EA031989B1

EA031989B1 - Ячеистая трубка

Info

Publication number: EA031989B1
Application number: EA201500369A
Authority: EA
Inventors: Ю-Мин Чиан; Даг Дорити; Дастин Диккенс; Дженнифер Гласс; Руэл Ван Атта
Original assignee: Сифейд
Priority date: 2012-09-26
Filing date: 2013-09-26
Publication date: 2019-03-29
Also published as: AU2013323428B2; AU2013323428A1; BR112015006566B1; US11739383B2; US20140087958A1; CA2886484A1; US20210164044A1; MX2015003859A; KR102214419B1; BR112015006566A2; US10870884B2; US20240076737A1; US20240068030A1; WO2014052671A1; JP2015532094A; CN105051546A; CN111979092A; US10190165B2; US20150275292A1; US20180245153A1

Abstract

Ячеистая трубка с плоской рамкой, ограничивающей проток для жидкости между первой плоской поверхностью и второй плоской поверхностью. На одном конце плоской рамки располагается средство сопряжения по жидкости. Такое средство сопряжения по жидкости имеет впуск для жидкости и выпуск для жидкости. Проток для жидкости, кроме того, включает планшетную ячейку, имеющую подложку планшета со множеством лунок. Планшетная ячейка располагается в плоской рамке между первой или второй поверхностью и подложкой планшета.

Description

Раскрытие изобретения

Некоторые варианты осуществления данного изобретения относятся к ячеистой трубке, которая может иметь плоскую рамку, ограничивающую проток для жидкости между первой плоской поверхностью и второй плоской поверхностью. На одном конце плоской рамки может располагаться средство сопряжения по жидкости. Такое средство сопряжения по жидкости может иметь впуск для жидкости и выпуск для жидкости. Проток для жидкости, кроме того, может включать планшетную ячейку, имеющую планшет с подложкой, в которой образовано множество лунок, при этом такая планшетная ячейка располагается в плоской рамке между первой или второй поверхностью и подложкой с лунками и при этом планшетная ячейка находится в сообщении по жидкости с впуском для жидкости и выпуском для жидкости.

В некоторых вариантах осуществления проток для жидкости может включать преамплификационную ячейку, устроенную в плоской рамке между первой и второй плоскими поверхностями.

В некоторых вариантах осуществления планшетная ячейка размещается между преамплификационной ячейкой и выпуском для жидкости.

В некоторых вариантах осуществления преамплификационная ячейка отсутствует.

В некоторых вариантах осуществления преамплификационная ячейка представляет собой узкий канал, содержащий один или несколько химикатов.

В некоторых вариантах осуществления преамплификационная ячейка может включать выход из ячейки, который находится в сообщении по жидкости с входом в планшетную ячейку.

В некоторых вариантах осуществления выход из преамплификационной ячейки отделен от входа в планшетную ячейку проходом.

В некоторых вариантах осуществления выход из преамплификационной ячейки может быть расположен на самом верхнем участке преамплификационной ячейки при вертикальной ориентации первой и второй плоских поверхностей.

В некоторых вариантах осуществления вход в планшетную ячейку может быть расположен в самом нижнем участке планшетной ячейки.

В некоторых вариантах осуществления вход в планшетную ячейку может быть расположен ниже преамплификационной ячейки.

В некоторых вариантах осуществления проход из преамплификационной ячейки в планшетную ячейку может располагаться под наклоном вниз.

В некоторых вариантах осуществления проток для жидкости содержит извилистый канал.

В некоторых вариантах осуществления проток для жидкости может быть бесклапанным.

В некоторых вариантах осуществления подложка планшета может иметь множество, от около 100 до около 1500, нанолунок.

В некоторых вариантах осуществления подложка планшета содержит множество лунок, имеющих диаметр от около 50 до около 500 мкм.

В некоторых вариантах осуществления подложка планшета может иметь множество нанолунок, каждая из которых имеет глубину около 100 мкм.

В некоторых вариантах осуществления подложка планшета может иметь множество нанолунок, где каждая лунка из множества нанолунок по глубине может располагаться в диапазоне от 25 до 1000 мкм.

В некоторых вариантах осуществления подложка планшета может иметь множество нанолунок, при этом каждая лунка из множества нанолунок имеет ширину в диапазоне от около 25 до около 500 мкм.

В некоторых вариантах осуществления подложка планшета может иметь множество нанолунок, при этом каждая лунка имеет объем около 8,5 нл.

В некоторых вариантах осуществления каждая лунка из множества лунок может иметь объем в диапазоне от около 0,1 до 500 нл.

В некоторых вариантах осуществления участок плоской рамки может ограничивать масляную ячейку для хранения гидрофобного материала.

В некоторых вариантах осуществления масляная ячейка может находиться в сообщении по жидкости с планшетной ячейкой.

В некоторых вариантах осуществления плоская рамка может быть каркасной структурой, продолжающейся от участка основания.

В некоторых вариантах осуществления первая и вторая плоские поверхности могут иметь первую и вторую пленки, которые обеспечивают закупоривание каркаса по отношению к жидкости.

В некоторых вариантах осуществления плоская рамка может находиться в сообщении по жидкости с контейнером для образцов через средство сопряжения по жидкости.

В некоторых вариантах осуществления подложка планшета может быть изготовлена из никелевого

- 1 031989 материала.

В некоторых вариантах осуществления множество лунок может содержать по меньшей мере один праймер нуклеиновой кислоты и/или зонд для амплификации и/или обнаружения специфической мишени.

В некоторых вариантах осуществления множество лунок может содержать молекулу, например антитело или нуклеиновую кислоту, для детектирования специфической мишени.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу обеспечения пробной жидкости к средству сопряжения по жидкости ячеистой трубки. Ячеистая трубка может иметь плоскую рамку, ограничивающую проток для жидкости между первой плоской поверхностью и второй плоской поверхностью, каждая из которых может герметизироваться тонкой гибкой пленкой. Планшетная ячейка протока для жидкости может заполняться пробной жидкостью, которая содержит предназначенный для анализа материал, и может, кроме того, содержать один или несколько реагентов для выполнения испытаний, таким образом, чтобы множество лунок в планшетной ячейке заполнялось пробной жидкостью. Пробная жидкость затем может эвакуироваться из планшетной ячейки так, чтобы множество лунок оставались, по меньшей мере, частично заполненными пробной жидкостью.

В некоторых вариантах осуществления преамплификационная ячейка присутствует в протоке для жидкости перед планшетной ячейкой и реакционная жидкость перед заполнением планшетной ячейки подвергается этапу амплификации в преамплификационной ячейке.

В некоторых вариантах осуществления преамплификационная ячейка может включать самый верхний выпуск из преамплификационной ячейки и преамплификационная ячейка может заполняться до уровня ниже самого верхнего выпуска из преамплификационной ячейки.

В некоторых вариантах осуществления гидрофобный материал эвакуируется из планшетной ячейки. В некоторых вариантах осуществления планшетная ячейка после удаления гидрофобного материала далее заполняется водосодержащей жидкостью.

В некоторых вариантах осуществления и к первой, и ко второй плоской поверхности применяются циклы нагревания и/или охлаждения.

В некоторых вариантах осуществления циклы нагревания и/или охлаждения применяются либо к первой, либо ко второй плоской поверхности.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к выполнению мультиплексной реакции амплификации в ячеистой трубке.

В некоторых вариантах осуществления пробная жидкость проводится по протоку для жидкости извилистым путем.

В некоторых вариантах осуществления мультиплексная реакция включает вложенную ПЦР.

В некоторых вариантах осуществления мультиплексная реакция отслеживается с помощью флуоресцентных индикаторов, указывающих на наличие ампликона.

В некоторых вариантах осуществления наличие ампликона обнаруживается способом анализа кривой плавления.

В некоторых вариантах осуществления мультиплексная реакция обнаруживает наличие или отсутствие по меньшей мере одного однонуклеотидного полиморфизма (SNP).

В некоторых вариантах осуществления материал проб, используемый в мультиплексной реакции, представлен биологической жидкостью или является полученным из биологической жидкости.

В некоторых вариантах осуществления материал проб представлен образцами ткани или является полученным из образца ткани.

В некоторых вариантах осуществления реакция детектирует наличие или отсутствие белка-мишени.

В некоторых вариантах осуществления реакция детектирует наличие или отсутствие нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота является ДНК.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота является мРНК.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота является микроРНК.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1А, 1В и 1С показана ячеистая трубка согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, вид в перспективе, с правой стороны и с левой стороны соответственно.

