JP2015532094A - ハニカムチューブ - Google Patents

Abstract

第１の平面表面と第２の平面表面との間の流体経路を規定する平面フレームを有するハニカムチューブ。流体インタフェースが平面フレームの一方の端に位置する。流体インタフェースは流体インレットと流体アウトレットとを有する。流体経路は、複数のウェルを備えたウェル基板を有するウェルチャンバを更に含む。ウェルチャンバは平面フレーム内で第１の表面又は第２の表面とウェル基板との間に配置される。

Description

本出願は、２０１２年９月２６日出願の米国特許仮出願第６１／７０６，１１５号の利益を主張する２０１３年３月１５日出願の米国特許出願第１３／８４３，７３９号の優先権を主張するものである。本出願はまた、２０１２年９月２６日出願の米国特許仮出願６１／７０６，１１５号の利益も主張するものである。前述の各出願の全体は参照によって本明細書中に援用される。

複数のアッセイを同時に実行して多様かつ広範なデータセットを提供することが望ましい場合がある。そのようなプロセスはしばしば「多重化アッセイ」と呼ばれる。従って、多重化アッセイを実行できる装置が必要とされている。

本発明のいくつかの実施形態は、第１の平面表面と第２の平面表面との間の流体経路を規定する平面フレームを有してもよいハニカムチューブに関する。流体インタフェースが平面フレームの一方の端に位置してもよい。流体インタフェースは流体インレットと流体アウトレットとを有してもよい。流体経路は、複数のウェルで構成されたウェル基板を有するウェルチャンバを更に含んでもよく、ウェルチャンバは平面フレーム内で第１の表面又は第２の表面とウェル基板との間に配置され、ウェルチャンバは流体インレット及び流体アウトレットと流体連通する。

いくつかの実施形態では、流体経路は、平面フレーム内で第１の平面表面と第２の平面表面との間に配置される前置増幅チャンバを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、ウェルチャンバは、前置増幅チャンバと流体アウトレットとの間にある。

いくつかの実施形態では、前置増幅チャンバは含まれない。

いくつかの実施形態では、前置増幅チャンバは、１つ以上の化学物質を含む狭い経路である。

いくつかの実施形態では、前置増幅チャンバは、ウェルチャンバ入口と流体連通するチャンバ出口を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、前置増幅チャンバ出口は、ウェルチャンバ入口から通路によって分離される。

いくつかの実施形態では、第１の平面表面及び第２の平面表面が垂直に向けられている場合、前置増幅チャンバ出口は、前置増幅チャンバの最上部に位置付けられてもよい。

いくつかの実施形態では、ウェルチャンバ入口は、ウェルチャンバの最下部に位置付けられてもよい。

いくつかの実施形態では、ウェルチャンバ入口は、前置増幅チャンバの下方に位置付けられてもよい。

いくつかの実施形態では、通路は、前置増幅チャンバ出口からウェルチャンバ入口まで下向きに傾斜してもよい。

いくつかの実施形態では、流体経路は蛇行チャネルを含む。

いくつかの実施形態では、流体経路は無弁であってもよい。

いくつかの実施形態では、ウェル基板は、約１００〜約１５００個の複数のナノウェルを有してもよい。

いくつかの実施形態では、ウェル基板は、約５０〜約５００μｍの直径を有する複数のウェルを含む。

いくつかの実施形態では、ウェル基板は、約１００μｍの深さをそれぞれが有する複数のナノウェルを有してもよい。

いくつかの実施形態では、ウェル基板は複数のナノウェルを有してもよく、複数のナノウェルのうちの各ウェルは深さが２５μｍ〜１０００μｍの範囲であってもよい。

いくつかの実施形態では、ウェル基板は複数のナノウェルを有してもよく、複数のナノウェルのうちの各ウェルは約２５μｍ〜約５００μｍの範囲内の幅を有する。

いくつかの実施形態では、ウェル基板は複数のナノウェルを有してもよく、各ウェルは約８．５ｎＬの容積を有する。

いくつかの実施形態では、複数のウェルのうちの各ウェルは約０．１ｎＬ〜５００ｎＬの範囲内の容積を有してもよい。

いくつかの実施形態では、平面フレームの一部が、疎水性物質を保持するためのオイルチャンバを規定してもよい。

いくつかの実施形態では、オイルチャンバはウェルチャンバと流体連通してもよい。

いくつかの実施形態では、平面フレームは、基部から延在するスカフォード（ｓｃａｆｆｏｌｄ）であってもよい。

いくつかの実施形態では、第１の平面表面及び第２の平面表面は、スカフォードを流体的に封止する第１の膜及び第２の膜を有してもよい。

いくつかの実施形態では、平面フレームは、流体インタフェースを介して試料容器に流体的に接続されてもよい。

いくつかの実施形態では、ウェル基板はニッケル材料から構成されてもよい。

いくつかの実施形態では、複数のウェルは、特異的な標的の増幅及び／又は検出のための、少なくとも１つの核酸プライマー及び／又はプローブを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、複数のウェルは、特異的な標的の検出のための分子、例えば抗体又は核酸を含んでもよい。

本発明のいくつかの実施形態は、ハニカムチューブの流体インタフェースに試料流体を提供する方法に関する。ハニカムチューブは、第１の平面表面と第２の平面表面との間の流体経路を規定する平面フレームを有してもよく、それらの表面のそれぞれは薄い可撓性膜を用いて封止されてもよい。流体経路のウェルチャンバは試料流体で充填されてもよく、試料流体は分析される試料材料を含み、アッセイを実施するための１つ以上の化学物質を更に含んでもよく、従ってウェルチャンバ内の複数のウェルは試料流体で充填される。試料流体は次に、ウェルチャンバから排出されてもよく、これにより複数のウェルは、試料流体で少なくとも部分的に充填されたままとなる。

いくつかの実施形態では、前置増幅チャンバが流体経路内でウェルチャンバの前に存在し、反応流体は、前置増幅チャンバ内で増幅工程を受けてから、ウェルチャンバを充填する。

いくつかの実施形態では、前置増幅チャンバは、前置増幅チャンバの最上部出口を含んでもよく、前置増幅チャンバは、前置増幅チャンバの最上部出口より下のレベルにおいて充填され得る。

いくつかの実施形態では、疎水性物質はウェルチャンバから排出される。いくつかの実施形態では、ウェルチャンバは、疎水性物質の排出の後、続いて水性流体で充填される。

いくつかの実施形態では、第１の平面表面及び第２の平面表面の両方に加熱及び／又は冷却サイクルが加えられる。

いくつかの実施形態では、第１の平面表面又は第２の平面表面のいずれかに加熱及び／又は冷却サイクルが加えられる。

本発明のいくつかの実施形態は、ハニカムチューブ内で多重増幅反応を実施することに関する。

いくつかの実施形態では、試料流体は、蛇行する様態で流体経路に沿って送られる。

いくつかの実施形態では、多重反応はネステッドＰＣＲを含む。

いくつかの実施形態では、多重反応は、アンプリコンの存在を示すための蛍光指示薬を使用して監視される。

いくつかの実施形態では、アンプリコンの存在は融解曲線分析を使用して検出される。

いくつかの実施形態では、多重反応は、少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の有無を検出する。

いくつかの実施形態では、多重反応において使用される試料材料は、体液であるか又は体液に由来する。

いくつかの実施形態では、試料材料は、組織試料であるか又は組織試料に由来する。

いくつかの実施形態では、反応はタンパク質標的の有無を検出する。

いくつかの実施形態では、反応は核酸の有無を検出する。

いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡである。

いくつかの実施形態では、核酸はｍＲＮＡである。

いくつかの実施形態では、核酸はマイクロＲＮＡである。

本発明のいくつかの実施形態によるハニカムチューブの斜視図を示す。 本発明のいくつかの実施形態によるハニカムチューブの右側面図を示す。 本発明のいくつかの実施形態によるハニカムチューブの左側面図を示す。 図１Ｄ及び１Ｅはそれぞれ、本発明のいくつかの実施形態によるハニカムチューブの右側面図である。 図２Ａ〜２Ｈは、本発明のいくつかの実施形態による、ウェル基板１２０の様々な実施形態を示すためのハニカムチューブの部分の断面を示す。 本発明のいくつかの実施形態による、ウェル基板１２０にプライマー材料を提供する方法の斜視図を示す。 図４Ａ〜４Ｅは、本発明のいくつかの実施形態による、ウェル基板を試料流体で充填する様々な方法を示す。 図５Ａ〜５Ｆは、本発明のいくつかの実施形態による、ハニカムチューブに関連する様々なセンサアセンブリの位置を示す。 本発明のいくつかの実施形態による、試料流体をハニカムチューブに提供するための流体制御及び処理システムを示す。 図７〜１３は、実施例１による多重ＰＣＲ ＳＮＰ分析を実行するための実施例の工程を示す。

Ｉ．例示的なハニカムチューブの構成
本明細書中で使用される場合、用語「ハニカム」は、予め設計された位置において固体基板の表面内に設けられる複数のウェルを表す。いくつかの実施形態では、本発明のハニカムチューブは少なくとも１００〜２００個のウェルを含む。いくつかの実施形態では、ハニカムチューブは約１００〜３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００の任意の数のウェル又はより多くのウェルを含んでもよい。ウェルは任意の形状であってもよく、それらの位置は予め規定されるが、任意のフォーマット又はパターンで基板上に配置されてもよい。本明細書中で使用される場合、用語「ハニカムチューブ」は「ウェルチャンバ」、「マルチウェル反応チャンバ」、又は「マルチウェル反応チューブ」と交換可能に使用され得る。

図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃはそれぞれ、ハニカムチューブ１００の斜視図、右側面図、及び左側面図を示す。ハニカムチューブ１００（マルチウェル反応チャンバと交換可能に使用される）は平面フレーム１０２を含み、平面フレーム１０２はいくつかの実施形態では、一般にＰＣＲ適合性であるポリマー（例えばポリプロピレン／アクリル基板）又は金属材料から形成されるトラス状構造である。平面フレーム１０２は、開いた側上で第１の平面基板１０４及び第２の平面基板１０６によって区切られるオープントラス又はスカフォードとして形成されてもよい。

