KR102214419B1 - 벌집형 반응튜브 - Google Patents

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Abstract

제1 평면 기판 및 제2 평면 기판 사이에 유체 통로(fluidic path)를 구성하는 평면 프레임(planar frame)이 구비된 벌집형 반응튜브. 유체 인터페이스(fluidic interface)는 상기 평면 프레임의 일측단에 위치한다. 상기 유체 인터페이스는 유체 유입구 및 유체 유출구를 포함한다. 상기 유체 통로는 다수의 웰이 구비된 웰-기판(well- substrate)을 가지는 웰 챔버를 추가로 포함한다. 상기 웰 챔버(well chamber)는 제1 평면 기판 또는 제2 평면 기판과 상기 웰-기판 사이의 평면 프레임에 정렬된다.

Description

벌집형 반응튜브{HONEYCOMB REACTION TUBE}
본 출원은 2012년 9월 26일자 출원된 미합중국 가출원 제 61/706,115호를 우선권으로 주장하는 2013년 3월 15일자 출원된 미합중국 특허출원 제13/843,739호에 대한 우선권을 주장한다. 또한, 본 출원은 2012년 9월 26일자 출원된 미합중국 가출원 제 61/706,115호를 우선권으로 주장한다. 상기 출원 전부는 본 출원에 참고문헌으로 인용된다.
다양한 대용량의 데이터 세트를 제공하기 위해서 동시에 여러가지 분석법을 수행하는 것이 바람직하다. 이러한 프로세스는 종종 "다중 분석(multiplexing assay)"이라 한다. 따라서, 다중 분석을 수행할 수 있는 장치에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명의 일부 실시태양은 제1 평면(first planar surface) 및 제2 평면(second planar surface) 사이에 유체 통로(fluidic path)를 구비하는 평면 프레임(planar frame)을 가지는 벌집형 반응튜브에 관한 것이다. 유체 인터페이스(fluid interface)는 평면 프레임의 일측단에 위치할 수 있다. 유체 인터페이스는 유체 유입구(fluidic inlet)와 유체 유출구(fluidic outlet)를 가질 수 있다. 유체 통로는 다수의 웰이 구비된 웰-기판(well-substrate)을 갖는 웰 챔버(well chamber)를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 웰 챔버는 제1 평면 또는 제2 평면과 웰-기판 사이의 평면 프레임에 정렬되고, 또한 유체 유입구와 유체 유출구와 유체적으로 연통(fluidic communication)된다.
본 발명의 일부 실시태양에 따르면, 상기 유체 통로는 제1 평면 및 제2 평면 사이의 평면 프레임에 정렬되는 사전-증폭 챔버(pre-amplification chamber)를 포함한다.
일부 실시태양에 따르면, 웰 챔버는 사전-증폭 챔버 및 유체 유출구 사이에 구비된다.
일부 실시태양에 따르면, 사전-증폭 챔버는 포함되지 않는다.
일부 실시태양에 따르면, 사전-증폭 챔버는 하나 또는 그 이상의 화학 물질을 보유하는 폭이 좁은 통로이다.
일부 실시태양에 따르면, 사전-증폭 챔버는 웰 챔버 입구(well chamber entrance)와 유체적으로 연통하는 챔버 출구(chamber exit)를 포함한다.
일부 실시태양에 따르면, 사전-증폭 챔버와 웰 챔버 입구 사이에 통로(passage)가 구비되어 서로 분리된다.
일부 실시태양에 따르면, 제1 평면 및 제2 평면이 수직으로 배향되는 경우, 사전-증폭 챔버 출구는 사전-증폭 챔버의 최상부에 위치한다.
일부 실시태양에 따르면, 웰 챔버 입구는 웰 챔버의 최하부에 위치한다.
일부 실시태양에 따르면, 웰 챔버 입구는 사전-증폭 챔버의 아래부분에 위치한다.
일부 실시태양에 따르면, 통로는 사전-증폭 챔버로부터 웰 챔버 입구로 하향 경사진다.
일부 실시태양에 따르면, 유체 통로는 구불구불한 채널(serpentine channel)을 포함한다.
일부 실시태양에 따르면, 유체 통로는 밸브가 존재하지 않는다.
일부 실시태양에 따르면, 상기 웰-기판은 다수의 약 100 내지 약 1,500개의 나노웰(nanowell)을 가진다.
일부 실시태양에 따르면, 상기 웰-기판은 약 50 내지 약 500㎛의 직경을 갖는 다수의 웰을 포함한다.
일부 실시태양에 따르면, 상기 웰-기판은 약 100㎛의 깊이를 갖는 다수의 나노웰을 가진다.
일부 실시태양에 따르면, 상기 웰-기판은 다수의 나노웰 각각은 깊이가 25㎛ 내지 1000㎛인 다수의 나노웰을 가진다.
일부 실시태양에 따르면, 상기 웰-기판은 다수의 나노웰 각각은 너비가 25㎛ 내지 500㎛인 다수의 나노웰을 가진다.
일부 실시태양에 따르면, 상기 웰-기판은 각 웰이 약 8.5 nL의 부피를 가지는 다수의 나노웰을 가진다.
일부 실시태양에 따르면, 다수의 웰 각각은 0.1nL 내지 500nL의 부피를 가진다,
일부 실시태양에 따르면, 상기 평면 프레임은 소수성 물질(hydrophobic substance)을 보유하기 위한 오일 챔버(oil chamber)를 구비한다.
일부 실시태양에 따르면, 상기 오일 챔버는 웰 챔버와 유체적으로 연통한다.
일부 실시태양에 따르면, 상기 평면 프레임은 평탄한 기저부(base portion)로부터 연장되는 지지체(scaffold)이다.
일부 실시태양에 따르면, 제1 평면 및 제2 평면은 상기 지지체를 유체적으로 밀봉하는 제1 필름 및 제2 필름을 가진다.
일부 실시태양에 따르면, 상기 평면 프레임은 유체 인터페이스를 통해 시료 용기에 유체적으로 연결된다.
일부 실시태양에 따르면, 상기 웰-기판은 니켈로 구성된다.
일부 실시태양에 따르면, 다수의 웰은 특정 표적의 증폭(amplification) 및/또는 검출(detection)을 위한 적어도 하나의 핵산 프라이머 및/또는 프로브를 수용한다.
일부 실시태양에 따르면, 상기 다수의 웰은 특정 표적의 검출을 위한 분자, 예를 들면, 항체 또는 핵산을 수용한다.
본 발명의 일부 실시태양은, 벌집형 반응튜브의 유체 인터페이스에 유체시료를 제공하는 방법에 관한 것이다. 벌집형 반응튜브는 제1 평면과 제2 평면 사이에 유체 통로를 구비하는 평면 프레임(planar frame)을 가지는데, 각 표면은 얇고 유연한 필름으로 씌워진다. 유체 통로의 웰-챔버는 시료물질로 채워지는데, 웰 챔버 내의 다수의 웰이 유체 시료로 채워지도록, 이는 분석할 시료물질과 분석을 수행하기 위한 하나 또는 그 이상의 화학 물질을 추가로 포함할 수 있다. 이어서, 유체 시료는 다수의 웰이 최소한 부분적으로 유체 시료로 채워지도록 웰 챔버로부터 배출된다.
일부 실시태양에 따르면, 사전-증폭 챔버가 웰 챔버에 앞서 유체 통로 내에 존재하고, 반응액은 웰 챔버를 채우기 전에 사전-증폭 챔버에서 증폭되는 단계를 거친다.
일부 실시태양에 따르면, 사전-증폭 챔버는 사전-증폭 챔버의 최상부 출구를 포함하고, 사전-증폭 챔버는 사전-증폭 챔버의 최상부 출구 아래의 수준으로 채워진다.
일부 실시태양에 따르면, 소수성 물질은 웰 챔버로부터 배출된다. 또한, 일부 실시태양에 따르면, 챔버 웰은 소수성 물질의 배출 이후, 수용성 유체로 채워진다.
일부 실시태양에 따르면, 가열 및/또는 냉각 사이클이 제1 평면 및 제2 평면 모두에 적용된다.
일부 실시태양에 따르면, 가열 및/또는 냉각 사이클이 제1 평면 또는 제2 평면에 적용된다.
본 발명의 일부 실시태양은, 벌집형 반응튜브에서의 다중 증폭반응에 관한 것이다.
일부 실시태양에 따르면, 유체 시료가 꾸불꾸불한 유체 통로를 따라 경유한다.
일부 실시태양에 따르면, 다중 반응은 이중 PCR(nested PCR)을 포함한다.
일부 실시태양에 따르면, 다중 반응은 증폭물(amplicon)의 존재를 나타내는 형광지표를 사용하여 모니터링한다.
일부 실시태양에 따르면, 증폭물의 존재는 용융 곡선 분석(melt-curve analysis)을 이용하여 검출한다.
일부 실시태양에 따르면, 다중 반응은 적어도 하나의 단일 염기 다구성(SNP)의 존재 유무를 검출한다.
일부 실시태양에 따르면, 다중 반응에서 사용되는 시료 물질은 체액이거나 체액으로부터 유도된다.
일부 실시태양에 따르면, 시료 물질은 조직이거나 조직으로부터 유래된다.
일부 실시태양에 따르면, 반응은 표적 단백질의 존재 유무를 검출한다.
일부 실시태양에 따르면, 반응은 핵산의 유무를 검출한다.
일부 실시태양에 따르면, 상기 핵산은 DNA이다.
일부 실시태양에 따르면, 상기 핵산은 mRNA이다.
일부 실시태양에 따르면, 마이크로 RNA는 핵산이다.
도 1a, 1b, 및 도 1c는 각각 본 발명의 일부 실시태양에 따른 벌집형 반응튜브의 사시도, 우측면도 및 좌측면도이다.
도 1d 및 1e는 각각 본 발명의 일부 실시태양에 따른 벌집형 반응튜브의 우측면도이다.
도 2a 내지 도 2h는 본 발명의 일부 실시태양에 따른 웰-기판(120)의 다양한 실시태양을 나타내는 벌집형 반응튜브의 부분 단면도이다.
도 3a는 본 발명의 일부 실시태양에 따라 웰-기판(120)에 프라이머를 공급하는 방법을 나타내는 사시도이다.
도 4a 내지 도 4e는 본 발명의 일부 실시태양에 따라 웰-기판에 유체 시료를 충진하는 다양한 방법을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5f는 본 발명의 일부 실시태양에 따른 벌집형 반응튜브에서 각종 센서 조립체의 위치를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일부 실시태양에 따른 벌집형 반응튜브에 유체 시료를 공급하기 위한 유체 제어 및 처리 시스템을 도시한다.
도 7 내지 도 13은 실시예 1에 따른 다중(multiplex) PCR SNP 분석을 수행하기 위한 단계를 나타낸다.
I. 예시적인 벌집형 반응튜브의 구축
본 명세서에 사용된 "벌집(honeycomb)"이라는 용어는 고체 기판의 표면 소정의 위치에 구비된 다수의 웰을 의미한다. 일부 실시태양에 따르면, 본 발명의 벌집형 반응튜브는 적어도 100 또는 200개의 웰을 포함한다. 일부 실시태양에 따르면, 벌집형 반응튜브는 약 100개, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, 1,200, 1,300, 1,400, 1,500개 또는 그 이상 사이의 임의 개수의 웰을 포함한다. 웰은 임의의 형상일 수 있지만, 그 정해진 위치는 기판 위에 임의의 형식(format) 또는 패턴(pattern)으로 배열된다. 본 명세서에 사용된 "벌집형 반응튜브(honeycomb tube)"라는 용어는 "웰 챔버(well chamber)", "멀티-웰 반응챔버(multi-well reaction chamber)" 또는 "멀티-웰 반응관(multi-well reaction tube)"과 혼용되어 사용된다.
