JP6718956B2 - 液体循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ - Google Patents
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Description
1.低い増幅効率:
(a)変性効率:図1aに示すように、鋳型又はアンプリコンの有効な変性は、鋳型又はアンプリコンが鋳型又はアンプリコンに必要とされる変性温度よりも温度が低くない領域D1を通過する時に起こり得るが、一方、鋳型又はアンプリコンが領域D1よりも高く位置する領域D2を通過する時には、有効な変性反応が起こり得ず、全体的に低い変性効率となる。
(b)アニーリング効率:図1aに示すように、有効なアニーリング反応は、一本鎖鋳型及びプライマーが、鋳型及びプライマーに必要とされるアニーリング温度よりも温度が高くない領域A1を通過する時に起こり得るが、一方、一本鎖鋳型及びプライマーが、領域A1よりも低く位置する領域A2を通過する時には、有効なアニーリング反応が起こり得ず、全体的に低いアニーリング効率となる。
2.増幅の低い特異性:
対流PCRでは、一定温度でのアニーリングのための場所及び時間がないため、温度場及び流動場を制御することによって、反応チューブの上端の温度が通常プライマーのアニーリング温度よりも低くなるように制御され、プライマーの十分なアニーリングを確実にする。しかし、一本鎖鋳型及び(又は)プライマーが、循環において温度が低すぎる領域を通過する時、アニーリング反応の特異性は低下し、1つのプライマー内若しくは2つのプライマー間、又はプライマーと鋳型(若しくはアンプリコン)の間の非特異的対形成が容易に形成され得、伸長反応が開始すると非特異的増幅産物が形成される。
3.それぞれのチューブにおいて平行する増幅反応間の差が存在し得る:
(a)反応の終点における定性的検出に関して、結果は主に増幅効率及び産物構成における差を示す。変性後、上述の2点目に記載したように非特異的増幅産物は、次の回の非特異的増幅において鋳型となり、非特異的増幅は継続的に拡大し、プライマー、酵素、dNTP、及び他の反応成分の利用を正しい増幅と競合するようになり、正しい増幅の阻害及び反応効率の低下をもたらす。しかし、この非特異的反応が起こるかどうか又はいつ起こるかは分からず、この反応の発生率は制御されず、すなわちそのような非特異的増幅が起こる反応チューブ間での増幅効率に関して不一致を引き起こす一定のランダム性がある。非特異的増幅が早い時点で起こる又は発生率が高い反応チューブでは、非特異的増幅が遅い時点で起こる又は発生率が低い反応チューブよりも反応効率が低い。上述の2つの反応チューブでは、非特異的増幅が起きていない反応チューブよりも反応効率が両方とも低い。同様に、非特異的増幅が早い時点で起こる又は発生率が高い反応チューブでは非特異的産物の割合が高く、非特異的増幅が遅い時点で起こる又は発生率が低い反応チューブでは非特異的産物の割合が低いが、一方、非特異的増幅が起きていない反応チューブでは、チューブ内の産物は全て正しい増幅産物である。
(b)リアルタイム定量検出に関して、結果は主に単位時間当たりの増幅効率における差を示す。すなわち、リアルタイム定量検出を行うことができない。1点目及び2点目に上述したように、対流PCR反応が開始する時、二本鎖鋳型が変性に有効な領域を通過できるか、又は一本鎖鋳型及びプライマーがアニーリングに有効な領域を通過できるか、及びアニーリング反応の間に非特異的反応が起こるかは分からない。したがって、反応の開始時に、産物構成における差が異なるチューブ間で生じ得る。これらの差は上記3(a)に記載した問題をもたらし得るだけでなく、単位時間当たりの異なる反応チューブにおける産物(鋳型)の量の差ももたらし、さらに増幅の対数期に入る時点での差をもたらし、したがって鋳型の定量は従来のリアルタイムモニタリング法によって行うことができない。
1)核酸増幅反応のための試薬を本発明の第一の態様のいずれか1つに記載の反応チューブに注入するステップ、
2)振動、遠心分離、又は他の方法によって、試薬を核酸増幅領域に充填し、任意選択により、試薬の表面を不揮発性物質(例えばパラフィン油又は低融点ワックス)によって覆う又はチューブカバーで反応チューブを閉じるステップ、
3)温度制御装置によって反応チューブの特定の部位において熱を供給又は除去し、RNA逆転写及び/又はDNA増幅反応を完了するステップ、