第１の平面基板１０４及び第２の平面基板１０６は、平面フレーム１０２に接着される又はその他の手法で接合される比較的薄いポリマー膜から形成されてもよい。いくつかの実施形態では、第１の平面基板１０４及び第２の平面基板１０６のうちの一方の、全て又は部分は、平面フレーム１０２と一体に形成されてもよい（例えば、基板のうちの一方を平面フレーム１０２と共に３Ｄプリンティング、成形、同時成形、又は機械加工することによって）。いくつかの実施形態では、第１の平面基板１０４及び第２の平面基板１０６は透明材料から構成され、これがここで示されている。第１の平面基板１０４及び第２の平面基板１０６のそれぞれは、内向き及び外向き表面を含む。これらの内向き表面は、平面フレーム１０２の内部キャビティを用いた流体通路を形成する。

平面フレーム１０２の一部は流体インタフェース１０８を形成する。流体インタフェース１０８は、平面フレーム１０２の大部分を片持ち梁式に支える構造部材である。流体インタフェース１０８は平面フレーム１０２と一体に形成されてもよい。流体インタフェース１０８は、本明細書中の他の箇所で説明するカートリッジ装置への機械的継手としても働く。流体インタフェース１０８は、カートリッジ装置又は試料容器への流体インタフェースを提供する流体インレット１１０と流体アウトレット１１２とを含む。流体インレット１１０及び流体アウトレット１１２のそれぞれは、平面フレーム１０２内で第１の平面基板１０４と第２の平面基板１０６との間に形成される流体経路１１４に流体的に結合される。用語「インレット」及び「アウトレット」の使用は、流体インレット１１０及び流体アウトレット１１２の機能を限定するものではないということを理解されたい。従って流体は、両方又はいずれかから導入及び排出され得る。いくつかの実施形態では、流体経路１１４は無弁であり、従って流体インレット（１１０）から流体アウトレット（１１２）まで延在する流体経路１１４内の流体を移動させるために、外部システムによって、外部からの圧力の増加又は減少が、流体インレット１１０及び流体アウトレット１１２を介して加えられてもよい。流体経路１１４の断面は円形又は矩形であってもよく、約５０μｍ〜約２ｍｍの範囲の径又は幅を有してもよい。一般に、径又は幅は約２５０μｍ〜約１ｍｍの範囲である。

流体経路１１４は、ウェルチャンバ１１８に流体的に接続された前置増幅チャンバ１１６を含む。ウェルチャンバ１１８は、複数のウェル（本明細書中ではナノウェルとも呼ばれる）を有するウェル基板１２０（本明細書中ではハニカムとも呼ばれる）を保持する。ウェル基板１２０は、金属（例えば金、白金、又はニッケル合金）、セラミック、ガラス、又はその他のＰＣＲ適合性ポリマー材料、あるいは複合材料から構成されてもよい。ウェル基板１２０は複数のウェルを含む。いくつかの実施形態では、ウェル基板１２０は１００〜１０００個の又はより多くのウェルを含んでもよい。ウェルは、ウェル基板１２０内に止まり穴又は貫通穴として形成されてもよい。ウェルは、例えばレーザ穿孔（例えばエキシマ又は固体レーザ）、超音波エンボス加工、熱エンボス加工リソグラフィ、ニッケル型の電鋳、射出成形、及び射出圧縮成形によってウェル基板１２０内に作成されてもよい。いくつかの実施形態では、ウェル基板１２０は平面フレーム１０２に接着されるか又は平面フレーム１０２と同時成形され、いくつかの実施形態では、ウェル基板１２０は平面フレーム１０２の成形された特徴である。いくつかの実施形態では、個々のウェルの容積は０．１〜１５００ｎＬ、一般には０．５〜２００ｎＬ、好ましくは０．５〜５０ｎＬの範囲である。例えばいくつかの実施形態では、各ウェルは約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３.５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、又は５００ｎＬの容積を有してもよい。ウェルの寸法は任意の形状、例えば円形、楕円形、正方形、矩形、卵形、六角形、八角形、円錐形、及び当業者に周知のその他の形状などを有してもよい。更にウェル形状は、軸に沿って変化する断面積を有してもよい。例えば正方形の穴が第１のサイズから、第１のサイズの数分の１である第２のサイズまで先細りしてもよい。いくつかの実施形態では、ウェルの寸法は、径と深さとがほぼ等しい正方形であってもよい。いくつかの実施形態では、ウェルの径と深さとは等しくない。いくつかの実施形態では、ウェルを規定する壁は非平行である。いくつかの実施形態では、ウェルを規定する壁は一点に収束する。ウェルの寸法は、ウェル基板１２０の総容積容量から導き出されてもよい。いくつかの実施形態では、ウェルの深さは２５μｍ〜１０００μｍの範囲であってもよい。いくつかの実施形態では、例えばウェルは２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、又は１０００μｍの深さを有してもよい。いくつかの実施形態では、ウェルの径は約２５μｍ〜約５００μｍの範囲であってもよい。いくつかの実施形態では、例えばウェルは２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、又は５００μｍの幅を有してもよい。

ウェル基板１２０の部分、及び／又は、第１の平面基板１０４及び／又は第２の平面基板１０６の内部は、流体の付着を助長又は抑止するために修正されてもよい。例えばウェルを規定する面は、親水性の材料でコーティングされ（又は親水性であるように修正され）てもよく、これにより流体の保持が助長される。更に、（ウェルを規定する内面を囲む）平面表面は、疎水性の材料でコーティングされ（又は疎水性であるように修正され）てもよく、これによりその上の流体の保持が抑止される。流体が好ましくはウェルの内部に保持され、しかし余分な流体の排出を助長するために上面上では保持されないように、その他の表面処理が行われてもよい。

ウェル基板１２０のウェルは、整列された行及び列の単純な幾何学的パターンを、あるいは対角線状に又は六角形に配置されたパターンを有するようにパターン化されてもよい。いくつかの実施形態では、ウェル基板１２０のウェルは、無秩序なパターンや、シリンガー（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇｅｒ）ら（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１２年１月２２日）によって記載されたイソジオメトリック（ｉｓｏｇｅｏｍｅｔｒｉｃ）設計パターンなどの複雑な幾何学的パターンを有するようにパターン化されてもよい。充填プロセス中の試薬の相互汚染の防止に役立つように、ウェルは互いに幾何学的に分離されてもよく、かつ／又は大きな深さ幅比を備えてもよい。いくつかの実施形態では、試薬の相互汚染を防止するために、本明細書中で開示される方法及び当業者に周知の方法が使用されてもよい。

図１Ａに示すように、ウェル基板１２０の前部と第１の平面基板１０４との間に（流体が通過することを可能にするための）ギャップが形成されるように、ウェル基板１２０の一部は第２の平面基板１０６に接続されてもよい。前置増幅チャンバ１１６は、存在する場合、（図示されている向きにおいて）前置増幅チャンバ１１６の最上部に位置する前置増幅チャンバ出口１２２を含む。ウェルチャンバ入口１２４がウェルチャンバ１１８の最下部に位置する。下向きに傾斜した中間通路１２６が、前置増幅チャンバ出口１２２とウェルチャンバ入口１２４とを分離する。最下インレット通路１２８及び最上アウトレット通路１３０が、流体経路１１４の残りの部分を構成する。

いくつかの実施形態では、平面フレーム１０２は、オイル又はその他の化学溶液などのプロセス流体を前置増幅チャンバ１１６、ウェルチャンバ１１８、及び／又は流体経路１１４の任意のその他の部分に提供するために使用可能な１つ以上の（すなわち少なくとも１つの）補助チャンバ１３２を含む。そのような補助チャンバ１３２は、１つ以上の膜、弁、及び／又は、金属箔又は薄膜などの圧力切断可能基板（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｓｅｖｅｒａｂｌｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）（すなわち補助チャンバ内の又は流体経路１１４の隣接する部分内の流体から所定の量の圧力を受けると壊れる材料）を介して流体経路１１４の部分に流体的に接続されてもよい。

いくつかの実施形態では、流体経路１１４は、図１Ｄに示すような曲がりくねった部分を含んでもよい。インレット通路１２８とウェルチャンバ１１８との間の曲がりくねった経路は、流体プロセスの制御及び処理に役立ち得る。曲がりくねった経路は、流体経路を通したオイルの流れを妨げる可能性がある気泡の形成を減らすのに役立ち得るということが見出された。図１Ｄに示すハニカムチューブ１００’は、図１Ａ〜図１Ｃに示すハニカムチューブ１００と大部分同じであるが、中間通路１２６’は、蛇行する様態で接続された複数の細長いチャネル部分を含む。ここでは３つの細長いチャネル部分が示されているが、より多くの又はより少ない部分が使用されてもよい。一般には少なくとも２つのチャネル部分が使用され、いくつかの実施形態では、２〜１０の細長いチャネル部分が使用される。

いくつかの実施形態では、流体経路１１４は、図１Ｅに示すような広範囲にわたる曲がりくねった部分を含む。ここに示すハニカムチューブ１００”は、図１Ａ〜図１Ｃに示すハニカムチューブ１００と大部分同じであるが、中間通路１２６”は、ハニカムチューブ１００”の構造の大部分を通して延在する。この手法において、中間通路１２６’の細長いチャネル部分は、内部で増幅が発生し得る細長いチャンバに類似するように比較的広くされてもよい。ここでは４つの細長いチャネル部分が示されているが、より多くの又はより少ない部分が使用されてもよい。一般には少なくとも２つのチャネル部分が使用され、いくつかの実施形態では、２〜１０の細長いチャネル部分が使用される。細長いチャネルの間で中間通路１２６’を規定する鋭角の内部曲線は、細長いチャネルの間の断面積を減らすために球状になっている。角のあたりの減らされた断面積は、曲線の内半径における流体と比較した曲線の外半径における流体の間の流量差を減らすために役立つ。そのような流量差が大きすぎる場合、泡形成を発生させる望ましくないキャビテーションがもたらされる可能性がある。ここでは、屈曲部の幅は、細長いチャネル部分の幅の約５０％である。いくつかの実施形態では、屈曲部の幅は、細長いチャネル部分の幅の１０〜９０％の範囲である。いくつかの実施形態では、屈曲部の幅は互いに異なる。