도 1a, 1b 및 도 1c는 각각 벌집형 반응튜브(100)의 사시도, 우측면도 및 좌측면도를 나타낸다. 벌집형 반응튜브(100)(멀티-웰 반응챔버와 혼용되어 사용됨)는 평면 프레임(102)을 포함하는데, 일부 실시태양에 따르면, 일반적으로 PCR 적합성(PCR compatible) 중합체(예를 들면, 폴리프로필렌/아크릴 기판) 또는 금속 재료로 구성되는 트러스-유사(truss-like) 구조이다. 평면 프레임(102)은 제1 평면 기판(104)과 제2 평면 기판(106)에 의해 개방면에 결합된, 오픈 트러스(open truss) 또는 지지체(scaffold)로서 구성된다.
제1 평면 기판(104) 및 제2 평면 기판은 평면 프레임(102)에 부착되거나 결합되는 비교적 얇은 고분자 필름으로 구성된다. 몇몇 실시태양에 따르면, 제1 평면 기판(104) 및 제2 평면 기판(106)의 전부 또는 일부가 평면 프레임(102)과 일체로 구성된다(예를 들면, 기판 중 어느 하나를 평면 프레임(102)과 3-D 프린팅, 성형, 이중사출, 또는 가공). 본 발명의 일부 실시태양에 따르면, 제1 평면 기판(104) 및 제2 평면 기판(106)은 투명한 재료로 구성된다. 제1 평면 기판(104)과 제2 평면 기판(106) 각각은 내부 및 외부 대향면(facing surface)을 포함한다. 이들 내부 대향면은 평면 프레임(102)의 내부 중공(interior cavity)과 유체 통로(fluidic passageway)를 구성한다.
평면 프레임(102)의 일부는 유체 인터페이스(fluidic interface, 108)를 구성한다. 유체 인터페이스(108)는 평면 프레임(102)의 대부분이 캔틸레버(cantliever)인 구조 부재(structural member)이다. 유체 인터페이스(108)는 평면 프레임(102)과 일체로 구성된다. 유체 인터페이스(108)는 또한 본 명세서의 다른 부분에서 설명하였듯이, 카트리지 장치에 기계적으로 결합하는 역할을 한다. 유체 인터페이스(108)는 유체 유입구(110) 및 유체 유출구(112)를 포함하는데, 이는 카트리지 장치 또는 시료 용기에 유체 인터페이스를 제공한다. 유체 유입구(110) 및 유체 유출구(112)의 각각은 제1 평면 기판(104) 및 제2 평면 기판(106) 사이에 평면 프레임(102)에 구성되는 유체 통로(fluidic path, 114)에 유체적으로 결합된다. "유입구(inlet)"와 "유출구(outlet)"라는 용어의 사용은 유체 유입구(fluidic inlet, 110) 및 유체 유출구(fidic outlet, 112)의 기능을 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 유체는 양쪽 또는 어느 하나로 유입되거나 배출될 수 있다. 일부 실시태양에 따르면, 유체 통로(114)는 밸브가 없고, 따라서 외부로부터의 압력 증가 또는 감소는 외부 시스템에 의해 유체 유입구(110) 및 유체 유출구(112)를 통해 적용되어 유체 통로(114) 내의 유체를 이동시키는데, 이는 유체 유입구(110) 및 유체 유출구(112)로부터 연장된다. 유체 통로(114)의 단면은 원형 또는 직사각형일 수 있고, 약 50㎛ 내지 약 2mm 범위의 직경 또는 폭을 가진다. 통상적으로, 직경 또는 폭은 약 250㎛ 내지 약 1mm 의 범위를 가진다.
유체 통로(114)는 웰 챔버(118)에 유체적으로 연결된(fluidically connected) 사전-증폭 챔버(116)를 포함한다. 웰 챔버(118)는 다수의 웰(본 명세서에서, 나노웰(nanowell)이라고도 함)을 가지는 웰-기판(120)(본 명세서에서, 벌집(honeycomb)이라고도 함)을 유지한다. 웰-기판(120)은 금속(예를 들면, 금, 백금 또는 니켈 합금), 세라믹, 유리, 또는 다른 PCR 적합성 고분자 물질 또는 복합 물질로 제조된다. 웰-기판(120)은 다수의 웰을 포함한다. 일부 실시태양에 따르면, 웰(120)은 100-1000개, 또는 그 이상의 웰을 포함한다. 웰은 웰-기판(120) 내에 막힌 구멍(blind hole) 또는 관통 구멍(through-hole)으로 구성된다. 웰은 웰-기판(120) 내에 예를 들면, 레이저 드릴링(예를 들어, 엑시머(excimer) 또는 고체상 레이저(solid-state laser)), 초음파 엠보싱, 핫 엠보싱 리소그래피, 니켈 금형 전주법(electroforming), 사출 성형, 사출 압축 성형(injection compressing molding)에 의해 웰-기판(120) 내에 생성된다. 일부 실시태양에 따르면, 웰-기판(120)은 평면 프레임(102)에 접착되거나 동시 성형되고, 일부 실시태양에서는 웰-기판(120)은 평면 프레임(102)의 성형 형태이다. 일부 실시태양에 따르면, 개별 웰의 부피는 0.1 내지 1,500nL, 통상적으로 0.5 내지 200 nL, 바람직하게는 0.5 내지 50nL의 범위이다. 예를 들어, 일부 실시태양에 따르면, 각 웰은 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 15, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 또는 500nL의 부피를 가진다. 웰의 디멘젼(dimension)은, 예를 들면, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된, 원형, 타원형, 정사각형, 직사각형, 난형(ovoid), 육각형, 팔각형, 원뿔형, 및 기타 다른 형상이다. 또한, 웰의 형태는 축(axis)을 따라 변화하는 단면적을 가진다. 예를 들어, 정사각형 구멍은 제1 사이즈로부터 제1 사이즈의 분수(fraction)인 제2 사이즈로 경사지게 된다. 일부 실시태양에 따르면, 웰의 디멘젼은 직경 및 깊이가 대략 같은 정사각형 일 수 있다. 일부 실시태양에 따르면, 웰의 깊이와 직경은 동일하지 않다. 일부 실시태양에 따르면, 웰을 구성하는 벽은 비-평행하다. 일부 실시태양에 따르면, 웰을 구성하는 벽은 점으로 수렴한다. 웰의 디멘젼은 일부 실시태양에서 웰-기판(120)의 전체 부피로부터 유도된다. 일부 실시태양에 따르면, 웰은 깊이 25㎛ 내지 1000 ㎛의 범위이다. 일부 실시태양에 따르면, 예를 들어, 웰은, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 또는 1,000㎛의 깊이를 가진다. 일부 실시태양에 따르면, 웰의 직경은 약 25㎛ 내지 약 500㎛의 범위이다. 일부 실시태양에 따르면, 예를 들어, 웰은 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500㎛의 폭을 가진다.
차트 I - 웰-기판의 예시적 디멘젼(미터법)
Figure 112015040440181-pct00001

웰-기판(120)의 일부 및/또는 제1 평면 기판(104) 및/또는 제2 평면 기판(106)의 내부는 유체 밀착(fluid adherence)을 도모하거나 억제하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 웰을 구성하는 표면은 친수성 물질로 코팅(또는 친수성으로 개질)될 수 있으며, 이로써 유체를 보유하게 한다. 또한, 평탄한 표면(웰을 구성하는 내부면 주변)은 소수성 물질로 코팅(또는 소수성으로 개질)될 수 있으며, 이로써 유체의 체류를 억제한다. 다른 표면 처리는 과잉의 유체가 배출되도록 유체가 바람직하게 상부 표면이 아닌 웰 내에 유지되도록 수행될 수 있다.
웰-기판(120)의 웰은 정렬된 행과 열(rows and columns)의 단순한 기하학적 패턴을 갖거나, 대각 또는 육방으로 배열된다. 일부 실시태양에 따르면, 쉴링거(Schillinger) 등의 Computer Methods in Applied Mechanics and Engineering January 22, 2102에 기술된 바와 같이, 웰-기판(120)의 웰은 혼란 패턴(chaotic pattern)이나 등기하학적 설계 패턴(isogeometric design pattern)과 같은 복잡한 형상의 패턴을 가질 수 있다. 웰은 충전 과정 중에 시약의 교차 오염을 방지하도록, 기하학적으로 서로 분리되고/분리되거나, 너비(width)에 대한 깊이(depth)의 비율의 큰 형상이 될 수 있다. 일부 실시태양에 따르면, 본 명세서에 기술된 방법 및 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 방법들이 시약의 교차 오염을 방지하기 위해 사용될 수 있다.
도 1a에서 보듯이, 웰-기판(120)의 일 부분은 상기 웰-기판의 전면부와 제1 평면 기판(104) 사이에 (유체가 통과하는) 간극이 구성되도록, 제2 평면 기판(106)과 연결된다. 사전-증폭 챔버(116)는, (도면에 표시된 바와 같이) 사전-증폭 챔버(116)의 최상부에 위치하는 사전-증폭 챔버의 출구(122)를 포함한다. 웰-챔버 입구(well chamber entrance, 124)는 웰-챔버(118)의 최하부에 위치한다. 하향 경사 중간 통로(down-ward intermediate passage, 126)는 사전-증폭 챔버 출구(122)와 웰-챔버 입구(124)를 구분한다. 최하부 유입 통로(128) 및 최상부 유출구 통로(130)는 유체 통로(114)의 나머지 부분을 구성한다.
일부 실시태양에 따르면, 평면 프레임(102)은 하나 이상(즉, 적어도 하나)의 보조 챔버(auxiliary chamber, 132)를 포함하는데, 이는 사전-증폭 챔버(116), 웰 챔버(118), 및/또는 유체 통로(114)의 어느 부분에 오일 또는 다른 화학약품 용액 등과 같은 공정 유체(process fluid)를 제공하는데 사용한다. 이러한 보조 챔버(132)는, 하나 또는 그 이상의 막, 밸브 및/또는 금속 호일 또는 얇은 막과 같이 압력 절단가능한 물질(pressure severable material)(즉, 보조 챔버 또는 유체 통로(114)의 인접 부분 내에서 유체로부터의 소정 압력을 가했을 때 파쇄되는 물질)을 통해 유체 통로(114)의 부분에 유체적으로 연결된다.
일부 실시태양에 따르면, 도 1d에 도시한 바와 같이, 유체 통로(114)는 구불구불한 부분(torturous portion)을 포함한다. 유입 통로(inlet passage, 128)와 웰-챔버(well-chamber, 118) 사이의 구불구불한 통로는 유체 공정의 제어 및 처리에 도움이 된다. 상기 구불구불한 통로는 유체 통로를 통해 기름이 흐르는 것을 방해하는 가스 거품(gas bubble)의 생성을 줄일 수 있음이 밝혀졌다. 도 1d에 도시된 벌집형 반응튜브(100')는 대략 도 1a 내지 도 1c에 도시된 벌집형 반응튜브(100)와 동일하나, 중간 통로(intermediate passage, 126')가 구불구불하게 연결된 다수의 연장된 채널을 포함한다. 3개의 연장된 채널 부분이 도시되어 있으나, 더 많거나 적은 부분이 사용될 수도 있다. 일반적으로, 최소 2개의 채널 부분이 사용되며, 일부 실시태양에 따르면, 2 내지 10개의 연장된 채널이 사용된다.
