发明的一个或多个测定方法有用的一种或多种试剂。总体上试剂盒包括一个包装，其中一个或多个容器以一种或多种单独组合物的形式，或任选地以混合物的形式，保持该一种或多种试剂(例如多种引物和/或一种或多种探针)，其中这些试剂的相容性将得到允许。该试剂盒还可以包括其他一种或多种物质，从使用者的观点来看该一种或多种物质可以是令人希望的，例如一种或多种缓冲剂、一种或多种稀释剂、一种或多种标准品、和/或在样品处理、洗涤、或进行该测定的任何其他步骤中有用的任何其他物质。

根据本发明的试剂盒通常上包括用于实现本发明的一种或多种方法的说明书。本发明的试剂盒中包括的说明书可以被附着在包装材料上或可以作为包装说明书而包括。虽然这些说明书典型地是书面或打印的材料，它们不限于此。能够存储这类说明书并且使它们与最终用户进行交流的任何介质是本发明考虑的。这类介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒带、芯片)，光学介质(例如CD ROM)，RF标记，等。如在此使用的，术语“说明书”可以包括提供该说明书的互联网的地址。

应当理解，本文所述的实例及具体实例仅是为说明目的且并且根据其的不同的修饰或变化将可对本领域中的普通技术人员进行建议，并将包括于本申请的精神及范围以及随附权利要求的范围内。

此外，出于所有的目的，在此引用的所有其他出版物、专利、以及专利申请都通过引用以其全部内容结合在此。

实例

实例1

在用于DNA测序的制品中用于对目标核酸进行条形码化的多引物扩增方法

在100以及0ng/ml(阴性对照[“NTC”])下将基因组DNA样品(BioChain，美国)扩增25个循环，使用7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems，美国)，使用200nM/引物下的下面各项的引物对：1)454尾；2)A5特异性引物；以及3)图10中所示的三个引物。在15μl反应体积(包括7.5μl FastStart

Probe Master(Roche Diagnostics，美国)、0.75μl DA载样试剂(Fluidigm公司，美国)以及6.75μl样品)中进行PCR。热循环条件包括在50℃下持续2分钟的一个初始热启动、以及在94℃下持续10分钟、紧接着在94℃下持续15s的25个循环，60℃持续30s以及72℃持续90s。遵循制造厂商说明书使用8μl反应混合物/道在电泳凝胶上(Invitrogen，美国)运行得到的扩增产物。参见图11，该图显示了3引物方法生成了正确尺寸的扩增子。使用Ampure

将从PCR扩增中生成的扩增子纯化，并且然后使用454尾引物在PCR板上再次扩增，紧接着用两个454尾引物之一进行Sanger测序，这表明这种3引物方法产生具有正确序列的一种扩增子。

实例2

在用于DNA测序的制品中用于对目标核酸进行定量的多引物扩增方法

用于制备基因组DNA以使用不同的DNA常规DNA测序方法来进行测序的引物显示如下。

鸟枪正向：5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3′(SEQ ID NO：1)

鸟枪反向：5′-CCTATCCCCTGTGTGCCTTG-3′(SEQ ID NO：2)

鸟枪UPR正向：5′-GGCGGCGACCATCTCATCCCTGCGTGTC-3′(SEQ IDNO：3)

MID正向：5′-GCCTCCCTCGCGCCATCAG-3′(SEQ ID NO：4)

MID反向：5′-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG-3′(SEQ ID NO：5)

MID UPR正向：5′-GGCGGCGAGCCTCCCTCGCGCCATCAG-3′(SEQ IDNO：6)

Solexa正向：5′-ACACTCTTTCCCTACACGA-3′(SEQ ID NO：7)

Solexa反向：5′-CAAGCAGAAGACGGCATA-3′(SEQ ID NO：8)

Solexa UPR正向：5′-GGCGGCGAACACTCTTTCCCTACACGA-3′(SEQ IDNO：9)

Solid正向：5′-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG-3′(SEQ ID NO：10)

Solid反向：5′-CTGCCCCGGGTTCCTCATTCT-3′(SEQ ID NO：11)

Solid UPR正向：5′-GGCGGCGACCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG-3′(SEQ ID NO：12)

454钛正向：5′-CCATCTCATCCCTGCGTG-3′(SEQ ID NO：13)

