BR112015006566B1 - Tubo de reação, e, método para preencher um tubo de reação - Google Patents
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Abstract
tubo alveolar, e, método um tubo alveolar com uma armação planar que define um trajeto fluídico entre uma primeira superfície planar e uma segunda superfície planar. uma interface fluídica está localizada em uma extremidade da armação planar. a interface fluídica tem uma entrada fluídica e uma saída fluídica. o trajeto fluídico inclui adicionalmente uma câmara da cavidade tendo um substrato da cavidade com uma pluralidade de cavidades. a câmara da cavidade é arranjada na armação planar entre a primeira ou a segunda superfície e o substrato da cavidade.
Description
[001] Este pedido reivindica prioridade ao pedido de patente US 13/843.739, depositado em 15 de março de 2013, que reivindica o benefício do pedido provisional US 61/706.115, depositado em 26 de setembro de 2012. Este pedido reivindica ainda o benefício do pedido provisional US 61/706.115, depositado em 26 de setembro de 2012. A integralidade de cada pedido mencionado é aqui incorporada pela referência.
[002] Pode ser desejável efetuar uma pluralidade de ensaios simultaneamente para prover variados e grandes conjuntos de dados. Tal processo é, por vezes, referido como “ensaios de multiplexação”. Desse modo, há a necessidade de dispositivos que possam efetuar ensaios de multiplexação.
[003] Algumas modalidades da invenção se referem a um tubo alveolar que pode ter uma armação planar definindo um trajeto fluídico entre uma primeira superfície planar e uma segunda superfície planar. Uma interface fluídica pode ser localizada em uma extremidade da armação planar. A interface fluídica pode ter uma entrada fluídica e uma saída fluídica. O trajeto fluídico pode ainda incluir uma câmara de cavidade tendo um substrato de cavidade configurado com uma pluralidade de cavidade, a câmara de cavidade sendo arranjada na armação planar entre a primeira ou segunda superfície e o substrato de cavidade, a câmara de cavidade ficando em comunicação fluídica com a entrada fluídica e a saída fluídica.
[004] Em algumas modalidades, o trajeto fluídico pode incluir uma câmara de pré-amplificação arranjada na armação planar entre a primeira e segunda superfície planar.
[005] Em algumas modalidades, a câmara de cavidade fica entre a câmara de pré-amplificação e a saída fluídica.
[006] Em algumas modalidades, a câmara de pré-amplificação não é incluída.
[007] Em algumas modalidades, a câmara de pré-amplificação é uma passagem estreita contendo um ou mais produtos químicos.
[008] Em algumas modalidades, a câmara de pré-amplificação pode incluir uma saída da câmara que fica em comunicação fluídica com uma entrada da câmara de cavidade.
[009] Em algumas modalidades, a saída da câmara de pré- amplificação é separada da entrada da câmara de cavidade por uma passagem.
[0010] Em algumas modalidades, a saída da câmara de pré- amplificação pode ser posicionada na posição mais elevada da câmara de pré- amplificação quando a primeira e segunda superfície planar forem verticalmente orientadas.
[0011] Em algumas modalidades, a entrada de câmara de cavidade pode ser posicionada na porção mais inferior da câmara de cavidade.
[0012] Em algumas modalidades, a entrada câmara de pré- amplificação pode ser posicionada abaixo da câmara de pré-amplificação.
[0013] Em algumas modalidades, a passagem pode ser inclinada para baixo, da saída da câmara de pré-amplificação para a entrada da câmara de cavidade.
[0014] Em algumas modalidades, o trajeto fluídico compreende um canal de serpentina.
[0015] Em algumas modalidades, o trajeto fluídico pode não ter válvula.
[0016] Em algumas modalidades, o substrato de cavidade pode ter uma pluralidade de cerca de 100 a cerca de 1.500 nanocavidades.
[0017] Em algumas modalidades, o substrato de cavidade compreende uma pluralidade de nanocavidades, cada uma tendo um diâmetro de cerca de 50 a cerca de 500 μm.
[0018] Em algumas modalidades, o substrato de cavidade pode ter uma pluralidade de nanocavidades, cada uma tendo uma profundidade de cerca de 100 μm.
[0019] Em algumas modalidades, o substrato de cavidade pode ter uma pluralidade de nanocavidades, onde cada cavidade da pluralidade de nanocavidades pode variar na faixa de cerca e 25 μm a 1.000 μm.
[0020] Em algumas modalidades, o substrato de cavidade pode ter uma pluralidade de nanocavidades, onde cada cavidade da pluralidade de nanocavidades tem uma largura na faixa de cerca de 25 μm cerca de 500 μm.
[0021] Em algumas modalidades, o substrato de cavidade pode ter uma pluralidade de nanocavidades, cada cavidade tendo um volume de cerca de 8,5 nl.
[0022] Em algumas modalidades, cada cavidade da pluralidade e cavidades pode ter um volume na faixa de cerca de 0,1 nl a cerca de 500 nl.
[0023] Em algumas modalidades, uma porção da armação planar pode definir uma câmara de óleo para conter uma substância hidrofóbica.
[0024] Em algumas modalidades, a câmara de óleo pode ficar em comunicação fluídica com a câmara de cavidade.
[0025] Em algumas modalidades, a armação planar pode ser um suporte que se estende a partir de uma porção de base.
[0026] Em algumas modalidades, a primeira e segunda superfícies planares podem ter primeira e segunda películas que vedam fluidicamente a estrutura de suporte.
[0027] Em algumas modalidades, a armação planar pode ser fluidicamente conectada a um recipiente de amostra via a interface fluídica.
[0028] Em algumas modalidades, o substrato de cavidade pode ser feito de um material de níquel.
[0029] Em algumas modalidades, a pluralidade de cavidades pode conter pelo menos um iniciador de ácido nucleico e/ou sonda para amplificação e/ou detecção de um alvo específico.
[0030] Em algumas modalidades, a pluralidade de cavidades pode conter uma molécula, por exemplo, um anticorpo ou um ácido nucleico, para a detecção de um alvo específico.
[0031] Algumas modalidades da invenção se referem a um método para prover um fluido de amostra a uma interface fluídica de um tubo de reação. O tubo de reação pode ter uma armação planar definindo um trajeto fluídico entre uma primeira superfície planar e uma segunda superfície planar, cada uma das superfícies podendo ser vedada com uma película flexível fina. Uma câmara de cavidade do trajeto fluídico pode ser enchida com um fluido de amostra, o qual compreende um material de amostra a ser analisado e que pode compreender ainda um ou mais sequências para a execução de um ensaio, de modo que uma pluralidade de cavidades na câmara de cavidade seja enchida com o fluido de amostra. O fluido de amostra pode, então, ser evacuado da câmara de cavidade, de modo que a pluralidade de cavidades permaneça, pelo menos parcialmente, enchida com o fluido de amostra.
[0032] Em algumas modalidades, uma câmara de pré-amplificação está presente no trajeto fluídico antes da câmara de cavidade, e o fluido de reação passa por uma etapa de amplificação na câmara de pré-amplificação antes do enchimento da câmara de cavidade.
[0033] Em algumas modalidades, a câmara de pré-amplificação pode incluir uma saída mais alta da câmara de pré-amplificação, e a câmara de pré- amplificação pode ser cheia a um nível abaixo da sida mais alta da câmara de pré-amplificação.
[0034] Em algumas modalidades, a substância hidrofóbica é evacuada da câmara de cavidade. Em algumas modalidades, a câmara de cavidade é subsequentemente enchida com um fluido aquoso após evacuação da substância hidrofóbica.
[0035] Em algumas modalidades, ciclos de aquecimento e/ou resfriamento são aplicados a ambas a primeira e segunda superfícies planares.
[0036] Em algumas modalidades, ciclos de aquecimento e/ou resfriamento são aplicados à primeira ou à segunda superfície planar.
[0037] Algumas modalidades da invenção se referem à execução de uma reação de amplificação multiplexada no tubo de reação.
[0038] Em algumas modalidades, o fluido de amostra é encaminhado ao longo do trajeto fluídico em uma maneira de serpentina.
[0039] Em algumas modalidades, a reação multiplexada envolve uma PCR aninhada.
[0040] Em algumas modalidades, a reação multiplexada é monitorada com uso de indicadores fluorescentes para indicar a presença de um amplicon.
[0041] Em algumas modalidades, a presença de amplicon é detectada com uso de análise de curva de fusão.
[0042] Em algumas modalidades, a reação multiplex detecta a presença ou ausência de pelo menos um único polimorfismo de nucleotídeo.
[0043] Em algumas modalidades, o material de amostra usado em uma reação multiplex é fluido corporal ou é derivado de um fluido corporal.
[0044] Em algumas modalidades, o material de amostra é uma amostra de tecido, ou é derivado de uma amostra de tecido.
[0045] Em algumas modalidades, uma reação detecta a presença ou ausência de um alvo de proteína.
[0046] Em algumas modalidades, uma reação detecta a presença ou ausência de um ácido nucleico.
[0047] Em algumas modalidades, o ácido nucleico é DNA.
[0048] Em algumas modalidades, o ácido nucleico é mRNA.
[0049] Em algumas modalidades, o ácido nucleico é micro RNA.
[0050] As figuras 1A, 1B, 1C mostram, respectivamente, vistas em perspectiva do lado direito e lado esquerdo de um tubo de reação, de acordo com algumas modalidades da invenção.
[0051] As figuras 1D e 1E são, respectivamente, vistas do lado direito de tubos alveolares, de acordo com algumas modalidades da invenção.
[0052] As figuras 2A-2H mostram seções transversais de porções do tubo de reação para mostrar várias modalidades do substrato de cavidade 120, de acordo com algumas modalidades da invenção.
[0053] A figura 3A mostra uma vista em perspectiva de um método para prover o substrato de cavidade 120 com material de iniciador, de acordo com algumas modalidades da invenção.
[0054] As figuras 4A-4E mostram vários métodos para encher um substrato de cavidade com um fluido de amostra, de acordo com algumas modalidades da invenção.
[0055] As figuras 5A-5F mostram várias posições de montagem de sensor em relação a um tubo de reação, de acordo com algumas modalidades da invenção.
[0056] A figura 6 mostra um sistema de controle e processamento de fluido para prover um fluido de amostra ao tubo de reação, de acordo com algumas modalidades da invenção.
[0057] As figuras 7 a 13 mostram etapas de um exemplo para efetuar análise PCR SNP multiplex de acordo com o Exemplo 1.
