CN113692447A - 系统 - Google Patents

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C·W·布朗三世
W·J·布莱克
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Abstract

本公开描述了允许灵敏检测目的核酸(即，核苷酸序列是或包含靶序列的核酸)的技术。

Description

系统
背景技术
开发可特异性检测目标核酸的技术变得越来越重要，尤其是当以非常低的丰度存在时。
发明内容
本公开描述了允许灵敏检测目标核酸(即，其核苷酸序列是或包含靶序列的核酸)的技术。
在一些实施方案中，提供的技术利用某些Cas酶的核酸切割活性特征；在许多实施方案中，提供的技术利用某些Cas酶的侧支切割活性。本公开确定了与某些先前开发的利用Cas的侧支切割活性的技术相关的问题的源头。本公开解决了此类问题，并且此外提供了相对于可选的可用系统具有意想不到的好处和/或能力的技术。
重要的是，在许多实施方案中，本公开提供了将序列检测与通过Cas酶的切割活化解偶联的技术。因此，本公开代表了与大多数基于Cas的技术系统的显著背离，集中于Cas酶的标志：它们的活性可以通过对指导RNA序列的操纵而特异性地针对任何目标序列。
在一些实施方案中，本公开提供了这样的见解，即通过采取相反的方法–使用Cas系统来检测特定序列但不工程化Cas指导RNA以与该序列杂交，可以实现某些优势和/或可以解决问题。在一些实施方案中，本公开传授了基于连接的系统用于初始靶核酸杂交的用途，其中设计该基于连接的系统的组件以使得连接事件产生作为Cas侧支切割活性的活化核酸的一个或多个核酸分子或模板。提供的系统允许所述活化核酸具有不需要在原始靶核酸中发现的序列。因此，在一些实施方案中，本公开提供了可以利用一种或相对少量的指导RNA序列来检测多种不同的目标核酸靶标(包括与其他核酸序列相差单个碱基的靶标)的技术。
可选地或另外地，在一些实施方案中，本公开提供了允许核酸检测的策略，即使有显著的(例如，阿托摩尔)灵敏性，也无需扩增初始靶核酸。
除其他事项外，所提供的技术的优点包括(i)可以消除靶核酸的预扩增，从而去除可能曲解测定结果的序列突变的潜在来源(例如，通过产生假阳性和/或假阴性读数)；(ii)将靶检测与Cas侧支活性的活化解偶联避免针对每个目标靶序列特异性设计不同gRNA的需要；(iii)将Cas侧支活性的活化与靶检测解偶联进一步允许在选择Cas系统方面的灵活性，因为可以产生和/或利用活化核酸的DNA和RNA之一或两者；(iv)连接特异性使能够进行单个碱基判别；(v)将靶检测与Cas侧支活性的活化解偶联允许(除其他事项外)Cas活化序列(即，由gRNA/crRNA结合的序列)的多聚化，从而潜在地允许多种Cas酶从单个连接产物(或其模板或拷贝)活化；以及(vi)其组合。
附图说明
图1A和图1B一起描绘了根据本公开的核酸检测的示例性实施方案。
图2描绘了根据本公开的核酸检测的示例性实施方案。
图3展示了SHERLOCKTM过程(上图，来自Science 356:438,2017)和本文所述的使用基于连接的转录活化和CRISPR侧支活性进行核酸检测的技术(下图)的比较。
图4描绘了所产生的aRNA的速率和/或量增加的示例性实施方案。
图5描绘了如本文所述的多路分析的示例性实施方案。
图6描绘了如本文所述的多路分析的示例性实施方案，包括对可以如何实施这种分析进行了说明，例如，经由流体系统，例如像蜂窝系统(例如，如在Cepheid的美国专利申请US2014/0087958中所述)。
图7描绘了具有不同位置的Cas识别元件的示例性连接寡核苷酸组。Hyb-Cas：Cas靶区域上游的杂交区域，T7启动子和Cas靶位于不同的链上；Cas-Hyb：Cas靶区域下游的杂交区域，T7启动子和Cas靶位于相同的链上。
图8描绘了为确保从ssDNA传感器高效产生RNA而测试的不同的报告基因类型(RNA、由RNA聚合酶转录的dsDNA和原位转化为dsDNA的ssDNA)。
图9证明了从图8所述的序列产生的RNA报告基因的Cas13检测。
图10A和图10B证明了当靶杂交区域位于Cas靶序列的上游或下游时，成功的靶RNA检测。
图11A和图11B证明了由单链的DNA(ssDNA)对Lwa Cas13活性的活化。
定义
氨基酸：如本文所用，在其最宽泛的意义上，是指可掺入多肽链中的任何化合物和/或物质，例如，通过形成一个或多个肽键。在一些实施方案中，氨基酸具有通用结构H2N–C(H)(R)–COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是非天然氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指天然存在的肽中常见的二十种标准L-氨基酸中的任何一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸之外的任何氨基酸，无论其是合成制备的还是从天然来源获得的。在一些实施方案中，与上述通用结构相比，多肽中的氨基酸(包括羧基端和/或氨基端的氨基酸)可包含结构修饰。例如，在一些实施方案中，与通用结构相比，氨基酸可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、聚乙二醇化、糖基化、磷酸化和/或取代(例如氨基基团、羧酸基团、一个或多个质子和/或羟基基团的取代)而修饰。在一些实施方案中，与包含其他方面相同的未经修饰的氨基酸的多肽相比，此类修饰可以例如改变包含经修饰的氨基酸的多肽的循环半衰期。在一些实施方案中，与包含其他方面相同的未经修饰的氨基酸的多肽相比，这种修饰不会显著改变含有经修饰的氨基酸的多肽的相关活性。从上下文可以清楚地看出，在一些实施方案中，术语“氨基酸”可用于指游离氨基酸；在一些实施方案中，它可用于指多肽的氨基酸残基。
类似物：如本文所用，术语“类似物”是指与参考物质共享一种或多种特定结构特征、元素、组分或部分的物质。典型地，“类似物”显示出与参考物质的显著结构相似性，例如共享核心或共有结构，但在某些离散方式上也有所不同。在一些实施方案中，类似物是可以从参考物质产生的物质，例如，通过参考物质的化学操纵。在一些实施方案中，类似物是可通过进行与产生参考物质的合成方法基本相似(例如，与其共享多个步骤)的合成方法而产生的物质。在一些实施方案中，类似物是或可以通过进行与用于产生参考物质的合成方法不同的合成方法来产生。
