JP2015532094A - ハニカムチューブ - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書中で使用される場合、用語「ハニカム」は、予め設計された位置において固体基板の表面内に設けられる複数のウェルを表す。いくつかの実施形態では、本発明のハニカムチューブは少なくとも100〜200個のウェルを含む。いくつかの実施形態では、ハニカムチューブは約100〜300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500の任意の数のウェル又はより多くのウェルを含んでもよい。ウェルは任意の形状であってもよく、それらの位置は予め規定されるが、任意のフォーマット又はパターンで基板上に配置されてもよい。本明細書中で使用される場合、用語「ハニカムチューブ」は「ウェルチャンバ」、「マルチウェル反応チャンバ」、又は「マルチウェル反応チューブ」と交換可能に使用され得る。
図4A及び図4Bは、ウェル基板120を試料流体で充填する方法を示す。図4Aでは、試料流体は、ウェル基板120と第1の平面基板104との間を(例えば圧力によって)前進させられる。流体がウェル基板120を通過する際に各ウェルが流体で充填され、流体は表面張力によってウェル内に主として保持される。上述のように、ウェルを規定する壁などのウェル基板120の部分は、親水性の物質でコーティングされるか又は比較的より親水性になるように処理されてもよく、これにより、試料流体が通過する際の完全かつ均一なウェルの充填が助長される。加えて、ウェル表面を囲む上面などの、ウェル基板120のその他の表面が、疎水性の物質でコーティングされるか又は比較的より疎水性になるように処理されてもよく、これにより、流体試料がウェル内のみに保持され、隣接する表面上には保持されないようになり、一貫性のない検査結果が減少する。加えて、第1の平面表面120の内面が疎水性効果のためにコーティングされるか又は処理されてもよい。図4Bでは、試料流体が後退した後にウェルのみが充填されていることがわかる。いくつかの実施形態では、流体試料は図4B’(日本語による訳文では図4B−2)に示すように前進させられて、空気のポケットがそれに続いてもよく、これにより、図4Bの例示的実施形態に示すように試料を撤収する必要がなくなる。ジャックマン(Jackman)ら(Anal Chem.、1998年、70、2280〜2287)によって、及びハッチ(Hatch)らの「デジタル生物学のためのマルチレイヤ高密度3Dナノウェルアレイ(MULTILAYER HIGH−DENSITY 3D NANOWELL ARRAYS FOR DIGITAL BIOLOGY)」(15th Int’l Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences、2011年10月2〜6日、269〜271)によって開示された「不連続ウェッティング(discontinuous wetting)」などの充填方法も使用されてもよい。一般に、ウェル内での異なるプライマーの相互汚染を避けるために、ウェル基板120はなるべく迅速にディウェッティングされるべきである。
いくつかの実施形態では、試料流体が流体インレット110内に、及びインレット通路128を通して導入される。次に前置増幅チャンバ116が試料流体で充填されてもよい。前置増幅チャンバ116は、所望の化学反応を引き起こしてそれによりその中の流体を増幅する1つ以上の化学物質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、流体は、所望の反応が発生するまで前置増幅チャンバ116内に、前置増幅チャンバ出口122に達するがそれを越えることのないように維持されてもよい。流体は次に前置増幅チャンバ出口122を通過して、下向きに傾斜した中間通路126内に入る。流体は次にウェルチャンバ入口124を通ってウェルチャンバ118を充填する。いくつかの実施形態では、前置増幅チャンバ内での流体の増幅の後、流体は前置増幅チャンバから流体インレットを通して流体処理カートリッジ内の別個のチャンバ内に混合のために撤収され、次に流体インレットを通して戻されて前置増幅チャンバを通過し、ウェルチャンバに入る。