454钛反向：5′-CCTATCCCCTGTGTGCCTTG-3′(SEQ ID NO：14)

454钛UPR正向：55′-GGCGGCGACCATCTCATCCCTGCGTG-3′(SEQ IDNO：15)

Solexa smRNA正向：5′-TAATGATACGGCGACCACC-3′(SEQ ID NO：16)

Solexa smRNA反向：5′-ACAAGCAGAAGACGGCATAC-3′(SEQ ID NO：17)

Solexa smRNA UPL正向：5′-GGCGGCGATAATGATACGGCGACCAC-3′(SEQID NO：18)

这些引物的特性显示于下表1中。

表1：

用于扩增基因组DNA以结合引物序列的反应混合物在下表2中给出。

表2：

实例3

在用于454DNA测序的制品中用于对目标核酸进行条形码化的额外的示例性引 物

下面表3和4显示了用于对用于454DNA测序的制品中的目标核酸进行条形码化的额外的示例性引物。“454F”是指一个454正向引物结合位点；“454R”是指一个454反向引物结合位点。“BC”是指一种核苷酸条形码。“TAG”是指一种核苷酸标记。“P53”是指一种目标特异性引物序列。

表3：

表4：

实例4

使用允许回收扩增产物的微流体装置对用于454DNA测序的制品中目标核酸 进行4引物条形码化

针对与前列腺癌相关联的48个基因组区域设计目标特异性引物。除了这些目标特异性区域之外，设计了多个引物以在5’末端包含额外的标记序列。正向引物包含序列ACACTGACGACATGGTTCTACA(SEQ ID NO：163)。反向引物包含序列TACGGTAGCAGAGACTTGGTCT(SEQ ID NO：164)。包含标记序列和目标特异性区域两者的引物的序列列于表5中。

表5：

反应混合物的制备

通过IDT在10nmol规模下合成引物，并且提供以100uM的浓度再悬浮于水中。表5中各区域的正向和反向引物被结合在96孔PCR板(USA scientific)中分离的孔中至终浓度为包含0.05％吐温-20的PCR质量水(Teknov)中各引物1μM。

来自HapMap样品收集的48个人类基因组DNA样品以50ng/μl被再悬浮于低EDTATE缓冲液(Teknova)中，并且如下制备用于PCR。

如下制备预置样品的混合物：

表6：

对于每个样品而言，在96孔PCR板中单独的孔中制备包含正向和反向条形码引物、基因组DNA、以及预置样品混合物的一个样品混合物。

表7：

样品混合物	体积(μl)
		预置样品混合物	2
2μM正向条形码引物	0.5
		2μm反向条形码引物	0.5
基因组DNA(50ng/μl)	1
		PCR级水	1

将每个样品与选自表8的一对条形码引物进行混合。

表8

运行Access Arrav IFC

在Access Array IFC载样之前，封闭和接口累加器储罐填充有300μl控制管线流体(Fluidigm PN 89000020)并且H1-H4试剂孔加载有500μl PCR级水中0.05％吐温-20。将5μl每个样品混合物加载到样品端口中，并且将5μl每个引物混合物加载到Access Array IFC上的引物入口中。

使用由Fluidigm公司制造的BioMark ^TM实时PCR系统使Access Array IFC进行热循环并且成像。Access Array IFC热循环实验方案包括一个热混合步骤[50℃持续2分钟，70℃持续20分钟]、一个热启动步骤[95℃持续10分钟]、一个35个循环的降落PCR策略[95℃持续15秒的2个循环，以及63℃持续1分钟，95℃持续15秒的2个循环，以及62℃持续1分钟，95℃持续15秒的2个循环，以及61℃持续1分钟，95℃持续15秒的2个循环，以及60℃持续1分钟，95℃持续15秒的2个循环，以及58℃持续1分钟，95℃持续15秒的25个循环，以及72℃持续1分钟]、以及一个延伸步骤[72℃持续3分钟]。使用Fluidigm实时PCR分析软件对实时数据进行分析以得到针对每个反应室的C_T值。

在扩增之后，使用Post-PCR IFC Loader AX从Access Array IFC中收集PCR产物。在收集之前，每个样品孔填充有2μl 0.05％吐温-20。从H1-H4试剂孔中移开残留溶液，并且它们被再填充有600μl 1X Access Array收集试剂(0.05％吐温-20)。在收集之后，每个样品孔变成一个PCR产物出口，该出口包含10μl(±10％)48个收集的PCR产物。在4℃下将这些收集的PCR产物从Access Array IFC中移开并且储存在一个微孔板中。