相关：两个事件或实体彼此“相关”，如果一者的存在、水平和/或形式与另一者的存在、水平、程度、类型和/或形式关联，则在本文中使用这个术语。例如，如果特定实体(例如多肽、遗传签名、代谢物、微生物等)的存在、水平和/或形式与疾病、病症或疾患的发生率和/或易感性关联(例如，在相关群体中)，则认为所述特定实体与所述特定疾病、病症或疾患相关。在一些实施方案中，如果两个或更多个实体直接或间接地相互作用，使它们彼此在物理上接近和/或保持在物理上接近，则它们在物理上彼此“相关”。在一些实施方案中，物理上彼此相关的两个或更多个实体彼此共价连接；在一些实施方案中，物理上彼此相关的两个或更多个实体彼此不共价连接，而是非共价相关，例如通过氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、磁性及其组合。
生物样品：如本文所用，术语“生物样品”典型地是指如本文所述从目标生物来源(例如，组织或生物体或细胞培养物)获得或衍生的样品。在一些实施方案中，目标来源是或包括生物体(如动物或人)。在一些实施方案中，生物样品是或包括生物组织或流体。在一些实施方案中，生物样品可以是或包括骨髓；血液；血细胞；腹水；组织或细针穿刺活检样品；含有细胞的体液；自由浮动核酸；痰；唾液；尿；脑脊液、腹腔液；胸膜液；粪便；淋巴；妇科流体；皮肤拭子；阴道拭子；口腔拭子；鼻拭子；冲洗物或灌洗物，例如导管灌洗物或支气管肺泡灌洗物；抽吸物；刮片；骨髓标本；组织活检标本；外科标本；粪便、其他体液、分泌物和/或排泄物；和/或来自其中的细胞等。在一些实施方案中，生物样品是或包括从个体获得的细胞。在一些实施方案中，获得的细胞是或包括来自获得样品的个体的细胞。在一些实施方案中，样品是通过任何适当的方式直接从目标来源获得的“初级样品”。例如，在一些实施方案中，初级生物样品通过选自下组的方法获得，该组由以下组成：活检(例如，细针穿刺抽吸或组织活检)、外科手术、体液(例如，血液、淋巴、粪便等)的收集等。在一些实施方案中，从上下文可以清楚地看出，术语“样品”是指通过对初级样品进行处理(例如，通过去除一种或多种组分和/或通过添加一种或多种剂)而获得的制剂。例如，使用半透膜过滤。这种“经处理的样品”可以包括例如从样品中提取的或通过使初级样品经受诸如mRNA的扩增或反转录、某些组分的分离和/或纯化等技术获得的核酸或蛋白质。
特征部分：如本文所用，术语“特征部分”在最广泛的意义上是指物质的一部分，所述物质的存在(或不存在)与物质的特定特征、属性或物质活性的存在(或不存在)关联。在一些实施方案中，物质的特征部分是在物质和相关物质中发现的部分，所述物质共享特定特征、属性或活性，但不存在于不共享特定特征、属性或活性的那些物质中。在某些实施方案中，特征部分与完整的物质共享至少一个功能性特征。例如，在一些实施方案中，蛋白质或多肽的“特征部分”是包含连续氨基酸段或氨基酸连续段集合的部分，它们一起是蛋白质或多肽的特征。在一些实施方案中，每个这样的连续段通常包含至少2、5、10、15、20、50或更多个氨基酸。一般而言，物质(例如蛋白质、抗体等)的特征部分是除了以上规定的序列和/或结构同一性之外，与相关的完整物质共享至少一个功能性特征的部分。在一些实施方案中，特征部分可以是生物活性的。
特征序列：“特征序列”是在多肽或核酸家族的所有成员中发现的序列，因此可以由本领域普通技术人员使用来定义所述家族的成员。
特征序列元件：如本文所用，短语“特征序列元件”是指聚合物(例如，多肽或核酸)中发现的序列元件，其代表聚合物的特征部分。在一些实施方案中，特征序列元件的存在与聚合物的存在、聚合物特定活性的水平、或聚合物的性质关联。在一些实施方案中，特征序列元件的存在(或不存在)将特定聚合物定义为此类聚合物的特定家族或组的成员(或非成员)。特征序列元件典型地包含至少两个单体(例如，氨基酸或核苷酸)。在一些实施方案中，特征序列元件包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个单体(例如，连续连接的单体)。在一些实施方案中，特征序列元件包括至少第一和第二段连续单体，所述单体被一个或多个间隔子区隔开，所述间隔子区的长度可以或可以不随共享该序列元件的聚合物而变化。
相当的：如本文所用，术语“相当的”是指两种或更多种剂、实体、情况、条件组等，它们可能彼此不同但足够相似以允许在它们之间进行比较，使得本领域技术人员将理解，可以基于观察到的差异或相似性合理地得出结论。在一些实施方案中，相当的条件组、环境、个体或群体的特征在于多个基本相同的特征和一个或少量不同特征。本领域普通技术人员将理解，在上下文中，在任何给定情况下，两种或更多种此类剂、实体、情况、条件组等所需要何种程度的同一性被认为是相当的。例如，本领域普通技术人员将理解，当以足够数量和类型的基本相同的特征为特征时，环境、个体或群体组彼此可比，以保证合理结论，即在不同的环境、个体或群体组的情况下获得的结果或观察到的现象的差异是由那些变化的特征的变化引起或指示的。
对应于：如本文所用，术语“对应于”可用于通过与合适的参考化合物或组合物的比较来指定化合物或组合物中结构元件的位置/身份。例如，在一些实施方案中，聚合物中的单体残基(例如，多肽中的氨基酸残基或多核苷酸中的核酸残基)可被鉴定为“对应于”合适的参考聚合物中的残基。例如，本领域普通技术人员将理解，出于简单的目的，通常使用基于参考相关多肽的标准编号系统来指定多肽中的残基，使得“对应于”位置190处残基的氨基酸，例如，实际上不必是特定氨基酸链中的第190个氨基酸，而是对应于参考多肽中第190位处的残基；本领域普通技术人员容易理解如何鉴定“相应的”氨基酸。例如，本领域技术人员将意识到可以使用各种序列比对策略，包括软件程序，例如像BLAST、CS-BLAST、CUSASW++、DIAMOND、FASTA、GGSEARCH/GLSEARCH、Genoogle、HMMER、HHpred/HHsearch、IDF、Infernal、KLAST、USEARCH、parasail、PSI-BLAS T、PSI-Search、ScalaBLAST、Sequilab、SAM、SSEARCH、SWAP HI、SWAPHI-LS、SWIMM、或SWIPE，可用于例如鉴定根据本公开的多肽和/或核酸中的“对应”残基。
可检测的实体：如本文所用，术语“可检测的实体”是指可检测的任何元件、分子、官能团、化合物、片段或部分。在一些实施方案中，单独地提供或使用可检测的实体。在一些实施方案中，可以将可检测的实体与另一种剂联合(例如，结合)来提供和/或利用。可检测的实体的实例包括、但不限于：各种配体、放射性核素(例如，3H、14C、18F、19F、32P、35S、135I、125I、123I、64Cu、187Re、111In、90Y、99mTc、177Lu、89Zr等)、荧光染料(对于特定的示例性荧光染料，参见下文)、化学发光剂(例如像吖啶酯、稳定的二氧环丁烷等)、生物发光剂、光谱可分辨的无机荧光半导体纳米晶体(即量子点)、金属纳米颗粒(例如，金、银、铜、铂等)纳米簇、顺磁性金属离子、酶(对于酶的特定实例，参见下文)、比色标记(例如像染料、胶体金等)、生物素、地高辛(dioxigenin)、半抗原以及抗血清或单克隆抗体可用的蛋白质。