ウェル基板120のウェルが次に、例えば図4A〜図4D”に示す方法に従って充填されてもよい。ウェル基板120のウェルが充填されたら、流体はウェルチャンバ118から、アウトレット通路130を通して又はインレット通路128を逆に通して排出されてもよい。いくつかの実施形態では、熱サイクリングの間の蒸発を防止するために、充填されたウェル上に鉱油などのオイルがコーティングされてもよい。いくつかの実施形態では、5〜20psi(訳注:34.47〜137.9kPa)の範囲の圧力がウェルチャンバ118に加えられる。従って、PCR緩衝液及び任意の熱伝導性液体(オイル)は、PCR液及び任意の乾燥したプライマーの再水和の間に発生する可能性がある小泡を保持するために圧力下に置かれる。この圧力の印加は、任意の発生した泡の不動化を引き起こし得、従って、移動する泡及び液体による光学干渉が発生しなくなる。いくつかの実施形態では、ウェルチャンバ118が100%の湿度を、又は熱サイクリングの間の過蒸発を防止するのに十分な湿度を有するように、蒸留水などの水和流体が前置増幅チャンバ116内で、又は補助チャンバ132のうちの1つの中で加熱されてもよい。充填が完了した後、PCRのための熱サイクリングを実行するために、ウェル基板120は、ハニカムチューブ100と熱的に接触している外部装置によって加熱されてもよい。いくつかの実施形態では、RFID、キュリー点、誘導、又はマイクロ波加熱などの非接触加熱方法が使用されてもよい。これら及びその他の非接触加熱方法は当業者に周知であり、本明細書中で開示されるハニカムチューブに容易に適用され得る。熱サイクリングの間、ハニカムチューブは、図5A〜図5Eで説明したセンサ配置によって化学反応について監視されてもよい。
本発明の一態様は、少なくとも1つの対象分析物、例えば標的タンパク質(例えば特定の抗原性の抗体)、標的細胞、標的遺伝子、標的遺伝子配列、標的mRNA転写、又は標的核酸などが検査試料内に存在することを示す光信号の(図5A〜図5Eのセンサ構成を使用した)監視に関する。そのような対象分析物(1つ又は複数)は、ウィルス性、細菌性、菌性、寄生性(例えば原生動物から)、動物、又はヒト由来など、任意の由来のものであってもよい。例えば、ウィルスタンパク質、ウィルス抗原に対する抗体、あるいは細菌又はウィルスゲノムに由来するDNA/RNA配列が、検査試料内で検出するための対象分析物であってもよい。例示的な非限定的な標的分析物としては、マイクロRNAなどの核酸配列、哺乳動物遺伝子、癌遺伝子内の(メチル化ステータスにおける様々なプロファイルを示す)様々な遺伝的突然変異体、対立遺伝子変異体、又は後成的変異などの、哺乳動物遺伝子の遺伝的変異体、癌抑制遺伝子、あるいは特定の病気又は症状と関連することが暗に示されてきた任意のその他の遺伝子が含まれ得、これらは本発明のハニカム検査チューブの適用における検出の焦点であり得る。例示的ウィルスであってその遺伝子及び/又はタンパク質が対象分析物であり得る例示的ウィルスとしては、以下に限定されないが、ヒト免疫不全ウィルス−1(HIV−1)、ヒトサイトメガロウィルス(CMV)、C型肝炎ウィルス(HCV)、B型肝炎ウィルス(HBV)、ヒト乳頭腫ウィルス(HPV)、エンテロウィルス、水痘−帯状疱疹ウィルス、フラビウィルス、ヘパドナウィルス、ヘルペスウィルス、ノロウィルス、オルソミクソウィルス、パルボウィルス、パポバウィルス、パラミクソウィルス、ペスチウィルス、ピコルナウィルス、及びインフルエンザが含まれ得る。例示的細菌であってその遺伝子及び/又はタンパク質が対象分析物であり得る例示的細菌は、ヒト型結核菌(TB)、炭疽菌、レジュネラ・ニューモフィラ菌、リステリア菌、淋菌、トラコーマクラミジア、髄膜炎菌、黄色ブドウ球菌、ヘリコバクターピロリ、及び大便連鎖球菌である。対象となる可能性がある例示的ヒト遺伝子は、p53、BRCA1及びBRCA2、Her2/Neu及びその他のEGFRファミリーメンバー、BCR−ABL、PTEN、RAS、RAF、Src、RB、Myc、VEGF、トポイソメラーゼ、及びAPOEε4対立遺伝子である。