4)任意選択により、核酸増幅の間又は後に増幅産物を検出するステップ
を含む。
本願の発明は以下に関するが、それに限定されない。
[発明1]
一端が閉じたチューブ本体(1)を含む核酸増幅用の反応チューブであって、前記チューブ本体(1)が、貯留領域(4)及び貯留領域の下に位置する核酸増幅領域(3)を含み、インサート(2)が、インサート(2)の上に残される上部空間とインサート(2)の下に残される下部空間とを備える前記核酸増幅領域(3)に配置される、反応チューブ。
[発明2]
試薬が反応チューブに注入されると、インサート(2)の物理的障壁効果により、試薬が内力又は外力下で反応チューブ内の上部空間及び下部空間を通る循環路に沿って動くことができる、発明1に記載の反応チューブ。
[発明3]
インサート(2)がチューブ本体(1)の中心軸に沿って提供され、インサートの両側(a、b)が核酸増幅領域(3)の内壁に接続され、
好ましくはインサート(2)が、チューブ本体(1)の中心軸に沿って核酸増幅領域を第一領域(3−1)と第二領域(3−2)に分け、第一領域(3−1)及び第二領域(3−2)が核酸増幅領域の上部領域(3−A)及び下部領域(3−B)を介して接続されている、
発明1に記載の反応チューブ。
[発明4]
発明1〜3のいずれか一項に記載の反応チューブであって、インサート(2)の下端(d)とチューブ本体の底部の間の距離が0mmよりも大きく(例えば1mm以上)、核酸増幅領域(3)の高さの1/2より小さく、
好ましくはインサート(2)の下端(d)とチューブ本体の底部の間の距離が0mmよりも大きく(例えば1mm以上)、核酸増幅領域(3)の高さの1/3より小さく、
さらに好ましくはインサート(2)の下端(d)とチューブ本体の底部の間の距離が0mmよりも大きく(例えば1mm以上)、4mm以下である、
反応チューブ。
[発明5]
発明1〜3のいずれか一項に記載の反応チューブであって、インサート(2)の上端(c)と核酸増幅領域(3)の最上部の間の距離が0mmよりも大きく(例えば1mm以上)、核酸増幅領域(3)の高さの1/2より小さく、
好ましくはインサート(2)の上端(c)と核酸増幅領域(3)の最上部の間の距離が0mmより大きく(例えば1mm以上)、核酸増幅領域(3)の高さの1/3より小さく、
さらに好ましくはインサート(2)の上端(c)と核酸増幅領域(3)の最上部の間の距離が0mmより大きく(例えば1mm以上)、3mm以下である、
反応チューブ。
[発明6]
チューブ本体(1)の底部がチューブ本体(1)と組み合う底栓(1−1)によって閉じられる、発明1〜3のいずれか一項に記載の反応チューブ。
[発明7]
チューブ本体(1)がそれと組み合うチューブカバーをさらに含む、発明1〜3のいずれか一項に記載の反応チューブ。
[発明8]
発明1〜7のいずれか一項に記載の反応チューブであって、核酸増幅領域(3)が3〜12の高さ/内径比を有し、
好ましくは核酸増幅領域(3)が6〜9の高さ/内径比を有する、
反応チューブ。
[発明9]
発明1〜7のいずれか一項に記載の反応チューブであって、核酸増幅領域(3)が30〜200μlの容積を有し、
好ましくは核酸増幅領域が40〜150μlの容積を有する、
反応チューブ。
[発明10]
チューブ本体(1)及びインサート(2)が耐熱材料製であり、例えば、耐熱材料が、ガラス、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホン、及びポリスルホンから選択される、発明1〜9のいずれか一項に記載の反応チューブ。
[発明11]
発明1〜10のいずれか一項に記載の反応チューブ、及び熱を供給又は除去することができる1つ以上の温度制御装置を含み、前記温度制御装置が反応チューブの外側又は内側に配置される、核酸増幅用の反応器具。
[発明12]
発明1〜10のいずれか一項に記載の反応チューブを含むキット。
[発明13]
発明1〜10のいずれか一項に記載の反応チューブ又は発明11に記載の反応器具を使用するステップを含む、試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、
好ましくは核酸がDNA又はRNAであり、
好ましくは増幅がPCR反応又は逆転写反応である、
方法。
[発明14]
1)核酸増幅反応のための試薬を発明1〜10のいずれか一項に記載の反応チューブに注入するステップ、