工程化：一般而言，术语“工程化”是指已经被人手工操纵的方面。例如，当两个或更多个在自然界中不以该顺序连接在一起的序列被人工操纵以在工程化多核苷酸中彼此直接连接时，多核苷酸被认为是“工程化的”。例如，在本发明的一些实施方案中，工程化的多核苷酸包含在自然界中发现的与第一编码序列可操作缔合但不与第二编码序列可操作缔合的调节序列，通过人工连接，使得它与第二编码序列可操作地缔合。相比之下，如果细胞或生物体被操纵从而使其遗传信息发生改变(例如，引入了先前不存在的新遗传物质，例如通过转化、交配、体细胞杂交、转染、转导或其他机制，或先前存在的遗传物质被改变或去除，例如通过将突变替换或缺失，或通过交配方案)则认为所述细胞或生物体被“工程化”。按照惯例并且被本领域技术人员理解，工程化的多核苷酸或细胞的后代典型地仍被称为“工程化的”，即使实际操纵是在先前实体上进行的。
标志物：如本文所用，标志物是指其存在或水平是特定状态或事件的特征的实体或部分。在一些实施方案中，特定标志物的存在或水平可以是疾病、病症或疾患的存在或所处阶段的特征。仅举一个例子，在一些实施方案中，术语是指具有特定肿瘤、肿瘤亚类、肿瘤分期等特征的基因表达产物。可选地或另外地，在一些实施方案中，特定标志物的存在或水平与特定信号传导途径的活性(或活性水平)关联，例如可能是特定肿瘤类型的特征。标志物的存在或不存在的统计显著性可能因特定标志物而异。在一些实施方案中，标记物的检测是高度特异性的，因为它反映了肿瘤属于特定亚类的高概率。这种特异性可能以灵敏性为代价(即，即使肿瘤是预期表达标记物的肿瘤，也可能出现阴性结果)而出现。相反，具有高度灵敏性的标志物可能比具有较低灵敏性的标志物特异性更低。根据本发明，有用的标志物不需要以100％准确度区分特定亚类的肿瘤。
核酸：如本文所用，在其最广泛的意义上，是指被掺入或可以掺入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是或可以经由磷酸二酯键掺入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。从上下文可以清楚地看出，在一些实施方案中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”是指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”是或包括RNA；在一些实施方案中，“核酸”是或包括DNA。在一些实施方案中，核酸是、包含一个或多个天然核酸残基，或由其组成。在一些实施方案中，核酸是、包含一个或多个核酸类似物，或由其组成。在一些实施方案中，核酸类似物与核酸的不同之处在于它不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施方案中，核酸是、包含一个或多个“肽核酸”，或由其组成，所述“肽核酸”是本领域已知的并且在主链中具有肽键而不是磷酸二酯键，被认为在本发明的范围内。可选地或另外地，在一些实施方案中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-N-亚磷酰胺键，而不是磷酸二酯键。在一些实施方案中，核酸是、包含一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷、和脱氧胞苷)，或由其组成。在一些实施方案中，核酸是、包含一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮杂腺苷、7-脱氮杂鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化的碱基、插入的碱基及其组合)或由其组成。在一些实施方案中，与天然核酸中的糖相比，核酸包含一个或多个经修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，核酸具有编码功能基因产物(例如RNA或蛋白质)的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包括一个或多个内含子。在一些实施方案中，可以通过以下的一种或多种来制备核酸：从天然来源分离、通过基于互补模板(体内或体外)的聚合的酶促合成、在重组细胞或系统中复制或化学合成。在一些实施方案中，核酸的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基。在一些实施方案中，核酸部分或全部地是单链；在一些实施方案中，核酸部分或全部地是双链。在一些实施方案中，核酸具有包括至少一个元件的核苷酸序列，所述元件编码或是编码多肽的序列的补体。在一些实施方案中，核酸具有酶活性。阅读本说明书的本领域技术人员将理解，连接寡核苷酸组、活化核酸和/或指导RNA均可以被工程化和/或操纵，例如以掺入核苷酸类似物等。
可操作地连接的：如本文所用，是指如下并置，其中所述组分处于容许其以预期的方式起作用的关系中。与功能性元件“可操作地连接”的控制元件以这样的方式缔合，即在与控制元件相容的条件下实现功能性元件的表达和/或活性。在一些实施方案中，“可操作地连接的”控制元件与目标编码元件相邻(例如，共价连接)；在一些实施方案中，控制元件以相反地或以其他方式作用于目标功能性元件。
多肽：如本文所用，是指任何聚合的氨基酸链。在一些实施方案中，多肽具有天然存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有非天然存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有被工程化的氨基酸序列，因为它是通过人工的作用设计和/或产生的。在一些实施方案中，多肽可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、或两者，或由其组成。在一些实施方案中，多肽可以仅包含天然氨基酸或非天然氨基酸，或仅由其组成。在一些实施方案中，多肽可以包含D-氨基酸、L-氨基酸或两者。在一些实施方案中，多肽可以仅包含D-氨基酸。在一些实施方案中，多肽可以仅包含L-氨基酸。在一些实施方案中，多肽可包括一个或多个侧基或其他修饰，例如，在多肽的N-末端、在多肽的C-末端或其任何组合处修饰或附接到一个或多个氨基酸侧链。在一些实施方案中，此类侧基或修饰可选自下组，该组由以下组成：乙酰化、酰胺化、脂化、甲基化、聚乙二醇化等(包括其组合)。在一些实施方案中，多肽可以是环状的，和/或可以包含环状部分。在一些实施方案中，多肽不是环状的和/或不包含任何环状部分。在一些实施方案中，多肽是线性的。在一些实施方案中，多肽可以是或包含钉合多肽。在一些实施方案中，术语“多肽”可以附加到参考多肽、活性或结构的名称；在这种情况下，它在本文中用于指如下多肽，所述多肽共享相关活性或结构，因此可被认为是多肽的同一类别或家族的成员。对于每个这样的类别，本说明书提供和/或本领域技术人员将意识到所述类别内的示例性多肽，其氨基酸序列和/或功能是已知的；在一些实施方案中，此类示例性多肽是针对多肽类别或家族的参考多肽。