본 발명의 일부 실시태양에 따르면, 도 1e에 도시된 바와 같이, 유체 통로(114)는 과도하게 구불구불한 부분을 포함하기도 한다. 여기 도시된 벌집형 반응튜브(100")는 대략 도 1a 내지 도 1c에 도시한 벌집형 반응튜브(100)와 동일하나, 중간 통로(126)가 상기 벌집형 반응튜브(100")의 대부분에 걸쳐 연장되어 있다. 이런 식으로, 중간 통로(126)의 연장된 채널부는 증폭이 일어나는 연장된 챔버와 마찬가지로 비교적 광범위하게 제작될 수 있다. 따라서, 4개의 연장된 채널 부분이 도시되어 있으나, 더 많거나 적은 부분이 사용될 수도 있다. 일반적으로, 적어도 2개의 채널부가 사용되나, 일부 실시태양에 따르면, 2개 내지 10개의 연장된 채널 부분이 사용되기도 한다. 상기 연장된 채널들 사이의 중간 통로(126)를 규정하는 급한 각도의 내부 곡선(sharply angled interior curve)은 연장된 채널들 사이에 단면적을 감소시키도록 둥글납작하다. 모서리 주변의 감소된 단면적은 곡선의 내부 반경(inner radius)에서의 유체와 대비하여 곡선의 외부 반경(outer radius)에서의 유체 간 유속 차이를 크지 않게 한다. 이때 유속 차이가 너무 크면, 바람직하지 않은 기포를 생성하는 공동현상(cavitation)이 야기된다. 여기서, 회전폭(width of turn)은 연장된 채널 부분 폭의 약 50%이다. 일부 실시태양에 따르면, 회전폭은 연장된 채널부 폭의 10 내지 90% 범위이다. 일부 실시태양에 따르면, 회전폭은 다양할 수 있다.
상술한 바와 같이, 제1e도에 도시한 채널의 형상(channel geometry)은 유체 공정의 제어 및 처리에 도움이 된다. 사전-증폭 챔버는 도시되지 않았지만, "벌집형 반응튜브(100")"의 특정한 응용에 따라 하나 이상 포함될 수 있다. 시료가 매우 적은 수의 표적(즉, 1 또는 2)을 포함하는 경우, 증폭 이후 구불구불한 채널의 선형 특성 때문에 증폭된 표적(amplified target)이 혼합되지 않고 균일하게 분산되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 다시 카트리지(하나의 주사기 튜브 또는 별개의 챔버) 내로 유체를 이동하여 혼합하고, 웰 챔버의 웰을 채우기 전에 증폭물(amplicon)을 균일하게 분산시키는 것이 필요하다.
도 2a 내지 도 2g는 다양한 실시태양의 웰-기판(120)을 보여주는 벌집형 반응튜브의 부분 단면도이다.
도 2a는 웰-기판(120)의 웰이 막힌 구멍(blind-hole)을 통하여 평면 프레임(102)으로 구성되는 실시태양을 도시한다. 이 실시태양에서는, 제2 평면 기판(106)은 평면 프레임(102)에 일체가 되도록 구성되어, 본질적으로 하나가 된다. 프라이머/프로브(134)은 웰-기판(120)의 각 웰에 배치되는 것으로 도시되었다.
도 2b는 웰-기판(120)의 웰이 관통 구멍(through-hole)을 통하여 평면 프레임(102)에 결합된 고분자 필름과 같은 기판으로 구성되는 실시태양을 도시한다. 예를 들면, 별도의 기판이 구멍을 통하여 웰-기판을 구성하도록 천공되고, 이어서 평면 프레임(102)에 부착되거나 용접된다. 이 실시태양에 따르면, 제2 평면 기판(106)은 평면 프레임(102)에 일체로 구성되어, 본질적으로 하나가 된다. 일부 실시태양에 따르면, 막힌 구멍(blind hole, 102)이 제2 평면 기판(106) 내에 구성되어 평면 프레임(102)에 결합될 수도 있다.
도 2c는 웰-기판(120)의 웰이 관통 구멍(through hole)을 통하여 평면 프레임(102)의 일부에 구성되는 실시태양을 도시한다. 이 실시태양에 따르면, 제2 평면 기판(106)은 평면 프레임(102)과 일체로 구성되고, 웰-기판(120)은 평면 프레임(102) 내의 포켓(pocket)에 부착되거나 용접되는 별도의 구성 요소이다.
도 2d는 웰-기판(120)의 웰이 관통 구멍을 통하여, 도 2c에 도시된 바와 같은 평면 프레임(102)의 일부에 구성되는 것을 도시한다. 그러나, 이 실시태양에 따르면, 가스 투과막(gas permeable membrane, 136)이 평면 프레임(102) 및 제2 평면 기판(106) 사이에 위치한다. 상기 막(136)은 유체가 통과하지 못하도록 하면서, 가스가 상기 막을 통해 웰로부터 배출될 수 있도록 한다. 가스 투과막은 기체 투과성 접착제에 의해 웰-기판에 부착된다. 일부 실시태양에 따르면, 상기 막(136)은 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)으로 구성되고, 20 내지 1000㎛ 범위의 두께를 가지며, 일부 실시태양에서는 100 내지 200㎛에 이르는 두께를 갖는다.
도 2e는 웰-기판(120)의 웰이 막힌 구멍을 통하여 평면 프레임(102)의 일부에 구성되는 실시태양을 도시한다. 이 실시태양에 따르면, 제2 평면 기판(106)은 평면 프레임(102)과 일체가 되고, 웰-기판(120)은 평면 프레임(102) 내에서 포켓에 부착되거나 용접되는 별도의 구성 요소이다.
웰-기판(120)의 전부 또는 일부는 도전성(conductive) 금속부(예를 들면, 금)를 포함하여, 금속으로부터 웰에 열 전달을 가능하게 한다. 예를 들어, 제2 평면 기판(106)에 대해 배치된 웰-기판(120)의 부분은 금속판이거나 코팅될 수 있다. 일부 실시태양에 따르면, 웰의 내부 표면은 열 전달을 가능하게 하는 금속으로 코팅될 수 있다.
도 2f는 도 2d의 실시태양과 유사하게 구성되는 실시태양을 나타낸다. 그러나, 여기에서 웰-기판은 제1 및 제2 기판 사이의 중간 지점에 위치한다. 가스 투과막(136)은 가스 투과성 접착제에 의해 웰-기판에 접착될 수 있다. 도 2d에 도시된 실시태양과 같이, 공기는 액체 충전(liquid filling) 도중에 가스 투과막을 통해 웰의 뒤로 배출된다. PCR 완충용액이 웰을 채우고 웰에서 건조된 프라이머 세트를 재수화(rehydration)한 후, 절연 오일(isolation oil) 또는 열전도성 액체로 웰-기판(120)의 양쪽을 채워서 크로스 토크(cross-talk)를 방지한다.
도 2h는 도 2f의 실시태양와 유사하게 구성되는 실시태양을 나타낸다. 그러나, 여기에서 막은 포함되지 않는다. 따라서, 공정 유체는 웰-기판(120)의 양측에 노출될 수 있다. PCR 완충액이 웰을 채우고 웰에서 건조 프라이머 세트를 재수화한 후, 절연 오일 또는 열전도성 액체로 웰-기판(120)의 양쪽을 채워서 크로스 토크를 방지한다.
도 2h는 예를 들면, 도 2a 내지 도 2f에서 보듯이, 본 명세서에 개시된 임의의 실시태양에 유용한 웰-기판(120)의 실시태양을 나타낸다. 여기서, 웰-기판(120)의 웰(121)은 원뿔(cone)과 유사하게 큰 직경에서 작은 직경으로 테이퍼(taper) 형상을 갖는다. 원뿔형 웰(cone-shaped well)은 웰의 경사진 벽이 프라이머를 포함하는 액체 시약을 증착하기 위한 비접촉 증착법(non-contact deposition)(예를 들어, 잉크젯)의 사용을 가능하게 하기 때문에, 프라이머 응용시 장점이 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 원뿔형 웰은 건조하기 쉽기 때문에, 접촉 및 비-접촉 방법 둘 다에 대한 액체 시약을 쉽게 사용할 수 있게 한다. 또한, 원뿔형 웰은 가스 투과막(136)이 존재할 때 거품 및 누출을 방지하는 것으로 밝혀졌다.
도 3a는 웰-기판(120)에 프라이머를 제공하는 방법을 도시한다. 도시된 바와 같이, 시판되는 인쇄 핀(printing pin)은 웰을 액체 프라이머로 채우는데, 웰에서 건조되거나, 액체가 채워진 웰은 충진 이후 밀봉된다(sealed over). 일부 실시태양에 따르면, 웰-기판(120)에 액체 형태의 프라이머가 공급된 이후, 프라이머 잔기가 향후 액화(liquefaction)를 위하여 각 웰에 부착되도록 프라이머는 건조된다. 이러한 핀(및 관련 시스템)의 예로서는, 524 East Weddell Drive, Sunnyvale, CA 94089, USA에 소재하는 Arraylt Corporation의 946MP(X) 시리즈 핀을 포함한다. 하산(Hasan) 등의 미합중국 특허공개 제 2009/0054266호 및 헤스(Hess) 등의 미합중국 특허 제 6,716,629호에 의해 개시된 방법 또한 프라이머를 제공하는데 사용된다. 응용공정에서, 인쇄 핀은 웰-기판(120)과 접촉하도록 구성될 수 있다. 일부 실시태양에 따르면, 예를 들면, 잉크젯 프린팅과 같은 액적-기반 방법(droplet-based method) 또는 당업자에게 공지된 다른 적합한 비-접촉 방법(non-contact process)과 같이, 웰을 구성하는 하나 또는 그 이상의 벽을 가지는 웰에 액체 시약(예를 들면, 프라이머)을 제공하는데 사용될 수 있다.
II. 벌집형 반응튜브에 시료 올리기(loading)
도 4a 및 도 4b는 웰-기판(120)에 유체 시료(sample fluid)를 충전하는 방법을 도시한다. 도 4a에서, 유체 시료는 웰-기판(120)과 제1 평면 기판(104) 사이로(예를 들면, 압력을 통하여) 흐른다. 유체 시료가 웰-기판(120)를 통과함에 따라, 각 웰은 유체로 가득 채워져 웰 내에 주로 표면 장력을 통해 유지된다. 상술한 바와 같이, 웰을 구성하는 벽과 같은 웰-기판(120)의 일부는 친수성 물질로 코팅되거나 또는 더 친수성이 되도록 처리되고, 이는 유체 시료가 통과함에 따라 웰의 완전하고도 균일한 충전을 돕는다. 또한, 웰 표면을 둘러싸는 상면(top surafce)과 같은 웰-기판(120)의 표면은, 유체 시료가 인접 부분이 아니라 웰에만 유지되도록 소수성 물질로 코팅되거나 또는 더 소수성이 되도록 처리되어, 시험 결과의 신뢰성을 높힌다. 또한, 제1 평면 기판(120)의 내부면은 코팅되거나 소수성 효과를 도모하기 위해 처리된다. 도 4b의 왼쪽 그림을 보면, 상기 유체 시료가 후퇴한 후, 웰만이 충진되어 있는 것을 알 수 있다. 일부 실시태양에 따르면, 도 4b의 오른쪽 그림에 도시된 바와 같이 유체 시료가 진행하여 공기 주머니(air pocket)가 생기며, 도 4b의 왼쪽 그림에 도시된 예시적인 실시태양에서와 같이이, 시료를 빼낼 필요성을 제거한다. Jackman et al., Anal. Chem., 1998, 70, 2280-2287 및 Hatch et al., MULTILAYER HIGH-DENSITY 3D NANOWELL ARRAYS FOR DIGITAL BIOLOGY, 15th Int' Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, Oct. 2-6 2011, 269-271에 개시된 "불연속 습윤(discontinuous wetting)" 등의 충진 방법도 사용할 수 있다. 일반적으로, 웰-기판(120)은 웰 내의 다른 프라이머에 의한 교차 오염(cross-contamination)을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 습기를 제거하여야(de-wet) 한다.
도 4c 및 도 4d는 웰-기판(120)에 유체 시료를 충진하는 다른 방법을 도시한다. 도 4c에서 보듯이, 웰-기판(120)은 도 4a 및 도 4b에 도시된 기술의 조합에 따라 충진된다. 그러나, 유체 시료는 오일 포켓(oil pocket)에 의해 끌리게 된다(trail). 도 4c에서는 오일이 유체 시료와 직접 접촉하는 것으로 도시되어 있지만, 공극(air gap)이 오일 캡(oil cap)과 유체 시료 사이에 생길 수 있다.