取出针对每个样品的1μl每种PCR产物集合并且加载到一个Agilent 1KBioanalyzer芯片上。图12显示了来自这48个单独的产物集合的每一个的电泳图。图13显示了一个单一产物池中产物尺寸的分布。所有产物都落在预测尺寸范围内，并且没有任何小尺寸PCR副产物的证据。

基于从这些Agilent Bioanalyzer迹线计算的浓度来收集每个样品的PCR产物。根据制造厂商的说明书使用AMPure珠粒(Agencourt)对产物集合进行纯化。

使纯化的产物集合经受乳液PCR随后根据制造厂商的说明书在454FLX测序仪(Roche Analytical Sciences)上进行焦磷酸测序。任何针对条形码PCR产物的存在对测序仪输出的序列文件进行分析。

针对每个条形码得到的序列的数量被计数并且绘图(图14(A))。对于每个条形码平均约3400个序列被计数。在＞50％平均数以及＜2倍平均数下表示所有的样品。

然后对在每个样品中针对每个单独的PCR产物进行计数的序列的数量进行分析(图14(B))。在测序仪上2304个PCR产物中仅一个没有被观察到。绝大多数序列以＞50％平均数并且＜2的平均数而存在。2303/2304产物被计数＞5次。图14(C)显示了来自所有2304个PCR反应的PCR产物在Access Array IFC中的分布。在50％至2倍平均覆盖率下对＞95％的序列进行了测量。在50％至2倍平均覆盖率下对＞99％的序列进行了测量。

实例5

使用具有引物结合位点以及核苷酸标记的不同组合的四个外侧引物的多引物扩 增

设计了多组引物对来对来自EGFR以及MET基因的多个特异性区域进行扩增。然后将这些与人类基因组DNA和四个外侧引物一起结合到一个Access Array IFC中(图15)。

反应混合物的制备

通过Eurofins MWG Operon在10nmol规模下合成引物，并且在100uM的浓度下提供再悬浮于水中。表9中各区域的正向和反向引物被结合在96孔PCR板(USAscientific)中分离的孔中至终浓度为包含0.05％吐温-20的PCR质量水(Teknova)中各引物1μM。

表9

将一个单一人类基因组DNA样品(Coriell NA10830)在50ng/μl下再悬浮于低EDTATE缓冲剂(Teknova)中并且如下制备用于PCR。

如下制备预置样品混合物：

表10

对于每个样品复制而言，在96孔PCR板中单独的孔中制备包含正向和反向条形码引物、基因组DNA以及预置样品混合物的一个样品混合物。

表11

样品混合物	体积(μl)
		预置样品混合物	2
4μM正向条形码引物	0.5
		4μm反向条形码引物	0.5
基因组DNA(50ng/μl)	1
		PCR级水	1

通过使每个样品与选自表12的条形码引物中的一对进行混合制备四个复制样品。

表12

运行Access Arrav IFC

在Access Array IFC载样之前，封闭和接口累加器储罐填充有300μl控制管线流体(Fluidigm PN 89000020)并且H1-H4试剂孔加载有500μl PCR级水中0.05％吐温-20。将5μl每个样品混合物加载到样品端口中，并且将5μl每个引物混合物加载到Access Array IFC上的引物入口中。

使用IFC单独热循环仪(Fluidigm公司)使Access Array IFC进行热循环并且成像。热循环实验方案包括一个热混合步骤[50℃持续2分钟，70℃持续20分钟]、一个热启动步骤[95℃持续10分钟]、一个35个循环的PCR策略[95℃持续15秒的2个循环，以及60℃持续4分钟，95℃持续15秒的33个循环，60℃持续15秒，72℃持续1分钟，以及一个延伸步骤[72℃持续3分钟]。

在扩增之后，使用Post-PCR IFC Loader AX从Access Array IFC中收集PCR产物。在收集之前，每个样品孔填充有2μl 0.05％吐温-20。从H1-H4试剂孔中移开残留溶液，并且它们被再填充有600μl 1X Access Array收集试剂(0.05％吐温-20)。在收集之后，每个样品孔变成一个PCR产物出口，该出口包含10μl(±10％)48个收集的PCR产物。在4℃下将这些收集的PCR产物从Access Array IFC中移开并且储存在一个微孔板中。