本発明のハニカムチューブ内で実行される多重化アッセイは一般に、ほぼ同じ条件でほぼ同時に実施されるため、ハニカムチューブの各スポット上又は各ウェル内に置かれる分析剤は、所定の反応パラメータのセットの下で最適又は概最適な反応結果を達成するために慎重に設計されなければならない。一例では、配列相補性に基づくハイブリダイゼーションによって試料内の8つの特異的な標的核酸を検出するために、8つの異なるポリヌクレオチドプローブが基板表面上にスポッティング又は不動化される。特定のアッセイのための所定の反応パラメータの範囲内に入るように各標的プローブ配列を設計及び最適化することは、十分に当業者の技能の範囲内である。プローブの設計及び最適化における非限定的なパラメータとしては、特定のアッセイのための所与の反応条件下でプローブとその標的との間の特異的なハイブリダイゼーションをもたらすプローブの長さ、標的配列内の相対位置、及びGC含量が含まれる。
実施例は、限定のためではなく、例示のみのために提供される。当業者は、本質的に同じ又は類似した結果をもたらすために変更又は修正され得る様々な非重要なパラメータを容易に認識するであろう。
ジーンエキスパート(GeneXpert)カートリッジ反応チューブを使用して、この一塩基多型分析において、8プローブ、8レプリケート、4パッチフォーマットがセットアップされた。具体的には、全体のプローブ配置は、反応チューブのフレームの一方の側を囲む薄膜である固体基板の表面上の8×8の所定のスポットの4パッチからなった。各パッチ内に、特異的なヌクレオチド配列の8つのヌクレオチドプローブのそれぞれが沈着され(チューブ内に合計256スポット、スポット当たりの直径100μm、スポット密度は50μM(50μmol/L)、及びスポット容量は0.5nL)、8つの予め選択されたスポットのクラスタに不動化され、結果として各特異的なプローブについて8つのレプリケートスポットがもたらされた。
この研究において使用されたハニカムチューブ100は射出成形によって作成された。部品は、PCR領域内の1つの支持するウェル基板120と共に成形される。ナノウェルが、193nmにおけるエキシマレーザ穿孔によって作成された。この研究で使用されたナノウェルの寸法は、直径150μm、深さ約150μm、ピッチ間隔250μmである。これらのウェルは止まり穴であり、最大2.6nLを保持可能である。
この実施例(及び実施例4)において使用されるハニカムチューブ100はポリプロピレンから構成された。ハニカムチューブ100は、PCR領域内の1つの支持するウェル基板120と共に成形される。複数のナノウェルが、193nmの波長におけるエキシマレーザを使用して作成された。この実施例において使用されたナノウェルの寸法は、直径150μm、深さ約250μm、ピッチ間隔250μmである。これらのウェルは貫通穴であり、最大4.4ナノリットルを保持可能である。ハニカムチューブ100は次に、チューブの両側においてポリプロピレン膜によって封止された。各個々のウェルは封止されず、PCRのためのダイヤモンド領域全体(25μLの領域)が封止された。ハニカムチューブ100は、図6に示すカートリッジ10に結合された。
実施例3におけるのと同じハニカムチューブ100を使用し、実施例3において説明した不連続ディウェッティング方法を使用して、ナノウェルはPCR緩衝液で充填された。しかし個々のナノウェルがPCR緩衝液によって充填された後、(実施例3におけるようにPCR緩衝液を排出する代わりに)PCRチャンバの充填を継続するために鉱油がインレット通路128からハニカムチューブのウェルチャンバ118内に5μL/秒で導入された。ナノウェルの上で、鉱油が、ウェルチャンバ118内の(すなわちポリプロピレン基板と上部封止膜との間の)PCR緩衝液に取って代わった。この方法は、2つの液体が連続的に表面を湿潤させるため、「連続ウェッティング」と呼ばれる。第1の液体(PCR緩衝液)は表面を湿潤させ、ナノウェルを充填する。第2の液体(鉱油)は表面を連続的に湿潤させるが、各ナノウェル「内」は充填せず、なぜなら表面張力と毛管力とが第1の水性液体をナノウェル内に保持するからである。
Claims (29)
- 第1の平面表面と第2の平面表面との間の流体経路を規定する平面フレームと、
前記平面フレームの一方の端における流体インタフェースであって、流体インレットと流体アウトレットとを備える、流体インタフェースと