[0058] Como usado aqui, o termo “alveolar” descreve uma pluralidade de cavidades disposta na superfície de um substrato sólido em locais pré-designados. Em algumas modalidades, um tubo de reação desta invenção contém, pelo menos, 100 ou 200 cavidades. Em algumas modalidades, o tubo de reação pode conter qualquer número de cavidades entre 100 e 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500 ou mais cavidades. As cavidades podem ter qualquer forma e suas localizações, embora predeterminadas, podem ser arranjadas em qualquer formato ou padrão sobre o substrato. Como usado aqui, o termo “tubo de reação” pode ser usado intercambiavelmente como “câmara de cavidade”, “câmara de reação com múltiplas cavidades”, ou “tubo de reação com múltiplas cavidades”.
[0059] As figuras 1A, 1B e 1C mostram, respectivamente, vistas em perspectiva do lado direito e lado esquerdo de um tubo de reação 100. O tubo de reação 100 (usado intercambiavelmente com uma câmara de reação de múltiplas cavidades) inclui uma armação planar 102 que, em algumas modalidades, é uma estrutura tipo treliça formada de polímero (por exemplo, substrato de polipropileno/acrílico) ou material metálico geralmente compatível com PCR. A armação planar 102 pode ser formada como uma treliça aberta ou estrutura de suporte, ligada sobre os lados abertos por um primeiro substrato planar 104 e um segundo substrato planar 106.
[0060] O primeiro substrato planar 104 e segundo substrato planar 106 podem ser formados a partir de um filme de polímero relativamente fino que é aderido, ou, de outro modo, unido à armação planar 102. Em algumas modalidades, todo ou porções de um do primeiro substrato planar 104 e segundo substrato planar 106 pode ser integralmente formado com a armação planar 102 (por exemplo, por impressão em 3D), moldagem, comoldagem, ou usinagem de um dos substratos com a armação planar 102). Em algumas modalidades, ao primeiro substrato planar 104 e o segundo substrato planar 106 são feitos de um material transparente, como aqui ilustrado. Cada um do primeiro substrato planar 104 e segundo substrato planar 106 inclui superfícies de face interior e exterior. Estas superfícies de face interior formam passagens fluídicas com cavidades internas da armação planar 102.
[0061] Uma porção da armação planar 102 forma uma interface fluídica 108. A interface fluídica 108 é um membro estrutural que a maior parte da armação planar 102 suporta em balanço. A interface fluídica 108 pode ser integralmente formada com a armação planar 02. A interface fluídica 108 serve ainda como um acoplamento mecânico a um dispositivo de cartucho, descrito adiante, A interface fluídica 108 inclui uma entrada fluídica 110 e saída fluídica 112, que proveem interfaces fluídicas ao dispositivo de cartucho ou recipiente de amostra. Cada uma da entrada fluídica 110 e saída fluídica 112 é fluidicamente acoplada a um trajeto fluídico 114 formado na armação planar 102, entre o primeiro substrato planar 104 e segundo substrato planar 106. Deve ser entendido que o uso dos termos “entrada” e “saída” não limita a função da entrada fluídica 110 e saída fluídica 112. Desse modo, o fluido pode ser introduzido e evacuado de ambas ou de uma das duas. Em algumas modalidades, o trajeto fluídico 114 não tem válvula e, assim, aumentos ou diminuições de pressão externa podem ser aplicados via a entrada fluídica 110 e saída fluídica 112 por um sistema externo para mover o fluido dentro do trajeto fluídico 114, que se estende da entrada fluídica (11) até a saída fluídica (112). A seção transversal do trajeto fluídico 114 pode ser redonda ou retangular, e pode ter diâmetros ou larguras variando de cerca de 50 μm a cerca de 2 mm. Tipicamente, os diâmetros ou larguras variam de cerca de 250 μm a cerca de 1 mm.
[0062] O trajeto fluídico 114 inclui uma câmara de pré-amplificação 116 fluidicamente conectada a uma câmara de cavidade 118. A câmara de cavidade 118 contém um substrato de cavidade 120 (também referido aqui como um alvéolo) tendo uma pluralidade de cavidades (referidos aqui também como nanocavidades). O substrato de cavidade 120 pode ser feito de um metal (por exemplo, ouro, platina ou liga de níquel), cerâmica, vidro ou outro material polimérico PCR compatível, ou um material compósito. O substrato de cavidade 120 inclui uma pluralidade de cavidades. Em algumas modalidades, o substrato de cavidade 120 pode incluir 100 a 1000 cavidades, ou mais. As cavidades podem ser formadas em um substrato de cavidade 120 como furos cegos ou furos traspassantes. As cavidades podem ser criadas dentro de um substrato de cavidade 120, por exemplo, por perfuração a laser (por exemplo, laser excímero ou de estado-sólido), estampagem ultrassônica, estampagem a quente, litografia, eletroformação de molde de níquel, moldagem por injeção, e moldagem por injeção-compressão. Em algumas modalidades, o substrato de cavidade 120 é aderido ou comoldado à armação planar 102 e, em algumas modalidades, o substrato de cavidade 120 é uma feição moldada da armação planar 102. Em algumas modalidades, o volume de cavidade pode variar de 0,1 a 1.500 nl, tipicamente, 0,5 a 200 nl, de preferência, 0,5 a 50 nl. Por exemplo, em algumas modalidades, cada cavidade pode ter um volume de cerca de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5; 10; 11; 12; 13; 14, 15; 16; 17; 18; 19; 20; 15; 30; 35; 40; 45; 50; 55; 60; 65; 70; 75; 80; 85; 90; 95; 100; 110; 120; 130; 140; 150; 160; 170; 180; 190; 200; 225; 250; 275; 300; 325; 350; 375; 400; 425; 450; 475; ou 500 nL. Dimensões de cavidades podem ter qualquer forma, por exemplo, circular, elíptica, quadrada, retangular, ovoide, hexagonal, octogonal, cônica e outras formas bem conhecidas por alguém experiente na técnica. Além disso, as formas das cavidades podem ter áreas de seção transversal que variam ao longo de um eixo. Por exemplo, um furo quadrado pode afunilar de um primeiro tamanho para um segundo tamanho que é uma fração do primeiro tamanho. Em algumas modalidades, as dimensões das cavidades podem ser a de um quadrado, com diâmetros e profundidades aproximadamente iguais. Em algumas modalidades, o diâmetro e profundidade das cavidades não são iguais. Em algumas modalidades, paredes que definem a cavidade não são paralelas. Em algumas modalidades, paredes que definem uma cavidade convergem para um ponto. Dimensões de cavidade podem ser derivadas da capacidade de volume total do substrato de cavidade 120. Em algumas modalidades, profundidades de cavidades podem variar de 25 μm a 1.000 μm. Em algumas modalidades, por exemplo, as cavidades podem ter uma profundidade de 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, ou 1.000 μm. Em algumas modalidades, o diâmetro da cavidade pode variar de cerca de 25 μm a cerca de 500 μm. Em algumas modalidades, por exemplo, as cavidades podem ter uma largura de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, ou 500 μm.
Tabela I - Dimensões exemplificativas (métrica) de substrato de cavidade
[0063] Porções do substrato de cavidade 120 e/ou o interior do primeiro substrato planar 104 e/ou segundo substrato planar 106 podem ser modificadas para facilitar ou dificultar aderência de fluido. Por exemplo, superfícies definindo as cavidades podem ser revestidas com um material hidrofílico (ou modificado para ser hidrofílico) e, assim facilitar a retenção de fluido. Além disso, superfícies planares (circundando superfícies interiores que definem as cavidades) podem ser revestidas com um material hidrofóbico (ou modificado para ser hidrofóbico) e, assim, dificultar a retenção de fluido sobre as mesmas. Outros tratamentos de superfície podem ser efetuados de modo que o fluido seja, de preferência, mantido dentro das cavidades, mas não sobre superfícies superiores, de modo a facilitar a drenagem de excesso de fluido.
[0064] As cavidades do substrato de cavidade 120 podem ser personalizados para um padrão geométrico simples de filas e colunas alinhadas, ou padrões arranjados diagonal ou hexagonalmente. Em algumas modalidades, as cavidades do substrato de cavidade 120 podem ser personalizados para padrões geométricos complexos, como padrões caóticos ou padrões de desenho isogeométrico, como escrito em Schillinger et al, Computer Methods in Applied Mechanics and Engineering, 22 de janeiro de 2012. As cavidades podem ser geometricamente separadas uma da outra e/ou dispostas com grandes relações entre profundidade e largura para ajudar a prevenir contaminação cruzada de reagentes durante o processo de enchimento. Em algumas modalidades, métodos como os aqui descritos e métodos bem conhecidos por alguém experiente na técnica podem ser usados para impedir esta contaminação cruzada.
[0065] Como mostrado na figura 1A, uma porção do substrato de cavidade 120 pode ser conectada ao segundo substrato planar 106, de modo que um vão seja formado (para permitir a passagem de fluido) entre uma porção frontal do substrato de cavidade 120 e o primeiro substrato planar 104. A câmara de pré-amplificação 116, quando presente, inclui uma saída 122 de câmara de pré-amplificação, localizada na porção mais superior da câmara de pré-amplificação 116 (na orientação mostrada). Uma entrada de câmara de cavidade 124 é localizada em uma porção mais inferior da câmara de cavidade 118. Uma passagem intermediária descendente 126 separa a saída da câmara de pré-amplificação 122 e a entrada da câmara de pré-amplificação 124. Uma passagem de entrada 128 mais abaixo e uma passagem de saída 130 mais acima constituem as porções restantes do trajeto fluídico 114.
[0066] Em algumas modalidades, a armação planar 102 inclui uma ou mais (ou seja, pelo menos uma) de câmaras auxiliares 132, que podem ser usadas para prover fluidos de processo, como óleo ou outras soluções químicas, à câmara de pré-amplificação 116, à câmara de cavidade 118, e/ou a qualquer outra porção do trajeto fluídico 114. Essas câmaras auxiliares 132 podem ser fluidicamente conectadas a porções do trajeto fluídico 114 via uma ou mais membranas, válvulas e/ou substratos rompíveis por pressão (ou seja, materiais que se rompem quando sujeitos a uma pressão predeterminada de fluido dentro de uma câmara auxiliar ou porção adjacente do trajeto fluídico 114) como lâmina ou filme fino metálico.
[0067] Em algumas modalidades, o trajeto fluídico 114 pode incluir porções tortuosas, como mostrado na figura 1D. Um trajeto tortuoso entre a passagem de entrada 128 e a câmara de cavidade 118 pode ser útil para controle e condução de processos fluídicos. Foi verificado que um trajeto tortuoso pode ajudar a reduzir a formação de bolhas e gás que podem interferir com o óleo fluindo através do trajeto fluídico. O tubo de reação 100’ mostrado na figura 1D é, em grande parte, igual ao tubo de reação 100 mostrado nas figuras 1A-1C, mas a passagem intermediária 126’ incluindo uma pluralidade de porções e canal alongadas conectadas à maneira de serpentina. Aqui, três porções alongadas são ilustradas, mas mais ou menos porções podem ser usadas. Geralmente, pelo menos duas porções de canal são usadas e, em algumas modalidades, 2 a 10 porções de canal alongadas são usadas.