基于从这些Agilent Bioanalyzer痕迹计算的浓度来收集每个样品的PCR产物。使纯化的产物集合经受乳液PCR随后根据制造厂商的说明书在454FLX测序仪(Roche Analytical Sciences)上进行焦磷酸测序。用包含附连A和B引物序列两者的珠粒运行乳液PCR反应，使得能够针对该扩增子的两个链进行序列读取。

对在每个样品中针对每个单独的PCR产物计数的序列的数量进行分析以证明PCR产物的出现(示于图15中)。通过将来乳液A的标记5序列与来自乳液B的标记8序列，或来自乳液B的标记5序列与来自乳液A的标记8序列进行汇总(图16A)可以针对这些扩增子(示于图15B中)的每一个对序列进行计数。图16显示了所有扩增子的表示主要位于2x至0.5x平均覆盖率之间。而且，针对每个引物对的两个扩增子的表示是非常类似的，虽然图16B中表示的扩增子在样品中显示较少的变化。

实例6

使用允许回收扩增产物的微流体装置对用于Illumina DNA测序的目标核酸进 行4引物条形码化

设计用于4引物标记方案以用于Illumina基因组分析仪II上的序列示于表13和14中。标记序列是内测引物序列。

表13

表14

使用设计用于Illumina GA II测序仪上的4引物策略的PCR产物的成功扩增示于图17中。

实例7

在454FLX测序仪(Roche Analytical Sciences)上针对钛化学对目标核酸进行 条形码化

表15显示了在454FLX测序仪(Roche Analytical Sciences)上用于与钛化学一起使用的正向条形码序列。表16显示了在454FLX测序仪(Roche AnalyticalSciences)上用于与钛化学一起使用的反向条形码序列。

表15

表16

实例8

目标核酸的多重条形码化

从表9中列出的引物中组装10个引物的三个集合。PCR条件与实例4中列出的相同，除了引物浓度被改变之外。图18显示了当这些PCR反应是针对单独的模板特异性引物以及以4引物模式运行时，三个集合的10组PCR引物(A，B，C)的PCR反应的结果。在该4引物策略中较高分子量产物的存在证明成功的4引物组装。

Claims (95)

1.一种用于在多个样品中扩增多个目标核酸的方法，该方法包括：

针对每个目标核酸制备一种扩增混合物，所述扩增混合物包括：

一个正向引物，该正向引物包括一个目标特异性部分；

一个反向引物，该反向引物包括一个目标特异性部分，其中该正向引物额外地包括一个第一核苷酸标记和/或该反向引物额外地包括一个第二核苷酸标记；以及

至少一个条形码引物，该条形码引物包括一个条形码核苷酸序列以及一个第一和/或第二核苷酸标记特异性部分，其中对于该一种或多种正向和/或反向引物而言该条形码引物是过量的；

使每个扩增混合物经受扩增作用从而生成多个目标扩增子，其中这些目标扩增子包括标记的目标核苷酸序列，每个序列包括位于该目标核苷酸序列侧翼的第一和/或第二核苷酸标记，以及位于该目标扩增子的5’或3’端上的至少一个条形码核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中该正向引物额外地包括一个第一核苷酸标记。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中该反向引物额外地包括一个第二核苷酸标记。

4.如权利要求1所述的方法，其中在这些扩增混合物中该条形码引物的浓度是该一种或多种正向和/或反向引物的浓度的至少4倍。

5.如权利要求4所述的方法，其中在这些扩增混合物中该条形码引物的浓度是该一种或多种正向和/或反向引物的浓度的至少50倍。

6.如权利要求1所述的方法，其中选择该第一和/或第二核苷酸标记和/或条形码核苷酸序列以便避免实质性地退火到目标核酸上。

7.如权利要求1所述的方法，其中该条形码核苷酸序列识别一个特定样品。

8.如权利要求1或7中所述的方法，其中该条形码引物包括一个条形码核苷酸序列以及一个第一核苷酸标记特异性部分。

9.如权利要求8所述的方法，其中多个正向引物包括相同的第一核苷酸标记。

10.如权利要求9所述的方法，其中在每个样品中用于扩增目标序列的所有正向引物包括相同的第一核苷酸标记。

11.如权利要求7所述的方法，其中针对每个目标的正向和反向引物最初是与样品分开结合的，并且每个条形码引物最初是与它的相应的样品结合的。

12.如权利要求11所述的方法，其中在S个样品中将T个目标扩增，T和S是大于一的整数，该方法额外地包括制备S×T个扩增混合物，其中将最初结合的正向和反向引物加入到最初结合的样品和条形码引物中。