도 4d의 왼쪽 그림에 도시된 바와 같이. 각 웰이 유체 시료로 채워진 다음, 오일은 각 웰을 "캡(cap)" 오프하여, 웰-기판(120)이 가열될 때 증발되는 것을 감소시킨다. 일부 실시태양에 따르면, 웰이 충진된 후, 챔버의 상부로부터 오일이 도입되고, 도 4d의 가운데 그림에 도시된 바와 같이 챔버 입구(124)로부터 배출된다. 도 4d의 왼쪽 및 오른쪽 그림에 도시된 실시태양 모두에서. 웰이 오일로 캡핑된 이후, 열전도성을 향상시키기 위해 수용액으로 열 챔버(118)를 채울 수 있다. 일부 실시태양에 따르면, 고정 수용액 유체(stationary aqueous solution)는 챔버(118) 내에서 가압되어 유체 및 기포의 움직임을 정지시킨다.
일부 실시태양에 따르면, 웰이 충진된 이후, 오일은 도 4d의 오른쪽 그림에 도시된 바와 같이 가열하는 동안 챔버 내에 고정 유지될 수 있다. 일부 실시태양에 따르면, 고정된 오일은 챔버(118) 내에서 가압되어 유체 및 기포의 움직임을 정지시킬 수 있다.
미네랄 오일과 같은 오일은 각 웰을 분리하고 열전도성을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 실시태양은 "오일(oil)"에 한정되지 않는다. 불소계 액체(fluorinated liquid, 예를 들면, 3M FC-40)와 같은 임의의 열전도성 액체를 사용할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 "오일"은 이러한 대안을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
일부 실시태양에 따르면, 도 4c에 도시된 바와 같이 웰이 유체 시료로 채워진 후. 오일은 유체 시료를 따라 웰을 캡핑할 수 있고, 웰 챔버(118) 내에 유지된다. 실시예 3에 기술되고 도 4e에 도시된 바와 같이, 이러한 실시태양의 상세한 실험이 수행되었다.
도 5a 및 도 5b는 웰-기판(120)에서 반응을 검출하기 위한 예시적인 센서 조립체(sensor assembly)를 나타낸다. 일부 실시태양에 따르면, 센서 조립체 A가 제1 평면 기판(104)에 대하여 인접하거나 대향하여 위치한다. 일부 실시태양에 따르면, 제2 센서 조립체 B는 제2 평면 기판(106)에 인접하거나 대향하여 위치한다. 각각의 센서 조립체는 PCR 테스트를 위한 여기(excitation) 및/또는 감지(detection) 장치를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 따르면, 센서는 형광의 여기 및 검출을 위한 광센서(optical sensor)이다.
도 5c는 도 5a 및 도 5b의 구성 대신에 혹은 조합하여 사용될 수 있는 예시적인 센서 조립체의 구성을 나타낸다. 여기서, 센서 조립체는 벌집형 반응튜브(100)의 전방 가장자리(forward edge)를 따라 배치된다. 일부 실시태양에 따르면, 제2 센서 조립체 B가 포함된다. 일부 실시태양에 따르면, 도 5a 및 도 5b에 도시된 센서 조립체 A와 B의 어느 하나 또는 전부는 도 5c에 도시된 센서 조립체 어느 하나 또는 전부와 조합하여 사용된다.
도 5d는 예시적인 센서 조립체의 구성을 나타낸다. 일부 실시태양에 따르면, 이 센서 조립체의 구성은 도 5a 내지 도 5c에 도시된 구성과 조합하여 사용될 수 있다. 센서 조립체는 광섬유 면판(fiber optic face plate, FOFP)에 결합된 CCD/CMOS 검출기를 포함한다. 필터는 FOFP 위에 적층되고, 표적(target)에 대향하거나 인접하여 배치되는데, 여기서는 웰-기판(120)이다. 일부 실시태양에 따르면, 상기 필터는 도 5e에 도시된 바와 같이, 상부에 위치한 FOFP와 함께 CCD의 상부에 직접 적층될 수 있다.
도 5f는 다른 예시적인 센서 조립체의 구성을 나타낸다. 일부 실시태양에 따르면, 이 구성은 도 5a 내지 도 5c에 도시된 구성의 어느 하나 또는 그 이상과 함께 사용될 수 있다. 여기서, CCD/CMOS 검출기 사이에 배치된 필터를 가지는 이중 렌즈 구성(double lens configuration)에 결합된다. 일부 실시태양에 따르면, 필터는 CCD/CMOS 검출기에 결합될 수 있다.
III . 사용방법
일부 실시태양에 따르면, 유체 시료는 유체 유입구(fluidic inlet, 110)로 유입 통로(inlet passage, 128)를 통해 도입된다. 그런 다음, 사전-증폭 챔버(116)는 유체 시료로 충전된다. 사전-증폭 챔버(116)는 원하는 화학 반응을 일으키고, 이에 의해 내부의 유체를 증폭시키도록, 하나 또는 그 이상의 화학 물질을 포함한다. 일부 실시태양에 따르면, 목적하는 반응이 일어날 때까지 유체는 사후가 아니라 사전-증폭 챔버의 출구(122)에 이르기까지 사전-증폭 챔버(116) 내에 유지된다. 유체는 이어서 사전-증폭 챔버의 출구(122)를 통해 하향 경사 중간 통로(download sloping intermediate passage, 126)에 전달된다. 그런 다음, 유체는 웰 챔버 입구(124)를 통과하고, 웰 챔버(118)를 채운다. 일부 실시태양에 따르면, 유체는 사전-유체 증폭 챔버에서 증폭된 후, 유체 유입구를 통해 사전-증폭 챔버로부터 혼합을 위한 유체 처리 카트리지 내의 별개의 챔버 내로 배출되고, 이어 유체 유입구를 통해 돌아와서 사전-증폭 챔버를 통해 웰-챔버로 유입된다. 웰-기판(120)의 웰은, 예를 들면, 도 4a 내지 도 4d에 도시된 방법에 의해 충전될 수 있다. 일단, 웰-기판(120)의 웰이 채워지면, 유체는 유출 통로(130)를 통하거나 거꾸로 유입 통로(128)를 통해 웰 챔버(118)로부터 배출될 수 있다. 일부 실시태양에 따르면, 미네랄 오일과 같은 오일은 가열 사이클(heating cycle) 동안 증발을 방지하기 위해 충진된 웰 위를 코팅할 수 있다. 일부 실시태양에 따르면, 5 내지 20psi에 이르는 압력이 웰-챔버(118)에 적용된다. 따라서, PCR 완충액 뿐만 아니라 열전도성 액체(오일)는 PCR 용액과 모든 작은 기포(건조된 프라이머의 재수화 과정에서 생성)를 유지한다. 이러한 가압은 생성된 기포의 고정화를 야기하여, 움직이는 기포와 액체의 광학적 간섭이 발생하지 않도록 한다. 일부 실시태양에 따르면, 웰 챔버(118)가 100%의 습도, 또는 증류수 등의 수화 유체(hydration fluid)는 웰 챔버(118)가 가열 사이클 도중 증발을 방지하기에 충분한 습도를 갖도록, 증류수와 같은 수화 유체(hydration fluid)는 사전-증폭 챔버(116) 내 또는 보조 챔버(132) 중 하나에서 가열된다. 충전이 완료되면, 웰-기판(120)은 PCR을 위한 가열 사이클을 수행하는 벌집형 반응튜브(100)와 열적으로 접촉하는 외부 장치에 의해 가열될 수 있다. 일부 실시태양에 따르면, RFID, 퀴리 점(Curie point), 유도성(inductive) 또는 마이크로웨이브 가열과 같은 비접촉 가열 방법들이 사용될 수 있다. 이들 및 다른 비접촉 가열 방법들은 당해 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있으며, 본 명세서에 개시된 바와 같이 용이하게 벌집형 반응튜브에 적용될 수 있다. 가열 사이클 동안 벌집형 반응튜브는 도 5a 내지 5e에 도시한 센서배열(sensor arrangement)을 통하여 화학반응이 모니터링된다.
벌집형 반응튜브(100)를 사용하는 다양한 생물학적 분석법이 일반적으로 시험 시료 중의 최소한 하나의 관심있는 분석 물질의 존재를 확인하기 위한 목적으로 수행될 수 있다. 이들 분석 방법은, 이에 한정되는 것은 아니나, 미리 선택된 쌍의 분자들(예컨대, 항체-항원 결합쌍 또는 충분한 상보성을 가지는 두개의 폴리뉴클레오티드 서열 등) 사이의 특이적인 결합 친화력에 근거하는 결합분석법, 소정의 염기서열 의존적인 핵산 증폭반응, 및 소정의 활성을 가지는 분자(효소 등)의 존재를 나타내는 화학반응을 포함한다.
일부 실시태양에 따르면, 예를 들어 "미끼(bait)" 단백질이나 핵산과 같은 소정의 배열로 벌집형 반응튜브에 증착되는 분석시약 또는 프로브가, 기판 표면에서의 최소한의 구조적 대체(alteration) 또는 변형(modification)을 가지는 고체 기판의 표면에 직접 고정된다. 다시 말해, 상기 분석시약 또는 프로브는 본질적으로 표면 위에 "스팟팅"되고(spotted) 2차원 공간 내에 배열되고 들어있게 된다. 일부 실시태양에 따르면, 기판은 상기 분석시약 또는 프로브를 수용하도록 소정의 치수를 가지는 다수의 웰 또는 압흔(indentation)의 배열을 구성하도록 제조되는데, 이는 웰 또는 압흔 내에 영구적으로 고정화되거나 분석 지속기간(assay time duration) 동안 웰 또는 압흔 내에 임시적으로 들어있게 된다. 다시 말해, 분석용 프로브는 3차원 공간 내에 한정된다.
벌집형 반응튜브의 분석 프로브로 적절한 물질은 단백질(예를 들어, 항체와 같은 전장 단백질, 단백질 조각, 또는 짧은 펩티드), 핵산(예를 들면, DNA, RNA, 마이크로 RNA), 탄수화물, 지질, 조직, 세포, 또는 거의 모든 화학적 성질을 가지는 분자들을 포함한다. 다시 말해, 다중분석용 마이크로 어레이에 사용되는 것으로 알려진 임의의 물질/분자가 본 발명의 벌집형 테스트 튜브에 이용될 수 있다.
IV . 관심있는 분석물의 검출
본 발명의 일 측면은, 예를 들어, 표적 단백질(예를 들면, 특정 항원의 항체), 표적 세포, 표적 유전자, 유전자의 표적 서열, 표적 mRNA의 전사 또는 표적 핵산 등 최소한 하나의 관심있는 분석 시료의 존재를 나타내는 광신호의 모니터링(도 5a 내지 도 5e에 도시한 센서의 구성을 이용)과 관련이 있다. 이러한 표적 분석물(들)은 바이러스, 세균, 곰팡이, 기생 생물(예를 들면, 원생 동물), 동물, 또는 인간 등 모든 기원(origin)이 될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 단백질, 바이러스 항원에 대한 항체, 박테리아 또는 바이러스 게놈 유래의 DNA/RNA 염기서열이 시험 시료에 대한 검출의 관심 분석물질이 될 수 있다. 표적 분석물질로서는, 이에 한정되는 것은 아니나, 마이크로 RNA, 포유류 유전자, 포유류 유전자의 각종 돌연변이, 대립 유전자 변이체(alleic variant), 또는 종양 유전자 내의 (메틸화 상태로 다른 프로파일을 나타내는) 후생 유전학적 변이체(epigenetic variation), 종양 억제 유전자, 또는 특정 질환 및 상태와 관련되는 것으로 유추되는 임의의 다른 유전자 등의 핵산 서열을 포함하고, 이는 본 발명의 벌집 테스트 튜브를 적용하여 검출하는 대상으로서 초점이 된다. 관심있는 표적이 되는 예시적인 바이러스, 유전자 및/또는 단백질은, 이에 한정되는 것은 아니나, 인간 면역결핍 바이러스-1(HIV-1), 인간 사이토메갈로 바이러스(CMV), C형 간염 바이러스(HCV), B형 간염 B 바이러스, 인간 파필로마 바이러스(HPV), 엔테로바이러스, 수두-대상 포진 바이러스(varicella-zoster virus); 플라비바이러스(flavivirus), 헤파드나바이러스(hepadnavirus), 헤르페스바이러스, 노나바이러스(norovirus), 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus), 파보바이러스(parvovirus), 파포바바이러스(papovavirus), 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 페스티 바이러스(pestivirus), 피코나바이러스(picornavirus), 및 인플루엔자를 포함한다. 검출 대상이 되는 대표적인 세균, 유전자 및/또는 단백질은 마이코박 테리움 투베르쿨로시스(mycobacterium tuberculosis, TB), 탄저균, 레지오넬라 뉴모필리아(legionella pneumophilia), 리스테리아 모노사이토젠스(lysteria monocytogenes), 나이제리아 임균(neisseria gonorrhoeae), 클라미디아 트라코마티스(chlamydia trachomatis), 나이제리아 메닌지티데스(neisseria meningitides), 크타필로코커스 구균(xtaphylococcus aureus), 헬리코박터 파일로리, 및 엔테로코커스 패칼리스(enterococcus faecalis)를 포함한다. 예시적인 관심 인간 유전자는 p53, BRCA1 및 BRCA2, Her2/Neu 및 다른 EGFR 패밀리, BCR-ABL, PTEN, RAS, RAF, Src, RB, Myc, VEGF, 토포이소머라제, 및 APOEε4 대립 유전자이다.