[0068] Em algumas modalidades o trajeto fluídico 114 inclui porções tortuosas extensas, como mostrado na figura 1E. O tubo de reação 100” mostrado aqui é, em grande parte, igual ao tubo de reação 100 mostrado nas figuras 1A-1C, mas a passagem intermediária 126’ se estende pela maior parte da estrutura do tubo de reação 100”. Desse modo, porções de canal alongadas da passagem intermediária 126’ podem ser feitas relativamente largas à semelhança de câmaras alongadas nas quais amplificação pode ocorrer. Aqui, quatro porções de canal alongadas são ilustradas, mas mais ou menos porções podem ser usadas. Geralmente, pelo menos 2 porções de canal são usadas e, em algumas modalidades, 2 a 10 porções de canal alongadas são usadas. Curvas internas de ângulo fechado que definem a passagem intermediária 126’ entre os canais alongados são bulbosas para reduzir área de seção transversal entre canais alongados. A área de seção transversal reduzida ao redor dos cantos ajuda a reduzir diferenciais de velocidade de fluxo entre fluidos no raio externo da curva, em comparação a fluidos no raio interno da curva. Caso esses diferencias e velocidade de fluxo sejam muito granes, cavitação indesejada causando formação de bolhas pode resultar. Aqui, as larguras das voltas são, aproximadamente, de 50% das larguras das porções de canal alongadas. Em algumas modalidades, larguras das voltas variam de 10 a 90% das larguras das porções de canal alongadas. Em algumas modalidades, as larguras das voltas variam uma em relação à outra.
[0069] Como descrito acima, a geometria de canal mostrada na figura 1E pode ser benéfica para controle e manuseio de processos de fluido. Embora uma câmara de pré-amplificação não seja mostrada, uma ou mais podem ser incluídas, dependendo da aplicação particular do tubo de reação 100”. Deve ser entendido que com a geometria mostrada, se uma amostra incluir muito poucas cópias de alvo (ou seja, 1 ou 2), então, após amplificação o alvo amplificado não pode ser misturado e uniformemente distribuído, devido à natureza linear do canal de serpentina. Desse modo, pode ser necessário retornar o fluido para o cartucho (ou para dentro do tubo de seringa ou uma câmara separada) para misturar e distribuir uniformemente a amplificação antes de encher as cavidades da câmara de cavidade.
[0070] As figuras 2A-2G mostram seções transversais de porções do tubo de reação para mostrar várias modalidades do substrato de cavidade 120.
[0071] A figura 2A mostra uma modalidade no qual cavidades do substrato de cavidade 120 são construídas via furos cegos feitos na armação planar 102. Nesta modalidade o segundo substrato planar 106 é integralmente formado com a armação planar 102, de modo que eles sejam essencialmente uma peça de material. Materiais de iniciador/sonda 134 são mostrados colocados em cada cavidade do substrato de cavidade 120.
[0072] A figura 2B mostra uma modalidade no qual cavidades do substrato de cavidade 120 são construídas via furos traspassantes na armação planar, como um filme de polímero, que é unido sobre a armação planar 102. Por exemplo, um substrato separado pode ser perfurado para formar um substrato de cavidade de furos traspassantes e, subsequentemente, aderido ou soldado sobre a armação planar 102. Nesta modalidade, o segundo substrato planar 106 é integralmente formado com armação planar 102, de modo que sejam essencialmente uma peça de material. Em algumas modalidades, furos cegos podem ser formados dentro do segundo substrato planar 106, que pode ser unido sobre a armação planar 102
[0073] A figura 2C mostra uma modalidade no qual cavidades do substrato de cavidade 120 são construídas via furos traspassantes formados dentro de uma porção da armação planar 102. Nesta modalidade, o segundo substrato planar 106 é integrado com a armação planar 102 e o substrato de cavidade 120 é um componente separado que é aderido ou soldado a uma bolsa dentro da armação planar 102.
[0074] A figura 2D mostra uma modalidade no qual cavidades do substrato de cavidade 120 são construídas via furos traspassantes formados dentro de uma porção da armação planar 102, como mostrado na figura 2C. Entretanto, nesta modalidade, uma membrana permeável a gás 136 é localizada entre a armação planar 10-2 e o segundo substrato planar 106. A membrana 136 possibilita que o gás seja evacuado das cavidades através da membrana, enquanto não permite que o fluido a atravesse. A membrana permeável a gás pode ser aderida ao substrato de cavidade por um adesivo permeável a gás. Em algumas modalidades, a membrana 136 é construída de polidimetilsiloxano (PDMS), e tem uma espessura variando de 2 a 1.000 μm e, em algumas modalidades, tem uma espessura variando de 100 a 200 μm.
[0075] A figura 2E mostra uma modalidade no qual cavidades do substrato de cavidade 120 são construídas via furos cegos formados dentro de uma porção da armação planar 102. Nesta modalidade, o segundo substrato planar 106 é integrado com a armação planar 102 e o substrato de cavidade 120 é um componente separado que é aderido ou soldado a uma bolsa dentro da armação planar 102.
[0076] Todas as porções do substrato de cavidade 120 podem conter porções de metal condutor (por exemplo, ouro) para possibilitar transferência de calor do metal para as cavidades. Por exemplo, a porção do substrato de cavidade 120 que é colocada contra o segundo substrato planar 106 pode ser chapa ou revestimento de metal. Em algumas modalidades, superfícies internas das cavidades podem ser revestidas com um metal para possibilitar transferência de calor.
[0077] A figura 2F mostra uma modalidade construído similarmente à modalidade da figura 2D. Entretanto, aqui, o substrato de cavidade é posicionado em um ponto intermediário entre os primeiro e segundo substratos. A membrana permeável a gás 136 pode ser aderida ao substrato de cavidade por um adesivo permeável a gás. Do mesmo modo que com a modalidade mostrado na figura 2D, ar pode sair através da membrana permeável a gás para os fundos das cavidades durante o enchimento com líquido. Após tampão de PCR encher as cavidades e reidratar os depósitos de iniciador seco nas cavidades, um óleo de isolamento ou líquido termalmente condutor pode encher ambos os lados do substrato de cavidade 120 para impedir ligação cruzada.
[0078] A figura 2H mostra uma modalidade que é construído similarmente à modalidade da figura 2F. Entretanto, aqui, uma membrana não é incluída. Desse modo, fluidos de processamento podem ser expostos a ambos os lados do substrato de cavidade 120. Após tampão de PCR encher as cavidades e reidratar os depósitos de iniciador seco nas cavidades, um óleo de isolamento ou líquido termalmente condutor pode encher ambos os lados do substrato de cavidade 120 para impedir ligação cruzada.
[0079] A figura 2H mostra uma modalidade do substrato de cavidade 120 utilizável com qualquer das modalidades aqui descritas, por exemplo, como mostrados nas figuras 2A-2F. Aqui, as cavidades 121 do substrato de cavidade 120 são modeladas para se afunilar de um diâmetro grande para um diâmetro menor, similar a um cone. Verificou-se que cavidades em forma de cone oferecem uma vantagem durante aplicação de iniciador, devido às paredes inclinadas das cavidades possibilitarem o uso de um método de deposição sem contato (por exemplo, jato de tinta) para depositar reagente líquido, que inclui o material de iniciador. Além disso, as cavidades em forma de cone possibilitam uma aplicação mais fácil de um reagente líquido para ambos os métodos de contato e sem contato de aplicação de reagente líquido, uma vez que a forma cônica ajuda na secagem. Verificou-se ainda que as cavidades em forma de cone ajudam a impedir bolhas e vazamentos quando a membrana permeável a gás 136 está presente.
[0080] A figura 3A mostra um método para prover o substrato de cavidade 120 com material de iniciador. Como mostrado, um pino de impressão comercialmente disponível pode ser usado para encher as cavidades com um iniciador líquido, que pode ser secado na cavidade ou a cavidade enchida com líquido pode ser vedada após enchimento. Em algumas modalidades, após o substrato de cavidade 120 ser provido com iniciador em forma líquida, o material de iniciador pode ser seco de modo que apenas um resíduo de iniciador permaneça aderido a cada cavidade para posterior liquefação. Exemplos desses pinos (e sistemas associados) incluem a série 946MP(x) de pinos de Arrylt Corporation, localizada em 524 East Weddell Drive, Sunnyvale, CA 94089, USA. Métodos descritos por Hasan et al., US PUB. 2009/0054.266 e Hess et al., patente US 6.716629 também podem ser usados para prover material de iniciador. Durante o processo de aplicação, o pino de impressão pode ser configurado para fazer contato com o substrato de cavidade 120. Em algumas modalidades, um processo sem contato pode ser usado para prover o reagente líquido (por exemplo, iniciador) à cavidade resultante com reagente seco sobre uma ou mais paredes que definem a cavidade, por exemplo, um método baseado em gotícula como impressão por jato de tinta ou outros processos sem contato adequados conhecidos por alguém experiente na técnica.
[0081] As figuras 4A e 4B mostram um método de encher o substrato de cavidade 120 com um fluido de amostra. Na figura 4, um fluido de amostra é avançado (por exemplo, via pressão) entre o substrato de cavidade 120 e o primeiro substrato planar 104. À medida que o fluido passa sobre o substrato de cavidade 120, cada cavidade se torna carregado com fluido, que é primariamente retido dentro das cavidades via tensão superficial. Como referido acima, porções do substrato de cavidade 120, como as paredes definindo as cavidades, podem ser revestidas com uma substância hidrofílica, ou tratada para se tornar relativamente mais hidrofílica e, desse modo, facilitar completo e uniforme carregamento das cavidades à medida que o fluido de amostra passa por cima delas. Adicionalmente, outras superfícies do substrato de cavidade 120, como superfícies de topo circundando as superfícies de cavidade, podem ser revestidas com uma substância hidrofóbica ou tratada para se tornar relativamente mais hidrofóbica, de modo que a amostra de fluido só seja retida nas cavidades e não sobre superfícies adjacentes, reduzindo, desse modo, resultados de testes inconsistentes. Adicionalmente, a superfície interna do primeiro substrato planar 120 pode ser revestida ou tratada para um efeito hidrofóbico. Na figura 4B, pode ser visto que apenas as cavidades são enchidas após o fluido de amostra ser retratado. Em algumas modalidades, uma amostra de fluido pode ser avançada, como mostrado na figura 4B’, seguida por uma bolsa de ar, eliminando assim a necessidade de remover a amostra como mostrado na modalidade exemplificativa mostrada na figura 4B. Métodos de enchimento, como “umedecimento descontínuo”, também podem ser usados, como descrito por Jackman et al., Anal. Chem. 1998, 70, 2280-2287 e por Hatch et al., MULTILAYER HIGH-DENSITY 3D NANOWELL ARRAYS FOR DIGITAL BIOLOGY, 15° Intl. Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, out., 2-6, 2011, 269-271. Geralmente, o substrato de cavidade 120 deve ter a água removida tão rapidamente quanto possível para evitar contaminação cruzada de iniciadores diferentes dentro das cavidades.