13.如权利要求1所述的方法，其中该扩增作用被执行至少3个循环从而引入该第一和第二核苷酸标记以及该条形码核苷酸序列。

14.如权利要求13所述的方法，其中该扩增作用被执行5至50个循环之间。

15.如权利要求1所述的方法，其中该扩增作用被执行足够数量的循环从而将目标扩增子拷贝数对这些目标并且对这些样品进行归一化。

16.如权利要求1所述的方法，其中至少50％的目标扩增子是以大于50％的目标扩增子的拷贝平均数并且小于2倍的目标扩增子的拷贝平均数而存在的。

17.一种用于在多个样品中扩增多个目标核酸的方法，该方法包括：

针对每个目标核酸制备一种扩增混合物，所述扩增混合物包括：

一个正向引物，该正向引物包括一个目标特异性序列；以及

一个反向引物，该反向引物包括一个目标特异性序列；

使每个扩增混合物经受扩增作用从而生成多个目标核苷酸序列；

对这些目标核苷酸序列进行标记从而生成多个目标扩增子，每个扩增子包含位于该目标核苷酸序列侧翼的第一和/或第二核苷酸标记。

其中至少50％的目标扩增子是以大于50％的目标扩增子的拷贝平均数并且小于2倍的目标扩增子的拷贝平均数而存在的。

18.如权利要求16或17所述的方法，其中至少70％的目标扩增子是以大于50％的目标扩增子的拷贝平均数并且小于2倍的目标扩增子的拷贝平均数而存在的。

19.如权利要求16、17、或18所述的方法，其中这些目标扩增子的平均长度是至少25个碱基。

20.如权利要求16、17、或18所述的方法，其中这些目标扩增子的平均长度是至少50个碱基。

21.如权利要求16、17、或18所述的方法，其中这些目标扩增子的平均长度是至少100个碱基。

22.如权利要求16、17、或18所述的方法，其中这些目标扩增子的平均长度是至少200个碱基。

23.如权利要求16、17、或18所述的方法，其中这些目标扩增子的平均长度是至少1千个碱基。

24.如权利要求16或17所述的方法，其中至少90％的目标扩增子是以大于50％的目标扩增子的拷贝平均数并且小于2倍的目标扩增子的拷贝平均数而存在的。

25.如以上权利要求中任何一项所述的方法，其中这些扩增混合物的体积是在约1皮升至约50纳升的范围内。

26.如权利要求17所述的方法，其中这些扩增混合物的体积是在约5皮升至约25纳升的范围内。

27.如权利要求1或17所述的方法，其中在扩增之前这些扩增混合物被形成于一个微流体装置的多个分离区室中，或被分布到其中。

28.如权利要求27所述的方法，其中该微流体装置是至少部分地由一种弹性体材料制造的。

29.如权利要求1或17所述的方法，其中该扩增是通过聚合酶链式反应(PCR)实现的。

30.如权利要求1或17所述的方法，该方法额外地包括从这些扩增混合物中回收这些目标扩增子。

31.如权利要求30所述的方法，其中以在回收的目标扩增子中小于约50％改变的体积和/或拷贝数来回收这些目标扩增子。

32.如权利要求30所述的方法，额外地包括使用对于该第一和第一核苷酸标记具有特异性的引物使至少一个目标扩增子经受扩增从而生成缺少条形码核苷酸序列的一种目标扩增子。