На фиг. 1D и 1E соответственно показаны ячеистые трубки согласно некоторым вариантам осуществления данного изобретения, виды справа.

На фиг. 2А-2Н показаны участки ячеистой трубки, виды в поперечном сечении, демонстрирующие различные варианты выполнения подложки планшета 120 согласно некоторым вариантам осуществления изобретения.

На фиг. 3А показан способ обеспечения подложки планшета 120 материалом праймера согласно некоторым вариантам осуществления данного изобретения, вид в перспективе.

На фиг. 4А-4Е показаны различные способы заполнения подложки планшета пробной жидкостью согласно некоторым вариантам осуществления данного изобретения.

На фиг. 5A-5F показаны различные положения узлов датчика относительно ячеистой трубки со- 2 031989 гласно некоторым вариантам осуществления данного изобретения.

На фиг. 6 показана система контроля и обработки жидкости, предназначенная для обеспечения пробной жидкости к ячеистой трубке, согласно некоторым вариантам осуществления изобретения.

На фиг. 7-13 показаны этапы примера выполнения мультиплексного SNP анализа ПЦР согласно примеру 1.

Осуществление изобретения

I. Модельная конструкция ячеистой трубки.

В данном контексте термин ячеистый описывает множество лунок, которые обеспечиваются в поверхности твердой подложки в заранее заданных положениях. В некоторых вариантах осуществления ячеистая трубка этого изобретения содержит по меньшей мере 100 или 200 лунок. В некоторых вариантах осуществления ячеистая трубка может содержать любое количество лунок между около 100 и 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 или более лунок. Лунки могут иметь любую форму, а их местоположение, хотя и задается заранее, может упорядочиваться на подложке в любой форме или по любому образцу. В данном контексте термин ячеистая трубка может употребляться на равных основаниях с планшетной ячейкой, многолуночной реакционной ячейкой или многолуночной реакционной трубкой.

На фиг. 1А, 1В и 1С показана ячеистая трубка 100 в перспективе, с правой стороны и с левой стороны соответственно. Ячеистая трубка 100 (термин используется взаимозаменяемо с многолуночной реакционной ячейкой) включает плоскую рамку 102, которая в некоторых вариантах осуществления является подобной ферме структурой, образованной из полимерного (например, полипропилен/акрилового субстрата) или металлического материала, который обычно является ПЦР-совместимым. Плоская рамка 102 может быть образована в виде открытой фермы или каркаса, ограниченного на открытых сторонах первой плоской подложкой 104 и второй плоской подложкой 106.

Первая плоская подложка 104 и вторая плоская подложка 106 могут быть образованы из относительно тонкой полимерной пленки, которая приклеена или иным способом присоединена к плоской рамке 102. В некоторых вариантах осуществления вся или участки одной из первой плоской подложки 104 и второй плоской подложки 106 могут быть образованы в виде единого целого с плоской рамкой 102 (например, с помощью 3-D принтера, формованием, совместным формованием или механической обработкой одной из подложек с плоской рамкой 102). В некоторых вариантах осуществления первая плоская подложка 104 и вторая плоская подложка 106 изготавливаются, как здесь изображено, из прозрачного материала. Каждая из первой плоской подложки 104 и второй плоской подложки 106 включают поверхности, обращенные вовнутрь и наружу. Эти внутренние поверхности образуют с внутренними полостями плоской рамки 102 протоки для жидкостей.

Один участок плоской рамки 102 образует средство 108 сопряжения по жидкости. Средство 108 сопряжения по жидкости является элементом конструкции, выступающим в качестве консоли для большей части плоской рамки 102. Средство 108 сопряжения по жидкости может быть образовано в виде единого целого с плоской рамкой 102. Средство 108 сопряжения по жидкости также служит в качестве средства механического присоединения к картриджу, который описывается здесь в другом месте. Средство 108 сопряжения по жидкости включает впуск 110 для жидкости и выпуск 112 для жидкости, которые обеспечивают сопряжение по жидкости для картриджа или контейнера для образцов. Каждый впуск 110 для жидкости и выпуск 112 для жидкости находятся в сообщении по жидкости с протоком 114 для жидкости, который образован в плоской рамке 102 между первой плоской подложкой 104 и второй плоской подложкой 106. Следует понимать, то применение терминов впуск и выпуск не ограничивает функцию впуска 110 для жидкости и выпуска 112 для жидкости. Таким образом, жидкость может вводиться и выводиться из обоих или из каждого. В некоторых вариантах осуществления проток 114 для жидкости является бесклапанным и, таким образом, увеличение или уменьшение наружного давления может быть применено внешней системой через впуск 110 для жидкости и выпуск 112 для жидкости для перемещения жидкости внутри протока 114 для жидкости, который продолжается от впуска (110) для жидкости к выпуску (112) для жидкости. Поперечное сечение протока для жидкости 114 может быть круглым или прямоугольным и может иметь диаметр или ширину в пределах от около 50 мкм до около 2 мм. Как правило, диаметр или ширина располагаются в диапазоне от около 250 мкм до около 1 мм.

Проток 114 для жидкости включает преамплификационную ячейку 116, которая является связанной по жидкости с планшетной ячейкой 118. Планшетная ячейка 118 удерживает подложку планшета 120 (также упоминаемую здесь как ячеистая структура), имеющую множество лунок (также упоминаемых здесь как нанолунки). Подложка планшета 120 может быть изготовлена из металла (например, золота, платины или никелевого сплава), керамики, стекла или другого ПЦР совместимого полимерного или композиционного материала. Подложка планшета 120 включает множество лунок. В некоторых вариантах осуществления подложка планшета 120 может включать 100-1000 лунок или более. Лунки могут быть образованы в подложке планшета 120 в виде глухих отверстий или сквозных отверстий. Лунки могут быть созданы внутри подложки планшета 120, например, сверлением лазером (например, эксимерным или твердотельным лазером), ультразвуковым тиснением, литографией с горячей штамповкой, гальванопластикой никелевых форм, литьем под давлением и инжекционным компрессионным формовани- 3 031989 ем. В некоторых вариантах осуществления подложка планшета 120 приклеена или совместно отформована с плоской рамкой 102, и в некоторых вариантах осуществления подложка планшета 120 является отформованной особенностью рельефа плоской рамки 102. В некоторых вариантах осуществления объем отдельной лунки может находиться в пределах от 0,1 до 1500 нл, в типичном случае от 0,5 до 200 нл, предпочтительно от 0,5 до 50 нл. Например, в некоторых вариантах осуществления каждая лунка может иметь объем около 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 15, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 или 500 нл. Г еометрические измерения могут иметь любую форму, например, круглую, эллиптическую, квадратную, прямоугольную, яйцевидную, гексагональную, восьмиугольную, коническую и другие формы, известные специалистам в данной области. Кроме того, форма лунки может иметь площадь поперечного сечения, которая изменяется вдоль оси. Например, квадратное отверстие может сходить на конус от первого размера ко второму размеру, который составляет некоторую долю от первого размера. В некоторых вариантах осуществления габариты лунки могут быть квадратными, с диаметрами и глубинами, являющимися приблизительно равным. В некоторых вариантах осуществления диаметр лунки и глубина не равны. В некоторых вариантах осуществления стенки, которые ограничивают лунку, являются не параллельными. В некоторых вариантах осуществления стенки, которые ограничивают лунку, сходятся в точке. Габариты лунки могут быть получены из общей вместимости подложки планшета 120. В некоторых вариантах осуществления глубина лунки может находиться в пределах от 25 до 1000 мкм. Например, в некоторых вариантах осуществления лунки могут иметь глубину 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр лунки может находиться в пределах от 25 до 500 мкм. Например, в некоторых вариантах осуществления лунки могут иметь ширину 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 или 500 мкм.