在一些实施方案中，多肽类别或家族的成员显示出显著的序列同源性或同一性，与所述类别的参考多肽(在一些实施方案中，与所述类别内的所有多肽)共享共同序列基序(例如，特征序列元件)，和/或共享共同的活性(在一些实施方案中，按相当的水平或在指定的范围内)。例如，在一些实施方案中，成员多肽显示与参考多肽的序列同源性或同一性的总体程度，即至少约30％-40％，并且通常高于约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，和/或包括至少一个区域(例如，可能在一些实施方案中是或包括特征序列元件的保守区)，所述区域显示非常高的序列同一性，通常高于90％或甚至95％、96％、97％、98％、或99％。这样的保守区通常涵盖至少3-4个并且经常多达20个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，保守区涵盖至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个连续氨基酸的至少一段。在一些实施方案中，相关多肽可以包含亲本多肽的片段，或由其组成。在一些实施方案中，有用的多肽可以包含多个片段或由多个片段组成，每个片段在同一亲本多肽中以相对于在目标多肽中发现的另一种不同的空间排列被发现(例如，在亲本中直接连接的片段可以在目标多肽中被空间分离，反之亦然，和/或片段在目标多肽中可能以与在亲本中不同的顺序存在)，使得目标多肽是其亲本多肽的衍生物。
参考：如本文所用，描述了与之进行比较的标准或对照。例如，在一些实施方案中，将目标剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与参考或对照剂、动物、个体、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施方案中，参考或对照与目的测试或确定基本上同时测试和/或确定。在一些实施方案中，参考或对照是历史参考或对照，任选地体现在有形介质中。典型地，如本领域技术人员所理解的，参考或对照是在与评估中的那些相当的条件或情况下确定或表征的。当存在足够的相似性来证明对特定的可能参考或对照的依赖和/或比较时，本领域技术人员将理解。
特异性结合：如本文所用，术语“特异性结合”是指在发生结合的环境中区分可能的结合配偶体的能力。当存在其他潜在的靶标时，与一个特定靶标相互作用的结合剂被称为与其相互作用的靶标的“特异性结合”。在一些实施方案中，通过检测或测定结合剂与其配偶体之间的缔合程度来评估特异性结合；在一些实施方案中，通过检测或测定结合剂-配偶体复合物的解离程度来评估特异性结合；在一些实施方案中，通过检测或测定结合剂竞争其配偶体和另一种实体之间可选的相互作用的能力来评估特异性结合。在一些实施方案中，通过在一定浓度范围内进行此类检测或确定来评估特异性结合。
某些实施方案的详细描述
最近，已经描述了各种核酸检测和/或操纵系统，它们利用存在于某些Cas酶中的所谓的“侧支切割”活性。这些系统包括例如，利用Cas13(和/或Csm6酶)的SHERLOCKTM系统并且描述于例如，Abudayeh等人的WO2018/107129；Gootenberg等人Science 356:438,2017；Gootenberg等人,Science 360:439,2018中，并且利用Cas12酶的DETECTRTM系统描述于例如，Doudna的WO2017/218573；Chen等人Science 360:436,2018中。著名期刊中对这些系统的综述将它们描述为“重大进步”(Kocak&Gersbach Nature 557:168,2018)和“分子诊断领域的革命”(Chertow Science 360:381,2018)。此外，越来越清楚的是，侧支活性是许多Cas酶的特征，并且技术可用于轻松识别那些显示此类活性的酶(参见，例如，Harrington等人,Science 362:839,2018，其描述了Cas14基因座和其中的酶)。
从广义上讲，利用Cas侧支切割活性来检测核酸的现有系统需要一种Cas酶，其gRNA已被工程化以与特定的目标靶序列杂交。当使这种Cas酶(及其gRNA)与含有具目标靶位点的核酸的样品接触时，所述Cas酶的侧支活性被活化；可以通过包括以其切割可检测的方式标记的探针来检测这种活化。仅举一个例子，当探针是用荧光团和猝灭剂标记的寡核苷酸时，所述寡核苷酸的切割从猝灭剂释放荧光团并产生可检测信号。本文提及的SHERLOCKTM和DETECTRTM系统已被描述为在与靶扩增(并且特别是等温扩增)组合时能够实现阿托摩尔灵敏性(参见，Gootenberg等人Science 360:439,2018和Chen等人Science360:436,2018)。
本公开理解所描述的SHERLOCKTM和DETECTRTM系统具有许多强大的属性。然而，本公开还确定了这些系统的某种或某些问题的根源，包括它们需要针对每个目标靶核酸设计新的指导RNA；本公开指出，对靶特异性gRNA的这种要求可能会给开发带来重大负担，因为可能需要优化单个gRNA对和/或与特定Cas酶一起使用。
本公开进一步指出，据报道SHERLOCKTM和DETECTRTM系统仅在与原始靶核酸的扩增一起使用时才能实现极高的灵敏性。本公开传授初始靶扩增的要求可能是问题的源头，因为它可能引入可能产生假阳性和/或假阴性结果的突变。
本公开解决了这些问题，并且进一步发现了将靶序列与Cas切割的活化解偶联的各种意想不到的和令人惊讶的优点。
在各种实施方案中，本公开提供了利用基于连接的技术用于与目标靶核酸进行初始(和靶序列依赖性)杂交的系统，并使用这些系统产生触发Cas切割的Cas活化核酸(例如，侧支切割)活性。因为如果仅存在目标靶核酸时才产生Cas活化核酸，所以Cas指导RNA不需要对靶序列具有特异性，而是可以结合活化核酸中的其他地方。
图1A和图1B一起描绘了根据本公开的核酸检测的示例性实施方案。如图1A所示，使可以包含至少一个目标核酸(即，其核苷酸序列是或包括目标靶位点)的核酸样品与连接寡核苷酸组接触，所述组包含：(i)第一连接寡核苷酸，其核苷酸序列包括模板元件和第一靶杂交元件；(ii)第二连接寡核苷酸，其核苷酸序列包括第二靶杂交元件和Cas识别元件；以及(iii)任选地一个或多个桥接寡核苷酸，其核苷酸序列是或包括一个或多个另外的靶杂交元件。选择所述组的寡核苷酸，以便当它们同时与目标核酸杂交时，它们彼此邻接，使得连接酶可以将它们连接以形成单个的连接链。所述连接链是通过至少一种Cas蛋白活化切割(例如，侧支切割)的核酸的补体或组分(例如，是双链实体的一条链)。