[0082] As figuras 4C e 4D mostram outro método de encher o substrato de cavidade 120 com fluido de amostra. N figura 4C, o substrato de cavidade 120 é carregado de acordo com uma combinação das técnicas mostradas nas figuras 4A e 4B. Entretanto, o fluido de amostra é acompanhado por uma bolsa de óleo. Embora o óleo na figura 4C seja mostrado contatando diretamente o fluido de amostra, um vão de ar pode ser provido entre o topo do óleo e o fluido de amostra.
[0083] Como mostrado na figura 4D, após cada cavidade ser carregada com fluido de amostra, o óleo pode (tampar” cada cavidade, o que pode ajudar na redução de evaporação quando o substrato de cavidade 120 for sujeito a ciclo termal. Em algumas modalidades, após as cavidades terem sido enchidos, óleo pode ser introduzido a partir do topo da câmara e ser removido da entrada da câmara 124, como mostrado na figura 4D’. Em ambos as modalidades mostradas na figura 4D e 4D’, após as cavidades terem sido terminados com óleo, uma solução aquosa pode encher a câmara 118 para aumentar a condutividade termal. Em algumas modalidades, a solução aquosa estacionária pode ser pressurizada dentro da Câmara 118 para interromper a movimentação de fluido e qualquer bolha.
[0084] Em algumas modalidades, após as cavidades terem sido enchidos, óleo pode ser mantido estacionário dentro da câmara durante ciclo termal, como mostrado na figura 4D”. Em algumas modalidades, o óleo estacionário pode ser pressurizado dentro da câmara 118 para interromper a movimentação de fluido e qualquer bolha.
[0085] Óleo, como óleo mineral, pode ser usado para isolamento de cada cavidade e prover condutividade termal. Entretanto, modalidades da invenção não estão limitados a “óleo”. Qualquer líquido condutor termal, como líquidos fluorados (por exemplo, FC-40 da 3M), pode ser usado. Desse modo, referências a “óleo” neste relatório devem ser entendidas como incluindo tais alternativas.
[0086] Em algumas modalidades, após as cavidades terem sido carregadas com fluido de amostra, como mostrado na figura 4C, o óleo pode acompanhar o fluido de amostra para tampar as cavidades e ser mantido no interior da câmara de cavidade 118. Uma experiência detalhando esta modalidade foi realizado conforme descrito no Exemplo 3 e como mostrado na figura 4E.
[0087] As figuras 5A e 5B mostram um posicionamento exemplificativo de conjunto de sensor para detectar reações no substrato de cavidade 120. Em algumas modalidades, o conjunto sensor A é posicionado diretamente adjacente ou contra o primeiro substrato planar 104. Estrutura móvel superior, um segundo conjunto sensor B é posicionado diretamente adjacente ou contra o segundo substrato planar 106. Cada conjunto sensor pode incluir dispositivos de excitação e/ou detecção para testes PCR. Em algumas modalidades, os sensores são sensores ópticos para a excitação e detecção de fluorescência.
[0088] A figura 5C mostra uma configuração exemplificativa de conjunto sensor que pode ser usada no lugar de, ou, em combinação com a configuração das figuras 5A e 5B. Aqui, o conjunto de sensor A é posicionado ao longo da borda frontal do tubo de reação 100. Em algumas modalidades, um segundo conjunto sensor B é incluído. Em algumas modalidades, um ou todos os conjuntos sensores A e B das figuras 5A e 5B são usados em combinação com um ou todos os conjuntos sensores A e B das figuras 5C.
[0089] A figura 5D mostra uma configuração exemplificativa de conjunto sensor. Em algumas modalidades, esta configuração de conjunto sensor pode ser usada em conjunto com a configuração mostrada nas figuras 5A-5C. O conjunto sensor inclui um detector CCD/CMOS acoplado a uma placa de face de fibra óptica (FOFP). Um filtro fica acamado sobre o topo da FOFP, e colocado contra ou adjacente ao alvo que, aqui, é o substrato de cavidade 120. Em algumas modalidades, o filtro pode ser acamado (unido) diretamente sobre o topo do CCD com a FOFP colocada sobre o topo, como mostrado na figura 5E.
[0090] A figura 5F mostra outra configuração exemplificativa de conjunto sensor. Em algumas modalidades, esta configuração pode ser usada em conjunto com uma ou mais das configurações mostradas nas figuras 5A- 5C. Aqui, um detector CCD/CMOS acoplado a uma configuração de lente dupla com um filtro colocado de entremeio. Em algumas modalidades, o filtro pode ser unido ao detector CCD/CMOS.
[0091] Em algumas modalidades, um fluido de amostra é introduzido na entrada fluídica 110 e através da passagem 128. A câmara de pré- amplificação 116 pode então ser carregada com o fluido de amostra. A câmara de pré-amplificação 116 pode incluir um ou mais produtos químicos para causar uma reação química desejada e, desse modo, amplificar o fluido contido na mesma. Em algumas modalidades, o fluido pode ser mantido dentro da câmara de pré-amplificação 116 até, mas não além, da saída 122 da câmara de pré-amplificação, até que a reação desejada ocorra. O fluido é, então, passado através da saída 122 da câmara de pré-amplificação e para a passagem intermediária inclinada descendentemente 126. O fluido passa, então, pela entrada da câmara de cavidade 124 e enche a câmara de cavidade 118. Em algumas modalidades, a amplificação do fluido na câmara de pré- amplificação, o fluido é retirado da câmara de pré-amplificação através da entrada de fluido e para dentro de uma câmara separada no cartucho de processamento de fluido para mistura e, depois, é retornado através da entrada de fluido para passar através da câmara de pré-amplificação e entrar na câmara de cavidade. As cavidades do substrato de cavidade 120 podem, então, ser enchidas, por exemplo, de acordo com um método como o mostrado nas figuras 4A-4D”. Uma vez que as cavidades do substrato de cavidade 120 estejam enchidas, o fluido pode ser evacuado da câmara de cavidade 118, através da passagem de saída 130, ou de volta através da passagem de entrada 128. Em algumas modalidades, um óleo, como um óleo mineral, pode revestir as cavidades enchidas para impedir evaporação durante ciclagem termal. Em algumas modalidades, a pressão variando de 34,4 a 137,8 (5 a 20 psi) será aplicada à câmara de cavidade 118. Desse modo, o tampão de PCR, bem como, qualquer líquido (óleo) termalmente condutor ficam sob compressão para manter o líquido de PCR e qualquer bolha pequena - possivelmente gerada durante a reidratação dos iniciadores secos. Esta aplicação de pressão pode causar imobilização de qualquer bolha gerada, de modo que nenhuma interferência óptica de movimentação de bolhas e líquido ocorra. Em algumas modalidades, um fluido de hidratação, como água destilada, pode ser aquecido dentro da câmara de pré-amplificação 116, ou uma das câmaras auxiliares 132, de modo que a câmara de cavidade 118 tenha 100% de umidade, umidade suficiente o bastante para impedir sobre evaporação durante ciclagem termal. Após o enchimento estar completo, o substrato de cavidade 120 pode ser aquecido por um dispositivo externo que fica em contato termal com o tubo de reação 100 para executar ciclagem termal para PCR. Em algumas modalidades, métodos sem contato de aquecimento podem ser empregados, como RFID, ponto de Curie, indutor, ou aquecimento por micro-onda. Estes e outros métodos sem contato de aquecimento são bem conhecidos por alguém experiente na técnica e podem ser prontamente aplicados ao tubo de reação como aqui descrito. Durante ciclagem termal, o tubo de reação pode ser monitorado quanto a reações químicas via os arranjos de sensor descritos nas figuras 5A-5E.
[0092] Uma variedade de ensaios biológicos pode ser executada usando o tubo de reação 100, tipicamente para a finalidade de indicar a presença de pelo menos um analito de interesse em uma amostra de teste. Estes ensaios incluem, mas não de modo limitativo, ensaios de ligação baseados na afinidade de ligação específica entre um par pré-selecionado de moléculas (como um par de ligação de anticorpo-antígeno ou duas sequências de polinucleotídeos com suficiente complementaridade), reações de amplificação de ácido nucleico baseadas em certos critérios predeterminados baseados em sequência de nucleotídeo, e reações químicas indicativas da presença de moléculas de atividade predefinida (como enzimas).
[0093] Em algumas modalidades, agentes analíticos ou sondas depositados no tubo de reação em um arranjo predeterminado, por exemplo, proteínas “isca” ou ácidos nucleicos, são diretamente imobilizados sobre a superfície de um substrato sólido com mínima alternância estrutural ou modificação da superfície do substrato. Em outras palavras, os agentes ou sondas são essencialmente “pontificados” sobre a superfície e arranjados e confinados dentro de um espaço bidimensional. Em algumas modalidades, o substrato pode ser manufaturado para formar um arranjo de múltiplas cavidades ou endentações de dimensões predeterminadas para alojar os agentes ou sondas, que podem ser permanentemente imobilizados dentro das cavidades ou endentações, ou temporariamente confinados dentro das cavidades ou endentações pela duração de tempo do ensaio. Em outras palavras, as sondas analíticas serão confinadas dentro de um espaço tridimensional.
[0094] Material adequado para servir como sondas analíticas do tubo de reação inclui seleção de proteínas (por exemplo, proteínas de extensão completa, como anticorpos, fragmentos de proteína, ou peptídeos curtos), ácidos nucleicos (por exemplo, DNA, RNA, microRNA), carboidratos, lipídios, tecidos, células ou moléculas virtualmente de qualquer e toda natureza química. Em outras palavras, qualquer material/molécula que seja conhecido como usado para fazer microarranjos para ensaios de multiplexação pode ser usado no tubo de teste alveolar desta invenção.