Таблица I. Габариты модельных подложек планшета (метрические)

				25 мкл пробирка	65 мкл пробирка	100 мкл пробирка
				Длина (мм)	Длина (мм)	Длина (мм)
				4,6	7,1	9,0
Диаметр	Глубина	Объем лунки	Шаг*	#лунки/ стороны	Всего лунок	# лунки/ стороны	Всего лунок	# лунки/ стороны	Всего лунок
(мм)	(мм)	(нл)	(mm^j)
од	од	0,8	0,23	20	400	31	961	39	1521
0,15	0,15	2,7	0,3	15	225	24	576	30	900
0,2	0,2	6,3	0,35	13	169	20	400	26	676
0,25	0,25	12,3	0,4	11	121	18	324	22	484

Участки подложки планшета 120, и/или внутренней части первой плоской подложки 104, и/или второй плоской подложки 106 могут быть модифицированы так, чтобы содействовать или препятствовать адгезии жидкости. Например, ограничивающие лунки поверхности могут быть покрыты гидрофильным материалом (или модифицированы для придания им гидрофильных свойств) и вследствие этого могут содействовать удержанию жидкости. Далее, плоские поверхности (окружающие внутренние поверхности, ограничивающие лунки) могут быть покрыты гидрофобным материалом (или модифицированы с приданием им гидрофобных свойств) и вследствие этого могут препятствовать удержанию на них жидкости. Могут быть выполнены и другие варианты обработки поверхности, такие, чтобы жидкость предпочтительно удерживалась внутри лунок, но не на верхних поверхностях, с тем, чтобы способствовать отводу излишней жидкости.

Лунки подложки планшета 120 могут быть расположены по такому шаблону, чтобы представлять простой геометрический рисунок выровненных рядов и колонок, или диагональное либо гексагональное расположение. В некоторых вариантах осуществления лунки подложки планшета 120 могут быть расположены так, чтобы образовывать сложные геометрические структуры, такие как хаотические структуры или структуры изогеометрического дизайна, как описано Schillinger и др. в Computer Methods in Applied Mechanics and Engineering, 22 января 2012. Лунки могут быть геометрически отделены друг от друга и/или могут характеризоваться большей глубиной по отношению к ширине, чтобы содействовать предупреждению перекрестного загрязнения реагентов во время процесса заполнения. В некоторых вариантах осуществления для препятствования перекрестному загрязнению реагентов могут применяться раскрываемые здесь способы и способы, известные средним специалистам в данной области.

Как показано на фиг. 1А, участок подложки планшета 120 может быть так соединен со второй плоской подложкой 106, чтобы образовывался зазор (позволяющий проходить жидкости) между передним участком подложки планшета 120 и первой плоской подложкой 104. Преамплификационная ячейка 116 в случае ее наличия включает выход 122 из преамплификационной ячейки, который располагается на самом верхнем участке преамплификационной ячейки 116 (в представленной ориентации). Вход 124 в планшетную ячейку расположен в самом нижнем участке планшетной ячейки 118. Наклонный, направленный вниз промежуточный проход 126 разделяет выход 122 из преамплификационной ячейки и вход

- 4 031989

124 в планшетную ячейку. Самый нижний впускной канал 128 и самый высокий выпускной канал 130 составляют остальные участки протока 114 для жидкости.

В некоторых вариантах осуществления плоская рамка 102 включает одну или несколько (то есть по меньшей мере одну) вспомогательных камер 132, которые используются для обеспечения рабочими жидкостями, такими как масло или другие химические растворы, преамплификационной ячейки 116, планшетной ячейки 118 и/или любых других участков протока 114 для жидкости. Такие вспомогательные камеры 132 могут быть связанными по жидкости с участками протока 114 для жидкости через одну или несколько мембран, вентилей и/или разделяемых давлением субстратов (то есть материалов, которые разрушаются при подвергании воздействию заранее определенного давления жидкости внутри вспомогательной камеры или смежного участка протока для жидкости 114), таких как металлическая фольга или тонкая пленка.

В некоторых вариантах осуществления проток для жидкости 114 может включать извилистые участки, как показано на фиг. 1D. Извилистая траектория между впускным каналом 128 и планшетной ячейкой 118 может быть полезной с точки зрения управления и манипуляций с проходящими в жидкости процессами. Было обнаружено, что извилистый маршрут может помогать в ослаблении образования газовых пузырьков, которые могут мешать протеканию через проток для жидкости масла. Показанная на фиг. 1D ячеистая трубка 100' в значительной степени является такой же, как и ячеистая трубка 100, представленная на фиг. 1А-1С, однако промежуточный проход 126' включает ряд удлиненных участков канала, соединенных петлевидным образом. Здесь отображены три удлиненных участка канала, однако применяться может большее или меньшее количество таких участков. Обычно применяются по меньшей мере 2 участка канала, но в некоторых вариантах осуществления применяются 2-10 удлиненных участков канала.

В некоторых вариантах осуществления проток для жидкости 114 включает крупные извилистые участки, как показано на фиг. 1E. Показанная здесь ячеистая трубка 100 в значительной степени является такой же, как и ячеистая трубка 100, представленная на фиг. 1А-1С, однако промежуточный проход 126 продолжается по большей части структуры ячеистой трубки 100. При таком способе удлиненные участки канала промежуточного прохода 126' могут быть сделаны относительно широкими с тем, чтобы походить на удлиненные ячейки, в которых может выполняться амплификация. Здесь отображены четыре удлиненных участка канала, однако применяться может большее или меньшее количество таких участков. Обычно применяются по меньшей мере 2 участка канала, но в некоторых вариантах осуществления применяются 2-10 удлиненных участков канала. Выражены угловатые внутренние кривые, которые определяют промежуточный проход 126' между удлиненными каналами, являются выпуклыми для того, чтобы уменьшить площадь сечения между удлиненными каналами. Сниженная площадь сечения возле углов содействует уменьшению различий в скорости потока между жидкостями на внешнем радиусе кривой по сравнению с жидкостями на внутреннем радиусе кривой. Если такие различия в скорости потока оказываются слишком большими, то в результате может наблюдаться нежелательная кавитация, приводящая к образованию пузырьков. Здесь ширина поворотов составляет приблизительно 50% ширины удлиненных участков канала. В некоторых вариантах осуществления ширина поворотов находится в диапазоне от 10 до 90% ширины удлиненных участков канала. В некоторых вариантах осуществления ширина поворотов варьирует относительно друг друга.

Как указано выше, показанная в фиг. 1E геометрия канала может быть полезной для управления и манипулирования с протекающими в жидкостях процессами. Хотя преамплификационная ячейка и не показана, одна или несколько могут быть включены в зависимости от конкретного применения данной ячеистой трубки 100. Следует понимать, что с показанной геометрией, если образец включает очень немного копий мишени (то есть 1 или 2), то после амплификации амплифицированная мишень не сможет смешаться и равномерно распределиться из-за линейной природы извилистого канала. Таким образом, может быть необходимым направить жидкость обратно в картридж (или в канюлю шприца, или в отдельную камеру) для смешивания и равномерного распределения ампликонов перед заполнением лунок планшетной ячейки.

На фиг. 2А-2Н показаны поперечные сечения участков ячеистой трубки, демонстрирующие различные варианты осуществления подложки планшета 120.

На фиг. 2А показан вариант осуществления, при котором лунки подложки планшета 120 созданы в виде глухих отверстий, проделанных в плоской рамке 102. В этом варианте осуществления вторая плоская подложка 106 образована в виде единого целого с плоской рамкой 102, так, что они являются по существу цельным блоком материала. Материалы праймера/пробы 134 показаны помещенными в каждую лунку подложки планшета 120.

На фиг. 2В показан вариант осуществления, при котором лунки подложки планшета 120 созданы в виде проделанных в подложке сквозных отверстий, такой как полимерная пленка, которая нанесена на плоскую рамку 102. Например, для образования подложки планшета со сквозными отверстиями может выполняться сверление отдельной подложки с ее последующим приклеиванием или привариванием к плоской рамке 102. В этом варианте осуществления вторая плоская подложка 106 образована в виде единого целого с плоской рамкой 102, так что они являются, по существу, цельным блоком материала. В

- 5 031989 некоторых вариантах осуществления глухие отверстия могут быть образованы внутри второй плоской подложки 106, которая может быть нанесена на плоскую рамку 102.

На фиг. 2С показан вариант осуществления, при котором лунки подложки планшета 120 созданы в виде сквозных отверстий, образованных внутри участка плоской рамки 102. В этом варианте осуществления вторая плоская подложка 106 выполнена в виде единого целого с плоской рамкой 102, а подложка планшета 120 является отдельным компонентом, который приклеивается или приваривается к карману внутри плоской рамки 102.