上述のように、図１Ｅに示すチャネル形状は、流体プロセスの制御及び処理のために有益であり得る。前置増幅チャンバは図示されていないが、ハニカムチューブ１００”の特定の用途によっては１つ以上が含まれてもよい。図示されている形状では、標的の極めて少数のコピー（すなわち１又は２）しか試料に含まれない場合、蛇行チャネルの直線的性質により、増幅後に、増幅された標的の混合及び均一な分配がなされない可能性があるということを理解されたい。従って、流体をカートリッジ内（シリンジチューブ又は別個のチャンバ内のいずれか）に戻してアンプリコンの混合及び均一な分配を行わせてから、ウェルチャンバのウェルを充填しなければならない可能性がある。

図２Ａ〜図２Ｇは、ウェル基板１２０の様々な実施形態を示すための、ハニカムチューブの部分の断面を示す。

図２Ａは、ウェル基板１２０のウェルが、平面フレーム１０２内に作られた止まり穴によって構成される一実施形態を示す。この実施形態では、第２の平面基板１０６は平面フレーム１０２と一体に、それらが本質的に１つの材料片であるように形成される。プライマー／プローブ材料１３４が、ウェル基板１２０の各ウェル内に配置されて示されている。

図２Ｂは、ウェル基板１２０のウェルが、平面フレーム１０２上に接合されるポリマー膜などの基板内に作られた貫通穴によって構成される一実施形態を示す。例えば、別個の基板が穿孔されて貫通穴のウェル基板が形成され、続いて平面フレーム１０２上に接着又は溶接されてもよい。この実施形態では、第２の平面基板１０６は平面フレーム１０２と一体に、それらが本質的に１つの材料片であるように形成される。いくつかの実施形態では、第２の平面基板１０６内に止まり穴が形成されてもよく、第２の平面基板１０６は平面フレーム１０２上に接合されてもよい。

図２Ｃは、ウェル基板１２０のウェルが、平面フレーム１０２の一部内に形成された貫通穴によって構成される一実施形態を示す。この実施形態では、第２の平面基板１０６は平面フレーム１０２と一体化され、ウェル基板１２０は平面フレーム１０２内のポケットに接着又は溶接される別個の構成要素である。

図２Ｄは、図２Ｃに示すのと同様に、ウェル基板１２０のウェルが、平面フレーム１０２の一部内に形成された貫通穴によって構成される一実施形態を示す。しかしこの実施形態では、平面フレーム１０２と第２の平面基板１０６との間に気体透過性膜１３６が位置する。膜１３６は、気体がウェルから膜を通して排出されることを可能にし、流体が通過することは許可しない。気体透過性膜は、気体透過性接着剤によってウェル基板に接着されてもよい。いくつかの実施形態では、膜１３６はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から構成され、２０〜１０００μｍの範囲の厚さを有し、いくつかの実施形態では１００〜２００μｍの範囲の厚さを有する。

図２Ｅは、ウェル基板１２０のウェルが、平面フレーム１０２の一部内に形成された止まり穴によって構成される一実施形態を示す。この実施形態では、第２の平面基板１０６は平面フレーム１０２と一体化され、ウェル基板１２０は平面フレーム１０２内のポケットに接着又は溶接される別個の構成要素である。

ウェル基板１２０の全て又は部分は、導電性金属部分（例えば金）を、金属からウェルへの熱伝達を可能にするために含んでもよい。例えば、第２の平面基板１０６に接触して配置されるウェル基板１２０の部分は、金属板又はコーティングであってもよい。いくつかの実施形態では、ウェルの内面は、熱伝達を可能にするために金属を用いてコーティングされてもよい。

図２Ｆは、図２Ｄの実施形態と同様に構成される一実施形態を示す。しかしここではウェル基板は、第１の基板と第２の基板との間の中間点に位置付けられる。気体透過性膜１３６が、気体透過性接着剤によってウェル基板に接着されてもよい。図２Ｄに示す実施形態と同様に、液体の充填中に気体透過性膜を通ってウェルの裏側に空気が出ることが可能である。ＰＣＲ緩衝液がウェルを充填しウェル内の乾燥したプライマーセットを再水和した後、クロストークを防止するために隔離オイル又は熱伝導性液体がウェル基板１２０の両方の側を充填してもよい。

図２Ｈは、図２Ｆの実施形態と同様に構成される一実施形態を示す。しかしここでは膜は含まれない。従って処理流体は、ウェル基板１２０の両方の側にさらされ得る。ＰＣＲ緩衝液がウェルを充填しウェル内の乾燥したプライマーセットを再水和した後、クロストークを防止するために隔離オイル又は熱伝導性液体がウェル基板１２０の両方の側を充填してもよい。

図２Ｈは、例えば図２Ａ〜図２Ｆに示すような、本明細書中で開示され示される実施形態のうちの任意のものと共に使用可能なウェル基板１２０の一実施形態を示す。ここでウェル基板１２０のウェル１２１は、円錐と同様に、より大きな直径からより小さな直径まで先細りするように形成される。円錐形のウェルでは、プライマー材料を含む液体試薬を沈着させるために非接触沈着方法（例えばインクジェット）を使用することがウェルの傾斜した壁により可能となるため、プライマー適用の間の利点が提供されるということが見出された。更に円錐形のウェルでは、円錐形により乾燥が促進されるため、液体試薬適用の接触及び非接触方法の両方について、液体試薬のより容易な適用が可能になる。円錐形のウェルは、気体透過性膜１３６が存在する場合の泡及び漏洩を防止するのにも役立つということが見出された。

図３Ａは、ウェル基板１２０にプライマー材料を提供する方法を示す。図示されているように、液体プライマーでウェルを充填するために市販のプリンティングピンが使用されてもよく、液体プライマーはウェル内で乾燥されてもよく、又は液体が充填されたウェルが充填後に封止されてもよい。いくつかの実施形態では、ウェル基板１２０にプライマーが液体形態で提供された後、プライマー材料は乾燥されてもよく、これにより、プライマー残留物のみが後で液化するために各ウェルに付着して残されてもよい。そのようなピン（及び関連するシステム）の例としては、米国カリフォルニア州９４０８９、サニーベール、イースト・ウェデル・ドライブ５２４（５２４ Ｅａｓｔ Ｗｅｄｄｅｌｌ Ｄｒｉｖｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ９４０８９，ＵＳＡ）に立地するアレイイット・コーポレーション（ＡｒｒａｙＩｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）による９４６ＭＰ（ｘ）シリーズのピンが含まれる。ヘイサン（Ｈａｓａｎ）らの米国特許出願公開第２００９／００５４２６６号明細書、及びヘス（Ｈｅｓｓ）らの米国特許第６，７１６，６２９号明細書によって開示された方法も、プライマー材料を提供するために使用されてもよい。適用プロセスの間、プリンティングピンはウェル基板１２０と接触するように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、非接触プロセス、例えばインクジェットプリンティングなどの小滴ベースの方法又は当業者に知られているその他の好適な非接触プロセスが、液体試薬（例えばプライマー）をウェルに提供するために使用されて、ウェルを規定する１つ以上の壁上の乾燥した試薬がもたらされてもよい。

ＩＩ．ハニカムチューブ内への試料の装填
図４Ａ及び図４Ｂは、ウェル基板１２０を試料流体で充填する方法を示す。図４Ａでは、試料流体は、ウェル基板１２０と第１の平面基板１０４との間を（例えば圧力によって）前進させられる。流体がウェル基板１２０を通過する際に各ウェルが流体で充填され、流体は表面張力によってウェル内に主として保持される。上述のように、ウェルを規定する壁などのウェル基板１２０の部分は、親水性の物質でコーティングされるか又は比較的より親水性になるように処理されてもよく、これにより、試料流体が通過する際の完全かつ均一なウェルの充填が助長される。加えて、ウェル表面を囲む上面などの、ウェル基板１２０のその他の表面が、疎水性の物質でコーティングされるか又は比較的より疎水性になるように処理されてもよく、これにより、流体試料がウェル内のみに保持され、隣接する表面上には保持されないようになり、一貫性のない検査結果が減少する。加えて、第１の平面表面１２０の内面が疎水性効果のためにコーティングされるか又は処理されてもよい。図４Ｂでは、試料流体が後退した後にウェルのみが充填されていることがわかる。いくつかの実施形態では、流体試料は図４Ｂ’（日本語による訳文では図４Ｂ−２）に示すように前進させられて、空気のポケットがそれに続いてもよく、これにより、図４Ｂの例示的実施形態に示すように試料を撤収する必要がなくなる。ジャックマン（Ｊａｃｋｍａｎ）ら（Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．、１９９８年、７０、２２８０〜２２８７）によって、及びハッチ（Ｈａｔｃｈ）らの「デジタル生物学のためのマルチレイヤ高密度３Ｄナノウェルアレイ（ＭＵＬＴＩＬＡＹＥＲ ＨＩＧＨ−ＤＥＮＳＩＴＹ ３Ｄ ＮＡＮＯＷＥＬＬ ＡＲＲＡＹＳ ＦＯＲ ＤＩＧＩＴＡＬ ＢＩＯＬＯＧＹ）」（１５ｔｈ Ｉｎｔ’ｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０１１年１０月２〜６日、２６９〜２７１）によって開示された「不連続ウェッティング（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｗｅｔｔｉｎｇ）」などの充填方法も使用されてもよい。一般に、ウェル内での異なるプライマーの相互汚染を避けるために、ウェル基板１２０はなるべく迅速にディウェッティングされるべきである。

図４Ｃ及び図４Ｄは、ウェル基板１２０を試料流体で充填する別の方法を示す。図４Ｃでは、ウェル基板１２０は、図４Ａ及び図４Ｂに示す技法の組み合わせに従って充填される。しかし試料流体にはオイルのポケットが続く。図４Ｃにおけるオイルは試料流体に直接接触して示されているが、オイルキャップと試料流体との間に空気ギャップが設けられてもよい。

図４Ｄに示すように、各ウェルが試料流体で充填された後は、オイルが各ウェルに完全に「蓋（キャップ）」をしてもよく、これはウェブ基板１２０が熱サイクルを受ける場合の蒸発の減少の一助となり得る。いくつかの実施形態では、ウェルが充填された後で、オイルがチャンバの最上部から導入され、図４Ｄ’（日本語訳文では図４Ｄ−２）に示すようにチャンバ入口１２４から撤収されてもよい。図４Ｄ及び図４Ｄ’の両方の実施形態において、ウェルがオイルで蓋をされた後、熱伝導性を向上させるためにチャンバ１１８を水溶液が充填してもよい。いくつかの実施形態では、流体及びいかなる泡の移動も停止させるために、静止した水溶液がチャンバ１１８内で加圧されてもよい。