관심있는 다양한 분석물을 검출 및/또는 정량하는 기본적인 기법은 예를 들어, Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual(3rd ed, 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual(1990); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(1994); 및 Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual(1988)에서 찾을 수 있다 .
특정 단백질의 존재를 검출하기 위하여, 면역학적 검정과 같은 다양한 결합 친화성-기반 분석법을 이용할 수 있다. 일부 실시태양에 따르면, (벌집형 포맷에서 소정의 스팟(spot)에 고정되거나 벌집형의 소정의 웰 내에 놓여 지는) 폴리펩티드에 대하여 특이적 결합 친화성을 갖는 항체를 함유하는 시험 시료로부터 표적 단백질을 잡아냄으로써 샌드위치 분석 포맷(sandwich assay format)이 수행될 수 있다. 단백질의 존재는 다음과 같은 형광 발생 분자와 같은, 검출 가능한 표지에 부착되는 이차 항체와 함께 표시될 수 있다.
관심있는 핵산의 존재를 검출하기 위하여는, 프로브, 또는 표적 핵산서열에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base-pairing)에 의거하여 상기 표적 서열에 혼성화되는 분자가 통상적으로 사용된다. 또한, 프로브는 소정의 위치에서 고체 기판의 표면에 고정화되거나 스팟을 형성하며, 일부 실시태양에 따르면, 상기 프로브는 상기 기판 위 소정의 패턴 내 소정의 위치의 웰에 놓이게 된다. 예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 등 검출되는 표적 폴리뉴클레오티드의 특성에 따라, 검출 프로브(detection probe)는 표적 서열에 대한 서열이 실질적으로 동일하거나 표적 서열에 상보적인 서열과 실질적으로 동일할 수 있다. 다시 말해, 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 경우에 따라서, 비결합 단편이 결합 단편과 표적 핵산 사이의 결합을 방해하지 않는 한, 프로브는 표적 뉴클레오티드에 대한 결합 단편(binding segment) 뿐만 아니라 비-결합 단편(non-binding segment)을 포함할 수 있다. 통상적으로, 결합 단편은 표적서열의 특이적인 인식을 확실히 하기 위하여, 적어도 8개, 종종 적어도 10, 12, 15, 20, 25, 30개 혹은, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 가닥 중 하나에 상보적인 그 이상 개수의 접촉(contigous) 뉴클레오티드를 가진다. 일부 실시태양에 따르면, 프로브는, 예를 들면, 플루오레세인, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 피코에리트린(phycoerythrin), 하이드록시쿠마린, 아미노쿠마린(aminocoumarin), 캐스케이드 블루, 퍼시픽 오렌지(Pacific Orange), 루시퍼 옐로우(lucifer yellow), 알로피코시아닌(allophycocyanin), TruRed, FluorX, 또는 란타닌드(lanthanide)와 같은 형광 또는 발광 분자 등의 검출을 용이하게 하기 위한 발광 잔기(light-emitting moiety)를 포함한다.
일부 실시태양에 따르면, 개별의 폴리뉴클레오티드 서열의 존재를 확인하기 위하여 상이한 형광 지시제(fluorescent indicator)가 사용된다. 일부 실시태양에 따르면, 일반적인 형광 지시제가 사용될 때 개별의 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하기 위해서는 융점-기반 검출법(melting point-based detection method)이 효과적일 수 있다.
관심있는 분석물질의 검출이 직접적으로 벌집형 반응튜브에 제공되는 분석물에의 친화성 결합에 기초하여 이루어지는 결합분석법(binding assay)과 달리, 관심있는 핵산의 검출 및/또는 정량을 위한 증폭-기반 분석 시스템(amplification-based assay system)은 광범위한 응용 스펙트럼을 제공한다. 이러한 증폭-기반 시스템에서, 서열-특이적 증폭반응이 종결되면, 하나 또는 그 이상의 관심있는 핵산이 검출 및/또는 정량된다. 또한, 증폭-기반 방법에 의해 표적 핵산을 검출하기 위하여, 여러 세트의 프라이머가 이중(nested)-PCR 형식으로 수행되는 검출을 위해 각 웰에 포함되는데, 예를 들면, 프라이머의 제1세트는 표적 서열의 일부를 규정하고 프라이머의 하나 또는 그 이상의 연속 세트에 의해 추가적인 증폭을 허용하는 증폭물(amplicon)을 생성한다.
일부 실시태양에 따르면, 관심있는 핵산은 DNA 분자이다. 서열-특이적 증폭은 적어도 하나의 프라이머 세트, 자유(free) 뉴클레오티드, 및 적절한 DNA 또는 RNA 중합효소를 벌집형 반응튜브의 각 웰에 제공함으로써 수행되고, 그런 다음 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 합성 및 증폭을 달성하기 위해 벌집형 반응튜브를 적절한 온도 조건 및 지속시간으로 유지시킨다.
각 프라이머는 통상적으로 염기쌍에 의해 폴리뉴클레오티드 주형과 이중체(duplex)를 형성하면, 핵산 합성의 개시점으로 작용할 수 있고, 연장된 이중체(extended duplex)가 형성되도록 주형을 따라 3' 말단으로부터 연장될 수 있는(천연 또는 합성) 올리고뉴클레오티드다. 프라이머의 연장은 일반적으로 DNA 또는 RNA 중합효소와 같은, 핵산 중합효소에 의해 수행된다. 연장 과정에서 첨가되는 뉴클레오티드 서열은 주형의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 결정된다. 대부분의 실시태양에서, 프라이머는 DNA 중합효소에 의해 연장된다. 종종, 프라이머는 6 내지 40개의 뉴클레오티드, 통상적으로 약 12 내지 약 20개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 프라이머는, 예를 들어, 단일 프라이머를 이용하는 선형 증폭반응(linear amplification reaction) 또는 두개 이상의 프라이머를 이용하는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 등 다양한 핵산 증폭반응에 이용된다. 특정 응용에 사용되는 프라이머의 길이 및 서열을 선택하기 위한 지침은 당해 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면, Dieffenbach, editor, PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd Edition(Cold Spring Harbor Press, New York, 2003)을 참조하라.
PCR 등의 핵산 증폭반응에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 증폭 산물은 본 명세서에서 "증폭물(amplicon)"이라 칭한다. 증폭물은 일반적으로 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 형태로, 프라이머 연장의 결과물인 폴리뉴클레오티드의 집단이다. 증폭물은 그의 산물이 하나 또는 그 이상의 표적 핵산 증폭 이후 복제물(replicator)인 다양한 증폭반응에 의해 제조된다. 일반적으로, 증폭물을 생산하는 증폭반응은 염기쌍에서 주형에 의해 주도된다: 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 프라이머 모두는 주형 폴리뉴클레오티드 또는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적이다. 이러한 상보성(complementarity)은 반응 생성물, 즉 증폭물의 생산에 긴요하다. 경우에 따라서는, 주형 기반 반응(template-driven reaction)은 핵산 중합효소에 의한 프라이머 연장(primer extension) 또는 핵산 연결효소에 의한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 연결(primer ligation)이다. 이러한 반응은, 이에 한정되는 것은 아니나, 중합효소 연쇄반응(PCR), 선형 중합효소 반응, 연결효소 연쇄반응(ligase chain reaction, LCR), 가닥-변위 반응(strand-displacement reaction, SDA), 핵산서열-기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA), 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification) 등을 포함하는데, Mullis et al, 미합중국 특허 제4,683,195호; 제4,965,188호; 제4,683,202호; 및 제4,800,159 호(PCR); Gelfand et al, 미합중국 특허 제 5,210,015호(real-time PCR using TaqMan probes); Wittwer et al, 미합중국 특허 제 6,174,670호; Landegren et al, 미합중국 특허 제4,988,617호(LCR); Birkenmeyer et al, 미합중국 특허 제 5,427,930호(gap-LCR); Kacian et al, 미합중국 특허 제 5,399,491호(NASBA); Walker, 미합중국 특허 제 5,648,211호 및 5,712,124호(SDA); Lizardi, 미합중국 특허 제 5,854,033호; Aono et al, 일본국 특허공개 JP 4-262799(rolling circle amplification); 등을 참조하라. 일부 실시태양에 따르면, 하나 또는 그 이상의 표적 핵산의 증폭물은 본 발명의 벌집형 반응튜브에서 하나 또는 그 이상의 예를 들어, 이중(nested)-PCR 등의 PCR을 통하여 제조된다.
중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 DNA의 상보적인 가닥의 동시적인 다수의 프라이머 연장에 의해 특정 DNA 서열의 시험관 내 증폭을 위한 효소-매개 반응(enzyme-mediated reaction)이다. 즉, PCR은 다음 단계의 하나 또는 그 이상의 반복을 포함하는, 표적 핵산 프라이머 결합부위 측면의 표적 핵산의 여러 사본 또는 복제물을 제조하는 반응이다: (ⅰ) 표적 핵산의 변성(denaturing); (ii) 프라이머 결합부위 어닐링(annealing); 및, (iii) 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 핵산 중합효소에 의한 프라이머의 연장(extending). 반응은 일반적으로 변성, 어닐링 및 연장 단계의 각각에 대해 상이한 온도 최적화를 통해 순환된다. 특정 온도, 각 단계에서의 지속 시간, 및 단계들 사이의 변화 속도는, 당업계에 통상의 기술자들에게 공지된 요인에 의존한다. 예를 들어, McPherson et al, editors, PCR: A Practical Approach and PCR2: A Practical Approach(IRL Press, Oxford, 1991, 1995)을 참조하라. 예를 들어, 종래의 Taq DNA 중합효소를 사용하는 PCR에서 이중 가닥 표적 핵산은 90℃ 이하의 온도에서 변성되고, 프라이머는 50 내지 75℃의 온도에서 어닐링되며, 72 내지 78℃의 온도에서 연장된다.
"PCR"이란 용어는, 이에 한정되는 것은 아니나, 역전사(reverse transcription, RT)-PCR, 실시간(real-time) PCR, 이중(nested) PCR, 정량적(quantitative) PCR, 다중(multiplexed) PCR, 및 기타 유사한 변형을 포함한다. 이들 다양한 PCR 분석을 위하여, 나노리터(nL), 예를 들면, 약 0.1 내지 약 500nL로부터 마이크로리터(㎕), 예를 들면, 약 1 내지 약 5㎕까지의 통상적인 반응부피가 본 발명의 벌집형 테스트 튜브 웰 내에 놓이게 되어, 신속한 다중화 분석을 가능하게 한다. 일부 이에 제한되지 않는 예시적인 실시태양에 따르면, 벌집형 반응튜브각 웰 내의 반응 부피는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9. 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100nL이다.