На фиг. 2D показан вариант осуществления, при котором лунки подложки планшета 120 созданы в виде сквозных отверстий, образованных внутри участка плоской рамки 102, как показано на фиг. 2С. Однако в этом варианте осуществления между плоской рамкой 102 и второй плоской подложкой 106 расположена газопроницаемая мембрана 136. Мембрана 136 позволяет газу эвакуироваться из лунок через мембрану, не давая возможности пройти жидкости. Г азопроницаемая мембрана может быть приклеена к подложке планшета с помощью газопроницаемого адгезивного материала. В некоторых вариантах осуществления мембрана 136 изготавливается из полидиметилсилоксана (PDMS) и имеет толщину в пределах от 20 до 1000 мкм, а в некоторых вариантах осуществления имеет толщину в пределах от 100 до 200 мкм.

На фиг. 2Е показан вариант осуществления, при котором лунки подложки планшета 120 созданы в виде глухих отверстий, образованных внутри участка плоской рамки 102. В этом варианте осуществления вторая плоская подложка 106 выполнена в виде единого целого с плоской рамкой 102, а подложка планшета 120 является отдельным компонентом, который приклеивается или приваривается к карману внугри плоской рамки 102.

Вся или участки подложки планшета 120 могут быть содержащими проводящие металлические участки (например, из золота) для того, чтобы сделать возможной теплопередачу от металла к лункам. Например, участок подложки планшета 120, который размещается напротив второй плоской подложки 106, может быть металлической пластинкой или покрытием. В некоторых вариантах осуществления для обеспечения возможности теплопередачи металлом могут быть покрыты внутренние поверхности лунок.

На фиг. 2F показан вариант осуществления, который выполнен аналогичным образом по отношению к варианту осуществления на фиг. 2D. Однако здесь подложка планшета располагается посередине между первой и второй подложками. Газопроницаемая мембрана 136 может быть приклеена к подложке планшета с помощью газопроницаемого адгезивного материала. Как и в случае варианта осуществления, показанного на фиг. 2D, при заполнении жидкостью воздух может выходить через газопроницаемую мембрану к задней части лунок. После заполнения лунок ПЦР-буфером и повторного гидратирования в лунки помещается сухой праймер, для препятствования взаимным помехам обе стороны подложки планшета 120 могут наполняться изолирующим маслом или теплопроводящей жидкостью.

На фиг. 2G показан вариант осуществления, который выполнен аналогичным по отношению к варианту осуществления на фиг. 2F образом. Однако в данном случае мембрана не включается. Таким образом, рабочие жидкости могут подвергаться воздействиям с обеих сторон подложки планшета 120. После заполнения лунок ПЦР-буфером и повторного гидратирования в лунки помещается сухой праймер, для препятствования взаимным помехам обе стороны подложки планшета 120 могут наполняться изолирующим маслом или теплопроводящей жидкостью.

На фиг. 2Н показан вариант выполнения подложки планшета 120, пригодной для применения с любым из показанных раскрываемых здесь вариантов осуществления, например, иллюстрируемых на фиг. 2A-2F. Здесь лункам 121 подложки планшета 120 придана форма конуса, сужающегося подобно рожку от большего диаметра к меньшему диаметру. Было обнаружено, что конусообразные лунки представляют преимущество в процессе применения праймера, поскольку наклонные стенки лунок позволяют использовать бесконтактный способ осаждения (например, струйный) при внесении жидкого реактива, включающего материал праймера. Кроме того, конусообразные лунки делают возможным более легкое применение жидкого реактива как для контактного, так и для бесконтактного способов нанесения жидкого реактива, так как коническая форма способствует высыханию. Также было найдено, что конусообразная форма лунок помогает препятствовать пузырькам и протечкам в случае наличия газопроницаемой мембраны 136.

На фиг. 3А показан способ обеспечения подложки планшета 120 материалом праймера. Можно видеть, что для наполнения лунок жидким праймером, который может быть высушен в лунке, или же жидкостью, которая может быть закупорена в лунке после наполнения, может использоваться коммерчески доступная печатающая игла. В некоторых вариантах осуществления после снабжения подложки планшета 120 праймером в жидкой форме материал праймера может быть высушен, так, чтобы в каждой лунке для позднейшего разжижения оставался только налипший осадок праймера. Примеры таких игл (и соответствующие системы) включают 946МР(x) серию игл производства ArrayIt Corporation, дислоцирующейся по адресу 524 East Weddell Drive, Sunnyvale, CA 94089, США. Для снабжения материалом праймера могут также применяться способы, раскрытые в патентных документах US № 2009/0054266, Hasan и др., и US № 6716629, Hess и др. В ходе процесса применения печатающая игла может быть сконфигурирована таким образом, чтобы контактировать с подложкой планшета 120. В некоторых вариантах осуще- 6 031989 ствления для снабжения лунки жидким реагентом (например, праймером) может применяться бесконтактный способ, приводящий к высушенному реагенту на одной или нескольких стенках, которые ограничивают лунку, например, способ на капельной основе, такой как струйная печать или другие подходящие бесконтактные способы, известные специалистам в данной области.

II. Загрузка образца в ячеистые трубки.

На фиг. 4А и 4В показан способ заполнения подложки планшета 120 пробной жидкостью. На фиг. 4А пробная жидкость продвигается (например, под действием давления) между подложкой планшета 120 и первой плоской подложкой 104. При прохождении жидкости по подложке планшета 120 каждая лунка наполняется жидкостью, которая первоначально сохраняется внутри лунки благодаря поверхностному натяжению. Как указывалось выше, такие участки подложки планшета 120, как ограничивающие лунки стенки, могут быть покрыты гидрофильным материалом или обработаны так, чтобы стать относительно более гидрофильными, и таким образом поощряется полное и однородное заполнение лунок при прохождении по ним пробной жидкости. Помимо этого, другие поверхности подложки планшета 120, такие как верхние поверхности, окружающие поверхности лунок, могут быть покрыты гидрофобным материалом или так обработаны, чтобы стать относительно более гидрофобными с тем, чтобы проба жидкости сохранялась только в лунках, а не на соседних поверхностях, и таким образом снижается доля плохо согласующихся результатов испытаний. Помимо этого, внутренняя поверхность первой плоской подложки 120 может быть покрыта или обработана для обеспечения гидрофобного эффекта. На фиг. 4В можно видеть, что после отвода пробной жидкости заполненными оказываются только лунки. В некоторых вариантах осуществления пробная жидкость может быть продвинута, как показано на фиг. 4В', в сопровождении воздушного кармана, и таким образом теряется необходимость в извлечении образца, как это показано в примере осуществления, иллюстрируемом на фиг. 4В. Также могут применяться такие способы заполнения, как прерывистое смачивание, описываемое Jackman и др., Anal Chem., 1998, 70, 2280-2287, и Hatch и др. в Multilayer High-Density 3d Nanowell Arrays For Digital Biology 15th Int'l. Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, 2-6 октября 2011, 269-271. Вообще для того, чтобы избегнуть перекрестного загрязнения различных праймеров внутри лунок, подложка планшета 120 должна быть как можно быстрее лишена смачивающей способности.

На фиг. 4С и 4D показан способ заполнения подложки планшета 120 пробной жидкостью. На фиг. 4С подложка планшета 120 заполняется посредством комбинирования методик, показанных на фиг. 4А и 4В. Однако пробную жидкость в этом случае сопровождает карман с маслом. Хотя масло на фиг. 4С показано непосредственно контактирующим с пробной жидкостью, между масляным колпачком и пробной жидкостью может быть обеспечен воздушный зазор.

Как показано на фиг. 4D, после того, как каждая лунка оказывается заполненной пробной жидкостью, масло может прикрыть каждую лунку, что может содействовать снижению испарения, когда подложка планшета 120 подвергается термоциклированию. В некоторых вариантах осуществления после того, как лунки оказываются заполненными, масло может вводиться сверху ячейки и удаляться через вход 124 в ячейку, как показано на фиг. 4D'. В обоих вариантах осуществления, показанных на фиг. 4D и фиг. 4D', после того, как лунки оказываются прикрыты маслом, ячейка 118 может быть заполнена водным раствором с целью улучшения теплопроводности. В некоторых вариантах осуществления находящийся в неподвижном состоянии водный раствор может быть внутри ячейки 118 подвергнут действию избыточного давления для прекращения движения жидкости и каких-либо пузырьков.

В некоторых вариантах осуществления после того, как лунки оказываются заполненными, во время термоциклирования внутри ячейки может в стационарном состоянии удерживаться масло, как показано на фиг. 4D. В некоторых вариантах осуществления находящееся в неподвижном состоянии масло может находиться внутри ячейки 118 под избыточным давлением для прекращения движения жидкости и каких-либо пузырьков.