33.如权利要求1或17所述的方法，其中这些目标核酸包括基因组DNA。

34.如权利要求1所述的方法，其中该正向引物、反向引物、以及条形码引物中的一个或多个包括至少一个额外的引物结合位点。

35.如权利要求34所述的方法，其中该条形码引物包括位于该条形码核苷酸序列上游的至少一个第一额外引物结合位点，该条形码核苷酸序列位于该第一核苷酸标记的上游。

36.如权利要求35所述的方法，其中该反向引物包括位于该第二核苷酸标记的下游的至少一个第二额外引物结合位点。

37.如权利要求36所述的方法，其中该第一和第二额外引物结合位点能够被DNA测序引物所结合。

38.如权利要求17所述的方法，其中该第一和第二核苷酸标记能够被DNA测序引物结合。

39.如权利要求37或38所述的方法，该方法额外地包括使至少一个目标扩增子经受DNA测序。

40.如权利要求1或17所述的方法，该方法额外地包括对扩增混合物中目标扩增子的数量进行定量。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述定量包括回收这些目标扩增子并且使它们经受数字扩增。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述数字扩增包括：

将预扩增的目标扩增子分布到离散的反应混合物中，其中平均而言每个反应混合物包括每个反应混合物不大于一个扩增子；并且

使这些反应混合物经受扩增。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述数字扩增包括实时PCR。

44.如权利要求42所述的方法，其中所述数字扩增包括终点PCR。

45.如权利要求42所述的方法，其中在扩增之前这些扩增混合物被形成于一个微流体装置的多个分离的区室中，或被分布到其中。

46.如权利要求45所述的方法，其中该微流体装置是至少部分地由一种弹性体材料制造的。

47.如权利要求1或17所述的方法，其中一种目标扩增子的存在是通过定量实时聚合酶链式反应(qPCR)来确定的。

48.如权利要求1或17所述的方法，其中将一种通用qPCR探针用于这些扩增混合物中以检测目标扩增子。

49.如权利要求1或17所述的方法，其中将一种或多种目标特异性qPCR探针用于这些扩增混合物中以检测目标扩增子。

50.如权利要求1或17所述的方法，其中使用一种荧光核酸酶测定法来检测一种目标扩增子的存在。

51.如权利要求1或17所述的方法，其中使用一种双重标记的荧光水解寡核苷酸探针来检测一种目标扩增子的存在。

52.如权利要求1或17所述的方法，该方法额外地包括对每个样品中存在的每种目标核酸的数量进行确定。

53.如权利要求1或17所述的方法，其中该方法是在确定每个样品中目标核酸的拷贝数中实现的。

54.如权利要求1或17所述的方法，其中该方法是在确定在相应于目标核酸的基因座处的基因型中实现的。

55.如权利要求1或17所述的方法，其中该方法是在确定这些目标核酸的表达水平中实现的。

56.如权利要求1或17所述的方法，其中该方法被实现以制备目标核酸用于测序。

57.一种微流体装置，包括：

多个第一输入管线；

多个第二输入管线；

多组第一室，其中每组第一室是与多个第一输入管线之一处于流体连通的；

多组第二室，其中每组第二室是与多个第二输入管线之一处于流体连通的；

多个第一泵元件，这些第一泵元件是与多个第二输入管线的一个第一部分处于流体连通的；以及

多个第二泵元件，这些第二泵元件是与多个第二输入管线的一个第二部分处于流体连通的。

58.如权利要求57所述的微流体装置，其中这些第一室包括多个测定室，并且这些第二室包括多个样品室。

59.如权利要求57所述的微流体装置，该装置进一步包括一组阀，这些阀防止组成一组样品室的样品室之间发生流体连通。

60.如权利要求59所述的微流体装置，该装置进一步包括一组阀，这些阀防止了组成一组测定室的测定室与来自该多组样品室中任何一个的一个样品室之间发生流体连通。

61.如权利要求57所述的微流体装置，其中多个第一泵元件包括多个第一阀。

62.如权利要求57所述的微流体装置，其中多个第二泵元件包括多个第二阀。

63.如权利要求57所述的微流体装置，其中该微流体装置包括弹性体材料。

64.如权利要求57所述的微流体装置，其中对于多组第一室的一个组而言：

这些第一室之一是通过一个流体管线与一个第一组的第二室中的一个第二室处于流体连通的；

这些第一室中的另一个是通过另一个流体管线与一个第二组的第二室中的一个第二室处于流体连通的；

一个第一阀是可操作的以防止流体流动通过该流体管线；并且