역전사(reverse transcription) PCR 또는 RT-PCR은 시료 내의 RNA의 검출 및 분석을 위한 강력한 수단이다. RT-PCR은 표적 RNA가 상보적인 단일 가닥 DNA로 전환되고, 그런 다음 일반 PCR 공정에서 증폭될때 역전사 반응에 의해 선행되는 PCR이다. 예를 들면 테콧(Tecott) 등의 미합중국 특허 제 5,168,038호를 참조하라.
실시간(real-time) PCR은 반응 생성물, 즉, 증폭물(amplicon)의 양이 반응이 진행됨과 동시에 모니터링되는 PCR이다. 반응 생성물(들)를 모니터링하는 검출 수단에서 주로 차이가 있는 실시간 PCR의 많은 형태가 존재한다. 예를 들어, Gelfand et al, 미합중국 특허 제 5,210,015호(TaqMan probes); Wittwer et al, 미합중국 특허 제 6,174,670호 및 제 6,569,627호(intercalating dyes); Tyagi et al, 미합중국 특허 제 5,925,517호(molecular beacons). Detection chemistries for real-time PCR are reviewed in Mackay et al, Nucleic Acids Research, 30: 1292-1305(2002)를 참조하라.
이중(nested) PCR은 프라이머의 제1 세트를 이용하는 제1 단계 PCR의 증폭물(amplicon)이 프라이머의 제2 세트를 사용하는 제2 단계 PCR을 위한 주형(template)이 되는 증폭의 적어도 두 단계를 포함하는 PCR 공정이다. 프라이머의 제2 세트 중 적어도 하나의 프라이머는 서열 상보성을 가지고, 증폭물 서열 내의 위치에, 첫번째의 두 프라이머의 혼성화 부위 사이, 즉 제1 단계 PCR의 증폭물의 서열 내 위치에서 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화된다.
다중(multiplexed) PCR은 다수의 잠재적 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 증폭이 동일한 반응 혼합물에서 수행되는 PCR 공정이다. 예를 들면, Bernard et al., Anal. Biochem., 273:221-228(1999)(two-color real-time PCR)을 참조하라. 본 발명의 벌집형 분석 포맷은 다중 PCR을 수행하기에 적합하다. 프라이머의 개별 세트는 별개의 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 증폭 및 검출을 위해 잘 의도되는 범주에 포함된다. 일반적으로, 벌집형 웰 배열에는 중복 웰(duplicate well)과 동일한 프라이머를 함유하는 다수의 반복되는 웰이 존재한다. 예를 들어, 이에 제한되지 않는 예시적인 실시태양에 따르면, 하나의 전체 벌집형 웰 배열은 개별 프라이머의 세트를 포함하는 각 반응 혼합물이 제공되는 8개의 복제 웰의 클러스터(cluster)를 가지며, 최대 8, 16, 25, 50 또는 심지어 lOO개의 서로 다른 프라이머 세트로부터 선택되는 별개의 프라이머 세트를 포함하는 서로 다른 사전-제작된(pre-made) 반응 혼합물을 포함한다.
정량적(quantitative) PCR은 하나의 시료에서 하나 또는 그 이상의 특정 표적 서열의 풍부함(abundance)을 측정할 수 있는 PCR이다. 정량적 PCR은 표적 서열의 절대적 정량(absolute quantitation) 및 상대적 정량(relative quantitation) 측정을 모두 포함한다. 정량적 측정(quantitative measurement)은 하나 또는 그 이상의 표적 서열과 함께 또는 개별적으로 분석될 수 있는 하나 또는 그 이상의 참조 서열(reference sequence)을 사용하여 행해진다. 참조 서열은 시료에 대하여 내인성(endogeneous, 자연적으로 존재) 또는 외인성(exogeneous, 인위적으로 첨가)이고, 후자의 경우, 하나 또는 그 이상의 경쟁적 주형(competitive template)을 포함할 수 있다. 통상적인 내인성 참조 서열은 β-액틴, GAPDH, β2-마이크로글로블린(microglobulin) 리보솜 RNA 등 유전자의 전사체 단편들을 포함한다. 정량적 PCR을 위한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, Freeman et al, Biotechniques, 26: 112-126(1999); Becker-Andre et al, Nucleic Acids Research, 17: 9437-9447(1989); Zimmerman et al, Biotechniques, 21 : 268-279(1996); Diviacco et al, Gene, 122: 3013-3020(1992); Becker-Andre et al, Nucleic Acids Research, 17: 9437-9446(1989)을 참조하라.
증폭반응은 반응 생성물이 증폭반응이 진행됨에 따라 동시에 반응생성물을 측정할 수 있는 검출기구가 존재할 때, "실시간(real-time)" 증폭될 수 있다. 예를 들어, 상술한 실시간 PCR, 또는 실시간 NASBA은 Leone et al., Nucleic Acids Research, 26: 2150-2155(1998)에 기재되어 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "증폭(amplifying)"은 증폭반응을 수행하는 것을 의미한다. "반응 혼합물(reaction mixture)"은 반응을 수행하기 위해 필요한 모든 시약을 함유하는 용액(또는 용액의 동결건조물)이지만, 이에 한정되지 않고, 완충제, 염, 공동 인자(co-factor), 제거제(scavenger) 등을 포함한다. 일부 실시태양에 따르면, 제조 공정 중에 건조 시약(dried reagent)이 벌집형 반응튜브의 웰에 증착된다. 일부 실시태양에 따르면, 건조 시약은 하나 또는 그 이상의 증폭물의 존재 및/또는 양을 나타내는 하나 또는 그 이상의 표적 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 효소(들), 및/또는 검출 잔기(detection moiety)의 증폭을 위한 프라이머의 적어도 하나의 세트를 포함한다. 일부 실시태양에 따르면, 검출 잔기는 형광 표시기(fluorescent indicator)이다. 실시간 PCR에서의 증폭물의 감지 또는 정량은 흔히 TaqMan® 프로브, 분자 비콘 프로브(Molecular beacon probe), 또는 스콜피온(Sccorpion) 프로브와 같은, 형광 공명 에너지 전달 프로브(fluorescence resonance energy transfer probe) 또는 FRET 프로브의 사용을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 형광 표시기(fluorescent indicator)는 증폭물이 반응 혼합물 중에 축적됨에 따라 형광 표시기의 신호가 적어도 그 증폭물의 소정의 농도 범위를 넘도록 증가하는 증폭반응의 생성물(즉, 증폭물) 또는 생성물들의 존재하에서 형광 신호를 생성하는 분자(예를 들면, 염료, 또는 프로브)이다.
여러 가지 유형의 형광 표시기가 본 발명의 벌집형 반응튜브에서 수행되는 증폭반응에 사용된다: 첫째, 형광 염료(fluorescent dye)가 사용될 수 있다. 이 클래스의 적합한 염료는, 이중 가닥 DNA 제품에 결합하는 예를 들어, 에티디움 브로마이드, SYBR Green I 및 II, SYBR Gold, YO(Oxazole Yellow), TO(Thiazole Orange) 및 PG(PicoGreen) 등의 삽입 염료(intercalation dye)와 같이 증폭물의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 비특이적이다. 예를 들어, Ishiguro et al, Anal. Biochem., 229: 207-213(1995); Tseng et al, Anal. Biochem., 245: 207-212(1997); Morrison et al, Biotechniques, 24: 954-962(1998)을 참조하라. 본 발명에 사용하기에 적합한 추가적인 형광 표시기는 당업자에게 공지되어 있다.
둘째로, 어떤 경우에는 하나 또는 그 이상의 프라이머가 형광 소광기(fluorescence quencher)에 인접하는 형광 분자와 함께 헤어핀 구조를 가지도록설계되어, 상기 헤어핀 구조가 프라이머 연장에 의해 이격될 때까지 형광이 형광 소광기에 의해 소광되게 할 수 있다. 예를 들어, Whitecombe et al., Nature Biotechnology, 17: 804-807(1999)(Amplifiuor™ primers)를 참조하라. 적합한 형광 분자는 상술한 것을 예로 들 수 있다.
셋째, 형광 표시기(fluorescent indicator)는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에 대해 특이적일 수 있다. 종종 형광 프로브(fluorescence probe)라고도 불리워지는 상기 표시기는 그들이 부착되는 올리고뉴클레오티드 잔기가 증폭물에 특이적으로 결합할 때까지, 일반적으로 형광 소광기에 인접하는 형광 잔기(fluorescent moiety)를 포함한다. 예를 들면, Gelfand et al, 미합중국 특허 제 5,210,015호 (TaqMan probes); Nazarenko et al, Nucleic Acids Research, 25: 2516-2521(1997)(scorpion probes); Tyagi et al, Nature Biotechnology, 16: 49-53(1998)(molecular beacons)를 참조하라. 형광 표시기는 실시간 PCR과 연결하여 사용되거나, 반응의 완료시 반응 생성물의 총량을 측정하는 데 사용된다. 다양한 분자 비콘(molecular beacon) 및 기타 헤어핀 프로브(hairpin probe)의 리뷰는 예를 들어, Broude, Encyclopedia of Diagnostic Genomics and Proeomics, 2005, pages 846-851를 참조하라.
일반적으로, 본 발명의 벌집형 반응튜브에서 수행되는 각 반응을 위하여, 결합 친화도(binding affinity)-기반 또는 증폭(amplification)-기반의 특성에 관계 없이, 하나 또는 그 이상의 양성 대조군 및 적어도 하나의 음성 대조군이 존재하여, 이들 대조군들이 성공적인 반응을 수행하도록 한다: 즉, 어떠한 검출된 양의 신호(positive signal)도 시스템 전체의 오염에 기인하지 않고, 어떠한 검출된 음의 신호(negative signal)도 분석 시스템의 오류에 기인하지 않는다. 일부 실시태양에 따르면, 내부 표준(internal standard)이 포함될 수 있다. 내부 표준은 예를 들어, 시료 중 표적물(target anlyte)을 정량(상대 정량 또는 절대 정량 중의 어느 하나)하기 위해서, 표적 폴리뉴클레오티드로서 동일한 증폭 반응에서 증폭되는 핵산서열과 같이, 동일 반응에 참여하는 공지된 물질이다. 내부 표준은 예를 들어 시료에 이미 존재하는 것으로 알려진 내인성(endogenous)이거나, 시험 전에 첨가되는 외인성(exogenous)일 수 있다.
V. 반응 조건을 수용하는 분석물의 설계
본 발명의 벌집형 반응튜브에서 수행되는 다중화 분석법(multiplexing assay)은 일반적으로 거의 동시에 거의 동일 조건에서 수행되기 때문에, 각 스팟(spot) 또는 벌집형 반응튜브의 각 웰(well) 내에 위치하는 분석물은, 소정의 반응 파라미터 세트 하에서 최적 또는 근사 최적 반응 결과를 얻을 수 있도록, 신중하게 설계되어야 한다. 하나의 실시태양에 따르면, 8개의 서로 다른 폴리뉴클레오티드 프로브는 서열 상보성-기반 혼성화에 의해 시료 중의 8개의 개별적 표적 핵산을 검출하기 위해 기판의 표면 위에 점적되거나(spotted) 고정화된다(immobilized). 특정 분석을 위해 소정의 반응 파라미터 내에 있도록 각 표적 프로브 서열을 설계하고 최적화하는 것은 당업계의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있다. 프로브를 설계 및 최적화하는데 있어서, 제한되지 않는 파라미터는, 프로브 길이(probe length), 표적 서열 내에서 상대적인 위치(relative location) 및 특정 분석을 위한 소정의 반응 조건 하에서 상기 프로브와 표적 사이의 특이적인 혼성화를 야기하는 GC 함량(GC content)을 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 8개의 서로 다른 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 증폭을 위한 8세트의 다른 반응 혼합물이, 각 패치가 반응액의 8개의 복제 스팟을 포함하는 4 패치 형식(4-patch format)으로 배열된다. 8개의 서로 다른 반응 혼합물은 8개의 세트 각각은, 별개의 표적 서열을 증폭하기 위한 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함한다. 이들 8개의 프라이머 세트는 변성, 어닐링 및 연장 단계가 모두 동일한 온도조건 하에서 동일한 시간 프레임 동안 적절하게 완료될 수 있도록 설계된다.