原则上，连接链本身可以被用作Cas活化核酸(在这种情况下不需要模板元件)。然而，在许多实施方案中，如图1A所描绘，连接链被作用于模板元件的系统拷贝。例如，当模板元件是或包括启动子(或它的补体)和/或一个或多个转录调控元件(或其补体)时，所述系统可以是或包括RNA聚合酶；其中所述模板元件是或包括可延伸引物的复制起点和/或结合位点(或其补体)，所述系统可以是或包括DNA聚合酶(在一些实施方案中，所述聚合酶可以是热稳定的DNA聚合酶，特别是如果所述连接链包括对应于第二可延伸引物的序列元件，并且所述系统包括合适的引物对来扩增所述连接链和其补体的双链体)。这种拷贝产生在本实施例和在图1A和图1B中被称为“Cas活化核酸”的核酸分子群，因为它们包括与具有将被检测到的切割(例如，侧支切割)活性的Cas蛋白的crRNA/gRNA互补的序列。如图1B所描绘，当使存在于Cas活化核酸中适合于针对核酸类型(即，RNA、ssDNA、或dsDNA)的合适的Cas与Cas靶核酸接触时，其切割(例如，侧支切割)活性被活化，并且合适的报告基因核酸被切割，产生可检测的信号。
下面，更详细地讨论本发明的各种元件和/或实施方案的某些特征和/或属性。阅读本公开的普通技术人员将意识到某些修改和/或变化是在普通技术人员的技术范围内并且也在本公开的精神和范围内。普通技术人员还将理解，鉴于核酸链的模板特性以及它们彼此杂交的能力，常规地本领域中指代特定的“序列元件”或“位点”并依赖于技术人员从上下文中理解何时引用“正向”或“有义”形式，以及何时引用其补体(“反向”或“反义”形式)。
靶核酸
本领域技术人员将立即理解本文提供的技术可广泛适用于实现广泛范围的核酸的检测，包括例如来自传染剂(例如，病毒、微生物、寄生虫等)的核酸、指示特定生理状态或状况(例如，疾病、病症或疾患(例如像癌症或炎症或代谢性疾病、病症或疾患等)的存在或状态)的核酸、产前核酸等。
在许多实施方案中，所提供的技术对于检测低丰度(例如，小于约10fM、或约1fM、或约100aM)的核酸特别有用或适用。
典型地，所提供的技术将应用于一个或多个样品以评估样品中一个或多个靶核酸的存在和/或水平。在一些实施方案中，样品是生物样品；在一些实施方案中，样品是环境样品。
在一些实施方案中，样品将被处理(例如，核酸将从初级样品中部分地或基本上分离或纯化)；在一些实施方案中，将仅进行最少的处理(即，样品将是粗样品)。
连接寡核苷酸组
如本文所述，本公开利用用于与初始靶核酸杂交/检测初始靶核酸的连接技术。因此，连接步骤对于目标靶序列是序列特异性的；对于每个这样的靶位点，设计连接寡核苷酸组，它们一起在目标靶序列上杂交，彼此相邻，使得连接酶的活性将杂交的寡核苷酸连接在一起以形成单个连接链。该连接链包括所选的整个靶位点的补体，并且还包括Cas识别元件，并且典型地是模板元件，在连接之前，它们不是同一寡核苷酸的一部分。
本领域技术人员将意识到，存在如下的多种系统，其仅在当连接寡核苷酸组通过连接而连在一起时，利用连接寡核苷酸组以将位于所述组的不同寡核苷酸上的功能性元件集合在一起，如在目标靶核酸的存在下发生的，所述组中的每个寡核苷酸在靶位点的相邻部分处杂交。(参见，例如，启动子-连接-活化-核酸序列的转录扩增，如描述于美国专利号5194370中；多路可连接探针扩增[MLPA]，如描述于美国专利6955901中，和Nucleic AcidsResearch 30:e27,2002；RNA夹板多核苷酸连接酶活性，如描述于例如Nucleic AcidsResearch42:1831,2013、美国专利申请US2014/0179539和Nucleic Acids Research 33:e116,2016中)。因此，本领域普通技术人员熟知与本文所述的寡核苷酸组内的寡核苷酸的构建相关的设计参数(还参见美国专利申请US2008/0090238)。
靶杂交元件
如图1所描绘的，根据本公开使用的连接寡核苷酸组被设计为使得每个寡核苷酸包括如下的序列元件，所述序列元件在与所述组中的另一个寡核苷酸所在位置相邻的位置处与靶核酸杂交，使得当特定组中的所有寡核苷酸与靶核酸(即，与包括含靶位点的核酸)杂交时，它们可以通过连接酶彼此共价连接。
在一些实施方案中，连接寡核苷酸组仅包含两个(即，第一和第二)寡核苷酸，其中的每个寡核苷酸包括靶杂交元件，且其中的一个包括Cas识别元件；在一些实施方案中，另一个包括模板元件。在一些实施方案中，连接寡核苷酸组包含与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸之间的靶位点杂交的一个或多个桥接寡核苷酸。
靶识别元件
阅读本公开的本领域技术人员将理解，靶位点可以是任何目标序列–例如，其在特定样品中的存在将被评估。本领域技术人员将进一步意识到(例如，从文献中描述的其他连接系统，包括本文引用的那些)与选择连接寡核苷酸组内寡核苷酸中单个靶杂交元件的长度和/或序列特征(例如，GC含量等)相关的设计考虑。
Cas识别元件
阅读本公开的本领域技术人员将进一步理解，Cas识别元件是被Cas gRNA结合并且可以被设计、选择和/或特别优化用于在如本文所述的检测系统中使用的序列(或在一些实施方案中，其补体)。如前所述，所提供的技术的一个特点是不必为每个靶核酸设计或利用不同的Cas识别元件；在连接步骤期间，Cas识别元件典型地不与靶核酸杂交。
在本公开的一些实施方案中，例如，当多个连接寡核苷酸组(即，设计用于检测不同的靶核酸)有待被同时使用(例如，一起在相同的反应中)时，所希望的是不同的连接寡核苷酸组具有不同的Cas识别元件(例如，每个连接寡核苷酸组可具有其自己的Cas识别元件)，但在一些实施方案中，多个不同的连接寡核苷酸组或甚至所有的连接寡核苷酸组可包括相同的Cas识别元件。
阅读本公开的本领域技术人员将理解，在一些实施方案中，Cas识别元件可以先于靶识别元件，在靶识别元件之前、上游和/或在5’处。在一些实施方案中，Cas识别元件可以跟随靶识别元件，继靶识别元件之后，在靶识别元件之后、下游和/或在其3’处。参见，例如，图7
模板元件
连接寡核苷酸组内的至少一个寡核苷酸将典型地包括模板元件，其允许和/或指导连接链的模板化。
在许多实施方案中，模板元件将是或包含可延伸寡核苷酸(即引物)的结合位点。连接链与这种寡核苷酸和合适的延伸酶(例如，DNA聚合酶)一起孵育产生模板链，使得产生双链体核酸。
在一些实施方案中，这样的双链体核酸包括结合位点第二可延伸寡核苷酸(即，第二引物)，使得所述双链体可以通过聚合酶链反应扩增；在此类实施方案中，相对于第一寡核苷酸，第二可延伸寡核苷酸的结合位点典型地在第二寡核苷酸中，在Cas识别元件的远端，使得在将双链体与第一引物和第二引物(或不同的引物对，只要它跨越Cas识别元件)和DNA聚合酶(例如，热稳定的DNA聚合酶)孵育时，产生包含Cas识别元件的双链体的多个拷贝。
在一些实施方案中，模板元件可以是或包括启动子和/或一个或多个转录调控元件(例如，增强子、阻遏子结合位点等)，使得连接链的多个RNA模板(或拷贝)通过将例如，如上所述的双链体与RNA聚合酶孵育而产生。
在一些实施方案中，模板元件可以是或包括复制起点，使得通过与DNA聚合酶一起孵育来产生连接链的多个DNA模板(或拷贝)。