いくつかの実施形態では、図４Ｄ”（日本語訳文では図４Ｄ−３）に示すように、ウェルが充填された後は、熱サイクリングの間、オイルがチャンバ内に静止して保持されてもよい。いくつかの実施形態では、流体及びいかなる泡の移動も停止させるために、静止したオイルはチャンバ１１８内で加圧されてもよい。

鉱油などのオイルが、各ウェルの隔離のために及び熱伝導性を提供するために使用されてもよい。但し本発明の実施形態は「オイル」に限定されない。フッ素化液体（例えば３Ｍ ＦＣ−４０）などの任意の熱伝導性液体が使用されてもよい。従って本開示中での「オイル」への言及は、そのような代替を含むものと理解されたい。

いくつかの実施形態では、図４Ｃに示すようにウェルが試料流体で充填された後、オイルが試料流体の後に続いて、ウェルに蓋をし、ウェルチャンバ１１８内に維持されてもよい。この実施形態を明示する実験が、実施例３で説明するように、及び図４Ｅに示すように行われた。

図５Ａ及び図５Ｂは、ウェル基板１２０における反応を検出するための例示的なセンサアセンブリの位置付けを示す。いくつかの実施形態では、センサアセンブリＡは第１の平面基板１０４に直接隣接して又は接触して位置付けられる。いくつかの実施形態では、第２のセンサアセンブリＢは第２の平面基板１０６に直接隣接して又は接触して位置付けられる。各センサアセンブリは、ＰＣＲ検査のための励起及び／又は検出デバイスを含んでもよい。いくつかの実施形態では、センサは、蛍光の励起及び検出のための光センサである。

図５Ｃは、図５Ａ及び図５Ｂの構成の代わりに又はそれと組み合わせて使用されてもよい例示的なセンサアセンブリの構成を示す。ここではセンサアセンブリＡは、ハニカムチューブ１００の前縁に沿って位置付けられる。いくつかの実施形態では、第２のセンサアセンブリＢが含まれる。いくつかの実施形態では、図５Ａ及び図５ＢのセンサアセンブリＡ及びＢのうちの一方又は全てが、図５ＣのセンサアセンブリＡ及びＢのうちの一方又は全てと組み合わせて使用される。

図５Ｄは、例示的なセンサアセンブリの構成を示す。いくつかの実施形態では、このセンサアセンブリ構成は、図５Ａ〜図５Ｃに示す構成と共に使用されてもよい。センサアセンブリは、光ファイバフェースプレート（ＦＯＦＰ）に結合されたＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器を含む。フィルタがＦＯＦＰの上に階層化され、標的に接触して又は隣接して配置され、ここでは標的はウェル基板１２０である。いくつかの実施形態では、図５Ｅに示すように、フィルタはＣＣＤの上に直接階層化（接合）され、その上にＦＯＦＰが配置されてもよい。

図５Ｆは、別の例示的なセンサアセンブリの構成を示す。いくつかの実施形態では、この構成は、図５Ａ〜図５Ｃに示す構成のうちの１つ以上と共に使用されてもよい。ここではＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器は、フィルタが間に配置された二重レンズ構成に結合される。いくつかの実施形態では、フィルタはＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器に接合されてもよい。

ＩＩＩ．使用方法
いくつかの実施形態では、試料流体が流体インレット１１０内に、及びインレット通路１２８を通して導入される。次に前置増幅チャンバ１１６が試料流体で充填されてもよい。前置増幅チャンバ１１６は、所望の化学反応を引き起こしてそれによりその中の流体を増幅する１つ以上の化学物質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、流体は、所望の反応が発生するまで前置増幅チャンバ１１６内に、前置増幅チャンバ出口１２２に達するがそれを越えることのないように維持されてもよい。流体は次に前置増幅チャンバ出口１２２を通過して、下向きに傾斜した中間通路１２６内に入る。流体は次にウェルチャンバ入口１２４を通ってウェルチャンバ１１８を充填する。いくつかの実施形態では、前置増幅チャンバ内での流体の増幅の後、流体は前置増幅チャンバから流体インレットを通して流体処理カートリッジ内の別個のチャンバ内に混合のために撤収され、次に流体インレットを通して戻されて前置増幅チャンバを通過し、ウェルチャンバに入る。ウェル基板１２０のウェルが次に、例えば図４Ａ〜図４Ｄ”に示す方法に従って充填されてもよい。ウェル基板１２０のウェルが充填されたら、流体はウェルチャンバ１１８から、アウトレット通路１３０を通して又はインレット通路１２８を逆に通して排出されてもよい。いくつかの実施形態では、熱サイクリングの間の蒸発を防止するために、充填されたウェル上に鉱油などのオイルがコーティングされてもよい。いくつかの実施形態では、５〜２０ｐｓｉ（訳注：３４．４７〜１３７．９ｋＰａ）の範囲の圧力がウェルチャンバ１１８に加えられる。従って、ＰＣＲ緩衝液及び任意の熱伝導性液体（オイル）は、ＰＣＲ液及び任意の乾燥したプライマーの再水和の間に発生する可能性がある小泡を保持するために圧力下に置かれる。この圧力の印加は、任意の発生した泡の不動化を引き起こし得、従って、移動する泡及び液体による光学干渉が発生しなくなる。いくつかの実施形態では、ウェルチャンバ１１８が１００％の湿度を、又は熱サイクリングの間の過蒸発を防止するのに十分な湿度を有するように、蒸留水などの水和流体が前置増幅チャンバ１１６内で、又は補助チャンバ１３２のうちの１つの中で加熱されてもよい。充填が完了した後、ＰＣＲのための熱サイクリングを実行するために、ウェル基板１２０は、ハニカムチューブ１００と熱的に接触している外部装置によって加熱されてもよい。いくつかの実施形態では、ＲＦＩＤ、キュリー点、誘導、又はマイクロ波加熱などの非接触加熱方法が使用されてもよい。これら及びその他の非接触加熱方法は当業者に周知であり、本明細書中で開示されるハニカムチューブに容易に適用され得る。熱サイクリングの間、ハニカムチューブは、図５Ａ〜図５Ｅで説明したセンサ配置によって化学反応について監視されてもよい。

様々な生物学的アッセイが、ハニカムチューブ１００を使用して、一般にテスト試料内の少なくとも１つの対象分析物の存在を示すという目的のために行われ得る。これらのアッセイとしては、以下に限定されないが、（抗体−抗原結合対、又は十分な相補性を有する２つのポリヌクレオチド配列などの）予め選択された分子対の間の特異的結合親和性に基づく結合アッセイ、特定の所定のヌクレオチド配列に基づく基準に依拠する核酸増幅反応、及び予め規定された活動の分子（酵素など）の存在を示す化学反応が含まれる。

いくつかの実施形態では、所定の配置においてハニカムチューブ内に沈着される分析剤又はプローブ、例えば「ベイト」タンパク質又は核酸は、基板表面の最小の構造的変更又は修正で固体基板の表面上に直接不動化される。言い換えると、薬剤又はプローブは表面上に本質的に「スポッティング」され、２次元空間内に配置され閉じ込められる。いくつかの実施形態では、基板は、薬剤又はプローブを収容するための、所定の寸法の複数のウェル又はくぼみの配置を形成するように製造されてもよく、薬剤又はプローブはウェル又はくぼみ内に恒久的に不動化されるか、あるいはアッセイの持続時間にわたって一時的にウェル又はくぼみ内に閉じ込められてもよい。言い換えると、分析プローブは３次元空間内に閉じ込められる。

ハニカムチューブの分析プローブとして働くのに好適な材料としては、タンパク質の選択肢（例えば抗体などの全長タンパク質、タンパク質フラグメント、又は短鎖ペプチド）、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）、炭水化物、脂質、組織、細胞、又はほとんど全ての化学的性質の分子が含まれる。言い換えると、多重化アッセイのためのマイクロアレイを作るために使用されることが知られている任意の材料／分子は、本発明のハニカム検査チューブにおいて使用され得る。

ＩＶ．対象分析物の検出
本発明の一態様は、少なくとも１つの対象分析物、例えば標的タンパク質（例えば特定の抗原性の抗体）、標的細胞、標的遺伝子、標的遺伝子配列、標的ｍＲＮＡ転写、又は標的核酸などが検査試料内に存在することを示す光信号の（図５Ａ〜図５Ｅのセンサ構成を使用した）監視に関する。そのような対象分析物（１つ又は複数）は、ウィルス性、細菌性、菌性、寄生性（例えば原生動物から）、動物、又はヒト由来など、任意の由来のものであってもよい。例えば、ウィルスタンパク質、ウィルス抗原に対する抗体、あるいは細菌又はウィルスゲノムに由来するＤＮＡ／ＲＮＡ配列が、検査試料内で検出するための対象分析物であってもよい。例示的な非限定的な標的分析物としては、マイクロＲＮＡなどの核酸配列、哺乳動物遺伝子、癌遺伝子内の（メチル化ステータスにおける様々なプロファイルを示す）様々な遺伝的突然変異体、対立遺伝子変異体、又は後成的変異などの、哺乳動物遺伝子の遺伝的変異体、癌抑制遺伝子、あるいは特定の病気又は症状と関連することが暗に示されてきた任意のその他の遺伝子が含まれ得、これらは本発明のハニカム検査チューブの適用における検出の焦点であり得る。例示的ウィルスであってその遺伝子及び／又はタンパク質が対象分析物であり得る例示的ウィルスとしては、以下に限定されないが、ヒト免疫不全ウィルス−１（ＨＩＶ−１）、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、ヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）、エンテロウィルス、水痘−帯状疱疹ウィルス、フラビウィルス、ヘパドナウィルス、ヘルペスウィルス、ノロウィルス、オルソミクソウィルス、パルボウィルス、パポバウィルス、パラミクソウィルス、ペスチウィルス、ピコルナウィルス、及びインフルエンザが含まれ得る。例示的細菌であってその遺伝子及び／又はタンパク質が対象分析物であり得る例示的細菌は、ヒト型結核菌（ＴＢ）、炭疽菌、レジュネラ・ニューモフィラ菌、リステリア菌、淋菌、トラコーマクラミジア、髄膜炎菌、黄色ブドウ球菌、ヘリコバクターピロリ、及び大便連鎖球菌である。対象となる可能性がある例示的ヒト遺伝子は、ｐ５３、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ及びその他のＥＧＦＲファミリーメンバー、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＰＴＥＮ、ＲＡＳ、ＲＡＦ、Ｓｒｃ、ＲＢ、Ｍｙｃ、ＶＥＧＦ、トポイソメラーゼ、及びＡＰＯＥε４対立遺伝子である。