Масло, такое минеральное масло, может применяться для изоляции каждой лунки и обеспечивать теплопроводность. Однако варианты осуществления данного изобретения не ограничиваются маслом. Применяться может любая теплопроводящая жидкость, такая как фторированные жидкости (например, 3М FC-40). То есть упоминание масла в этом раскрытии должно пониматься как включающее такие альтернативные варианты.

В некоторых вариантах осуществления после того, как лунки заполняются пробной жидкостью, как показано на фиг. 4С, масло может следовать за пробной жидкостью, чтобы прикрывать лунки, и сохраняется внутри планшетной ячейки 118. Эксперимент, детализирующий этот вариант осуществления, был выполнен, как описано в примере 3 и показано на фиг. 4Е.

На фиг. 5А и 5В показан модельный датчик в сборе, размещаемый на подложке планшета 120 для детектирования реакций. В некоторых вариантах осуществления узел А датчика располагается в непосредственном соседстве или напротив первой плоской подложки 104. В некоторых вариантах осуществления второй узел В датчика располагается в непосредственном соседстве или напротив второй плоской подложки 106. Каждый узел датчика может включать возбуждающие и/или детектирующие устройства для ПЦР-испытаний. В некоторых вариантах осуществления датчики являются оптическими датчиками для возбуждения и обнаружения флюоресценции.

- 7 031989

На фиг. 5С показан пример конструкции узла датчика, которая может применяться вместо или в комбинации с конфигурацией на фиг. 5А и 5В. Здесь узел А датчика располагается вдоль переднего края ячеистой трубки 100. В некоторых вариантах осуществления включается второй узел В датчика. В некоторых вариантах осуществления один или все узлы А и В датчика с фиг. 5А и 5В применяются в комбинации с одним или всеми узлами А и В датчика с фиг. 5С.

На фиг. 5D показана модельная конструкция узла датчика. В некоторых вариантах осуществления эта конфигурация узла датчика может применяться совместно с конфигурацией, показанной на фиг. 5А5С. Узел датчика включает детектор CCD/CMOS, присоединенный к волоконно-оптической лицевой панели (FOFP). Поверх FOFP нанесен слой фильтра, помещенный напротив или по соседству с мишенью, которая здесь является подложкой планшета 120. В некоторых вариантах осуществления фильтр может быть наслоен (сцеплен) непосредственно поверх CCD с FOFP, размещенной сверху, как показано на фиг. 5Е.

На фиг. 5F показан другой пример конфигурации узла датчика. В некоторых вариантах осуществления эта конфигурация может применяться совместно с одной или несколькими конфигурациями, показанными на фиг. 5А-5С. Здесь детектор CCD/CMOS соединен с двухлинзовой конструкцией с размещенным посредине фильтром. В некоторых вариантах осуществления фильтр может быть прикреплен к детектору CCD/CMOS.

III. Способы применения.

В некоторых вариантах осуществления пробная жидкость вводится во впуск 110 для жидкости и через впускной канал 128. Далее преамплификационная ячейка 116 может быть заполнена пробной жидкостью. Преамплификационная ячейка 116 может включать один или несколько реагентов для инициации желательной химической реакции и тем самым осуществлять амплификацию находящейся в ней жидкости. В некоторых вариантах осуществления жидкость может поддерживаться внутри преамплификационной ячейки 116 вплоть до, но не далее выхода 122 из преамплификационной ячейки до тех пор, пока не пройдет желательная реакция. Далее жидкость проходит через выход 122 из преамплификационной ячейки и попадает в направленный вниз наклонный проход 126. Затем жидкость минует вход 124 в планшетную ячейку и заполняет планшетную ячейку 118. В некоторых вариантах осуществления после прохождения амплификации жидкости в преамплификационной ячейке жидкость извлекается из преамплификационной ячейки через впуск для жидкости и попадает в отдельную камеру в картридже для обработки жидкости для смешивания и далее возвращается через впуск для жидкости с тем, чтобы пройти через преамплификационную ячейку для попадания в планшетную ячейку. Лунки подложки планшета 120 после этого могут быть заполнены согласно, например, способу, показанному на фиг. 4A-4D. Как только лунки подложки планшета 120 оказываются заполнены, жидкость может быть эвакуирована из планшетной ячейки 118 либо через выпускной канал 130, либо обратно через впускной канал 128. В некоторых вариантах осуществления масло, такое как минеральное масло, может быть нанесено поверх наполненных лунок для препятствования испарению в процессе термоциклирования. В некоторых вариантах осуществления к планшетной ячейке 118 прикладывается давление в пределах от 5 до 20 фунт/кв. дюйм. Таким образом, ПЦР буфер, а также любая теплопроводящая жидкость (масло) находится под воздействием избыточного давления для удержания ПЦР-жидкости и любых мелких пузырьков, потенциально могущих образовываться в ходе повторной гидратации сухих праймеров. Такое действие давления может вызвать иммобилизацию любых образовавшихся пузырьков таким образом, чтобы не происходило никаких оптических помех от движения пузырьков и жидкости. В некоторых вариантах осуществления гидратационная жидкость, такая как дистиллированная вода, может нагреваться внутри преамплификационной ячейки 116 или в одной из вспомогательных камер 132 с тем, чтобы в планшетной ячейке 118 обеспечивалась 100% влажность или же влажность, достаточно высокая для того, чтобы препятствовать испарению во время термоциклирования. После завершения заполнения подложка планшета 120 может быть нагрета внешним устройством, которое находится в тепловом контакте с ячеистой трубкой 100, для проведения термоциклирования ПЦР. В некоторых вариантах осуществления могут применяться бесконтактные способы нагревания, такие как RFID, с использованием точки Кюри, индуктивный или высокочастотный нагрев. Эти и другие бесконтактные способы нагревания известны средним специалистам в данной области и могут быть легко применены к раскрываемой здесь ячеистой трубке. В ходе термоциклирования ячеистая трубка может отслеживаться в отношении протекающих химических реакций с помощью отображенного на фиг. 5А-5Е датчика.

С использованием ячеистой трубки 100 может выполняться множество различных биологических испытаний, в типичном случае для целей индикации наличия в образце для испытаний по меньшей мере одного интересующего анализируемого компонента. Эти испытания включают, но не ограничиваются анализами связывания, основывающимися на специфической аффинности связывания между предварительно отобранной парой молекул (таком как антитело-антиген парное связывание или связывание двух полинуклеотидных последовательностей с достаточной комплементарностью), реакциями амплификации нуклеиновой кислоты, основывающимися на некоторых заранее определенных, базирующихся на нуклеотидных последовательностях критериях, и химическими реакциями, показательными с точки зрения присутствия молекул с заранее заданной активностью (таких как ферменты).

- 8 031989

В некоторых вариантах осуществления аналитические агенты или зонды, осажденные в ячеистой трубке в заранее определенном порядке, например, белки-приманки или нуклеиновые кислоты, иммобилизуются непосредственно на поверхности твердой подложки с минимальным структурным чередованием простых и кратных связей или модификацией поверхности подложки. Другими словами, такие агенты или зонды по существу маркированы на поверхности и упорядочиваются и удерживаются в пределах двухмерного участка. В некоторых вариантах осуществления подложка может быть изготовлена так, чтобы образовывать порядок расположения множества лунок или углублений с заранее заданными габаритами для размещения агентов или зондов, которые могут быть необратимо иммобилизованы внутри лунки или углубления, или же временно удерживаться внутри лунки или углубления на время проведения испытания. Другими словами, аналитические зонды будут удерживаться внутри трехмерного пространства.

Материал, подходящий для выполнения функции аналитических зондов ячеистой трубки, включает белки (например, непроцессированные белки, такие как антитела, белковые фрагменты или короткие пептиды), нуклеиновые кислоты (например, ДНК, РНК, микроРНК), углеводы, липиды, ткани, клетки или молекулы фактически любой химической природы. Другими словами, любой материал/молекула, которые известны в качестве применимых для изготовления микрочипов для мультиплексных анализов, могут применяться в ячеистой испытательной трубке данного изобретения.