阅读本公开的本领域普通技术人员将理解，可以选择用于在特定实施方案中使用的合适的模板元件来产生(或允许准备产生–例如通过变性)模板化的产物(例如，RNA、ssDNA或dsDNA)，其对于任何Cas酶(例如，Cas9、Cas12、Cas13、Cas14等)有效作为Cas活化核酸将被用于本文所述的切割过程。
活化核酸
“活化”核酸，如本公开中使用的该术语，是gRNA与之杂交的核酸，从而活化相关的Cas酶(并且，更具体地，其侧支活性)。
本领域技术人员将意识到不同的Cas酶被不同类型的活化核酸(例如，RNA、ssDNA、dsDNA或其组合)活化，并且将能够容易地根据本公开设计系统，产生适合于特定使用的Cas酶的活化核酸。
本领域技术人员将意识到，例如，Cas13酶通常被RNA活化，而Cas12酶通常被DNA活化。
在本公开的一些实施方案中，Cas活化核酸是或包括RNA。在一些实施方案中，Cas活化核酸是或包括ssDNA。在一些实施方案中，Cas活化核酸是或包括dsDNA。
在一些实施方案中，Cas活化核酸不是扩增的靶核酸。
典型地，根据本公开的活化核酸通过一个或多个模板元件的作用产生。
Cas酶
Cas酶最初被鉴定为CRISPR(代表“规则间隔的短回文重复序列的簇”)-Cas(代表“CRISPR相关的”)系统的一部分，所述系统为微生物提供对感染性核酸的适应性免疫。本领域技术人员意识到大量的Cas酶，以及将它们分为不同类别的其序列元件和功能性特征。1类CRISPR-Cas系统具有多亚基效应子复合物；2类系统具有单亚基效应子。
已经描述了至少六种不同“类型”的Cas蛋白；I型、II型和IV型是1类酶，而II型(包括Cas9)、V型(包括Cas12和Cas14)和VI型(包括Cas13)是2类酶。用于鉴定Cas酶并对它们进行分类(例如，基于RuvC结构域和/或一种或多种其他序列元件的存在、组织和/或序列)的技术目前是本领域众所周知的。此外，已经制备了许多Cas变体，并且本领域技术人员对参与Cas酶活性(例如，对于其是必需和/或足够的)的结构(例如，序列)元件有很好的理解。
阅读本申请的本领域技术人员将理解，在各种实施方案中，所提供的技术可以利用任何具有切割活性的Cas酶(或其变体，例如工程化变体)，所述切割活性适合于读出有待被利用并被gRNA结合活化。此外，阅读本公开的本领域技术人员将非常熟悉适合于匹配的设计选择等，例如特定类型的Cas与特定的Cas活化核酸和/或切割底物(例如探针)。
侧支切割
某些Cas酶，特别是包括某些V型和VI型Cas酶，例如Cas12、Cas13和Cas14(例如，Cpf1/Cas12a、C2c2/Cas13a、Cas 13b、Cas13c、Cas14a等)已被证明当它们的gRNA/crRNA与其靶标结合时被活化时具有非特异性核酸酶活性。这种非特异性切割活性通常被称为“侧支切割”。
如上所述，最近开发的核酸检测系统利用Cas蛋白的侧支切割活性来检测目标靶核酸(或更准确地，其核苷酸序列包括靶位点的核酸)的存在。在许多实施方案中，本发明利用具有侧支活性的Cas蛋白，并检测该活性的活化/探针的切割。
位点特异性切割
在某些实施方案中，本公开可以利用切割底物而不是通过侧支切割的Cas酶；本领域技术人员将理解，许多或大多数Cas酶显示位点特异性切割活性，通常在其gRNA结合位点处或附近处。
通过提供将Cas活化与靶核酸序列杂交解除关联的技术，本公开允许使用位点特异性Cas切割读出系统，同时仍然避免需要为每个目标核酸靶工程化新的gRNA。因此，在一些实施方案中，位点特异性Cas切割可用作读出；在一些此类实施方案中，相关的Cas(例如，Cas9)不具有侧支切割活性。
本领域技术人员意识到已经开发和/或可用于检测Cas位点特异性切割活性的多种系统。举几个例子，可以采用从能够进行无细胞报告基因表达的dsDNA表达盒中切割失活DNA序列，或其他检测dsDNA断裂的方法。
指导RNA
当Cas酶的指导RNA与互补序列(本文称为“Cas识别元件”)杂交时，Cas酶被活化以切割(无论是特异性还是非特异性)核酸。众所周知，研究人员可以将指导RNA工程化以与任何目标序列杂交。另外，众所周知，指导RNA可以包括天然核苷酸、核苷酸类似物和/或其组合。所有这些已建立的知识都与本公开内容相关并且可以在本公开内容的实践中使用。
例如，本领域技术人员将理解，在一些实施方案中，指导RNA可以具有在约16-28个核苷酸(例如，约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、或约28个核苷酸)的范围内的长度(和/或与Cas识别元件杂交的部分)。
本领域技术人员还将理解，在某些实施方案中，指导RNA可以与相关Cas识别元件具有小于100％的完美互补性(例如，可以是约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或100％互补性)。
本文所述的系统的一个特征是，在某些实施方案中，它们可以被设计和/或利用来检测靶核酸，所述靶核酸不包括与具有侧支切割活性的Cas酶的指导RNA互补的序列元件。实际上，所提供的技术的一个优点是它们不需要为每个目标靶核酸对不同的指导RNA工程化。相反，可以提供和/或利用一种或多种有效的(例如，优化的和/或所希望的其他方式)指导RNA/Cas识别元件对来检测多种不同的目标靶核酸。
探针
根据本公开，Cas酶的切割(例如，侧支切割)活性可以通过检测合适探针的切割来检测。本领域技术人员意识到不同的Cas酶可以证明了关于不同探针的切割(并且特别是侧支切割)活性–例如，Cas13酶典型地侧支切割RNA探针；Cas12酶典型地切割ssDNA探针。Cas9酶通常不具有侧支活性并切割dsDNA底物。阅读本公开的本领域技术人员将能够容易地设计、选择和/或生产对特定Cas酶的侧支切割敏感的合适探针。
典型地，根据本公开使用的探针的特征在于其切割可以被检测。本领域技术人员意识到探针的多种策略和实施方案，其通过特定Cas酶的侧支切割是可检测的。仅举一个例子，在一些实施方案中，可以用荧光发射染料对(例如，FRET对或荧光/猝灭剂对)标记探针，使得改变(例如，增加–例如当探针被切割时，观察到荧光的猝灭、减少、波长变化或其组合)。合适的FRET对是本领域已知的(参见，例如，Bajar等人sensors(Basel),2016；Abraham等人PLoS One10:e0134436,2015)。
用于检测探针切割的各种其他策略也是本领域已知的，并且包括，例如，如关于SHERLOCKTM(参见，例如，WO 2018/107129，通过引用并入本文)所述的掩蔽构建体。
可选地或另外地，在一些实施方案中，探针可以是与表面偶联的合适的核酸，使得可以通过例如，检测与表面接近的DNA或RNA缀合的颗粒来检测探针的切割。
应用
阅读本说明书的本领域技术人员将立即理解它提供的技术在广泛的上下文中是有用的，并且能以多种格式应用。
在一些实施方案中，一种或多种组分(例如，靶核酸、一个或多个连接寡核苷酸、连接链、Cas活化核酸、Cas及其组合)可以与固体支持物缔合(例如，附接)。