様々な対象分析物を検出及び／又は定量化する基礎技術については、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）及びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ）の「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（第３版、２００１年）、クリーグラー（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ）の「遺伝子の導入と発現：実験室マニュアル（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９９０年）、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らの「分子生物学の現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（１９９４年）、並びにハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）及びレーン（Ｌａｎｅ）の「抗体、実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９８８年）において見出すことができる。

任意の特定の同一性のタンパク質の存在を検出する目的のために、免疫学的アッセイなどの、結合親和性に基づく様々なアッセイを使用することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する（ハニカムフォーマットで所定のスポットに不動化された、又はハニカムの所定のウェル内に閉じ込められた）抗体を有する検査試料から標的タンパク質を捕捉することによって、サンドイッチアッセイフォーマットが実行されてもよい。タンパク質の存在は次に、蛍光発生分子などの、検出可能な標識にアタッチされる二次抗体を用いて示されてもよい。

対象核酸の存在を検出する目的のために、標的核酸配列に対して実質的に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む、かつワトソン−クリック型塩基対に基づいて標的配列にハイブリダイズすることが可能な、プローブ又は分子が一般に使用される。再び、プローブは固体基板の表面に所定の位置において不動化又はスポッティングされてもよく、又はいくつかの実施形態では、プローブは基板上の所定のパターン内の所定の位置におけるウェルに閉じ込められてもよい。例えば二本鎖であるか一本鎖であるかなどの、検出される標的ポリヌクレオチドの性質に応じて、検出プローブは、標的配列と実質的に配列が同一であるか、又は標的配列の相補的配列と実質的に配列が同一であってもよい。言い換えるとプローブは、標的ヌクレオチド配列に特異的に結合することが可能である。場合によっては、プローブは、標的ヌクレオチドに対する１つの結合セグメントと、非結合セグメントとを、非結合セグメントの存在が結合セグメントと標的核酸との間の特異的結合を妨げない限り含み得る。結合セグメントは一般に、標的配列の特異的認識を確実にするために、標的ポリヌクレオチド配列のいずれかの鎖に対して相補的である少なくとも８、多くの場合は少なくとも１０、１２、１５、２０、２５、３０、又はそれ以上の隣接ヌクレオチドを有する。プローブは、いくつかの実施形態では、例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサス赤、フィコエリトリン、ヒドロキシクマリン、アミノクマリン、カスケード青、パシフィックオレンジ、ルシファーイエロー、アロフィコシアニン、トゥルーレッド、フルオロＸ、又はランタニドのような蛍光又は発光分子などの、容易な検出のための発光部分を含む。

いくつかの実施形態では、特異的なポリヌクレオチド配列の存在を示すために様々な蛍光指示薬が使用される。いくつかの実施形態では、一般的な蛍光指示薬が使用される場合、融点に基づく検出方法が、特異的な標的ポリヌクレオチド配列の存在を検出するために有効であり得る。

ハニカムチューブ内に提供される分析剤への、分析物の結合親和性に直接基づいて対象分析物の検出が行われる結合アッセイフォーマットに加えて、対象核酸の検出及び／又は定量化のための増幅に基づくアッセイシステムが、広範囲の用途を提供する。この増幅に基づくシステムでは、配列特異的な増幅反応が完了したら、１つ以上の対象核酸が検出及び／又は定量化される。更に、増幅に基づく方法によって対象核酸を検出する目的のために、複数セットのプライマーが各ウェル内に、ネステッドＰＣＲフォーマットで実施される検出を可能にするために含まれてもよく、例えば、第１のセットのプライマーが標的配列の一部を規定し、１つ以上の後続のセットのプライマーによる更なるアンプリケーションを可能にするアンプリコンを生成してもよい。

いくつかの実施形態では、対象核酸はＤＮＡ分子である。ハニカムフォーマットの各ウェル内に少なくとも１セットのプライマー、遊離ヌクレオチド、及び適切なＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼを提供し、次にハニカムチューブを適切な温度に適切な持続時間だけさらして任意の標的ポリヌクレオチド配列の合成及び増幅を達成することによって、配列特異的な増幅が実行される。

各プライマーは一般に、塩基対によってポリヌクレオチド鋳型と二重鎖を形成したら核酸合成の開始点として機能し得、伸長された二重鎖が形成されるようにその３’末端から鋳型に沿って伸長され得る、オリゴヌクレオチド（天然又は合成のいずれであってもよい）である。プライマーの伸長は通常、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼを用いて実施される。伸長プロセスにおいて追加されるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。ほとんどの実施形態において、プライマーはＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。多くの場合、プライマーは６〜４０ヌクレオチドの範囲の、一般には約１２〜約２０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。プライマーは、例えば単一のプライマーを用いる直鎖増幅反応、又は２つ以上のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの、様々な核酸増幅反応において使用される。特定の用途のためのプライマーの長さ及び配列の選択の指針は当業者に周知であり、例えば、ディーフェンバッハ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ）編「ＰＣＲプライマー：実験室マニュアル（ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、２００３年）を参照されたい。

ＰＣＲなどの核酸増幅反応の文脈において、標的ポリヌクレオチド配列の増幅生成物は「アンプリコン」と呼ばれる。アンプリコンは、プライマー伸長によってもたらされるポリヌクレオチドの集団であり、通常は二重鎖ポリヌクレオチドの形態である。アンプリコンは様々な増幅反応によって生成され得、増幅反応の生成物は、１つ以上の標的核酸の複数ラウンドの増幅後の複製物である。一般に、アンプリコンを生成する増幅反応は、反応物の塩基対形成における鋳型駆動（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｒｉｖｅｎ）であり、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドプライマーの両方が鋳型ポリヌクレオチド又は標的ポリヌクレオチド配列内に相補体を有する。そのような相補性は、反応生成物又はアンプリコンの生成のために必要とされる。場合によっては、鋳型駆動の反応は、核酸ポリメラーゼを用いたプライマー伸長、又は核酸リガーゼを用いたオリゴヌクレオチドライゲーションである。そのような反応としては、以下に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、線状ポリメラーゼ反応、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換反応（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅などが含まれ、例えば、マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らの米国特許第４，６８３，１９５号明細書、米国特許第４，９６５，１８８号明細書、米国特許第４，６８３，２０２号明細書、及び米国特許第４，８００，１５９号明細書（ＰＣＲ）、ゲルファンド（Ｇｅｌｆａｎｄ）らの米国特許第５，２１０，０１５号明細書（ＴａｑＭａｎプローブを使用したリアルタイムＰＣＲ）、ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）らの米国特許第６，１７４，６７０号明細書、ランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）らの米国特許第４，９８８，６１７号明細書（ＬＣＲ）、バーケンメイヤー（Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒ）らの米国特許第５，４２７，９３０号明細書（ギャップＬＣＲ）、カシィアン（Ｋａｃｉａｎ）らの米国特許第５，３９９，４９１号明細書（ＮＡＳＢＡ）、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）の米国特許第５，６４８，２１１号明細書及び米国特許第５，７１２，１２４号明細書（ＳＤＡ）、リザーディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）の米国特許第５，８５４，０３３号明細書、青野（Ａｏｎｏ）らの特開平４−２６２７９９号公報（ローリングサークル増幅）などを参照されたい。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的核酸のアンプリコンは、本発明のハニカムチューブ内で実行される１ラウンド以上のＰＣＲ、例えばネステッドＰＣＲによって生成される。

ポリメラーゼ連鎖反応すなわちＰＣＲは、同時、複数ラウンドの、ＤＮＡの相補的鎖のプライマー伸長による、特異的なＤＮＡ配列のインビトロ増幅のための酵素媒介反応である。言い換えるとＰＣＲは、プライマー結合部位によって隣接される標的核酸の複数のコピー又は複製物を作るための反応であり、そのような反応は、（ｉ）標的核酸を変性させる工程と、（ｉｉ）プライマー結合部位にプライマーをアニーリングする工程と、（ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸の存在下で核酸ポリメラーゼによってプライマーを伸長させる工程とを１回以上繰り返すことを含む。反応では一般に、変性、アニーリング、及び伸長の各工程のために最適化された異なる温度が繰り返される。各工程における特定の温度、持続時間、及び工程間の変化速度は、当業者に周知の多くの要因に依存し、例えば、マクファーソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）ら編「ＰＣＲ：ア・プラクティカル・アプローチ（ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」及び「ＰＣＲ２：ア・プラクティカル・アプローチ（ＰＣＲ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、それぞれ１９９１年及び１９９５年）を参照されたい。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用する従来のＰＣＲでは、二重鎖標的核酸が９０℃を超える温度で変性され、プライマーが５０〜７５℃の範囲内の温度でアニーリングされ、プライマーが７２〜７８℃の範囲内の温度で伸長され得る。

用語「ＰＣＲ」は、以下に限定されないが、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、及びその他の同様の変種を含む派生形態の反応を包含する。これらの様々なＰＣＲアッセイについて、一般的な反応容積は、ナノリットル、例えば約０．１〜約５００ｎＬから、マイクロリットル、例えば約１〜約５μＬまでの範囲であってもよく、かつ本発明のハニカム検査チューブのウェル内に容易に含まれ得、従って迅速な多重化分析を可能にするものであってもよい。いくつかの非限定的な例示的実施形態では、ハニカムチューブの各ウェル内の反応容積は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、及び１００ｎＬである。

逆転写ＰＣＲすなわちＲＴ−ＰＣＲは、試料内のＲＮＡの検出及び分析のための特に強力なツールである。ＲＴ−ＰＣＲは、先行する逆転移反応によって標的ＲＮＡが相補的一本鎖ＤＮＡに変換され、これが次に通常のＰＣＲプロセスにおいて増幅されるＰＣＲであり、例えば、テコット（Ｔｅｃｏｔｔ）らの米国特許第５，１６８，０３８号明細書を参照されたい。