2)振動、遠心分離、又は他の方法によって、試薬を核酸増幅領域(3)に充填し、任意選択により、試薬の表面を不揮発性物質(例えばパラフィン油又は低融点ワックス)によって覆う又はチューブカバーで反応チューブを閉じるステップ、
3)RNA逆転写及び/又はDNA増幅反応を行うために温度制御装置により反応チューブの特定の部位において熱を供給又は除去するステップ、並びに
4)任意選択により、核酸増幅の間又は後に増幅産物を検出するステップ
を含む、発明13に記載の方法。
[発明15]
核酸増幅における発明1〜10のいずれか一項に記載の反応チューブ又は発明9に記載の反応器具の使用。
[発明16]
核酸増幅のために使用されるキットの調整における発明1〜10のいずれか一項に記載の反応チューブの使用。
1.増幅効率の改善:(a)変性効率の改善:図1bに示すように、インサート2の物理的障壁効果により、循環中の試薬が反応チューブの下端へ移動する時、インサート2の下の領域D1のみを通過することができ、温度制御装置により、その領域は変性反応に必要な温度よりも高い温度に維持することができる。したがって、有効な変性反応は、循環中の試薬が反応チューブのインサート2の下の領域D1を通過する時に起こり得る;(b)アニーリング効率の改善:図1bに示すように、インサート2の物理的障壁効果により、循環中の試薬が反応チューブの上端へ移動する時、インサート2の上の領域A1のみを通過することができ、温度制御装置により、その領域は特異的プライマーのアニーリングに望ましい温度に維持することができる。したがって、有効なアニーリング反応は、循環中の試薬が反応チューブのインサート2の上を通過する時に起こり得る。
2.増幅の特異性の保証:図1bに示すように、インサート2の物理的障壁効果により、循環中の試薬が反応チューブの上端へ移動する時、インサート2の上の領域A1のみを通過することができ、温度制御装置により、その領域は特異的プライマーのアニーリング温度をはるかに下回ることなく、特異的プライマーのアニーリングに望ましい温度に維持することができる。したがって、循環中の試薬がその領域を通過する時、1つのプライマー内若しくは2つのプライマー間、又はプライマーと鋳型(若しくはアンプリコン)の間の非特異的対形成が起こることができず、非特異的増幅をもたらさない。
3.異なるチューブにおける増幅間での一貫性の改善:
(a)特異性を増すことによる異なるチューブにおける増幅間の一貫性の改善:上述の2点目に記載したように、プライマー、酵素、dNTP、及び他の反応成分を正しい増幅と競合する非特異的産物のランダムな形成が起こらないため、正しい増幅の効率は非特異的増幅によって影響されず、したがって、単位時間当たりの異なるチューブにおける増幅間の一貫性を改善することができる;(b)増幅効率を上げることによる異なるチューブにおける増幅間の一貫性の改善:対流PCRが開始すると、反応チューブ内のインサート2の物理的障壁効果及び温度制御装置による制御機能により、チューブ内の全ての二本鎖鋳型が有効な変性のための領域を通過することができ、変性反応を受ける;循環中の試薬が反応チューブの上端へ移動する時、全ての一本鎖鋳型及びプライマーがアニーリングのための領域を通過することができ、アニーリング反応を受ける。したがって、縦に並んだ循環路による無効なサイクル(すなわち、循環中の試薬が下部位置へ移動する時、変性に望ましい温度の領域を通過せず、及び(/又は)循環中の試薬が上部位置へ移動する時、アニーリングに望ましい温度の領域を通過しない)が起こらず、単位時間当たりの異なるチューブにおける増幅間の一貫性が改善する。(c)増幅間で改善した一貫性により、平行する反応の間の終点での増幅産物の一貫性を改善することができ、したがって平行する反応における単位時間当たりの増幅間の一貫性も改善することができる。したがって、対流PCR増幅における最初の鋳型の定量は、リアルタイム蛍光検出によって実現できる。
特に指定しない限り、本発明において使用する分子生物学実験方法及び免疫測定法は、J.Sambrookら、Molecular Cloning:Laboratory Manual、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory出版、1989年、及びF.M.Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、第三版、John Wiley & Sons,Inc.、1995年に記載の方法に実質的に従って行い、酵素は製品の製造業者によって推奨される条件下で使用する。実施例は本発明を例示するために使用されるが、請求項のように本発明の範囲を限定することを意図しないことは当業者によって理解される。