在一些实施方案中，基本上同时利用多个连接寡核苷酸组，使得可以同时检测多个靶核酸。
在一些实施方案中，所提供的技术可以是多路的，例如，针对不同的靶核酸序列和/或不同的连接寡核苷酸利用不同的Cas酶(和/或读数)。
例示
实施例1:使用基于连接的转录活化和CRISPR侧支活性，对核酸进行灵敏性、特异性检测的示例性系统
本实施例描述了使用基于连接的转录激活和CRISPR侧支活性对核酸进行灵敏性、特异性检测的示例性系统。在这种提供的系统的属性中特别值得注意的是：(i)它可以将CRISPR侧支活性的活化与待检测的靶序列解偶联；和/或(ii)即使不使用扩增技术(例如等温扩增)，它也可以提供灵敏性和特异性检测，直至单个碱基判别。
如本文所述，最近开发的系统利用已针对某些Cas酶鉴定的所谓“侧支切割”活性来检测核酸被描述为“重大进步”(Kocak&Gersbach Nature 557:168,2018)和“分子诊断领域的革命”(Chertow Science360:381,2018)。描述这些系统的文献通常强调使用扩增技术的好处，或甚至需要使用扩增技术(特别强调某些等温扩增技术，诸如例如重组酶聚合酶扩增，RPA)，这些技术应用于靶样品以扩增靶核酸以实现超高灵敏性核酸检测(参见，例如，SHERLOCKTM系统，描述于例如Abudayeh等人的WO2018/107129；Gootenberg等人Science356:438,2017；Gootenberg等人,Science 360:439,2018中；和DETECTRTM系统，描述于例如Doudna的WO2017/218573；Chen等人Science 360:436,2018中；包括如在例如，ChertowScience 360:381,2018和Kocak&Gersbach Nature 557:168,2018中综述的)。
本公开尤其认识到在某些情况下依赖这种扩增可能是有问题的和/或不合需要的。此外，本公开提供了诸如本实施例中描述的系统，其提供了多种益处并且不利用这种靶-核酸扩增。
在文献中描述的SHERLOCKTM系统中，靶序列被等温扩增，然后通过例如Cas13a和设计的crRNA进行检测；这种检测活化了Cas13a侧支切割活性和报告基因分子的后续切割(例如，通过RNA连接的荧光猝灭剂)。本实施例描述了例如图2中所描绘的技术，其可以将侧支切割活性与靶序列解偶联。在图2所描绘的实施方案中，这种解偶联是基于靶序列的存在，通过产生crRNA相容序列(其可称为“活化RNA”并在图2中标记为“aRNA”)来实现。aRNA是通过无细胞转录产生的，所述转录通过由靶序列桥接的单链DNA的两个分子的连接(即，与靶序列的杂交并列)而活化。连接随后第二链合成产生能够进行aRNA的启动子驱动的转录的功能性dsDNA转录盒。
该系统的优点包括，例如，(i)可以消除经由常用等温扩增进行的预扩增(由于经由无细胞转录进行的aRNA扩增)；(ii)不需要设计对靶序列具有特异性的引物；(iii)DNA和RNA均可用于活化aRNA的表达；(iv)连接特异性使能够进行单碱基判别；(v)aRNA可能具有Cas活化序列(即通过crRNA结合)的重复序列，这可能潜在地允许从单个aRNA活化多种Cas酶；及(vi)其组合。
在图2所描绘的特定实施方案中，将一起构成转录盒(包括启动子和aRNA表达序列)的两条DNA有义链用于检测靶序列，使得所述靶序列桥接两条单链。上游链的3’端包含与靶序列的区域杂交的序列，并且下游链的5’端包含与靶序列的连续区域杂交的序列，连同的5’磷酸根，以实现连接。当存在靶序列时，它桥接两条链，从而能够通过连接酶(例如，小球藻属病毒DNA连接酶或T4 DNA连接酶)进行连接。第二链合成(例如，从包含的引物或发夹末端)经由链置换DNA聚合酶产生双链DNA转录盒，所述转录盒对于aRNA的转录(例如，通过T7转录)具有功能性。这种功能性aRNA活化合适的Cas酶(例如，Cas13a)的侧支活性，其crRNA与aRNA编码序列结合。
在某些实施方案中，可以例如通过将一种或多种另外的组分掺入所使用的系统中来增加产生的aRNA的速率和/或量。例如，在一些实施方案中(例如，如图4所描绘)，可以利用催化RNA-DNA杂交体中RNA水解切割的反转录酶和核酸内切酶。如参考图4可以看出，在标记为“步骤4”的步骤中，引物可以是具有合适的5’启动子序列的单独设计的引物，或者可以是与图上部描绘的上游传感器分子相同的分子；这种连接后扩增利用了先前描述为转录介导的扩增(TMA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)的技术。
实施例2:示例性多路系统
图5呈现了如本文所述的示例性多路测定–即，其中可以例如同时检测多个靶核酸的测定。如所示，可以在多个不同的核酸分子上或可以代表单个核酸分子上的多个区域(例如，不同的基因或位点，或单个基因内的不同区域)的多个靶核酸被不同的探针/引物组靶向。
多个连接寡核苷酸组，每个都针对特定的靶核酸，与样品接触并连接。任选地，合成一条或多条第二链，每条链与特定的连接产物互补。在一些实施方案中，合成了多个这样的第二链。在一些此类实施方案中，两条或更多条此类第二链以及任选地所有第二链通过相同引物的延伸产生，所述引物与存在于每个相关连接引物组的一个引物中的序列杂交。仍进一步任选地，在一些实施方案中，例如通过诸如PCR或LCR的扩增，产生通过这种第二链合成形成的双链体的一条或两条链的另外拷贝。再次，在一些实施方案中，一种或多种共同引物可用于合成两条或更多条或任选地全部连接链的拷贝。
在一些实施方案中，用于连接和(任选的)第二链合成和/或扩增的试剂包括在“单罐”反应中。
在一些实施方案中，连接(和任选的第二链合成和/或扩增)的产物被分配到多个孔并与不同的Cas系统接触，所述系统的特征在于通过识别靶核酸之一而活化的侧支活性。如所示，在一些实施方案中，Cas系统可以是或包含Cas12/Cas12样(即，具有通过识别特定DNA序列而活化的侧支活性的Cas)系统；在一些实施方案中，Cas系统可以是或包含Cas13/Cas13样(即，具有通过识别特定的RNA序列而活化的侧支活性的Cas)系统。
在一些实施方案中，连接和/或延伸/扩增可以在“单罐”中进行。在一些实施方案中，延伸/扩增和/或侧支切割可以在“单罐”中进行。在一些情况下，可以在“单罐”中进行连接和/或侧支切割，以及任选地任何链延伸和/或扩增。本领域技术人员将理解，特别是对于在“单罐”中进行延伸/扩增和侧支切割的测定，可能希望利用酶(例如，DNA聚合酶和/或一种或多种Cas酶)，所述酶的一种或多种相关活性具有足够的热稳定性。
图6描绘了这种示例性测定的特定实施方案，其中进行了扩增，并且此外所有连接的产物都被制成双链，然后通过对单个“通用”引物组进行延伸来扩增；然后将产物分配到孔中，并进行Cas12和/或Cas13测定。由该图说明的特定实施方案显示为在所谓的“蜂窝(honeycomb)”管中进行，此类管已经由例如Cepheid描述，包括在美国专利申请US2014/0087958中。