リアルタイムＰＣＲは、反応生成物すなわちアンプリコンの量が、反応が進行するのと同時に監視されるＰＣＲプロセスである。反応生成物（１つ又は複数）の監視のために使用される検出手段が主として異なる多くの形態のリアルタイムＰＣＲが存在し、例えば、ゲルファンド（Ｇｅｌｆａｎｄ）らの米国特許第５，２１０，０１５号明細書（ＴａｑＭａｎプローブ）、ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）らの米国特許第６，１７４，６７０号明細書及び米国特許第６、５６９、６２７号明細書（インターカレーティング色素）、タイアギ（Ｔｙａｇｉ）らの米国特許第５，９２５，５１７号明細書（分子ビーコン）を参照されたい。リアルタイムＰＣＲのための検出用化学物質については、マッケイ（ＭａｃＫａｙ）ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０：１２９２〜１３０５、２００２年）において概説されている。

ネステッドＰＣＲは、第１のセットのプライマーを使用する第１段階のＰＣＲのアンプリコンが、第２のセットのプライマーを使用する第２段階のＰＣＲのための鋳型となる、少なくとも２段階の増幅を含むＰＣＲプロセスである。第２のセットのプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーは、第１のセットの２つのプライマーのハイブリダイゼーション部位の間の位置において、すなわち第１段階のＰＣＲのアンプリコンの配列内の位置において、標的ポリヌクレオチド配列に対する配列相補性を有し、これにハイブリダイズすることが可能である。

多重ＰＣＲは、複数の潜在的標的ポリヌクレオチド配列の増幅が、同じ反応混合物中で同時に実施されるＰＣＲプロセスであり、例えば、バーナード（Ｂｅｒｎａｒｄ）ら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７３：２２１〜２２８、１９９９年）（２色リアルタイムＰＣＲ）を参照されたい。本発明のハニカムアッセイフォーマットは多重ＰＣＲを実施するのに好適である。特異的なセットのプライマーが、特異的な標的ポリヌクレオチド配列の増幅及び検出を目的とするウェル内に含まれる。一般に、同じプライマーを含む多数の反復ウェルが重複ウェルとしてハニカムウェル配置内に存在する。例えば、非限定的な例示的実施形態において、１つの全体的なハニカムウェル配置は、様々な予め作られた反応混合物であってそれぞれが合計で最大８、１６、２５、５０、又は更には１００の異なるセットのプライマーから選択される特異的なプライマーセットを含む反応混合物を、特異的なセットのプライマーを含む各反応混合物のために設けられる８レプリケートウェルのクラスタを用いて含み得る。

定量ＰＣＲは、試料内の１つ以上の特異的な標的配列の存在量を測定することを可能にするＰＣＲプロセスである。定量ＰＣＲは、標的配列の絶対的定量化及び相対的定量化の両方の測定を含み得る。定量測定は、標的配列と別個に又は一緒にアッセイされてもよい１つ以上の基準配列を使用して行われる。基準配列は試料に対して内在性（天然に存在する）又は外来性（人工的に追加される）であってもよく、後者の場合は１つ以上の競合鋳型を含み得る。一般的な内在性基準配列としては、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ、β_２―ミクログロブリン、リボソマルＲＮＡなどの遺伝子の転写物のセグメントが含まれる。定量ＰＣＲのための技法は当業者に周知であり、例えば、フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２６：１１２〜１２６、１９９９年）、ベッカー−アンドレ（Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ）ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７：９４３７〜９４４７、１９８９年）、ツィンマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ）ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２１：２６８〜２７９、１９９６年）、ディヴィアッコ（Ｄｉｖｉａｃｃｏ）ら（Ｇｅｎｅ、１２２：３０１３〜３０２０、１９９２年）、ベッカー−アンドレ（Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ）ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７：９４３７〜９４４６、１９８９年）を参照されたい。

増幅反応の進行と同時に反応生成物が測定されることを可能にする検出機構、例えば、上述のリアルタイムＰＣＲ、又は例えばレオーネ（Ｌｅｏｎｅ）ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２６：２１５０〜２１５５、１９９８年）に記載のリアルタイムＮＡＳＢＡが存在する場合、増幅反応は「リアルタイム」増幅であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「増幅する」は、増幅反応を実行することを意味する。「反応混合物」は、反応を行うために必要な全ての反応物を含む溶液（又はそのような溶液の凍結乾燥されたバージョン）であり、そのような反応物としては、以下に限定されないが、緩衝剤、塩、補因子、スカベンジャーなどが含まれ得る。いくつかの実施形態では、乾燥された試薬がハニカムチューブのウェル内に、製造プロセス中に沈着される。いくつかの実施形態では、乾燥された試薬は、１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列、ヌクレオシド三リン酸、酵素（１つ又は複数）、及び／又は１つ以上のアンプリコンの存在及び／又は量を示す検出部分を増幅するための、少なくとも１セットのプライマーを含む。いくつかの実施形態では、検出部分は蛍光指示薬である。リアルタイムＰＣＲにおけるアンプリコンの検出又は定量化は多くの場合、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、分子ビーコンプローブ、又はスコーピオンプローブなどの、蛍光共鳴エネルギー移動プローブすなわちＦＲＥＴプローブの使用を含む。

本明細書中で使用される場合、蛍光指示薬は、増幅反応の生成物（１つ又は複数）（すなわちアンプリコン）の存在下で蛍光シグナルを生成することが可能な分子（例えば色素又はプローブ）であり、これにより、少なくとも所定の範囲のアンプリコン濃度にわたって、反応混合物中にアンプリコンが蓄積するにつれて蛍光指示薬のシグナルが増加する。

いくつかのタイプの蛍光指示薬が、本発明のハニカムチューブ内で行われる増幅反応において使用されてもよく、第１に、蛍光色素が使用されてもよい。このクラスの好適な色素は、例えばエチジウムブロマイド、ＳＹＢＲグリーンＩ及びＩＩ、ＳＹＢＲゴールド、ＹＯ（オキサゾールイエロー）、ＴＯ（チアゾールオレンジ）、及びＰＧ（ピコグリーン）などの、二本鎖ＤＮＡ生成物に結合するインターカレーティング色素のような、アンプリコンのポリヌクレオチド配列に関して非特異的なものであり、例えば、イシグロ（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ）ら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２９：２０７〜２１３、１９９５年）、ツェング（Ｔｓｅｎｇ）ら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２４５：２０７〜２１２、１９９７年）、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２４：９５４〜９６２、１９９８年）を参照されたい。本発明と共に使用するのに好適な追加の蛍光指示薬は当業者に周知である。

第２に、場合によっては、１つ以上のプライマーは、蛍光分子が蛍光クエンチャーに近接して保持され、これにより、プライマー伸長によってヘアピン構造が強制的に離されるまでクエンチャーによって蛍光が消光される、ヘアピン構造を有するように設計されてもよく、例えば、ウィットコーム（Ｗｈｉｔｅｃｏｍｂｅ）ら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７：８０４〜８０７、１９９９年）（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（商標）プライマー）を参照されたい。好適な蛍光分子としては、前述のものが含まれる。

第３に、蛍光指示薬はまた、標的核酸のポリヌクレオチド配列に特異的であってもよい。このタイプの指示薬はしばしば蛍光プローブと呼ばれ、通常、蛍光部分と蛍光クエンチャーとを、それらがアタッチされるオリゴヌクレオチド部分が増幅生成物に特異的に結合するまでは近接して含み、例えば、ゲルファンド（Ｇｅｌｆａｎｄ）らの米国特許第５，２１０，０１５号明細書（ＴａｑＭａｎプローブ）、ナザレンコ（Ｎａｚａｒｅｎｋｏ）ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２５：２５１６〜２５２１、１９９７年）〈スコーピオンプローブ）、タイアギ（Ｔｙａｇｉ）ら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６：４９〜５３、１９９８年）（分子ビーコン）を参照されたい。蛍光指示薬は、リアルタイムＰＣＲに関連して使用されてもよく、又はそれらは反応の完了時に反応生成物の総量を測定するために使用されてもよい。様々な分子ビーコン及びその他のヘアピンプローブの概説については、ブルード（Ｂｒｏｕｄｅ）の「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｅｏｍｉｃｓ」（２００５年、８４６〜８５１ページ）を参照されたい。

一般に、本発明のハニカムチューブ内で行われる各反応について、その性質が結合親和性に基づくものであるか又は増幅に基づくものであるかに関係なく、少なくとも１つのポジティブコントロール及び少なくとも１つのネガティブコントロールが存在し、従ってこれらのコントロールによって正常な反応の確立がもたらされ、すなわち、ポジティブシグナルが検出されてもシステム全体の汚染によるものではなく、ネガティブシグナルが検出されてもアッセイシステムの障害によるものではない。いくつかの実施形態では、内部標準が含まれ得る。内部標準は、同じ反応に関与する既知の分子であり、例えば、試料内の標的分析物の定量化（相対的定量化又は絶対的定量化のいずれか）を可能にするために、標的ポリヌクレオチドと同じ増幅反応において増幅される核酸配列である。内部標準は、内在性、すなわち試料内に予め存在することが知られているものであってもよく、又は外来性、すなわち検査に先立って追加されるものであってもよい。

Ｖ．反応条件に対応するための分析剤の設計
本発明のハニカムチューブ内で実行される多重化アッセイは一般に、ほぼ同じ条件でほぼ同時に実施されるため、ハニカムチューブの各スポット上又は各ウェル内に置かれる分析剤は、所定の反応パラメータのセットの下で最適又は概最適な反応結果を達成するために慎重に設計されなければならない。一例では、配列相補性に基づくハイブリダイゼーションによって試料内の８つの特異的な標的核酸を検出するために、８つの異なるポリヌクレオチドプローブが基板表面上にスポッティング又は不動化される。特定のアッセイのための所定の反応パラメータの範囲内に入るように各標的プローブ配列を設計及び最適化することは、十分に当業者の技能の範囲内である。プローブの設計及び最適化における非限定的なパラメータとしては、特定のアッセイのための所与の反応条件下でプローブとその標的との間の特異的なハイブリダイゼーションをもたらすプローブの長さ、標的配列内の相対位置、及びＧＣ含量が含まれる。