一个第二阀是可操作的以防止流体流动通过该另一个流体管线。

65.如权利要求64所述的微流体装置，其中使用一个共同来源将该第一阀和第二阀致动。

66.一种操作一种微流体装置的方法，该装置具有一个测定室、一个样品室、以及一个收集端口，该方法包括：

将该测定室与该样品室之间的一个流体管线关闭；

使一个样品通过一个样品输入管线流入该样品室中；

使一个测定液通过一个测定液输入管线流入该测定室中；

将该测定室与该样品室之间的流体管线开放；

使至少一部分该样品与至少一部分该测定液进行结合从而形成一种混合物；

使该混合物反应从而形成一种反应产物；

将该测定室与该样品室之间的流体管线关闭；

使一种收集试剂从该收集端口流到该样品室中；并且

从该微流体装置中移开该反应产物。

67.如权利要求66所述的方法，该方法进一步包括使该混合物进行热循环。

68.如权利要求66所述的方法，其中从该微流体装置中移开该反应产物包括使该反应产物流动通过该样品输入管线的至少一部分到达一个样品输入端口。

69.如权利要求68所述的方法，其中使该反应产物流动通过该样品输入管线的至少一部分包括进行膨胀泵送。

70.如权利要求69所述的方法，其中这种膨胀泵送包括小于或等于10μl/小时的流体流速。

71.如权利要求69所述的方法，其中进行膨胀泵送包括：

a)关闭布置在该样品室与该样品输入端口之间的一个第一阀；

b)开放布置在该收集端口与该样品室之间的一个第二阀；

c)关闭该第二阀；

d)开放该第一阀；并且

将步骤(a)至(d)重复一个预定数量的次数。

72.如权利要求70所述的方法，其中该流体流速是小于或等于5μl/小时。

73.如权利要求72所述的方法，其中该流体流速是小于或等于1μl/小时。

74.如权利要求66所述的方法，其中该样品的至少一部分与该测定液的至少一部分相结合从而形成一种混合物包括一个自由界面扩散过程。

75.如权利要求66所述的方法，其中移开该反应产物包括小于或等于10微升/小时的流体流速。

76.如权利要求75所述的方法，其中该流体流速是小于或等于5微升/小时。

77.如权利要求76所述的方法，其中该流体流速是小于或等于2微升/小时。

78.如权利要求77所述的方法，其中该流体流速是小于或等于1微升/小时。

79.如权利要求66所述的方法，其中移开该反应产物包括从该微流体装置中移开至少95％的该反应产物。

80.如权利要求66所述的方法，其中通过该样品输入管线使该样品流入该样品室中包括将压力施加到一个样品输入端口以对该样品输入管线加压。

81.如权利要求66所述的方法，其中通过该测定液输入管线使该测定液流入该测定室中包括将压力施加到一个测定液输入端口以对该测定液输入管线加压。

82.一种制备反应产物的方法，该方法包括：

提供M个样品；

提供N个测定液；

将M个样品与N个测定液相混合从而形成M x N个配对组合，这些M x N个配对组合中每一个被包含在一个封闭体积中；

从该M x N个配对组合中形成M x N个反应产物；并且

对该M x N个反应产物进行回收。

83.如权利要求82所述的方法，其中M个样品被包含在M组第一室中并且N个测定液被包含在N组第二室中。

84.如权利要求83所述的方法，其中包含M个样品之一的这些第一室与一组第二室相结合，该组第二室的每一个包含该N个测定液之一。

85.如权利要求84所述的方法，其中将M个样品与N个测定液混合包括将流体管线开放以在包含该M个样品之一的这些第一室与包含该N个测定液之一的该组第二室的每一个之间提供该流体连通。

86.如权利要求82所述的方法，其中这些第一室的特征为体积小于或等于100nl。

87.如权利要求86所述的方法，其中该体积是小于或等于40nl。

88.如权利要求82所述的方法，其中这些第二室的特征为体积小于或等于10nl。

89.如权利要求88所述的方法，其中该体积是小于或等于2nl。

90.如权利要求82所述的方法，其中该封闭体积的特征为体积小于或等于100nl。

91.如权利要求82所述的方法，该方法进一步包括使该M x N个配对组合进行热循环。

92.如权利要求82所述的方法，其中该M个样品是在一个微流体装置的M个样品端口处提供的。

93.如权利要求91所述的方法，其中该M x N个样品是在该微流体装置的M个样品端口处回收的。

94.如权利要求82所述的方法，其中形成该M x N个配对组合是同时实现的。

95.如权利要求82所述的方法，其中形成该M x N个配对组合是依次实现的。

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