IV. Обнаружение интересующих анализируемых компонентов.

Один объект настоящего изобретения относится к мониторингу оптического сигнала (с применением конфигурации датчика с фиг. 5А-5Е), показательного с точки зрения наличия в образце для испытаний по меньшей мере одного интересующего анализируемого компонента, например белка-мишени (например, антитела со специфической антигенностью), клетки-мишени, гена-мишени, целевой последовательности генов, транскрипции целевой мРНК или целевой нуклеиновой кислоты. Такой целевой анализируемый компонент(ы) может иметь любое происхождение: вирусное, бактериальное, грибковое, паразитарное (например, из простейших), животное или человеческое происхождение. Например, интересующими для обнаружения в образцах для испытаний анализируемыми компонентами могут быть вирусные белки, антитела против вирусных антигенов или последовательности ДНК/РНК, полученные из бактериального или вирусного генома. Неограничивающие примеры целевых анализируемых компонентов могут включать последовательности нуклеиновых кислот, таких как микро-РНК, гены млекопитающих, генетические варианты генов млекопитающих, такие как различные генетические мутанты, аллельные варианты или эпигенетические изменения (демонстрирующие различные профили в статусе метилирования) в онкогенах, генах-супрессорах опухолевого роста или любых других генах, которые подразумеваются в качестве релевантных по отношению к некоторым заболеваниям и состояниям и могут находиться в фокусе внимания при выполнении обнаружений с помощью ячеистой испытательной трубки этого изобретения. Модельные гены вирусов и/или белки, которые могут быть объектами интереса, могут включать без ограничений вирус человеческого иммуннодефицита 1 (HIV-1), цитомегаловирус человека (CMV), вирус гепатита С (HCV), вирус гепатита В (HBV), вирус папилломы человека (HPV), энтеровирус, вирус ветряной оспы; флавивирусы, гепаднавирусы, герпесвирусы, норовирусы, ортомиксовирусы, парвовирусы, паповавирусы, парамиксовирусы, пестивирусы, пикорнавирусы и вирус гриппа. Модельные гены бактерий и/или белки, которых могут быть мишенями обнаружения, представлены микобактериями туберкулеза (ТВ), возбудителем сибирской язвы, Legionella Pneumophilia, Chlamydia Trachomatis, Neisseria Meningitides, Xtaphylococcus aureus, Helicobacter Pylori и Enterococcus Faecalis. Вызывающие потенциальный интерес модельные человеческие гены представлены генами р53, BRCA1 и BRCA2, Her2/Neu и другими членами семейства EGFR, BCR-ABL, PTEN, RAS, RAF, Src, RB, Мус, VEGF, топоизомеразой и аллелем АРОЕе4.

Основные методики обнаружения и/или количественного определения различные интересующих анализируемых компонентов могут быть найдены, например, в публикациях Sambrook и Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3^rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); Ausubel и др., Current Protocols in Molecular Biology (1994); и Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988).

Для целей обнаружения наличия белка любой конкретной природы могут применяться различные варианты анализа связывания на основе аффинности, такие как иммунологические испытания. В некоторых вариантах осуществления испытания могут выполняться в формате сэндвич-анализа захватыванием белка-мишени из образца для испытаний с антителом (которое иммобилизируется на заранее определенном участке в ячеистой структуре или удерживается в заранее определенной лунке), обладающим специфической аффиностью связывания с полипептидом. Наличие белка далее может индицироваться с вторичным антителом, присоединенным к детектируемой метке, такой как генерирующая флюоресценцию молекула.

Для целей обнаружения наличия интересующих нуклеиновых кислот в типичном случае применяется зонд или молекула, содержащая полинуклеотидную последовательность, по существу комплиментарную для последовательности целевой нуклеиновой кислоты и способную к гибридизации с целевой последовательностью на базе спаривания оснований по Уотсону-Крику. И в этом случае зонд может

- 9 031989 быть иммобилизован или локализован на поверхности твердой подложки в заранее определенном положении или же в некоторых вариантах осуществления зонд может удерживаться в лунке в заранее определенном положении в пределах заранее определенной структуры на подложке. В зависимости от природы детектируемого полинуклеотида-мишени, например, в зависимости от того, является ли он двухцепочечным или одноцепочечным, детектируемый зонд может быть по существу поочередно идентичным последовательности-мишени или по существу поочередно идентичным последовательности, комплиментарной по отношению к последовательности-мишени. Другими словами, зонд оказывается способным к специфическому связыванию с целевой нуклеотидной последовательностью. В некоторых случаях зонд может содержать один сегмент, связывающийся с нуклеотидом-мишенью, а также несвязывающийся сегмент при условии, что наличие несвязывающего сегмента не мешает специфическому связыванию между связывающим сегментом и целевой нуклеиновой кислотой. В типичном случае связывающий сегмент будет иметь по меньшей мере 8, часто по меньшей мере 10, 12, 15, 20, 25, 30 или более соседних нуклеотидов, которые являются комплиментарными к любой нити целевой полинуклеотидной последовательности для обеспечения специфического распознавания последовательности-мишени. Зонд может в некоторых вариантах осуществления включать светоизлучающую функциональную группу для легкого обнаружения, например, флуоресцентную или люминесцентную молекулу, такую как флуоресцеин, родамин, техасский красный, фикоэритрин, гидроксикумарин, аминокумарин, каскадный голубой, тихоокеанский апельсиновый, желтый люцифер, аллофикоцианин, TruRed, FluorX или лантанид.

В некоторых вариантах осуществления применяются различные флуоресцентные индикаторы для отображения присутствия определенных полинуклеотидных последовательностей. В некоторых вариантах осуществления, когда применяется обычный флуоресцентный индикатор, эффективным для обнаружения наличия различных целевых полинуклеотидных последовательностей может оказаться способ детектирования по точке плавления.

Помимо формата анализа связывания, при котором детектирование интересующего анализируемого компонента проводится непосредственно на основе аффинности связывания анализируемого компонента по отношению к аналитическому агенту, обеспечиваемому в ячеистой трубке, амплификационная система испытаний для детектирования и/или количественной оценки содержания интересующих нуклеиновых кислот предлагает широкий спектр применений. В этой основывающейся на амплификации системе одна или несколько интересующих нуклеиновых кислот детектируются и/или определяются количественно после прохождения специфической для данной последовательности реакции амплификации. Кроме того, для обнаружения целевой нуклеиновой кислоты амплификационным способом в каждую лунку могут вноситься мультиплексные наборы праймеров для получения возможности выполнения обнаружения в формате вложенной ПЦР, например, первый набор праймеров может определять один участок последовательности-мишени и произвести ампликон, который делает возможной дальнейшую амплификацию с помощью одного или нескольких последующих наборов праймеров.

В некоторых вариантах осуществления интересующая нуклеиновая кислота является молекулой ДНК. Специфическая в отношении данной последовательности амплификация выполняется при обеспечении в каждой лунке ячеистой структуры по меньшей мере одного набора праймеров, свободных нуклеотидов и подходящей ДНК- или РНК-полимеразы с последующим подверганием ячеистой трубки действию температур и временной выдержки, подходящих для обеспечения синтеза и амплификации любой целевой полинуклеотидной последовательности.

Каждый праймер обычно представлен олигонуклеотидом (который может быть природным или синтетическим), способным при образовании посредством спаривания оснований двойной цепи с полинуклеотидной матрицей выступать в качестве точки инициации синтеза нуклеиновой кислоты и при этом продолжается от 3'-конца вдоль матрицы таким образом, чтобы образовывалась продолжающаяся двойная цепь. Достройка праймера обычно выполняется с полимеразой нуклеиновой кислоты, такой как полимераза РНК или ДНК. Последовательность нуклеотидов, добавляемых в процессе достройки, определяется полинуклеотидной последовательностью матрицы. В большинстве вариантов осуществления праймеры достраиваются полимеразой ДНК. Часто праймеры имеют длину в диапазоне от 6 до 40 нуклеотидов, в типичном случае от около 12 до около 20 нуклеотидов. Праймеры применяются в разнообразных реакциях амплификации нуклеиновых кислот, например, в реакциях линейной амплификации, использующих единственный праймер, или в полимеразных цепных реакциях (ПЦР), применяющих два или более праймеров. Руководства по выбору длины и последовательности праймеров для конкретных применений известны средним специалистам в данной области, см., например, издание под редакцией Dieffenbach PCR Primer: A Laboratory Manual, 2-е издание (Cold Spring Harbor Press, Нью-Йорк, 2003).