別の例では、８つの異なる標的ポリヌクレオチド配列の増幅を目的とする８セットの異なる反応混合物が、４パッチフォーマットで配置され、各パッチは各反応混合物の８つのレプリケートスポットを含む。これらの８セットの異なる反応混合物のそれぞれは、特異的な標的配列の増幅のための少なくとも１セットのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。これらの８つのセットのプライマーは、変性、アニーリング、及び伸長の工程が、８つの異なる標的配列について同じ温度下でかつ同じ時間フレーム内で全て適切に完了し得るように設計されてもよい。

当業者は、プローブ又はプライマーの長さ、ＧＣ含量を調節することによって、必要な設計を達成することができる。場合によっては、天然に存在するヌクレオチドを、修正された又は人口のヌクレオチドで置換することが、プローブ及びプライマーのアニーリング／変性挙動を更に微調整するのに効果的である。例えば、ルコント（Ｌｅｃｏｎｔｅ）ら（Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００８年；１３０（７）：２３３６〜２３４３）、米国特許第８，２６８，９７８号明細書を参照されたい。いくつかの既知の類似体としては、１−メチルアデニン、１−メチルイノシン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、２−チオシトシン、２−チオシトシン、２−チオウラシル、２，２−ジメチルグアニン、２，６−ジアミノプリン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、３−メチルシトシン、４−アセチルシトシン、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、５−フルオロウラシル、５−メチルシトシン、５−メトキシウラシル、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メチルウラシル、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、７−メチルグアニン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、β−Ｄ−マンノシルケオシン、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、オキシブトキソシン、プソイドイソシトシン、プソイドウラシル、プソイドウラシル、ケオシン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、及びウラシル−５−オキシ酢酸などが含まれる。多くのヌクレオチド類似体が、シグマ（Ｓｉｇｍａ）及びアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの供給業者を通して市販されている。

図６は、複数のチャンバ１３を有するハウジング１２を含む流体制御及び処理カートリッジ１０を示す。内部に位置する流体制御装置（図示せず）、及びハニカムチューブ１００は、ハウジング１２の異なる部分に接続される。カートリッジ１０は、流体インタフェース１０８と流体的に結合することによって、試料流体及びその他の流体を必要に応じてハニカムチューブに提供する。一般に、ハニカムチューブを含むカートリッジは、米国カリフォルニア州サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のセフィエド（Ｃｅｐｈｅｉｄ）（登録商標）によるジーンエキスパート（ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ）（登録商標）システム内で使用される。いくつかの実施形態では、ハニカムチューブを含むカートリッジは、参照によって援用され付録Ａの一部として本明細書に添付される米国特許出願第６１／６３９８２０号明細書において開示されたヘテロジナスシステム（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）の１つ以上のモジュール内で使用される。システム１０及び使用法の追加の詳細は、米国特許第８，０４８，３８６号明細書、米国特許第８，１８７，５５７号明細書、米国特許第８，１１９，３５２号明細書、及び米国特許出願公開第２００８−００３８７３７号明細書に記載されており、当該特許及び特許出願公開のそれぞれは参照によって本明細書中に援用され付録Ａとして本明細書に添付される。

ＶＩ．実施例
実施例は、限定のためではなく、例示のみのために提供される。当業者は、本質的に同じ又は類似した結果をもたらすために変更又は修正され得る様々な非重要なパラメータを容易に認識するであろう。

実施例１：コドン１２及び１３におけるＫ−Ｒａｓ ＳＮＰの分析
ジーンエキスパート（ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ）カートリッジ反応チューブを使用して、この一塩基多型分析において、８プローブ、８レプリケート、４パッチフォーマットがセットアップされた。具体的には、全体のプローブ配置は、反応チューブのフレームの一方の側を囲む薄膜である固体基板の表面上の８×８の所定のスポットの４パッチからなった。各パッチ内に、特異的なヌクレオチド配列の８つのヌクレオチドプローブのそれぞれが沈着され（チューブ内に合計２５６スポット、スポット当たりの直径１００μｍ、スポット密度は５０μＭ（５０μｍｏｌ／Ｌ）、及びスポット容量は０．５ｎＬ）、８つの予め選択されたスポットのクラスタに不動化され、結果として各特異的なプローブについて８つのレプリケートスポットがもたらされた。

８つのオリゴヌクレオチドプローブのそれぞれはそのヌクレオチド配列において、１つのバージョンのＫ−Ｒａｓ配列のみとハイブリダイズするように設計された。この特定の研究において、１つのプローブは、コドン１２及び１３を囲む野生型（ＷＴ）Ｋ−Ｒａｓ配列とハイブリダイズするように設計され、１つのプローブは１２Ｖａｌ突然変異体とハイブリダイズするように、１つのプローブは１２Ａｓｐ突然変異体とハイブリダイズするように、１つのプローブは１２Ａｒｇ突然変異体とハイブリダイズするように、１つのプローブは１２Ｃｙｓ突然変異体とハイブリダイズするように、１つのプローブは１２Ｓｅｒ突然変異体とハイブリダイズするように、１つのプローブは１２Ａｌａ突然変異体とハイブリダイズするように、１つのプローブは１３Ａｓｐ突然変異体とハイブリダイズするように設計された。固体基板上の８プローブ配置を図７に示し、プローブ配列を表１に示す。表２はプローブの融解温度を示す。

基板表面上にプローブを不動化するために、表面は最初に水酸化プロセスによって浄化され、これにより、約６０°の接触角において表面エネルギーが３８ｄｙｎ／ｃｍ（訳注：３８×１０^−３Ｎ／ｍ）以上となり、表面反応性及び湿潤性が後続の機能化のために向上された。

機能化プロセスには、グリシドキシプロピルトリメトキシシランを前駆体として使用してグリシジル（ｇｌｙｃｉｄａｌ）（エポキシ）基を基板表面に導入することが含まれた。スポッティングプロセスの間に、官能基とオリゴヌクレオチドプローブとの間に、その３’末端において共有結合が確立された。

薄膜基板の機能化及びプローブのスポッティングの後、スポッティングされたプローブアレイを含む反応チューブは、フレームの、機能化された固体基板の側とは反対側上に第２の薄膜を配置することによって封止された。図７に示すような８プローブフォーマットを含む封止された反応チューブは次に、流体試料で充填され、基板表面上の全てのスポットが完全に浸漬された。試料内に存在するＫ−Ｒａｓ配列のコドン１２／１３ ＳＮＰ分析は、非対称ＴａｑＭａｎ増幅反応から開始され、これは、ＳＮＰ領域にまたがるＫ−Ｒａｓ配列とハイブリダイズする、ＣＦ４標識の正行プライマーと非標識の逆行プライマーとを含むものであった。反応混合物にはまた、（１）ＣＦ５で標識された、かつＰＣＲの進行を示す目的のために正行及び逆行プライマーの間にＫ−Ｒａｓ配列のセグメントに対応する配列を含む、ＴａｑＭａｎプローブ、及び（２）ＷＴアンプリコンを抑止する目的のための非標識のブロックメルト（ＢｌｏｃｋＭｅｌｔ）プローブも含まれていた。

この特定の研究において、ＰＣＲプロセス及び後続のハイブリダイゼーションプロセスのために、反応チャンバの一方の側上で加熱／冷却が提供された。正行プライマー（５’ＣＦ４）は１０００ｎＭ（訳注：１０００ｎｍｏｌ／Ｌ）の濃度において使用された。逆行プライマーは１００ｎＭ（訳注：１００ｎｍｏｌ／Ｌ）の濃度において使用された。ＴａｑＭａｎプローブ（５’ＣＦ５）は５０ｎＭ（訳注：５０ｎｍｏｌ／Ｌ）の濃度において使用された。±Ｋ−Ｒａｓ ＷＴブロッカープローブ、非標識、は１００ｎＭ（訳注：１００ｎｍｏｌ／Ｌ）の濃度において使用された。６０サイクルのＰＣＲの後、反応チャンバの温度は、プローブ−アンプリコンハイブリダイゼーションのために、ＰＣＲ溶出緩衝液（トリス緩衝液ｐＨ８）内で１〜２時間にわたって約５４℃に設定された。反応チャンバは次に、非特異的な残留ＣＦ４信号を除去するために、洗浄緩衝液（チューブウォッシュアレイイット（Ｔｕｂｅ Ｗａｓｈ ＡｒｒａｙＩｔ）の「ウォッシュバッファ２（Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ２）」）を用いて少なくとも１回、最大５回洗浄された。

Ｋ−Ｒａｓ ＷＴ細胞系（ホモ接合性正常）、Ｋ−Ｒａｓ ＣＣＬ細胞（ヘテロ接合性）、及びブロックされたＫ−Ｒａｓ ＣＣＬ細胞（ホモ接合性突然変異体）という３つの異なる試料が分析された。図８は、６０サイクルのＰＣＲの間の蛍光シグナル曲線を示す。図９Ａ〜図９Ｃは、ＷＴ、ヘテロ接合性１３Ａｓｐ突然変異体、及びホモ接合性１３Ａｓｐ突然変異体細胞試料からの予想結果を示す。図１０Ａ〜図１０Ｃは、試料からの実際の結果を示す。全体のプローブスポッティングパターンの包括的な図を図１１に示す。図１２は、励起に続いて内蔵顕微鏡下で見た全体のプローブスポッティングパターンの包括的な図を示す。

実施例２：乾燥したウェル内への試薬の装填
この研究において使用されたハニカムチューブ１００は射出成形によって作成された。部品は、ＰＣＲ領域内の１つの支持するウェル基板１２０と共に成形される。ナノウェルが、１９３ｎｍにおけるエキシマレーザ穿孔によって作成された。この研究で使用されたナノウェルの寸法は、直径１５０μｍ、深さ約１５０μｍ、ピッチ間隔２５０μｍである。これらのウェルは止まり穴であり、最大２．６ｎＬを保持可能である。