液体の自然発生的な循環路を制御する反応チューブ
図2a、2b、2c、及び2dに示すように、液体の循環路を制御することができる本発明の核酸増幅用の反応チューブは、一端が閉じたチューブ本体1を含み、チューブ本体1は貯留領域4及び貯留領域の下に提供される核酸増幅領域3を含み、インサート2が、インサートの上に上部空間を残し、インサート2の下に下部空間を残して核酸増幅領域3に配置される。試薬が反応チューブに注入されると、インサート2の物理的障壁効果により、試薬は内力又は外力下で反応チューブ内の上部空間及び下部空間を通る循環路に沿って動くことができる。
例1の液体循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブにおけるDNA鋳型の増幅及び検出
1.実験材料
化学試薬:SpeedSTAR HS DNAポリメラーゼ(TaKaRa)、10×Fast Buffer I(Mg2+ plus)(TaKaRa)、dNTP(TaKaRa)、DEPC水、パラフィン油、6×DNAローディングバッファー(Sybr Greenを含む)
機器及び材料:核酸増幅のための自作機器(出願CN201110456811.9を参照);例1の液体の循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ、ゲル電気泳動機器、ゲルイメージャー(Bio−Rad)
プライマー:JxbUL54F1:GTGCGCCTTGACACTGTAC(配列番号1)
JxbUL54R11:CGACAAGTACTTTGAGCAGG(配列番号2)
試験鋳型1:CMVウイルスのDNA抽出物、濃度は103コピー/mL
試験鋳型2:DEPC水
(1)増幅試薬の調整:3.2mM dNTP、4μL 10×Fast Buffer I(Mg2+ plus)、1U SpeedSTAR HS DNAポリメラーゼ、0.4μL 10μM JxbUL54F1、0.4μL 10μM JxbUL54R11、5μL試験鋳型;及びDEPC水を使用して総容積を40μLにする。
例1の液体循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブにおけるRNA鋳型の増幅及び検出
1.実験材料
化学試薬:SpeedSTAR HS DNAポリメラーゼ(TaKaRa)、MMLV逆転写酵素(Transgen)、10×Fast Buffer I(Mg2+ plus)(TaKaRa)、dNTP(TaKaRa)、DEPC水、パラフィン油、6×DNAローディングバッファー(Sybr Greenを含む)
機器及び材料:核酸増幅のための自作機器(出願CN201110456811.9を参照);例1の液体の循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ、ゲル電気泳動機器、ゲルイメージャー(Bio−Rad)
プライマー:
CA16−WJ−F6−1:CAAGTAYTACCYACRGCTGCCAA(配列番号3)
CA16−WJ−R6−1:CAACACACAYCTMGTCTCAATGAG(配列番号4)
試験鋳型1:コクサッキーウイルスA16(CA16ウイルス)のRNA抽出物、濃度は103コピー/mL
試験鋳型2:DEPC水
(1)増幅試薬の調整:3.2mM dNTP、4μL 10×Fast Buffer I(Mg2+ plus)、1U SpeedSTAR HS DNAポリメラーゼ、0.4U MMLV、0.4μL 10μM JxbUL54F1、0.4μL 10μM JxbUL54R11、5μl試験鋳型;及びDEPC水を使用して総容積を40μlにする。
循環制御の機能がある及び機能がない反応チューブにおける増幅間での一貫性及び特異性の比較
1.実験材料
化学試薬:SpeedSTAR HS DNAポリメラーゼ(TaKaRa)、10×Fast Buffer I(Mg2+ plus)(TaKaRa)、dNTP(TaKaRa)、DEPC水、パラフィン油、6×DNAローディングバッファー(Sybr Greenを含有する)