당업자라면 길이(length), 프로브 또는 프라이머의 GC-함량(GC-contents)을 조정하여 필요한 디자인을 할 수 있다. 경우에 따라서는, 자연계에 존재하는 뉴클레오티드를 변형하거나 인공적인 뉴클레오티드로 대체하는 것이 프로브와 프라이머의 연장(annealing)/변형(denaturing)을 더욱 더 정밀하게 조정하는데 효과적이다. 예를 들어, Leconte et al. J Am Chem Soc. 2008;130(7):2336-2343; 미합중국 특허 제 8,268,978호를 참조하라. 몇몇 알려진 유사체는 1- 메틸아데닌, 1-메틸이노신, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 2-티오시토신, 2-티오우라실, 2,2-디메틸구아닌, 2,6-디아미노, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 3-메틸시토신, 4-아세틸시토신, 4-티오우라실, 5-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-(카복시히드록시메틸)우라실, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 5-플루오로우라실, 5-메틸시토신, 5-메톡시우라실, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 5-메틸우라실, 5'-메톡시카보닐메틸우라실-4,5-메톡시아미노메틸-2-티오, 메틸구아닌-7, 8-히드록시-N6 메틸아데노신, 아지리디닐시토신(aziridinylcytosine), 베타 D-만노실퀘오신(mannosylqueosine), 디히드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, N6 메틸아데닌, N-우라실-5-옥시아세트산메틸 에스테르, 옥시부톡신(oxybutoxosine), 슈도이소시토신(pseudoisocytosine), 슈도우라실, 퀘오신(queosine), 우라실-5-옥시아세트산, 우라실-5-옥시아시트산메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산 등을 포함한다. 다수의 뉴클레오티드 유사체가 시그마(Sigma)와 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 등의 업체를 통해 시판되고 있다.
도 6은 다수의 챔버(13)를 가지는 하우징(12)을 포함하는 유체 제어 및 처리 카트리지(fluid control and processing cartridge, 10)를 도시한다. 내부에 구비된 유체 제어 장치(미도시) 및 벌집형 반응튜브(100)는 하우징(12)의 서로 다른 부분에 연결되어 있다. 카트리지(10)는 필요에 따라, 유체 인터페이스(108)와의 유체적 결합(fluidic coupling)에 의해 벌집형 반응튜브에 유체 시료와 다른 유체를 공급한다. 통상적으로, 벌집형 반응튜브를 포함하는 카트리지는 서니 베일, 캘리포니아, 미국 Cepheid®의 GeneXpert® 시스템에 사용된다. 일부 실시태양에 따르면, 벌집형 반응튜브를 포함하는 카트리지는 본 명세서에 참고문헌으로 인용된 미합중국 특허출원 제 61/639820호에 개시된 바와 같은 이종 시스템(heterogenous system)의 하나 또는 그 이상의 모듈에 사용된다. 시스템(10) 및 사용 방법의 추가적 설명은 미합중국 특허 제 8,048,386호, 제 8,187,557호, 제 8,119,352호 및 미합중국 특허공개 제2008-0038737호에 개시되어 있는데, 상기 문헌 모두는 여기에 참고문헌으로 포함된다.
VI . 실시예
한정되지 않는 단지 설명하기 위한 예시로서 이하의 실시예들이 제공된다. 당업자는 용이하게 변형되거나 본질적으로 동일하거나 유사한 결과를 야기하는 변화하거나 변형될 수 있는 다양한 비-임계 파라미터(non-critical parameter)를 용이하게 인지할 수 있을 것이다.
코돈 12 및 13에서의 K-RAS SNP 분석
GeneXpert 카트리지 반응관을 사용하는 단일 염기 다구성(single nucleotide polymorphism)의 분석에 8개의 프로브(probe), 8개의 복제물(replicate), 4개의 패치 형식(patch format)이 도입하였다. 구체적으로, 전체의 프로브 배열은 반응관 프레임의 일측단을 막는 박막인 고체 기판의 표면 위에 8×8개의 소정 스팟(predetermined spot) 4개 패치로 구성되었다. 각각의 패치에 서로 다른 뉴클레오티드 서열의 8개 올리고뉴클레오티드 프로브가 각각 증착되었고(튜브 중 총 256개의 스팟, 스팟 당 lOOum 직경, 스팟 밀도 50uM, 스팟 부피 0.5nL), 8개의 사전-선택(pre-selected) 스팟에 고정화되어, 각 별개의 프로브 당 8개의 복제 스팟(replicate spot)이 생겼다.
8개의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각은 K-RAS 서열 하나의 버전에만 혼성화되도록 그 염기서열을 설계하였다. 이 실험에서, 1개의 프로브는 야생형과 코돈 12 및 13 주변의 야생형(WT) K-RAS 서열과 혼성화되고; 1개의 프로브는 12Val 변이체와 혼성화되며; 1개의 프로브는 ASP 변이체와 혼성화되고; 1개의 프로브는 12Arg 변이체와 혼성화되며; 1개의 프로브는 12Cys 변이체와 혼성화되고; 1개의 프로브는 12Ser 변이체와 혼성화되며; 1개의 프로브는 12Ala 변이체와 혼성화되고; 1개의 프로브는 ASP 변이체와 혼성화하도록 설계하였다. 기판 표면상의 8개의 프로브 배열은 도 7에 도시하였고, 프로브 서열은 표 1에 제시되었다. 표 2는 프로브의 용융 온도를 제공한다.
Figure 112020014534676-pct00002
Figure 112020014534676-pct00003
기판의 표면 위에 프로브를 고정화하기 위하여, 표면 에너지(surface energy)가 약 60°의 접촉각(contact angle)에서 38dyne/cm 보다 더 적고, 표면 반응성(surface activity) 및 습윤성(wettability)이 차후에 이어지는 기능화(functionalization)를 위해 개선되도록, 우선 표면을 수산화(hydroxylation)하여 세정하였다.
기능화는 전구체로서 글리시드옥시프로필트리메틸실록산(glycidoxypropyl-trimethoxysilane)을 사용하여 글리시달(glycidal)(에폭시)기를 기판의 표면에 도입하는 단계를 포함한다. 스팟팅 과정에서, 올리고뉴클레오티드 프로브와 그의 3' 말단 관능기 사이에 공유결합을 하게 된다.
박층 필름 기판의 기능화 및 프로브의 스팟팅 이후, 스팟팅된 프로브 어레이(probe array)를 포함하는 반응 튜브를 기능화된 고체 기판으로부터 프레임의 반대쪽에 제2 박막(second thin film)을 배치함으로써 밀봉하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 8개의 프로브 형식을 함유하는 밀봉된 반응 튜브를 유체 시료로 충진하여, 기판 표면상의 모든 스팟을 완전히 침지하였다. 시료에 존재하는 K-RAS 서열의 코돈 12/13 SNP 분석을, CF4 표지된 정방향 프라이머(forward primer)와 비표지 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하며, K-RAS 서열과 혼성화하여 SNP 영역을 늘리는, 비대칭(assymetric) TaqMan 증폭 반응으로 시작하였다. 또한, 반응 혼합물에는 (1) PCR의 진행 상황을 표시하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머 사이의 K-RAS 서열의 단편에 대응하는 서열을 포함하는 CF5 표지(CF5-labeled) TaqMan 프로브; (2) WT의 증폭물을 억제하기 위한 비표지(unlabeled) BlockMelt 프로브가 포함된다.
본 실험에서는, PCR 공정과 후속 혼성화 공정을 위하여 반응챔버의 한쪽 면을 가열(heating)/냉각(cooling)하였다. 정방향 프라이머(5'CF4)는 1000nM의 농도로 사용하였다. 역방향 프라이머는 100nM의 농도로 사용하였다. TaqMan 프로브(5'CF5)는 50nM의 농도로 사용하였다. 표지되지 않은 ±K-RAS WT 차단제 프로브는 100nM의 농도로 사용하였다. 60사이클의 PCR을 수행한 후, 반응챔버의 온도는 PCR 용출 완충액(트리스 완충용액 pH 8)에서 1 내지 2시간 동안 프로브-증폭물(probe-amplification)의 혼성화를 위해 약 54℃로 설정하였다. 그런 다음, 반응챔버를 비특이적으로 잔류하는 CF4 신호를 제거하기 위해, 세척 완충액(Tube Wash Arraylt "Wash Buffer 2")으로 최소한 한번 5 번까지 세정하였다.
세가지 서로 다른 시료를 분석하였다: K-RAS WT 세포주(정상 동형 접합, homozygous normal), K-RAS CCL 세포(이형 접합, heterozygous), 및 차단된 K-RAS CCL 세포(동형 접합 돌연변이체, homozygous mutant). 도 8은 60사이클의 PCR을 수행하는 동안의 형광신호 곡선을 나타낸다. 도 9a 내지 도 9c는 WT, 이형 접합 13ASP 돌연변이체, 동형 접합 13ASP 돌연변이 세포 시료로부터의 투영된 결과(projected result)를 나타낸다. 도 10a 내지 도10c는 시료로부터의 실제 결과를 나타낸다. 전체 프로브 스팟팅 패턴은 도 11에 나타내었다. 도 12는 여기(excitation)하고 융합 현미경(integrated microscope)으로 관찰한 전체 프로브의 스팟팅 패턴을 나타낸다.
건조된 웰(dry well)에 시약 올리기(loading)
본 실험에 사용된 벌집형 반응튜브(100)는 사출 성형에 의해 만들어졌다. 부품은 PCR 영역에 하나의 지지 웰-기판(supporting well-substrate, 120)로 성형된다. 나노웰(nanowell)은 193nm에서 시추 엑시머 레이저(excimer laser drilling)에 의해 만들어졌다. 본 실험에 사용된 나노웰의 크기는 직경 150㎛, 깊이 약 150㎛, 피치 거리(pitch distance) 250㎛이었다. 이들 웰은 막힌 구멍(blind hole)이며, 2.6nL까지 보유할 수 있다.
도 3a에 도시된 바와 같이, 마이크로 스팟팅 핀(모델번호 #946MP3, 핀의 끝 직경 100㎛)으로 식용 녹색 염료(green food dye)를 NanoPrint® by Arraylt®을 이용하여 인쇄했다. 핀으로부터 각 액적(drop)은 0.7nL의 부피를 가진다. NanoPrint®는 Arraylt®에 의해 상용화된 마이크로 어레이 프린터이고, 다른 피치 거리에 대해 프로그래밍이 가능하며, 946MP3를 사용하는 경우 0.7nL의 다중 액체 양을 공급할 수 있다. 핀을 선택해야 하는데, 가장 작은 마이크로 스팟팅 핀은 액적 당 0.35nL 만을 공급한다. 실제의 경우, 식용 녹색 염료는 프라이머 세트이거나 PCR 공정을 위한 효소를 가지는 프라이머 세트이다. 각 개별 나노웰은 PCR 과정에서 증폭되는 특정 핵산 표적을 위한 다른 프라이머 세트를 가질 수 있다. 스팟팅 후, 보존을 위해 동결 건조 또는 동결 건조 공정을 수행할 수 있다.
시료 충전 및 밀봉을 위한 불연속적 탈수(discontinuous dewetting)
본 실시예(및 실시예 4)에서 사용되는 벌집형 반응튜브(100)는 폴리프로필렌으로 구성된다. 벌집형 반응튜브(100)는 PCR 영역에서 하나의 지지 웰-기판(120)으로 성형된다. 복수의 나노웰이 193nm 파장의 엑시머 레이저를 사용하여 생성되었다. 이 실시예에서 사용된 나노웰의 크기는 직경 150㎛, 깊이 약 250㎛, 피치 거리 250㎛이다. 이 웰은 관통 구멍(through hole)이며, 4.4nL까지 보유할 수 있다. 벌집형 반응튜브(100)는 이어 튜브의 양측을 폴리프로필렌 필름으로 밀봉하였다. 각 개별 웰은 밀봉하지 않았지만, PCR의 전체 다이아몬드 영역(25㎕ 영역)은 밀봉되었다. 벌집형 반응튜브(100)는 도 6에 도시된 카트리지(10)에 결합시켰다.