[0095] Um aspecto da presente invenção se refere ao monitoramento de um sinal óptico (usando as configurações de sensor das figuras 5A-5E) indicadoras da presença em uma amostra de teste de pelo menos um analito de interesse, por exemplo, uma proteína alvo (por exemplo, um anticorpo de determinada antigenicidade), uma célula alvo, um gene alvo, uma sequência de genes alvo, uma transcrição de mRNA alvo, ou um ácido nucleico alvo. Esse(s) analito(s) alvo podem ser de qualquer origem: viral, bacteriana, fúngica, parasítica (por exemplo, de um protozoário), animal, ou origem humana. Por exemplo, proteínas virais, anticorpos contra antígenos virais, ou sequência de DNA/RNA derivada de um genoma bacteriano ou viral podem ser os analitos de interesse para detecção em amostras de teste. Analitos alvo exemplificativos não limitativos podem incluir uma sequência de ácido nucleico, como microRNA, genes e mamíferos, variantes genéticas de um gene de mamífero, como vários mutantes genéticos, variantes alelíticas, ou variações epigenéticas (exibindo diferentes perfis no estafo de metilação), dentro de oncogenes, genes supressores de tumor, ou qualquer outro gene que tenha sido implicado como relevante para certas doenças e condições, podem ser o foco de detecção na aplicação do tubo de teste alveolar desta invenção. Vírus exemplificativos, cujos genes e/ou proteínas podem ser alvos de interesse, podem incluir, mas não de modo limitativo, vírus-1 (HIV-1) de imunodeficiência humana, citomegalovírus humano (CMV, vírus e hepatite C(HCV), vírus de hepatite B (HBV) Papiloma vírus humano (HPV), enterovírus, vírus de varicela-zoster, flavivírus, hepadnavírus, herpes vírus, norovírus, ortomixovírus, parvovírus, papovavírus, paramixovírus, pestivírus, picornavírus e influenza. Bactérias exemplificas cujos genes e/ou proteínas podem ser alvos de detecção são mycobacterium tuberculosis (TB), bacillus anthracis, legionela pneumophilia, litria monocytogenes, neisseria gonorrheae, chlamidia tracomatis, neisseria meningitides, xtaphylococcus aureus, helicobacter pylori, e enterococcus faecalis. Genes humanos exemplificativos de potencial interesse são p53, BRCA1 e BRCA2, Her2/Neu e outros membros da família EGFR, BCR-ABL, OTEN, RAS, Src, RB, Myc, VEGF, topoisomerase, e alelo APOE€4.
[0096] Técnicas básicas de detecção e/ou quantificação de vários analitos de interesse podem ser encontradas, por exemplo, em Sambrook e Russel, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a Ed. 2001). Kriegler, Gene Transfer and EXpression: A Laboratory Manual (1990); Ausubel ET AL., Current Protocols en Molecular Biology (1994); e Harlow & Lane, Anticorpos, A Laboratory Manual (1988).
[0097] Para o propósito de detectar a presença de uma proteína de qualquer identidade particular, podemos empregar uma variedade de ensaios de ligação baseados em finidade, como ensaios imunológicos. Em algumas modalidades, um formato de ensaio sanduíche pode ser executado pela captura de uma proteína alvo de uma amostra de teste com um anticorpo (que é imobilizado para um ponto predeterminado em um formato alveolar ou confinado dentro de uma cavidade predeterminada do alvéolo) tendo afinidade de ligação específica para o polipeptídio. A presença da proteína pode, então, ser indicada com um anticorpo secundário fixado a um rótulo detectável, como molécula geradora de fluorescência.
[0098] Para a finalidade de detecção da presença de um ácido nucleico de interesse, uma sonda, ou uma molécula contendo uma sequência de polinucleotídeos substancialmente complementar à sequência de ácido nucleico alvo e capaz de hibridização para a sequência alvo baseada nos pares de base de Watson-Crick é tipicamente usada. Novamente, a sonda pode ser imobilizada ou focada na superfície de um substrato sólido em uma localização predeterminada dentro de um padrão predeterminado sobre o substrato. Dependendo da natureza do polinucleotídeo alvo sendo detectado, por exemplo, se é de cadeia dupla ou única, uma sonda de detecção pode ser substancialmente idêntica na sequência à sequência alvo, ou substancialmente idêntica em sequência à sequência complementar da sequência alvo. Em outras palavras, a sonda é capaz de ligar-se especialmente à sequência de nucleotídeos alvo. Em alguns casos, a sonda pode conter um segmento de ligação ao nucleotídeo alvo, bem como, um segmento não de ligação, enquanto a presença do segmento não ligante não interferir com a ligação específica entre o segmento de ligação e o ácido nucleico alvo. Tipicamente, o segmento de ligação terá pelo menos 8, por vezes, pelo menos 10, 12, 15, 20, 25, 30 ou mesmo mais nucleotídeos contíguos que são complementares à cadeia da sequência de polinucleotídeos alvo, de modo a assegurar reconhecimento específico da sequência alvo. Uma sonda pode, em algumas modalidades, incluir uma metade emissora de luz para fácil detecção, por exemplo, uma molécula fluorescente ou luminescente, como fluorescina, rodamina, Texas Red, ficoertrin, hidroxicumarim, aminocumarim, azul cascade, laranja Pacífico, amarelo Pacífico, alloficocianina, TruRed, FluorX, ou um lantanídio.
[0099] Em algumas modalidades, diferentes indicadores fluorescentes são empregados para indicar a presença de sequências distintas de polinucleotídeo. Em algumas modalidades, um método de detecção baseado em ponto de efusão pode ser eficaz para detectar a presença de sequências distintas de polinucleotídeo alvo quando um indicador fluorescente comum é usado.
[00100] Além do formato de ensaio de ligação, onde a detecção de analito de interesse é feita diretamente com base na afinidade de ligação do analito ao agente analítico provido no tubo de reação, um sistema de ensaio baseado em amplificação para detecção e/ou quantificação de ácidos nucleicos de interesse oferece um largo espectro de aplicações. Neste sistema baseado em amplificação, um ou mais ácidos nucleicos de interesse é detectado e/ou quantificado pela completação de uma reação de amplificação específica da sequência. Além disso, para a finalidade de detecção de um ácido nucleico alvo por um método baseado em amplificação, múltiplos depósitos de iniciadores podem ser incluídos em cada cavidade para permitir detecção executada no formato de PCR aninhado, por exemplo, o primeiro depósito de iniciador pode definir uma porção da sequência alvo e gerar uma amplificação que permite amplificação adicional por um ou mais depósito subsequente de iniciadores.
[00101] Em algumas modalidades, o ácido nucleico de interesse é uma molécula de DNA. Amplificação específica de sequência é efetuada pela provisão de pelo menos um conjunto de iniciadores, nucleotídeos livres, e apropriada polimerase de DNA ou RNA em cada cavidade do formato alveolar e, depois, sujeitar o tubo de reação a temperaturas apropriadas e durações de tempo para se obter a síntese e amplificação de qualquer sequência de polinucleotídeos alvo.
[00102] Cada iniciador é, tipicamente, um oligonucleotídeo (que pode ser natural ou sintético) capaz de, quando da formação de um duplex com um modelo de polinucleotídeo por par de base, atuar como um ponto de iniciação de síntese de ácido nucleico e ser estendido de sua extremidade 3’ ao longo do modelo de modo que um duplex estendido seja formado. Extensão de um iniciador é normalmente executada com uma polimerase de ácido nucleico, como uma polimerase de DNA ou RNA. A sequência de nucleotídeos adicionada no processo de extensão é determinada pela sequência do polinucleotídeo de modelo. Na maioria das modalidades, iniciadores são estendidos por uma polimerase de DNA. Frequentemente, iniciadores têm um comprimento na faixa de, aproximadamente, 6 a 40 nucleotídeos, tipicamente, de cerca de 12 a cerca de 20 nucleotídeos. Iniciadores são empregados em uma variedade de reações de amplificação de ácido nucleico, por exemplo, reações de amplificação linear usando um único iniciador, ou reações em cadeia de polimerase (PCR), empregando dois ou mais iniciadores. Guia para selecionar os comprimentos e sequências de iniciadores para aplicações particulares é bem conhecido por alguém experiente na técnica, ver, por exemplo, Dieffenbach, editor, PCR Iniciador: A Laboratory Manual, 2a edição (Cold Spring Harbor Press, New York, 2002)
[00103] No contexto de uma reação de amplificação de ácido nucleico como uma PCR, o produto de amplificação de uma sequência de polinucleotídeos alvo é referida como “amplicon”. Amplicons são uma população de nucleotídeos resultante de extensão de iniciador, normalmente em forma de polinucleotídeos de cadeia dupla. Amplicons podem ser produzidos por uma variedade de reações de amplificação cujos produtos são replicados após múltiplas rodadas de amplificação de um ou mais ácidos nucleicos alvo. Geralmente, reações de amplificação produzindo amplicons são feitas por modelo no par de base de reagentes: ambos os iniciadores de nucleotídeos e oligonucleotídeos têm complementos em uma sequência de polinucleotídeos modelo ou de polinucleotídeos alvo. Essa complementaridade é necessária para a produção de produtos de reação, ou amplicons. Em alguns casos, reações por modelo são extensões de iniciador com ligações de uma polimerase de ácido nucleico ou de oligonucleotídeo com uma ligase de ácido nucleico. Essas reações incluem, mas não de modo limitativo, reação de cadeia de polimerase (PCR), reação de polimerase lineares, reação de cadeia de ligase (LER), reação de deslocamento de cadeia (DAS), amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASÇA), amplificações circulares de rolagem e similares, ver, por exemplo, Mullis et al., patentes US 4.6983.195; 4.965.188; 4.683.202; e 4.800.159 (PCR); Gelfand et al., patente US 5.210.015 (PCR em tempo real usando sondas TaqMan); Wittwer et al., patente US 6.174.670; Landegreen er al., patente US 4.988.617 (LCT); Birkenmeyer ET al., patente US 5.427.930 (vão-LCR); Kacian et al., patente US 5.399.491 (NASBA); Walker, patentes US 5.648.211 e 5.712.124 (DAS); Lizardi, patente US 5.854.033; Aono ET al., pedido de patente JP 4-262.799 (amplificação de círculo de rolagem); e similares. Em algumas modalidades, amplicons de um ou mais ácidos nucleicos alvo são produzidos por uma ou mais rodadas de PCR, por exemplo, PCR aninhada, efetuadas no tubo de reação da presente invenção.
[00104] Uma reação em cadeia de polimerase, ou PCR, e é uma reação mediada por enzima para amplificação in vitro de sequências de DNA específicas pelas múltiplas rodadas simultâneas de extensões de iniciador de cadeias complementares de DNA. Em outras palavras, uma PCR é uma reação para obtenção de múltiplas cópias ou replicados de um ácido nucleico alvo flanqueado por locais de união de iniciador, tal reação compreendendo uma ou mais repetições das seguintes etapas: (i) desnaturar o ácido nucleico alvo; (ii) temperar iniciadores para os locais de união de iniciador; e (ii) estender os iniciadores por um polimerase de ácido nucleico na presença de trifosfatos de nucleosídeo. A reação é, tipicamente, ciclada através de diferentes temperaturas otimizadas para cada uma das etapas de desnaturação, têmpera e extensão. Temperaturas, duração de tempo em cada etapa e velocidades de mudança particulares entre etapas dependem de muitos fatores bem conhecidos por alguém experiente na técnica, ver, por exemplo, Mcpherson et al., editores, PCR: A Practical Approach e PCR2: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991 e 1995, respectivamente). Por exemplo, em uma PCR convencional usando polimerase Taq DNA, um ácido nucleico alvo de cadeia dupla pode ser desnaturado a uma temperatura >90°C, iniciadores temperados a uma temperatura na faixa de 50-75°C, e iniciadores estendidos a uma temperatura na faixa de 72-78°C.