如图5和图6中描述的测定的特别的优点包括，例如，(i)可以实现低拷贝检测，特别是在利用扩增前PCR或LCR(转录)的实施方案中；(ii)高特异性-可以对扩增前和Cas活化步骤实现单核苷酸判别；(iii)使用通用引物的高度多路PCR/LCR；(iv)与已知系统(例如蜂窝系统)相容。
实施例3具有不同的Cas识别元件放置的另外的示例性系统
单分子寡核苷酸被设计成在连接后代表如本文所述的寡核苷酸组(例如，寡核苷酸A和寡核苷酸B，连接以形成寡核苷酸AB)，其中Cas识别元件被置于靶识别元件的上游或靶识别元件的下游结合另外的间隔子元件。参见图8。然后使用每个寡核苷酸从RNA、由RNA聚合酶转录的dsDNA或原位转化为dsDNA然后转录为RNA的ssDNA中产生单个Cas靶RNA寡核苷酸。图9证明，每个寡核苷酸Cas靶都能够有效地活化Cas侧支切割。
然后设计连接寡核苷酸组，并将其与同源靶核酸(CT＝衣原体，FLU＝甲型流感病毒)一起孵育以进行如图2所描述的测定。如图10A所示，当设计连接寡核苷酸组使得Cas识别元件在靶识别元件的下游3’(即，Cas识别元件在杂交元件的下游)时，所述系统在低背景下是有活性且灵敏的。然而，图10B证明，在相反的顺序中，即Cas识别元件在靶识别元件的上游或5’，所述测定不那么稳健，并证明了更高的背景信号。
实施例4ssDNA作为Cas13活化核酸的证明
本实施例证明了通过单链的DNA(ssDNA)对Lwa Cas13活性的活化。图11A显示了ssRNA-靶Cas13系统的标准活性。靶RNA与Cas13-指导RNA复合物的结合活化了侧支Cas切割，这可以通过(例如)由RNA桥连接的荧光团-猝灭剂对的切割来监测。值得注意的是，在标准ssRNA(图11B，右)或ssDNA(图11B，左)靶序列存在的情况下，观察到了侧支切割活性。
等效方案
本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或者能够确定本文所描述的发明的具体实施方案的很多等效方案。本发明的范围并不旨在限于上述描述，而是如以下权利要求中所述：

Claims (26)

1.一种系统，所述系统包括：
具有不同核苷酸序列的多个核酸分子；
连接寡核苷酸组，所述连接寡核苷酸组包含：
第一连接寡核苷酸，其核苷酸序列包括模板元件和第一靶杂交元件；和
第二连接寡核苷酸，其核苷酸序列包括第二靶杂交元件和Cas识别元件；以及
任选地一个或多个桥接寡核苷酸，其核苷酸序列是或包括一个或多个另外的靶杂交元件，
其中所述靶杂交元件结合至共同靶位点的不同部分，使得当所述多个核酸分子包括至少一个其核苷酸序列包括所述靶位点的核酸分子时，所述连接寡核苷酸组则与所述靶位点杂交并且形成易于与连接酶连接的有缺口的核酸链，从而产生连接链。
2.如权利要求1所述的系统，所述系统进一步包括连接酶。
3.如权利要求1所述的系统，其中所述寡核苷酸中的一个或多个与固体支持物缔合。
4.如权利要求1所述的系统，其中所述多个核酸与固体支持物缔合。
5.如权利要求1所述的系统，所述系统进一步包括与第一连接寡核苷酸组不同的、指向第二靶位点的第二连接寡核苷酸组。
6.如权利要求5所述的系统，其中所述第一连接寡核苷酸组和第二连接寡核苷酸组的模板元件是相同的。
7.如权利要求5所述的系统，其中所述第一连接寡核苷酸组和第二连接寡核苷酸组的模板元件是不同的。
8.如权利要求5-7中任一项所述的系统，其中所述第一连接寡核苷酸组和第二连接寡核苷酸组的Cas识别元件是相同的。
9.如权利要求5-7中任一项所述的系统，其中所述第一连接寡核苷酸组和第二连接寡核苷酸组的Cas识别元件是不同的。
10.如权利要求1所述的系统，其中所述模板元件是或包括启动子或其补体。
11.如权利要求1所述的系统，其中所述模板元件是或包括复制起点或其补体。
12.如权利要求1所述的系统，其中所述模板元件是或包括第一可延伸引物的结合位点。
13.如权利要求12所述的系统，所述系统进一步包括第一可延伸引物。
14.如权利要求12或权利要求13所述的系统，所述系统进一步包括DNA聚合酶。
15.如权利要求12或权利要求13所述的系统，其中所述第二连接寡核苷酸具有包括第二可延伸引物的结合位点的补体的序列。
16.如权利要求15所述的系统，所述系统进一步包括第二可延伸引物。
17.如权利要求16所述的系统，所述系统进一步包括DNA聚合酶。
18.如权利要求17所述的系统，其中所述DNA聚合酶是热稳定的。
19.如前述权利要求中任一项所述的系统，所述系统进一步包括RNA聚合酶。
20.一个连接寡核苷酸组，所述连接寡核苷酸组包含：
第一连接寡核苷酸，其核苷酸序列包括模板元件和第一靶杂交元件；和
第二连接寡核苷酸，其核苷酸序列包括第二靶杂交元件和Cas识别元件；以及
任选地一个或多个桥接寡核苷酸，其核苷酸序列是或包括一个或多个另外的靶杂交元件，
其中所述靶杂交元件结合至共同靶位点的不同部分，使得当使所述连接寡核苷酸组与其核苷酸序列包括靶位点的核酸分子接触时，所述连接寡核苷酸组则与所述靶位点杂交，并形成易于与连接酶连接的有缺口的核酸链，从而产生连接链。
21.一种方法，所述方法包括以下步骤：
使如权利要求20所述的连接寡核苷酸组在允许所述连接寡核苷酸组中的寡核苷酸与核酸样品中的一个或多个单个核酸分子同时杂交的条件下与所述核酸样品接触；
同时或随后使所述连接寡核苷酸组与连接酶接触，使得如果所述核酸样品包含至少一个其核苷酸序列包括靶位点的核酸分子，则产生连接链。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述模板元件是或包括可延伸引物的结合位点，并且所述方法进一步包括以下的步骤：
将所述可延伸引物与所述连接链杂交；以及
将所述可延伸引物延伸，使得形成双链体。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述模板元件进一步是或包括启动子，并且所述方法包括以下的步骤：
从所述启动子转录，使得产生包括所述Cas识别元件的转录物。
24.如权利要求22所述的方法，所述方法进一步包括以下的步骤：复制所述双链体的一条或两条链，使得产生各自包括所述Cas识别元件的单链或双链核酸分子的群体。
25.如权利要求23或权利要求24所述的方法，所述方法进一步包括以下的步骤：使所述Cas识别元件与以下接触：
以侧支活性为特征的Cas酶；和
与所述Cas识别元件结合的指导RNA，
所述接触是在当核酸探针易于被存在的所述Cas酶侧支切割时进行的；以及
检测所述核酸探针的切割。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述检测指示其核苷酸序列包括所述靶位点的靶核酸存在于所述核酸样品中，并且所述方法进一步包括：
对存在于所述核酸样品中的靶核酸的量进行定量。
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