В контексте реакций амплификации нуклеиновой кислоты, такой как ПЦР, продукт амплификации целевой полинуклеотидной последовательности именуется ампликон. Ампликоны представляют собой популяцию полинуклеотидов, образующихся в результате достройки праймера, обычно в форме двухцепочечных полинуклеотидов. Ампликоны могут быть получены разнообразными реакциями амплификации, продукты которых являются репликами, получаемыми после многократных раундов амплификации одной или нескольких целевых нуклеиновых кислот. В целом продуцирующие ампликоны реакции амплификации являются направляемыми матрицей при спаривании оснований реагентов, когда и нуклео

- 10 031989 тиды, и олигонуклеотидные праймеры имеют комплементы в последовательности полинуклеотидов матрицы или полинуклеотидной мишени. Такая комплементарность требуется для получения продуктов реакции, или ампликонов. В некоторых случаях направляемые матрицей реакции являются удлинением праймера с полимеразой нуклеиновой кислоты или лигированием олигонуклеотидов с лигазой нуклеиновой кислоты. Такие реакции включают, но не ограничиваются полимеразной цепной реакцией (PCR), полимеразной линейной реакцией, лигазной цепной реакцией (LCR), реакцией амплификации замещением цепей (SDA), амплификацией, основанной на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA), амплификацией по типу катящегося кольца и другими подобными, см., например, Mullis и др., патентные документы US №№ 4683195; 4965188; 4683202 и 4800159 (PCR); Gelfand и др., патентный документ US №5210015 (ПЦР в режиме реального времени с использованием проб TaqMan); Wittwer и др., патентный документ US № 6174670; Landegren и др., патентный документ US № 4988617 (LCR); Birkenmeyer и др., патентный документ US № 5427930 (gap-LCR); Kacian и др., патентный документ US № 5399491 (NASBA); Walker, патентные документы US №№ 5648211 и 5712124 (SDA); Lizardi, патентный документ US 5854033; Aono и др., патентный документ № JP 4-262799 (амплификация по типу катящегося кольца); и т.п. В некоторых вариантах осуществления ампликоны одной или нескольких целевых нуклеиновых кислот производятся в один или несколько раундов ПЦР, например, вложенной ПЦР, выполняемой в ячеистой трубке настоящего изобретения.

Полимеразная цепная реакция, или ПЦР, является ферментативно-опосредованной реакцией для in vitro амплификации специфических последовательностей ДНК параллельно выполняемыми, многократными раундами удлинения праймера комплементарных цепей ДНК. Другими словами, ПЦР является реакцией для получения многократных копий или реплик целевой нуклеиновой кислоты, фланкированной участками связывания праймера, при этом такая реакция содержит одно или более повторений следующих этапов: (i) денатурации целевой нуклеиновой кислоты; (ii) отжига праймеров в участки связывания праймера; и (iii) достройки праймеров полимеразой нуклеиновой кислоты в присутствии нуклеозидтрифосфатов. Такая реакция в типичном случае периодически повторяется при различных температурах, оптимизированных для каждого этапа денатурации, отжига и достройки. Конкретные показатели температуры, длительности на каждом этапе и скорости изменений между этапами зависят от многих факторов, известных средним специалистам в данной области, см., например, издание под редакцией McPherson и др. PCR: A Practical Approach and PCR2: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991 and 1995, соответственно). Например, в стандартной ПЦР, использующей ДНК-полимеразу Taq, двухцепочечная целевая нуклеиновая кислота может быть денатурирована при температуре > 90°C, праймеры отжигаются при температуре в диапазоне 50-75°C и праймеры достаиваются при температуре в диапазоне 72-78°C.

Термин ПЦР охватывает модифицированные формы реакции, включая, но не ограничиваясь ПЦР с обратной транскрипцией (RTl-ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, вложенной ПЦР, количественной ПЦР, мультиплексированной ПЦР и другими подобными вариантами. Поскольку это различные ПЦР испытания, типичные объемы реакции могут располагаться в диапазоне от нанолитров, например, от около 0,1 до около 500 нл, до микролитров, например, от около 1 до около 5 мкл, и могут легко вмещаться в лунках испытательных ячеистых трубок настоящего изобретения, обеспечивая, таким образом, возможность быстрого мультиплексного анализа. В некоторых неограничивающих примерах осуществления реакционный объем внутри каждый из лунок ячеистой трубки составляет около 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 и 100 нл.

ПЦР с обратной транскрипцией или ПЦР в реальном масштабе времени (ПЦР-РВ) представляют собой особенно мощный инструмент обнаружения и анализа РНК в образце. ПЦР-РВ является ПЦР, предшествующей реакции обратной транскрипции, когда РНК-мишень преобразуется в комплиментарную одноцепочечную ДНК, которая затем амплифицируется в стандартном ПЦР-процессе, см., например, Tecott и др., патентный документ US № 5 168 038.

ПЦР реального масштаба времени является ПЦР-способом, в ходе выполнения которого количество продуктов реакции, то есть ампликонов, отслеживается в то же самое время, когда происходит реакция. Существует много форм ПЦР реального масштаба времени, которые отличаются главным образом по средствам детектирования, используемым для контролирования продукта(-ов) реакции, см., например, Gelfand и др., патентный документ US № 5 210 015 (зонд TaqMan); Wittwer и др., патентные документы US №№ 6174670 и 6569627 (интеркалирующие красители); Tyagi и др., патентный документ US № 5925517 (молекулярные маяки). Химия детектирования для ПЦР в режиме реального времени рассматривается в публикации Mackay и др., Nucleic Acids Research, 30: 1292-1305 (2002).

Вложенная ПЦР является способом ПЦР, который включает по меньшей мере две стадии амплификации, где ампликон первой стадии ПЦР, использующей первый набор праймеров, становится матрицей для второй стадии ПЦР, использующей второй набор праймеров. По меньшей мере один праймер из второго набора праймеров имеет комплиментарность последовательности и может гибридизировать к целевой полинуклеотидной последовательности в локализации между участками гибридизации двух праймеров из первого набора, то есть в локализации внутри последовательности ампликона первой стадии ПЦР.

- 11 031989

Мультиплексная ПЦР представляет собой способ ПЦР, при котором одновременно в той же самой реакционной смеси выполняется амплификация множественных потенциальных целевых полинуклеотидных последовательностей, см., например, Bernard и др., Anal. Biochem., 273: 221-228 (1999) (двухцветная ПЦР в режиме реального времени). Ячеистый формат испытаний настоящего изобретения является подходящим для осуществления мультиплексной ПЦР. В лунках, предназначаемых для амплификации и детектирования определенной целевой полинуклеотидной последовательности, содержится определенный набор праймеров. Как правило, имеется некоторое количество повторных лунок, содержащих те же самые праймеры, что и дублирующие лунки в ячеистой структуре расположения лунок. Например, в одном неограничивающем примере осуществления одна полностью ячеистая структура размещения лунок может включать различные заранее приготовленные реакционные смеси, каждая из которых содержит иной набор праймеров, выбранный из в общей сложности вплоть до 8, 16, 25, 50 или даже 100 различных наборов праймеров, с кластером из 8 лунок-реплик, каждая из которых обеспечивается реакционной смесью, содержащей отличающийся набор праймеров.

Количественная ПЦР является способом ПЦР, который позволяет измерить содержание одной или нескольких специфических целевых последовательностей в образце. Количественные способы ПЦР могут включать определение как абсолютной количественной оценки, так и относительной количественной оценки целевых последовательностей. Количественные измерения выполняются с помощью одной или нескольких эталонных последовательностей, которые могут анализироваться отдельно или вместе с последовательностью-мишенью. Эталонная последовательность может быть эндогенной (естественно существующий) или экзогенный (искусственно добавленной) к образцу, и в последнем случае может содержать одну или несколько конкурентных матриц. Типичные эндогенные эталонные последовательности включают сегменты транскриптов следующих генов: β-актин, GAPDH, в₂-микроглобулин, рибосомная РНК и другие подобные. Методики количественной ПЦР известны средним специалистам в данной области, см., например, Freeman и др., Biotechniqv.es, 26: 112-126 (1999); Becker-Andre и др., Nucleic Acids Research, 17: 9437-9447 (1989); Zimmerman и др., Biotechniques, 21: 268-279 (1996); Diviacco и др., Gene, 122: 3013-3020 (1992); Becker-Andre и др., Nucleic Acids Research, 17: 9437-9446 (1989).