図３Ａに示すように、次に、アレイイット（ＡｒｒａｙＩｔ）（登録商標）によるナノプリント（ＮａｎｏＰｒｉｎｔ）（登録商標）をマイクロスポッティングピン（ピンの先端における直径が１００μｍのモデル番号＃９４６ＭＰ３）と共に使用することによって、緑色の食用色素がプリントされた。ピンからの各滴下は０．７ｎＬの容積を有する。ナノプリント（ＮａｎｏＰｒｉｎｔ）（登録商標）はアレイイット（ＡｒｒａｙＩｔ）（登録商標）による商用化されたマイクロアレイプリンタであり、様々なピッチ間隔のためにプログラム可能であり、９４６ＭＰ３を使用する場合は０．７ｎＬの倍数の液体量を供給することが可能である。選択するためのピンの品揃えが存在する。最も小さいマイクロスポッティングピンは、滴下当たりわずか０．３５ｎＬを供給することが可能である。実際の場合、緑色の食用色素はＰＣＲプロセスのための、プライマーセットとなるか又は酵素を有するプライマーセットとなる。各個々のナノウェルは、ＰＣＲプロセスの間に増幅されるべき特定の核酸標的のための異なるプライマーセットを有し得る。スポッティングの後、保存の目的のためにフリーズドライ又は凍結乾燥プロセスが行われ得た。

実施例３：試料の充填及び封止のための不連続ディウェッティング
この実施例（及び実施例４）において使用されるハニカムチューブ１００はポリプロピレンから構成された。ハニカムチューブ１００は、ＰＣＲ領域内の１つの支持するウェル基板１２０と共に成形される。複数のナノウェルが、１９３ｎｍの波長におけるエキシマレーザを使用して作成された。この実施例において使用されたナノウェルの寸法は、直径１５０μｍ、深さ約２５０μｍ、ピッチ間隔２５０μｍである。これらのウェルは貫通穴であり、最大４．４ナノリットルを保持可能である。ハニカムチューブ１００は次に、チューブの両側においてポリプロピレン膜によって封止された。各個々のウェルは封止されず、ＰＣＲのためのダイヤモンド領域全体（２５μＬの領域）が封止された。ハニカムチューブ１００は、図６に示すカートリッジ１０に結合された。

ポリプロピレンの疎水性のため、ポリプロピレン表面上のウェッティングを向上させるためにＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭ（訳注：５０ｍｍｏｌ／Ｌ）トリス、ＰＨ８．６）が最初に界面活性剤（０．１％ツイーン）と混合された。少量の黄色の食用色素が、視覚化を向上させるためにＰＣＲ緩衝液内に滴下された。このＰＣＲ緩衝液は次に、図６に示すカートリッジ１０内のチャンバ１３のうちの１つの中に追加された。鉱油（ＣＡＳ＃８０４２−４７−５）が別のチャンバ内に追加された。カートリッジ１０を制御してハニカムチューブ１００の液体充填を駆動するために、セフィエド（Ｃｅｐｈｅｉｄ）（登録商標）による市販のジーンエキスパート（ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ）（登録商標）システムが使用された。

ジーンエキスパート（ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ）（登録商標）システムは、流体チャネルを通してウェルチャンバ１１８内に、１μＬ／秒の割合でＰＣＲ緩衝液を供給するようにプログラムされた。ＰＣＲ緩衝液はウェルチャンバ１１８内の各ナノウェルを充填し、いくらかの過剰なＰＣＲ緩衝液は上部流体チャネルを介して出た。ハニカムチューブ１００のＰＣＲチャンバが充填された後、チューブ１００内のＰＣＲ緩衝液は次に、ウェルチャンバの底部から流体チャネル内に５μＬ／秒の割合で排出された。緩衝液は、上部流体チャネルからインレット通路１２８（最低部の流体チャネル）内に引き戻された。排出の後、毛管力によって各個々のナノウェル内にＰＣＲ緩衝液が残った。排出手順にもかかわらず、各ナノウェル内のＰＣＲ緩衝液は流出しなかった。ＰＣＲ緩衝液がインレット通路１２８を介して完全に排出された後、鉱油がウェルチャンバ１１８内に１μＬ／秒で導入された。図４Ｅに示すように、封止膜とナノウェルを有するポリプロピレン基板との間のギャップは鉱油によって充填された。

実施例４：試料の充填及び封止のための連続ウェッティング
実施例３におけるのと同じハニカムチューブ１００を使用し、実施例３において説明した不連続ディウェッティング方法を使用して、ナノウェルはＰＣＲ緩衝液で充填された。しかし個々のナノウェルがＰＣＲ緩衝液によって充填された後、（実施例３におけるようにＰＣＲ緩衝液を排出する代わりに）ＰＣＲチャンバの充填を継続するために鉱油がインレット通路１２８からハニカムチューブのウェルチャンバ１１８内に５μＬ／秒で導入された。ナノウェルの上で、鉱油が、ウェルチャンバ１１８内の（すなわちポリプロピレン基板と上部封止膜との間の）ＰＣＲ緩衝液に取って代わった。この方法は、２つの液体が連続的に表面を湿潤させるため、「連続ウェッティング」と呼ばれる。第１の液体（ＰＣＲ緩衝液）は表面を湿潤させ、ナノウェルを充填する。第２の液体（鉱油）は表面を連続的に湿潤させるが、各ナノウェル「内」は充填せず、なぜなら表面張力と毛管力とが第１の水性液体をナノウェル内に保持するからである。

実施例３及び実施例４において使用される両方の方法で、所望のＰＣＲ緩衝液がナノウェル内に正常に導入され、鉱油を使用して各個々のナノウェル内のＰＣＲ緩衝液が隔離された。鉱油キャップは、ナノウェル内の水性液体が熱サイクリングプロセスの間に蒸発するのを防止できるという更なる利点を有する。

ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を含む、本出願において引用された全ての特許、特許出願、及びその他の出版物は、参照によってその全体が全ての目的のために援用される。

Claims (29)

1. 第１の平面表面と第２の平面表面との間の流体経路を規定する平面フレームと、
   前記平面フレームの一方の端における流体インタフェースであって、流体インレットと流体アウトレットとを備える、流体インタフェースと
   を備え、前記流体経路は、複数のウェルをで構成されたウェル基板を有するウェルチャンバを更に含み、前記ウェルチャンバは前記平面フレーム内で前記第１の表面又は第２の表面と前記ウェル基板との間に配置され、前記ウェルチャンバは前記流体インレット及び前記流体アウトレットの間で流体連通する、
   ハニカムチューブ。
2. 前記流体経路は、前記平面フレーム内で前記第１の平面表面と前記第２の平面表面との間に配置される前置増幅チャンバを含む、請求項１に記載のハニカムチューブ。
3. 前記前置増幅チャンバは、ウェルチャンバ入口と流体連通する前置増幅チャンバ出口を含む、請求項２に記載のハニカムチューブ。
4. 前記前置増幅チャンバ出口は、前記ウェルチャンバ入口から通路によって分離される、請求項３に記載のハニカムチューブ。
5. 前記第１の平面表面及び第２の平面表面が垂直に向けられている場合、前記前置増幅チャンバ出口は、前記前置増幅チャンバの最上部に位置付けられる、請求項４に記載のハニカムチューブ。
6. 前記ウェルチャンバ入口は、前記ウェルチャンバの最下部に位置付けられる、請求項５に記載のハニカムチューブ。
7. 前記ウェルチャンバ入口は、前記前置増幅チャンバの下方に位置付けられる、請求項６に記載のハニカムチューブ。
8. 前記通路は、前記前置増幅チャンバ出口から前記ウェルチャンバ入口まで下向きに傾斜する、請求項７に記載のハニカムチューブ。
9. 前記流体経路は蛇行チャネルを備える、請求項１に記載のハニカムチューブ。
10. 前記流体経路は無弁である、請求項１に記載のハニカムチューブ。
11. 前記ウェル基板は１００〜１０００個のナノウェルを備える、請求項１に記載のハニカムチューブ。
12. 前記ウェル基板は、約１００〜約５００μｍの深さを有する複数のウェルを備える、請求項１に記載のハニカムチューブ。
13. 前記ウェル基板は、約５０〜約５００μｍの直径を有する複数のウェルを備える、請求項１に記載のハニカムチューブ。
14. 前記ウェル基板は、複数の０．８ｎｌウェルを備える、請求項１に記載のハニカムチューブ。
15. 前記平面フレームの一部は、疎水性物質を保持するオイルチャンバを規定する、請求項１に記載のハニカムチューブ。
16. 前記オイルチャンバは前記ウェルチャンバと流体連通する、請求項１５に記載のハニカムチューブ。
17. 前記平面フレームは、基部から延在するスカフォードを備える、請求項１に記載のハニカムチューブ。
18. 前記第１の平面表面及び第２の平面表面は、前記スカフォードを流体的に封止する第１の膜及び第２の膜を備える、請求項１７に記載のハニカムチューブ。
19. 前記平面フレームは、前記流体インタフェースを介して試料容器に流体的に接続される、請求項１に記載のハニカムチューブ。
20. 前記ウェル基板はニッケル材料を備える、請求項１に記載のハニカムチューブ。
21. ハニカムチューブの流体インタフェースに試料流体を提供し、前記ハニカムチューブは、第１の平面表面と第２の平面表面との間の流体経路を規定する平面フレームを備え、
    前記流体経路に沿って、増幅された流体でウェルチャンバを充填し、これにより前記ウェルチャンバの複数のウェルが前記増幅された流体でコーティングされ、
    前記ウェルチャンバから前記増幅された流体を排出し、これにより前記複数のウェルは、少なくともいくらかの前記増幅された流体で湿潤されたままとなること
    を含む方法。
22. 前記流体経路の前置増幅チャンバを前記試料流体で充填することを更に含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記前置増幅チャンバは、最上部に前置増幅チャンバ出口を含み、前記前置増幅チャンバは、前記前置増幅出口より下のレベルにおいて充填される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記前置増幅チャンバ出口は、下向きに案内する通路を介してウェルチャンバ入口に流体接続される、請求項２３に記載の方法。
25. 前記流体経路は無弁である、請求項２４に記載の方法。
26. 排出されたウェルチャンバを疎水性物質で充填することを更に含む、請求項２１に記載の方法。
27. 前記疎水性物質は、前記ウェルチャンバと流体連通する前記平面フレームのオイルチャンバから供給される、請求項２５に記載の方法。
28. 前記試料流体は、蛇行する様態で前記流体経路に沿って送られる、請求項２１に記載の方法。
29. 前記第１の平面表面及び第２の平面表面に加熱及び冷却サイクルを加えることを更に含む、請求項２１に記載の方法。