機器及び材料:核酸増幅のための自作機器;例1の液体の循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ、循環制御の機能がない反応チューブ(出願番号201110360350.5を参照)、ゲル電気泳動機器、ゲルイメージャー(Bio−Rad)
プライマー:
JxbUL54F1:GTGCGCCTTGACACTGTAC(配列番号1)
JxbUL54R11:CGACAAGTACTTTGAGCAGG(配列番号2)
試験鋳型1:CMVウイルスのDNA抽出物、濃度は103コピー/mL
試験鋳型2:DEPC水
(1)増幅試薬の調整:3.2mM dNTP、4μL 10×Fast Buffer I(Mg2+ plus)、1U SpeedSTAR HS DNAポリメラーゼ、0.4μL 10μM JxbUL54F1、0.4μL 10μM JxbUL54R11、5μl試験鋳型;及びDEPC水を使用して総容積を40μlにする。
循環制御の機能がある及び機能がない反応チューブの増幅効率の比較
1.実験材料
化学試薬:SpeedSTAR HS DNAポリメラーゼ(TaKaRa)、10×Fast Buffer I(Mg2+ plus)(TaKaRa)、dNTP(TaKaRa)、DEPC水、パラフィン油、6×DNAローディングバッファー(Sybr Greenを含有する)
機器及び材料:核酸増幅のための自作機器;例1の液体の循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ、循環制御の機能がない反応チューブ(出願番号201110360350.5を参照)、ゲル電気泳動機器、ゲルイメージャー(Bio−Rad)
プライマー:
JxbUL54F1:GTGCGCCTTGACACTGTAC(配列番号1)
JxbUL54R11:CGACAAGTACTTTGAGCAGG(配列番号2)
試験鋳型1:CMVウイルスのDNA抽出物、濃度は103コピー/mL
試験鋳型2:DEPC水
(1)増幅試薬の調整:3.2mM dNTP、4μL 10×Fast Buffer I(Mg2+ plus)、1U SpeedSTAR HS DNAポリメラーゼ、0.4μL 10μM JxbUL54F1、0.4μL 10μM JxbUL54R11、5μl試験鋳型;及びDEPC水を使用して総容積を40μlにする。
循環制御の機能がある又は機能がない反応チューブでの増幅のリアルタイム蛍光検出の結果の比較
1.実験材料
化学試薬:SpeedSTAR HS DNAポリメラーゼ(TaKaRa)、10×Fast Buffer I(Mg2+ plus)(TaKaRa)、dNTP(TaKaRa)、DEPC水、パラフィン油
機器及び材料:核酸増幅のための自作機器及びリアルタイム蛍光検出(出願番号CN201110456811.9を参照);例1の液体の循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ、循環制御の機能がない反応チューブ(出願番号201110360350.5を参照)
プライマー:
JxbUL54F1:GTGCGCCTTGACACTGTAC(配列番号1)
JxbUL54R11:CGACAAGTACTTTGAGCAGG(配列番号2)
プローブ:JxbUL54P1:FAM−AGCCGGCTCCAAGTGCAAG−BHQ−1(配列番号5)
試験鋳型1:CMVウイルス由来のDNA抽出物の鋳型、濃度は106コピー/mL
試験鋳型2:CMVウイルス由来のDNA抽出物の鋳型、濃度は105コピー/mL
試験鋳型3:DEPC水
(1)増幅試薬の調整:3.2mM dNTP、4μL 10×Fast Buffer I(Mg2+ plus)、1U SpeedSTAR HS DNAポリメラーゼ、0.4μL 10μM JxbUL54F1、0.4μL 10μM JxbUL54R11、0.2μL 10μM JxbUL54P1、5μl試験鋳型;及びDEPC水を使用して総容積を40μlにする。
Claims (19)
- 一端が閉じたチューブ本体(1)を含む核酸増幅用の反応チューブであって、前記チューブ本体(1)が、貯留領域(4)及び貯留領域の下に位置する核酸増幅領域(3)を含み、インサート(2)が、インサート(2)の上に残される上部空間とインサート(2)の下に残される下部空間とを備える前記核酸増幅領域(3)に配置される、反応チューブであって;