[00105] O termo “PCR” abrange formas derivadas da reação, incluindo, mas não de modo limitativo, transcrição reversa (RT)-PCR, PCR em tempo real, PCR aninhada, PCR quantitativa, PCR multiplexada e outras variações similares. Para estes vários ensaios PCR, volumes típicos de reação podem variar de nano litros, por exemplo, cerca de 0,1 a cerca de 500 nl, a microlitros, por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 5 μl, e podem ser contidos prontamente dentro de cavidades dos tubos de teste alveolares da presente invenção, permitindo, assim, uma análise rápida de multiplexação. Em algumas modalidades exemplificativos não limitativos, o volume de reação dentro de cada uma das cavidades do tubo de reação são de cerca de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6. 0.7, 0.8, 0.9. 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, e 100 nl.
[00106] Uma PCR de transcrição reversa ou RT-PCR é uma ferramenta particularmente poderosa para a detecção e análise de DNA em uma amostra. Uma RT-PCR é uma PCR precedida por uma reação de transcrição reversa quando um RNA alvo é convertido em um DNA complementar de cadeia única, que é, então, amplificada no processo de PCR regular, ver, por exemplo, Tecott et al., patente US 5.168.038.
[00107] Uma PCR em tempo real é um processo de PCR durante o qual a quantidade de produtos de reação, ou seja, amplicons, é monitorada ao mesmo tempo em que a reação prossegue. Há muitas formas de PCR em tempo real que diferem principalmente nos meios de detecção usados par monitorar o(s) produto(s) de reação, ver, por exemplo, Gelfand ET al., patente 5.210.015 (sondas TaqMan); Wittwer et al., patentes US 6.174,.670 e 6.569.627 (matrizes intercaladas); Tiagi et al., patente US 5.925.517 (guias moleculares). Químicas de detecção para PCR em tempo real são revistas em Mackay et al., Nucleic Acids Research, 30: 1292-1305 (2002).
[00108] Uma PCR aninhada é um processo de PCR que envolve pelo menos dois estágios de amplificação, onde o amplicon de uma PCR de primeiro estágio usando um primeiro conjunto de iniciadores se torna o modelo para uma PCR de segundo estágio usando um segundo conjunto de iniciadores. Pelo menos um iniciador do segundo conjunto de iniciadores tem uma sequência complementar e pode ser hibridizada à sequência de polinucleotídeo alvo em um local entre os locais de hibridização dos dois iniciadores do primeiro conjunto, ou seja, um local dentro da sequência do amplicon da PCR de primeiro estágio
[00109] Uma PCR multiplexada é um processo de PCR no qual amplificação de múltiplas sequências de polinucleotídeos é simultaneamente executada na mesma mistura de reação, ver, por exemplo, Bernard ET al., Anal. Biochem., 273:221-228 (1999) (PCR em tempo real de duas cores). O formato de ensaio de PCR da presente invenção é adequado para a execução de PCR multiplexada. Um conjunto distinto de iniciadores é contido em cavidade destinada à amplificação e detecção de uma sequência distinta de polinucleotídeo alvo. Tipicamente, há várias cavidades repetidas contendo os mesmos iniciadores que cavidades duplicadas no arranjo alveolar de cavidades. Por exemplo, em uma modalidade exemplificativo não limitativo, todo um arranjo de cavidade alveolar pode incluir diferentes misturas de reação pré-efetuadas, cada uma contendo um conjunto distinto de iniciador selecionado de um total de até 8, 16, 25, 50 ou mesmo 1000 diferentes conjuntos de iniciadores, com um grupo de 8 cavidades replicadas provido para cada mistura de reação contendo um distinto conjunto de iniciadores.
[00110] Uma PCR quantitativa é um processo de PCR que permite alguém medir a abundância de uma ou mais sequências alvo específicas em uma amostra. PCRs quantitativas podem envolver a medição tanto de quantificação absoluta, quanto quantificação relativa das sequências alvo. Medições quantitativas são feitas com uso de uma ou mais das sequências de referência que podem ser ensaiadas separadamente ou em conjunto com uma sequência alvo. A sequência de referência pode ser endógena (de existência natural) ou exógena (adicionada artificialmente) uma amostra e, neste último caso, pode compreender um ou mais gabaritos competidores. Sequências endógenas típicas de referência incluem segmentos de transcritos dos seguintes genes: β-actina, GAPDH, β2-microglobulina, RNA ribossômico, e similar. Técnicas para PCR quantitativa são bem conhecias por alguém experiente na técnica, ver, por exemplo, Freeman et al., Biotechniques, 26: 112-126 (1999); Becker-Andre et al., Nucleic Acids Research, 17: 9437-9447 (1989); Zimmerman et al., Biotechniques, 21: 268-279 (1996); Diviacco et al., Gene, 122: 3013-3020 (1992); Becker-Andre et al., Nucleic Acids Research, 17: 9437-9446 (1989).
[00111] Uma reação de amplificação pode ser uma amplificação em tempo real quando um mecanismo de detecção está presente permitindo um produto de reação ser medido ao esmo tempo que a reação de amplificação progride, por exemplo, PCR em tempo real descrita acima, ou NASBA em tempo real como descrita, por exemplo, em Leone et al., Nucleic Acids Research, 26: 2150-2155 (1998) Como usado aqui, o termo “Amplificar” significa efetuar uma reação de amplificação. Uma “mistura de reação” é uma solução (ou uma versão liofilizada dessa solução) contendo todos os reagentes necessários para efetuar a reação, que podem incluir, mas não de modo limitativo, agentes de tamponamento, sais, cofatores, recuperadores etc. Em algumas modalidades, um reagente seco é depositado em uma cavidade do tubo de reação durante o processo de fabricação. Em algumas modalidades, o reagente segundo componente contém pelo menos um conjunto de iniciadores para amplificação de uma ou mais sequências de polinucleotídeo alvo, trifosfatos de nucleosídeo, enzima(s), e/ou um meio de detecção que indica a presença e/ou quantidade de um ou mais amplicons. Em algumas modalidades, o meio de detecção é um indicador fluorescente. Detecção ou quantificação de amplicons em uma PCR em tempo real envolve, frequentemente, o uso de sonda de transferência de energia de ressonância de fluorescência, ou uma sonda FRET, como uma sonda TaqMan, uma sonda guia Molecular, ou uma sonda Scorpion.
[00112] Como usado aqui, um indicador fluorescente é uma molécula (por exemplo, um corante, ou uma sonda) capaz de gerar um sinal fluorescente na presença de um produto ou produtos de uma reação de amplificação (ou seja, um amplicon) de modo que, à medida que o amplicon se acumula na mistura de reação, o sinal do indicador fluorescente aumente, pelo menos acima de uma faixa predeterminada de concentrações de amplicon.
[00113] Vários tipos de indicadores fluorescentes podem ser usados nas reações de amplificação efetuadas nos tubos alveolares desta invenção: primeiro, um corante fluorescente pode ser usado. Corantes adequados desta classe não são específicos em relação à sequência de polinucleotídeos do amplicon, como corantes intercalados que se unem a produtos de DNA de cadeia dupla, por exemplo, brometo de etídio, SYBR Green I e II, SYBR Gold, YO (oxazol amarelo), TO (tiazol laranja), e PG (PicoGreen), ver, por exemplo, Ishiguro et al., Anal.Biochem., 229:207-213 (1995); Tseng et al., Anal.Biochem., 245: 207-212 (1997); Morrison ET al., Biotechniques, 24:954-962 (1998). Indicadores fluorescentes adicionais adequados para uso com a invenção são bem conhecidos por alguém experiente na técnica.
[00114] Segundo, em alguns casos, um ou mais iniciadores podem ser projetados para ter uma estrutura de grampo de cabelo com uma molécula fluorescente contida na proximidade de um repressor fluorescente, de modo que a fluorescência seja extinta pelo repressor até que a estrutura de grampo de cabelo seja forçada a se dividir pela extensão de iniciador, ver, por exemplo, Whitecombe et al., Nature Bioyechnology, 17: 804-807 (1999). (Amplifluor™ iniciadores). Moléculas fluorescentes adequadas incluem aquelas mencionadas em uma seção anterior.
[00115] Terceiro, indicadores fluorescentes podem também ser específicos para a sequência de polinucleotídeos de um ácido nucleico alvo. Muitas vezes referidos como sondas fluorescentes, estes tipos de indicadores normalmente compreendem um meio fluorescente na proximidade de um supressor fluorescente até que um meio de oligonucleotídeo ao qual eles são fixados especificamente seja ligado a um produto de amplificação, ver, por exemplo, Gelfand ET al., patente US 5.210.015 (sondas TaqMan); Nazarenko ET al., Nucleic Acids Research, 25: 2516-2521 (1997) (sondas Scorpion); Tyagi ET al., Nature Biotechnology, 16: 49-53 (1998) (guias moleculares). Indicadores fluorescentes podem ser suados em conexão com PCR de tempo real, ou podem ser suados para medir a quantidade total de produto de reação na completação de uma reação. Para uma revista a vários guias moleculares e outras sondas de grampo de cabelo, ver Broude, Encyclopedia of Diagnostic Genomics and Proeomics, 2005, páginas 846-851.
[00116] Tipicamente, para cada reação efetuada nos tubos alveolares desta invenção, a despeito de sua natureza de ser baseada em afinidade de união ou baseada em amplificação, haverá pelo menos um controle positivo e pelo menos um controle negativo, de modo que estes controles produzam confirmação de uma reação bem-sucedida: qualquer sinal positivo detectado não será devido a uma contaminação de todo o sistema, e qualquer sinal negativo detectado não será devido a falha do sistema e ensaio. Em algumas modalidades, um padrão interno pode ser incluído. Um padrão interno é uma molécula conhecida que participa da mesma reação, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é amplificada na mesma reação de amplificação que o polinucleotídeo alvo, de modo a permitir quantificação (relativa ou absoluta) do analito alvo em uma amostra. Um padrão interno pode ser endógeno, ou seja, conhecido como pré-existentes em uma amostra, ou exógeno, ou seja, adicionado antes do teste.