폴리프로필렌의 소수성(hydrophobility) 때문에 폴리프로필렌 표면의 습윤을 향상시키기 위하여, PCR 완충액(50 mM 트리스, pH8.6)을 계면활성제(0.1% 트윈)와 혼합하였다. 시각화를 향상시키기 위해, 소량의 식용 황색 염료(yellow food dye)를 PCR 완충액에 적가하였다. 이 PCR 완충액을 이어 도 6에 도시된 바와 같이 카트리지(10)의 챔버(13) 중 어느 하나에 가하였다. 미네랄 오일(CAS # 8042-47-5)을 다른 챔버에 가하였다. Cepheid®에 의해 시판되는 GeneXpert® 시스템을 벌집형 반응튜브(100)의 액체 충전을 도모하도록 카트리지(10)를 제어하는데 사용하였다.
GeneXpert® 시스템은 웰 챔버(118)에 유체 채널을 통해 1㎕/초의 유속으로 PCR 완충액을 제공하도록 프로그래밍되었다. PCR 완충액은 웰 챔버(118)의 나노웰을 채우고, 일부 과잉의 PCR 완충액은 상부 유체 채널(top fluid channel)을 통해 유출된다. 벌집형 반응튜브(100)의 PCR 챔버는 충진 후, 튜브(100)의 PCR 완충액을 웰 챔버의 바닥에서 5㎕/초의 속도로 상기 유체 채널로 배출시켰다. 완충액은 다시 상단 유체 채널로부터 유입 통로(inlet passage, 128)(가장 아래 유체 채널)로 배출되었다. 배출 후, PCR 완충액는 모세관력(capillary force)에 의해, 각 나노웰에 잔류한다. 배출(draining)에도 불구하고, 각 나노웰에서 PCR 완충액은 밖으로 유출되지 않았다. PCR 완충액이 완전히 유입 통로(inlet passage, 128)를 통해 배출된 후, 미네랄 오일을 1㎕/초의 유속으로 웰-챔버를 채웠다. 도 4e에 도시된 바와 같이, 나노웰을 가지는 프로필렌 기판과 밀봉 필름 사이의 간극은 미네랄 오일로 채워진다.
시료 충전 및 밀봉을 위한 연속습윤(continuous wetting)
실시예 3과 동일한 벌집형 반응튜브(100)를 사용하여, 나노웰을 실시예 3에서 기술된 불연속 탈수법(discontinuous dewetting)을 사용하여 PCR 완충액으로 채웠다. 그러나, 각 나노웰을 PCR 완충액으로 채운 후, 미네랄 오일을 벌집형 반응튜브의 웰 챔버(118) 내로 도입하여 (실시예 3에와 같이 PCR 완충액을 배출하는 대신) 유입 통로(inlet passage, 128)로부터 5㎕/초의 속도로 PCR 챔버를 계속하여 충진하였다. 미네랄 오일은 나노웰의 상부에 웰-챔버(118) 내(즉, 폴리프로필렌 기판과 상부 밀봉 필름 사이) PCR 완충액을 치환한다. 이 방법은 두 액체가 연속적으로 표면을 적시기 때문에, "연속습윤(continuous wetting)"으로 지칭된다. 제1 액체(PCR 완충액)는 표면을 적시고 나노웰을 채운다. 제2 액체(미네랄 오일)는 계속해서 표면을 습윤시키지만, 각 나노웰 "을(in)" 채우지 않는다 - 나노웰에서 표면 장력과 모세관력은 수용액을 유지하기 때문이다.
실시예 3 및 실시예 4에서 사용된 두 방법 모두 성공적으로 원하는 PCR 완충액을 나노웰에 도입하고, 미네랄 오일을 각 나노웰에서 PCR 완충액을 분리하는데 사용하였다. 미네랄 오일 캡은 가열 과정에서 나노웰에서 수용액의 증발을 방지하는 추가적 이점을 갖는다.
본 출원에서 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 GenBank 기탁 번호를 포함하는 다른 간행물은 모든 목적을 위해 전체가 참조로 인용된다.

Claims (29)

  1. 평면 프레임의 일측면을 감싸는 제1 평면 기판 및 상기 평면 프레임의 다른 일측면을 감싸는 제2 평면 기판 사이에 유체 통로(fluidic path)를 구비하는 평면 프레임(planar frame); 및,
    상기 평면 프레임의 일측단에 위치하며, 상기 유체 통로의 유체 유입구(fluidic inlet) 및 상기 유체 통로의 유체 유출구(fluidic outlet)를 포함하는 유체 인터페이스(fluidic interface)를 포함하되,
    상기 유체 통로는, 상기 제1 평면 기판과 상기 제2 평면 기판 사이의 평면 프레임에 구비되는 웰 챔버(well chamber)를 추가로 포함하고,
    상기 웰 챔버는, 패턴을 이루는 다수의 웰이 구비된 평면 웰-기판(planar well substrate)을 포함하며 유체 유입구 및 유체 유출구 사이에서 유체적으로 연통(fluidic communication)하고,
    상기 유체 통로는, 상기 유체 유입구로부터 연장되어 상기 웰 챔버와 유체적으로 연통하는 유입 통로(inlet passage) 및, 상기 웰 챔버와 유체적으로 연통하며 상기 유체 유출구로 연장되는 유출 통로(outlet passage)를 포함하는 것을 특징으로 하는 벌집형 반응튜브.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유체 통로는 제1 평면 기판 및 제2 평면 기판 사이의 평면 프레임에 정렬되는 사전-증폭 챔버(pre-amplification chamber)를 포함하고,
    상기 사전-증폭 챔버는, 유입 통로를 통하여 유입된 액체 시료가 웰 챔버의 다수의 웰을 채우기 전에 증폭되도록, 유체 유입구와 웰 챔버 사이에 구비되는 상기 유체 통로의 확장부로 제공되는 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  3. 제2항에 있어서,
    사전-증폭 챔버는 상기 웰 챔버와 유체적으로 연통하는 웰 챔버 입구(well chamber entrance)와 유체적으로 연통하는 챔버 출구(chamber exit)를 포함하는 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  4. 제3항에 있어서,
    사전-증폭 챔버 출구는 통로(passage)에 의해 웰 챔버 입구와 유체적으로 결합되는(fluidically coupled) 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  5. 제4항에 있어서,
    사전-증폭 챔버 출구는, 반응튜브를 수직으로 배치하는 경우, 사전-증폭 챔버의 최상부에 위치하는 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  6. 제5항에 있어서,
    웰 챔버 입구는, 반응튜브를 수직으로 배치하는 경우, 웰 챔버의 최하부에 위치하는 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  7. 제6항에 있어서,
    웰 챔버 입구는, 반응튜브를 수직으로 배치하는 경우, 사전-증폭 챔버의 아래부분에 위치하는 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  8. 제7항에 있어서,
    통로는 사전-증폭 챔버로부터 웰 챔버 입구쪽으로 하향 경사지는 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  9. 제1항에 있어서,
    유체 통로는 구불구불한 채널(serpentine channel)을 포함하는 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  10. 제1항에 있어서,
    유체 통로는 밸브가 없는 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  11. 제1항에 있어서,
    웰-기판은 100 내지 1,000개의 나노웰(nanowell)을 포함하는 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  12. 제1항에 있어서,
    웰-기판은 100 내지 500㎛의 깊이를 가지는 다수의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  13. 제1항에 있어서,
    웰-기판은 50 내지 500㎛의 직경을 가지는 다수의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  14. 제1항에 있어서,
    웰-기판은 다수의 0.8nl 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  15. 제1항에 있어서,
    평면 프레임의 일부가 소수성 물질을 보유하는 오일 챔버(oil chamber)를 구비하는 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  16. 제15항에 있어서,
    오일 챔버는 웰 챔버와 유체적으로 연통(fluidic communication)되는 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  17. 제1항에 있어서,
    기저부(base portion)를 추가로 포함하고, 상기 평면 프레임은 상기 기저부로부터 연장되는 지지체(scaffold)를 포함하는 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  18. 제17항에 있어서,
    제1 평면 기판 및 제2 평면 기판은 지지체(scaffold)를 유체적으로 밀봉하는(fluidically seal) 제1 필름 및 제2 필름을 포함하는 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  19. 제1항에 있어서,
    평면 프레임은 유체 인터페이스(fluidic interface)를 통하여 시료 보관고(sample container)와 유체적으로 연결되는(fluidically connected) 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  20. 제1항에 있어서,
    웰-기판은 니켈 물질(nickel material)을 포함하는 것을 특징으로 하는
    벌집형 반응튜브.
  21. 제1 평면 기판 및 제2 평면 기판 사이에 유체 통로가 구비되며 반응튜브의 일측단과 반대쪽 일측단 사이를 연결하여 확장되는 평면 프레임(planar frame)과, 반응튜브의 일측단을 따라 배치되며 유체 통로의 유체 유입구 및 유체 유출구를 포함하는 유체 인터페이스(fluidic interface)를 포함하는, 제1항에 따른 벌집형 반응튜브를 충진함에 있어서,
    액체 시료를 상기 벌집형 반응튜브의 유체 인터페이스의 유체 유입구를 통해 도입(introducing)하고, 상기 유체 인터페이스의 유체 유입구 또는 유체 유출구에 압력을 가하여 유체 통로를 따라 상기 액체 시료를 전진(advancing)시키는 단계;
    상기 액체 시료를 상기 유체 통로를 따라 더욱 전진시켜 상기 액체 시료를 웰 챔버 내의 다수의 웰에 축적(depositing)시킴으로써, 상기 액체 시료를 웰 챔버에 충진(filling)하는 단계; 및,
    상기 액체 시료의 최소 일부만 상기 다수의 웰 내에 축적되도록 상기 유체 인터페이스의 유체 유입구 또는 유체 유출구에 압력을 가함으로써, 상기 액체 시료의 일부분을 웰 챔버 내의 다수의 웰 외부로 배출(evacuating)시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 벌집형 반응튜브를 충진하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    액체 시료를 유체 통로를 따라 전진시켜 액체 시료로 상기 유체 통로의 사전-증폭 챔버를 충진하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 사전-증폭 챔버는, 상기 액체 시료가 웰 챔버에 도입되고 상기 웰 챔버의 다수의 웰이 채워지기 전에 그 안의 액체 시료가 증폭되도록, 상기 유체 유입구와 웰 챔버 사이에 구비되는 유체 통로의 확장부로 제공되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  23. 제21항에 있어서,
    사전-증폭 챔버는 사전-증폭 챔버의 최상부 출구를 포함하고, 사전-증폭 출구 아래 수준까지 충진되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  24. 제23항에 있어서,
    사전-증폭 챔버 출구는 웰 챔버 입구와 하향 선두 통로(downward leading passage)를 통하여 유체적으로 연결되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  25. 제24항에 있어서,
    유체 통로는 밸브가 없는 것을 특징으로 하는
    방법.
  26. 제21항에 있어서,
    배출이 완료된 웰 챔버를 소수성 물질로 충진하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는
    방법.
  27. 제26항에 있어서,
    소수성 물질은 웰 챔버와 유체적으로 연통하는 평면 프레임의 오일 챔버로부터 공급되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  28. 제21항에 있어서,
    유체 시료는 유체 통로를 따라 구불구불하게 경유하는 것을 특징으로 하는
    방법.
  29. 제21항에 있어서,
    제1 평면 기판 및 제2 평면 기판에 가열(heating) 및 냉각(cooling) 사이클을 적용하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는
    방법.
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