インサート(2)がチューブ本体(1)の中心軸に沿って提供され、インサートの両側(a、b)が核酸増幅領域(3)の内壁に接続され;
インサート(2)の下端(d)とチューブ本体の底部の間の距離が0mmよりも大きく(例えば1mm以上)、核酸増幅領域(3)の高さの1/3より小さく;
インサート(2)の上端(c)と核酸増幅領域(3)の最上部の間の距離が0mmよりも大きく(例えば1mm以上)、核酸増幅領域(3)の高さの1/3より小さい;
前記反応チューブ。 - インサート(2)が、チューブ本体(1)の中心軸に沿って核酸増幅領域を第一領域(3−1)と第二領域(3−2)に分け、第一領域(3−1)及び第二領域(3−2)が核酸増幅領域の上部領域(3−A)及び下部領域(3−B)を介して接続されている、
請求項1に記載の反応チューブ。 - インサート(2)の下端(d)とチューブ本体の底部の間の距離が0mmよりも大きく(例えば1mm以上)、4mm以下である、
請求項1又は2に記載の反応チューブ。 - インサート(2)の上端(c)と核酸増幅領域(3)の最上部の間の距離が0mmより大きく(例えば1mm以上)、3mm以下である、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の反応チューブ。 - チューブ本体(1)の底部がチューブ本体(1)と組み合う底栓(1−1)によって閉じられる、請求項1又は2に記載の反応チューブ。
- チューブ本体(1)がそれと組み合うチューブカバーをさらに含む、請求項1又は2に記載の反応チューブ。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の反応チューブであって、核酸増幅領域(3)が3〜12の高さ/内径比を有する、
反応チューブ。 - 核酸増幅領域(3)が6〜9の高さ/内径比を有する、請求項7に記載の反応チューブ。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の反応チューブであって、核酸増幅領域(3)が30〜200μlの容積を有する、
反応チューブ。 - 核酸増幅領域が40〜150μlの容積を有する、請求項9に記載の反応チューブ。
- チューブ本体(1)及びインサート(2)が耐熱材料製である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の反応チューブ。
- 前記耐熱材料が、ガラス、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホン、及びポリスルホンから選択される、請求項11に記載の反応チューブ。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の反応チューブ、及び熱を供給又は除去することができる1つ以上の温度制御装置を含み、前記温度制御装置が反応チューブの外側又は内側に配置される、核酸増幅用の反応器具。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の反応チューブを含むキット。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の反応チューブ又は請求項13に記載の反応器具を使用するステップを含む、試料中の標的核酸を増幅するための方法。
- 核酸がDNA又はRNAであり、及び/又は増幅がPCR反応又は逆転写反応である、請求項15に記載の方法。
- 1)核酸増幅反応のための試薬を請求項1〜12のいずれか一項に記載の反応チューブに注入するステップ、
2)振動、及び/又は遠心分離によって、試薬を核酸増幅領域(3)に充填し、任意選択により、試薬の表面を不揮発性物質(例えばパラフィン油又は低融点ワックス)によって覆う又はチューブカバーで反応チューブを閉じるステップ、
3)RNA逆転写及び/又はDNA増幅反応を行うために温度制御装置により反応チューブの特定の部位において熱を供給又は除去するステップ、並びに
4)任意選択により、核酸増幅の間又は後に増幅産物を検出するステップ
を含む、請求項15に記載の方法。 - 核酸増幅における請求項1〜12のいずれか一項に記載の反応チューブ又は請求項13に記載の反応器具の使用。
- 核酸増幅のために使用されるキットの調製における請求項1〜12のいずれか一項に記載の反応チューブの使用。
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