[00117] Devido a ensaios de multiplexação efetuados nos tubos alveolares desta invenção serem, tipicamente, executados, aproximadamente, nas mesmas condições e, aproximadamente, ao mesmo tempo, os agentes analíticos localizados sobre cada marca ou dentro de cada cavidade do tubo de reação têm que ser cuidadosamente projetados para obter resultados de reação ótimos ou quase ótimos sob um conjunto de parâmetros de reação predeterminado. Em um exemplo, 8 diferentes sondas de polinucleotídeo são marcadas ou imobilizadas sobre uma superfície de substrato para detectar 8 distintos ácidos nucleicos alvo em uma amostra em virtude de hibridização baseada em complementaridade de sequência. Faz parte do conhecimento de alguém experiente na técnica projetar e otimizar cada sequência de sonda alvo para que fiquem dentro de parâmetros predeterminados de reação para um determinado ensaio. No projeto e otimização de uma sonda, parâmetros não limitativos incluem comprimento de sonda, localização relativa dentro de uma sequência alvo, e teor de GC que resultam em hibridização específica entre a sonda e seu alvo sob as dadas condições de reação para um determinado ensaio.
[00118] Em outro exemplo, 8 conjuntos de diferentes misturas de reação destinadas à amplificação de 8 diferentes sequências de polinucleotídeo alvo são arranjadas em um formato de 4 excertos, cada excerto contendo 8 pontos replicados de cada mistura de reação. Cada um destes 8 conjuntos de diferentes misturas de reação contém um conjunto de iniciadores de oligonucleotídeo para amplificação de uma distinta sequência alvo. Estes 8 conjuntos de iniciadores podem ser projetados de modo que as etapas de desnaturação, têmpera e extensão possam todas ser completadas adequadamente para 8 diferentes sequências alvo, sob as mesmas temperaturas e durante o mesmo quadro de tempo.
[00119] Alguém experiente na técnica será capaz de realizar o necessário projeto pelo ajuste do comprimento, teores de GC das sondas ou iniciadores. Em alguns casos, a substituição de nucleotídeos de ocorrência natural por nucleotídeos modificados ou artificiais é eficaz para afinação adicional do comportamento de têmpera/desnaturação da sonda e iniciadores. Ver, por exemplo, Leconte et al., J AM Chem Soc., 2008: 130(7): 2336-2343, U.S. Pat. No. 8,268,978. Alguns análogos conhecidos contêm 1-metiladenina, 1-metilinosina, 1-metilpseudouracil, 1-metilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 2-tiocitosina, 2-tiocitosina, 2-tiouracil, 2,2-dimetilguanina, 2,6-diaminopurina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, 3-metilcitosina, 4-acetilcitosina, 4-tiouracil, 5-bromouracil, 5- carboximetilaminometil-2-tiouracil, 5-(carboxihidroxilmetil) uracil, 5-carboximetilaminometiluracil, 5-fluorouracil, 5-metilcitosina, 5-metoxiuracil, 5-metilaminometiluracil, 5-metil-2-tiouracil, 5-metiluracil, 5'-metoxicarbonilmetiluracil, 5-metoxiaminometil-2-tiouracil, 7-metilguanina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, beta-D-manosilqueosina, dihidrouracil, inosina, N6-isopenteniladenina, N6-metiladenina, N- uracil-5-ácido oxiacético metilester, oxibutoxosina, pseudoisociosina, pseudouracil, pseudouracil, queosina, uracil-5-ácido oxiacético, uracil-5-ácido oxiacético metilester, e uracil-5- ácido oxiacético etc. Muitos análogos de nucleotídeo são comercialmente disponibilizados por fornecedores como Sigma and Applied Biosystems.
[00120] A figura 6 mostra um cartucho de controle e processamento de fluido 10 incluindo um alojamento 12 tendo uma pluralidade de câmaras 13. Um dispositivo de controle de fluido localizado internamente (não mostrado) e o tubo de reação 100 são conectados a diferentes porções do alojamento 12. O cartucho provê o tubo de reação com fluido de amostra e outros fluidos conforme necessário, por acoplar-se fluidicamente com a interface fluídica 108. Tipicamente, o cartucho compreendendo o tubo de reação é usado em um sistema GENEXpert®, por Cepheid® de Sunnyvale, Califórnia, USA. Em algumas modalidades o cartucho compreendendo um tubo de reação é usado em um ou mais módulos de um sistema heterogêneo, conforme descrito no pedido de patente US 61/639.820, aqui incorporado pela referência e anexado como parte do Apêndice A. Detalhes adicionais do sistema 10 e métodos de uso estão descritos nas patentes US 8,048,386, 8,187,557, 8,119,352, e U.S. Pub.. 2008-0038737, todos aqui incorporados pela referência, e anexados como Apêndice A.
[00121] Os exemplos são providos apenas como ilustração e não como limitação. Alguém experiente na técnica reconhecerá prontamente uma variedade de parâmetros não críticos que poderia ser mudada ou modificada para fornecer essencialmente os mesmos resultados ou similares.
[00122] Um formato de 8 sondas, 8 replicados, 4 excertos foi estabelecido nesta análise de polimorfismo de nucleotídeo único usando um tubo de reação de cartucho GeneXpert. Especificamente, todo o arranjo de sonda consistia de 4 excertos de 8 x 8 pontos predeterminados sobre a superfície de um substrato sólido, que era o fino filme envolvendo um lado do quadro do tubo de reação. Em cada excerto, cada uma das 8 sondas de oligonucleotídeo de distintas sequências de nucleotídeos foi depositada (256 pontos totais no tubo, 100 μm de diâmetro por ponto, densidade de ponto de 50 μM e volume de ponto de 0,5 nl) e imobilizada a um grupo de 8 pontos pré-selecionados, resultando em 8 pontos replicados para cada sonda distinta.
[00123] Cada uma das 8 sondas de oligonucleotídeo foi projetada, em sua sequência de nucleotídeos, de modo a hibridizar com uma versão da sequência de K-Ras apenas. Neste estudo particular, 1 sonda foi projetada para se hibridizar com a sequência K-Ras de tipo natural (WT) circundando códons 12 e 13; 1 sonda para se hibridizar com o mutante 12Asp; 1 sonda para se hibridizar com o mutante 12Arg; 1 sonda para se hibridizar com o mutante 12Ala; e 1 sonda para se hibridizar com o mutante 13Asp. O arranjo de 8 sondas sobre a superfície de substrato está mostrado na figura 7, e as sequências de sondas estão providas na Tabela 1. A Tabela 2 provê as temperaturas de fusão das sondas Tabela 1: Sequência de sondas K-RAS
Tabela 2: Sondas KRAS Tm (VisualOmp) 
[00124] Para imobilizar as sondas sobre a superfície do substrato, a superfície foi, primeiro, limpa por um processo de hidroxilação, de modo que a energia superficial não fosse menor do que 38 dina/cm a um ângulo de contato de cerca de 60 graus e que a reatividade e umectabilidade superficial fosse melhorada para funcionalização subsequente.
[00125] O processo de funcionalização envolveu introduzir um grupo de glicídios (epóxi) na superfície do substrato usando glicidoxipropiltrimetoxisilano como um precursor. Durante o processo de identificação, uma ligação covalente foi estabelecida entre o grupo funcional e a sonda de oligonucleotídeo em sua ponta 3’.
[00126] Após a funcionalização do substrato de filme fino e identificação da sonda, o tubo de reação contendo o arranjo de sondas identificadas foi vedado pela colocação de um segundo filme fino sobre o lado oposto do quadro em relação ao substrato sólido funcionalizado. O tubo de reação vedado contendo o formato de 8 sondas, como mostrado na figura 7, foi, então carregado com uma mostra de fluido, submergindo completamente todas as marcas sobre a superfície de substrato. A análise do códon 12/13 SNP da sequência K-Ras presente na amostra começou com uma reação de amplificação assimétrica TaqMan, que envolveu um iniciador de avanço rotulado com CF4 e um iniciador reverso sem rótulo, que deveria hibridizar com a sequência K-Ras para cobrir a região SNP. Foram incluídas ainda na mistura de reação: (1) uma sonda TaqMan rotulada com CF5 e compreendendo uma sequência correspondente a um segmento da sequência K-Ras entre os iniciadores de avanço e reverso para a finalidade de indicar progresso de PCR; e (2) uma sonda BlockMelt sem rótulo para a finalidade de suprimir amplicons WT.
[00127] Neste estudo particular, foi provido aquecimento/resfriamento sobre um lado da câmara de reação para o processo PCR e o subsequente processo de hibridização. Iniciador de avanço (5’ CF4) foi usado a concentrações de 1.000 nM. Iniciador reverso foi usado à concentração de 100 nM. Sonda TaqMan (5’CF5) foi usada à concentração de 50 nM. A sonda de bloqueio WT +/- K-Ras, sem rótulo, foi usada à concentração de 100 nM. Após uma PCR de 60 ciclos, a temperatura da câmara de reação foi ajustada em, aproximadamente, 54°C para sonda-hibridização de amplicon por 1 a 2 horas em tampão de eluição de PCR (Tris Buffer pH8). A câmara de reação foi, então, lavada pelo menos uma vez e até 5 vezes com tampão de lavagem (Tube Wash Arraylt “Wash Buffer 2”) para remover sinal de CF4 residual não específico.
[00128] Três amostras diferentes foram analisadas: a linha de célula WT K-Ras (homozigótica normal). A figura 8 mostra a curva de sinal fluorescente durante PCR de 60 ciclos. AS figuras 9A-9C mostram resultados projetados de amostras de células WT, mutantes 13 Asp heterozigóticos e mutantes 13 ASP homozigóticos. As figuras 10A-C mostram resultados atuais das amostras. Uma vista global de todo o padrão de identificação de sonda está mostrada na figura 11. A figura 12 mostra uma vista global de todo o padrão de identificação de sonda como visualizado sob um microscópio integrado em seguida à excitação.
[00129] Um tubo de reação 100 usado neste estudo foi criado por moldagem por injeção. A parte é moldada com um substrato de cavidade de suporte 120 na área de PCR. Nanocavidades foram criadas pelo Laser excímero perfurando a 193 nm. A dimensão dos nanocavidades usados neste estudo é de 150 μm de diâmetro e de cerca de 150 μm de profundidade, com distância de passo de 250 μm. Estas cavidades são furos cegos e podem conter até 2,6 nl.
[00130] Como mostrado nas figuras 3A, corante verde de alimento foi, então, impresso pelo uso de NanoPrint® por Arraylt® com o pino de micro marcação (modelo #946MP3 com 100 μm de diâmetro na ponta do pino). Cada gota proveniente do pino tem um volume de 0,7 nl. NanoPrint® é uma impressora de micro arranjo comercializada por Arraylt®, e programável para diferentes distâncias de passo, e despachando a quantidade de líquido a multiplex de 0,7 nl quando usando 946MP3. Há uma variedade de pinos à escolha. O menor pino de micro marcação pode despachar apenas 0,35 nl por gota. No caso presente, o corante alimentar verde pode ter iniciador diferente ajustado para ácido nucleico alvo particular a ser amplificado durante o processo PCR. Após marcação, um processo de congelamento seco ou liofilização poderia ser realizado para fins de armazenamento.