を備え、前記流体経路は、複数のウェルをで構成されたウェル基板を有するウェルチャンバを更に含み、前記ウェルチャンバは前記平面フレーム内で前記第1の表面又は第2の表面と前記ウェル基板との間に配置され、前記ウェルチャンバは前記流体インレット及び前記流体アウトレットの間で流体連通する、
ハニカムチューブ。 - 前記流体経路は、前記平面フレーム内で前記第1の平面表面と前記第2の平面表面との間に配置される前置増幅チャンバを含む、請求項1に記載のハニカムチューブ。
- 前記前置増幅チャンバは、ウェルチャンバ入口と流体連通する前置増幅チャンバ出口を含む、請求項2に記載のハニカムチューブ。
- 前記前置増幅チャンバ出口は、前記ウェルチャンバ入口から通路によって分離される、請求項3に記載のハニカムチューブ。
- 前記第1の平面表面及び第2の平面表面が垂直に向けられている場合、前記前置増幅チャンバ出口は、前記前置増幅チャンバの最上部に位置付けられる、請求項4に記載のハニカムチューブ。
- 前記ウェルチャンバ入口は、前記ウェルチャンバの最下部に位置付けられる、請求項5に記載のハニカムチューブ。
- 前記ウェルチャンバ入口は、前記前置増幅チャンバの下方に位置付けられる、請求項6に記載のハニカムチューブ。
- 前記通路は、前記前置増幅チャンバ出口から前記ウェルチャンバ入口まで下向きに傾斜する、請求項7に記載のハニカムチューブ。
- 前記流体経路は蛇行チャネルを備える、請求項1に記載のハニカムチューブ。
- 前記流体経路は無弁である、請求項1に記載のハニカムチューブ。
- 前記ウェル基板は100〜1000個のナノウェルを備える、請求項1に記載のハニカムチューブ。
- 前記ウェル基板は、約100〜約500μmの深さを有する複数のウェルを備える、請求項1に記載のハニカムチューブ。
- 前記ウェル基板は、約50〜約500μmの直径を有する複数のウェルを備える、請求項1に記載のハニカムチューブ。
- 前記ウェル基板は、複数の0.8nlウェルを備える、請求項1に記載のハニカムチューブ。
- 前記平面フレームの一部は、疎水性物質を保持するオイルチャンバを規定する、請求項1に記載のハニカムチューブ。
- 前記オイルチャンバは前記ウェルチャンバと流体連通する、請求項15に記載のハニカムチューブ。
- 前記平面フレームは、基部から延在するスカフォードを備える、請求項1に記載のハニカムチューブ。
- 前記第1の平面表面及び第2の平面表面は、前記スカフォードを流体的に封止する第1の膜及び第2の膜を備える、請求項17に記載のハニカムチューブ。
- 前記平面フレームは、前記流体インタフェースを介して試料容器に流体的に接続される、請求項1に記載のハニカムチューブ。
- 前記ウェル基板はニッケル材料を備える、請求項1に記載のハニカムチューブ。
- ハニカムチューブの流体インタフェースに試料流体を提供し、前記ハニカムチューブは、第1の平面表面と第2の平面表面との間の流体経路を規定する平面フレームを備え、
前記流体経路に沿って、増幅された流体でウェルチャンバを充填し、これにより前記ウェルチャンバの複数のウェルが前記増幅された流体でコーティングされ、
前記ウェルチャンバから前記増幅された流体を排出し、これにより前記複数のウェルは、少なくともいくらかの前記増幅された流体で湿潤されたままとなること
を含む方法。 - 前記流体経路の前置増幅チャンバを前記試料流体で充填することを更に含む、請求項21に記載の方法。
- 前記前置増幅チャンバは、最上部に前置増幅チャンバ出口を含み、前記前置増幅チャンバは、前記前置増幅出口より下のレベルにおいて充填される、請求項22に記載の方法。
- 前記前置増幅チャンバ出口は、下向きに案内する通路を介してウェルチャンバ入口に流体接続される、請求項23に記載の方法。
- 前記流体経路は無弁である、請求項24に記載の方法。
- 排出されたウェルチャンバを疎水性物質で充填することを更に含む、請求項21に記載の方法。
- 前記疎水性物質は、前記ウェルチャンバと流体連通する前記平面フレームのオイルチャンバから供給される、請求項25に記載の方法。
- 前記試料流体は、蛇行する様態で前記流体経路に沿って送られる、請求項21に記載の方法。
- 前記第1の平面表面及び第2の平面表面に加熱及び冷却サイクルを加えることを更に含む、請求項21に記載の方法。
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