[00131] O tubo de reação (100) usado neste Exemplo (e no Exemplo 4) foi construído de polipropileno. O tubo de reação 100 é moldado com um substrato de cavidade de suporte 120 na área de PCR. Uma pluralidade de nanocavidades foi criada usando Laser excímero a 123 nm de comprimento de onda. A dimensão das nanocavidades usadas neste exemplo é de 150 μm de diâmetro e de cerca de 250 μm de profundidade, com distância de passo de 250 μm. Estas cavidades são furos traspassantes e podem conter até 4,4 nano litros. O tubo de reação 100 foi, então vedado pelo filme de polipropileno em ambos os lados do tubo. Cada cavidade individual não foi vedada, mas toda a área em losango (25 μl de área) para PCR foi vedada. O tubo de reação 100 foi acoplado ao cartucho 10 mostrado na figura 6.
[00132] Um tampão de PCR (50 mM TRis, pH8,6) foi misturado primeiro com surfactante (0,1% de Tween) para realçar a umectação sobre a superfície de polipropileno devido à hidrofobilidade do polipropileno. Uma pequena quantidade de corante alimentar amarelo foi pingada no tampão de PCR para facilitar visualização. Este tampão de PCR foi então adicionado a uma das câmaras 13 no cartucho 10 mostrado na figura 6. Óleo mineral (CAS#8042-47-5) foi adicionado em outra câmara. Um sistema GeneXpert®, disponibilizado comercialmente por Cefheid®, foi usado para controlar o cartucho 10 no direcionamento de um carregamento líquido do tubo de reação 100.
[00133] O sistema GeneXpert® foi programado para despachar o tampão de PCR através do canal de fluido para a câmara de cavidade 118 a uma taxa de 1 μl/s. P tampão de PCR encheu cada nanocavidade na câmara de cavidade 118 e seu excesso saiu via o canal de fluido de topo. Após a câmara de PCR do tubo de reação 100 ter sido carregada, o tampão de PCR no tubo 100 foi, então, drenado a uma taxa de 5 μl/s, do fundo da câmara de cavidade para o canal d fluido. O tampão foi extraído do canal de fluido de topo de volta para a passagem de entrada 128 (canal de fluido mais baixo). Após a drenagem, o tampão de PCR permaneceu em cada nanocavidade individual, via forças capilares. A despeito do procedimento de drenagem, o tampão de PCR em cada nanocavidade não escapou para fora. Após o tampão de PCR ter sido completamente drenado via a passagem de entrada 128, óleo mineral foi introduzido na câmara de cavidade 118 a 1 μl/s. O vão entre o filme de vedação e o substrato de polipropileno com nanocavidades foi enchido pelo óleo mineral, como mostrado na figura 4E.
[00134] Usando o mesmo tubo de reação 100 como no Exemplo 3, as nanocavidades foram enchidas com tampão de PCR usando o método de deumectação descontínua explicado na Exemplo 3. Entretanto, após a nanocavidade ter sido carregada pelo tampão de PCR, óleo mineral foi introduzido na câmara de cavidade 118 do tubo de reação para continuar a carregar a câmara de PCR a 5 μl/s pela passagem de entrada 128 (em vez de drenar o tampão de PCR como no Exemplo 3). Óleo mineral deslocou o tampão de PCR na câmara de cavidade 119 (ou seja, entre o substrato de polipropileno e o filme de vedação de topo) Este método é referido como “umectação contínua” devido a dois líquidos umectarem continuamente a superfície. O primeiro líquido (tampão de PCR) umecta a superfície e enche os nanocavidades. O segundo líquido (óleo mineral) umecta continuamente a superfície, mas não enche cada nanocavidade - devido à tensão superficial e força capilar manter o primeiro líquido aquoso na nanocavidade.
[00135] Ambos os métodos usados nos Exemplos 3 e 4 introduziram com sucesso o desejado tampão de PCR no nanocavidade e usaram o óleo mineral para isolar o tampão de PCR em cada nanocavidade individual. A capa de óleo mineral tem a vantagem adicional de impedir que o líquido aquoso no nanocavidade evapore durante o processo de ciclagem termal. Todas as patentes, pedidos de patentes, e outras publicações, incluindo GenBank Accession Numbers, citados neste pedido são incorporados pela referência em sua integralidade e para todos os fins.
Claims (29)
1. Tubo de reação (100), caracterizado pelo fato de compreender: uma armação planar (102) que define um trajeto fluídico (114) entre um primeiro substrato planar (104) e um segundo substrato planar (106); e uma interface fluídica (108) em uma extremidade da armação planar (102), a interface fluídica (108) compreendendo uma entrada fluídica (110) e uma saída fluídica (112) do trajeto fluídico (114) , em que a entrada fluídica (110) e a saída fluídica (112) são fornecidas em locais diferentes ao longo da mesma borda da armação planar (102); em que o trajeto fluídico (114) inclui ainda uma câmara de cavidade (118) definida na armação planar (102) entre o primeiro e o segundo substrato, a câmara de cavidade (118) incluindo um substrato de cavidade (120) definindo uma pluralidade de cavidades dispostas em um padrão e abertas para a câmara de cavidade (118), a câmara de cavidade (118) em comunicação fluídica entre a entrada fluídica (110) e a saída fluídica (112), em que a interface fluídica (108) é configurada para acoplar mecanicamente e fluidicamente com um recipiente de amostra contendo uma amostra fluida de modo que o tubo de reação (100) é apoiado com o primeiro e segundo substratos planares verticalmente orientados de modo que a saída fluídica (112) está acima da entrada fluídica (110), e em que o trajeto fluídico (114) é configurado de modo que, com o trajeto fluídico (114) fluidicamente conectado ao recipiente de amostra através da interface fluídica (108) e a armação planar (102) sendo verticalmente orientada, a câmara de cavidade (118) é preenchida com uma amostra fluida ou a amostra fluida é evacuada da câmara de cavidade (118).
2. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o trajeto fluídico (114) inclui uma câmara de pré-amplificação (116) arranjada na armação planar (102) entre o primeiro e o segundo substratos planares.
3. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a câmara de pré-amplificação (116) inclui uma saída da câmara (122) em comunicação fluídica com uma entrada da câmara de cavidade (124).
4. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a saída da câmara de pré-amplificação (122) é separada da entrada da câmara de cavidade (124) por uma passagem.
5. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a saída da câmara de pré-amplificação (122) é posicionada em uma porção mais superior da câmara de pré-amplificação (116) quando o primeiro e segundo substratos planares são orientados verticalmente com a saída fluídica (122) posicionada acima da entrada fluídica (110).
6. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a entrada câmara de cavidade (124) é posicionada em uma porção mais inferior da câmara de cavidade (118) com a saída fluídica (112) posicionada acima da entrada fluídica (110).
7. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a entrada da câmara de cavidade (124) é posicionada abaixo da câmara de pré-amplificação (116) com a saída fluídica (112) posicionada acima da entrada fluídica (110).
8. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a passagem se inclina para baixo da saída da câmara de pré-amplificação (122) para a entrada da câmara de cavidade (124) com a saída fluídica (112) posicionada acima da entrada fluídica (110).
9. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o trajeto fluídico (114) compreende um canal de serpentina.
10. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o trajeto fluídico (114) é sem válvula.
11. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato de cavidade (118) compreende 100 a 1000 nanocavidades.
12. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato de cavidade (118) compreende uma pluralidade de cavidades que têm uma profundidade de 100 a 500 μm.
13. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato de cavidade (118) compreende uma pluralidade de cavidades tendo um diâmetro de 50 a 500 μm.
14. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato de cavidade (118) compreende uma pluralidade de cavidades de 0,8 nl.
15. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma porção da armação planar (102) define uma câmara de óleo que retém uma substância hidrofóbica, em que a câmara de óleo está em comunicação fluídica com a câmara de cavidade (118) e configurada de modo que o fluxo pressurizado ao longo do caminho fluídico (114) fornece a substância hidrofóbica para a câmara de cavidade (118) a partir da câmara de óleo.
16. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a câmara de óleo está em comunicação fluídica com a câmara de cavidade (118).
17. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a armação planar (102) compreende uma estrutura de suporte que se estende a partir de uma porção de base.
18. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que as primeira e segunda superfícies planares compreendem primeira e segunda películas que fluidicamente vedam a estrutura de suporte.
19. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a armação planar (102) é fluidicamente conectada a um recipiente da amostra via a interface fluídica (108).
20. Tubo de reação (100) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato de cavidade (118) compreende um material de níquel.
21. Método para preencher um tubo de reação (100) como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir um fluido de amostra para uma entrada fluido de uma interface fluídica (108) do tubo de reação (100) e avançar a amostra fluida ao longo de um trajeto fluídico (114) através da aplicação de pressão na interface fluídica (108), em que o tubo de reação (100) compreende uma armação planar (102) que define um trajeto fluídico (114) entre um primeiro substrato planar (104) e um segundo substrato planar (106) e estendendo entre primeira e segunda extremidades opostas do tubo de reação (100), a interface fluídica (108) compreendendo a entrada de fluido e a saída de fluido do trajeto fluídico (114), cada uma sendo disposta ao longo da primeira extremidade do tubo de reação (100); preencher uma câmara de cavidade (118) ao longo do trajeto fluídico (114) com a amostra fluida através do avanço adicional da amostra fluida ao longo do trajeto fluídico (114) de modo que uma pluralidade de cavidades da câmara de cavidade (118) seja pelo menos parcialmente preenchida com a amostra fluida; e evacuar o excesso de amostra fluida da câmara de cavidade (118) através da aplicação de pressão na interface fluídica (108) de modo que a pluralidade de cavidades permanece umidificada com, pelo menos, alguma amostra fluida.
22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente encher uma câmara de pré- amplificação (116) do trajeto fluídico (114) com o fluido de amostra.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a câmara de pré-amplificação (116) inclui uma saída mais superior da câmara de pré-amplificação (116), e que a câmara de pré- amplificação (116) é enchida a um nível abaixo da saída de pré-amplificação.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a saída da câmara de pré-amplificação (122) é conectada de maneira fluida à entrada da câmara de cavidade (124) via uma passagem de condução para baixo.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o trajeto fluídico (114) é sem válvula.
26. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente encher a câmara de cavidade (118) evacuada com uma substância hidrofóbica.
27. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a substância hidrofóbica é fornecida a partir de uma câmara de óleo da armação planar (102) que está em comunicação fluida com a câmara de cavidade (118).
28. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o fluido de amostra é encaminhado ao longo do trajeto fluídico (114) em uma maneira de serpentina.
29. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente aplicar ciclos de aquecimento e resfriamento às primeira e segunda superfícies planares.
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| B06U | Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette] | ||
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