Реакция амплификации может быть амплификацией в реальном времени, когда присутствует механизм детектирования, который позволяет измерять продукт реакции одновременно по мере развития реакции амплификации, например, как в описанной выше ПЦР в режиме реального времени, или NASBA в реальном времени, описанной, например, Leone и др., Nucleic Acids Research, 26: 2150-2155 (1998). В данном контексте термин аплификация означает выполнение реакции амплификации. Реакционная смесь является раствором (или лиофилизированной версией такого раствора), содержащим все необходимые реагенты для выполнения реакции, которые могут включать без ограничений буферные агенты, соли, кофакторы, акцепторы и другие подобные. В некоторых вариантах осуществления высушенный реактив осаждается в лунке ячеистой трубки в ходе процесса обработки. В некоторых вариантах осуществления высушенный реактив содержит по меньшей мере один набор праймеров для амплификации одной или нескольких целевых полинуклеотидных последовательностей, нуклеозидтрифосфаты, фермент(-ы) и/или детектирующее вещество, которое указывает на наличие и/или количество одного или несколько ампликонов. В некоторых вариантах осуществления детектирующее вещество представляет собой флуоресцентный индикатор. Обнаружение или определение количества ампликонов при ПЦР в режиме реального времени часто включает применение резонансного переноса энергии флуоресценции или FRET-зонда, такого как зонд TaqMan®, зонд-молекулярный маяк или зонд-скорпион.

В данном контексте флуоресцентный индикатор является молекулой (например, красителя или зонда), которая является способной к генерированию флуоресцентного сигнала в присутствии продукта или продуктов реакции амплификации (то есть ампликона) таким образом, что по мере накопления ампликона в реакционной смеси сигнал флуоресцентного индикатора возрастает по меньшей мере по установленному диапазону концентраций ампликона.

При реакциях амплификации, выполняемых в ячеистых трубках данного изобретения, могут применяться несколько типов флуоресцентных индикаторов — прежде всего может использоваться флуоресцентный краситель. Подходящие красители этого класса являются неспецифическими по отношению к полинуклеотидной последовательности ампликона, такими как интеркалирующие красители, которые присоединяются к двухцепочечным продуктам ДНК, например, этидия бромид, SYBR, зеленый I и II, SYBR золотой, YO (оксазол желтый), ТО (тиазол оранжевый) и PG (PicoGreen), см, например, Ishiguro и др., Anal. Biochem., 229: 207-213 (1995); Tseng и др., Anal. Biochem., 245: 207-212 (1997); Morrison и др., Biotechniques, 24: 954-962 (1998). Дополнительные флуоресцентные индикаторы, подходящие для применения с данным изобретением известны средним специалистам в данной области.

Во-вторых, в некоторых случаях могут быть разработаны один или несколько праймеров, дающих шпилечную структуру с флуоресцентной молекулой, удерживаемой поблизости от флуоресцентного гасителя таким образом, что флюоресценция тушится гасителем до тех пор, пока шпилечная структура не раздвигается при удлинении праймера, см., например, Whitecombe и др., Nature Biotechnology, 17: 804807 (1999) (праймеры Amplifluor™). Подходящие флуоресцентные молекулы включают упоминаемые в

- 12 031989 предшествующем разделе.

В-третьих, флуоресцентные индикаторы также могут быть специфическими для полинуклеотидной последовательности целевой нуклеиновой кислоты. Часто называемый флуоресцентными зондами, этот тип индикаторов обычно содержит флуоресцентную функциональную группу поблизости от флуоресцентного гасителя до тех пор, пока олигонуклеотидная функциональная группа, к которой они присоединены, специфически связывается с продуктом амплификации, см., например, Gelfand и др., патентный документ US № 5 210 015 (зонды TaqMan); Nazarenko и др., Nucleic Acids Research, 25: 2516-2521 (1997) (зонды-скорпионы); Tyagi и др., Nature Biotechnology, 16: 49-53 (1998) (молекулярные маяки). Флуоресцентные индикаторы могут применяться по отношению к ПЦР в режиме реального времени, или же они могут применяться для измерения общего количества продукта реакции при завершении реакции. Обзор различных молекулярных маяков и других зондов со шпилечной структурой представлен Broude, Encyclopedia of Diagnostic Genomics and Proeomics, 2005, стр. 846-851.

Как правило, для каждой реакции, выполняемой в ячеистых трубках этого изобретения, независимо от ее природы, обусловленной связыванием на основе аффинности или на основе амплификации, будет присутствовать по меньшей мере один положительный контроль и по меньшей мере один отрицательный контроль, таким образом, чтобы эти контрольные данные подтверждали успешность прохождения реакции - любой детектируемый положительный сигнал происходит не из-за загрязнения всей системы, а любой детектируемый отрицательный сигнал не является результатом отказа аналитической системы. В некоторых вариантах осуществления может быть включен внутренний стандарт. Внутренний стандарт это известная молекула, которая участвует в той же самой реакции, например, последовательность нуклеиновых кислот, которая амплифицируется в той же самой реакции амплификации в качестве полинуклеотида-мишени, с тем, чтобы сделать возможным определение количества (определение относительного количества или определение абсолютного количества) целевого анализируемого компонента в образце. Внутренний стандарт может быть эндогенным, то есть известным в качестве изначально существующего в образце, или экзогенным, то есть добавляемым перед испытанием.

V. Разработка аналитических агентов для приспособления условий реакции.

Поскольку мультиплексные анализы, выполняемые в ячеистых трубках этого изобретения, в типичном случае проводятся в приблизительно одинаковых условиях и в приблизительно одно и то же время, аналитические агенты, размещаемые в каждой локализации или внутри каждой лунки ячеистой трубки, должны быть тщательно разработаны с тем, чтобы обеспечивать оптимальные или близкие к оптимальным результаты реакции в условиях комплекса заранее определенных параметров реакции. В одном примере 8 различных полинуклеотидных зондов нанесены или иммобилизированы на поверхности подложки для детектирования 8 различных целевых нуклеиновых кислот в образце посредством основанной на комплиментарности гибридизации последовательности. Методы разработки и такой оптимизации зондов для каждой целевой последовательности, чтобы соответствовать заранее определенным параметрам реакции для конкретного испытания, хорошо известны среднему специалисту в данной области. При разработке и оптимизации зонда неограничивающие параметры включают длину зонда, относительную локализацию внутри целевой последовательности и содержание GC, которое является результатом специфической гибридизации между зондом и его мишенью под определенными для конкретного испытания условиями реакции.

В другом примере 8 наборов реагентов, необходимых для проведения различных реакций с целью амплификации 8 различных полинуклеотидных последовательностей, были разделены между 4-мя участками так, чтобы в каждом из них можно было провести по две параллельные реакции из всех 8 наборов. Каждый из этих 8 наборов различных реакционных смесей содержит по меньшей мере один набор олигонуклеотидных праймеров для амплификации определенной целевой последовательности. Эти 8 наборов праймеров могут быть разработаны так, чтобы все этапы денатурации, отжига и достраивания могли быть адекватно выполнены для 8 различных целевых последовательностей при одних и тех же температурах и в течение одного и того же временного интервала.

Специалист в данной области сможет осуществить необходимый дизайн, регулируя длину, GCсодержание зондов или праймеров. В некоторых случаях оказывается эффективным замещение естественно встречающихся нуклеотидов модифицированными или искусственными нуклеотидами с точки зрения тонкой настройки поведения зондов и праймеров при отжиге/денатурации. См., например, Leconte и др. J Am Chem Soc. 2008;130(7):2336-2343; патентный документ US № 8268978. Некоторые известные аналоги включают 1-метиладенин, 1-метилинозин, 1-метилпсевдоурацил, 1-метилгуанин, 2метиладенин, 2-метилгуанин, 2-тиоцитозин, 2-тиоурацил, 2,2-диметилгуанин, 2,6-диаминопурин, 2метилтио-Н6-изопентениладенин, 3-метилцитозин, 4-ацетилцитозин, 4-тиоурацил, 5-бромурацил, 5карбоксиметиламинометил-2-тиоурацил, 5-(карбоксигидроксиметил)урацил, 5-карбоксиметиламинометилурацил, 5-фторурацил, 5-метилцитозин, 5-метоксиурацил, 5-метиламинометилурацил, 5-метил-2тиоурацил, 5-метилурацил, 5'-метоксикарбонилметилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, 7метилгуанин, 8-гидрокси-Л6-метиладенозин, азиридинилцитозин, бетаЮ-маннозилквеозин, дигидроурацил, инозин, Ж>-изопентениладенин. Ж>-метиладенин. метиловый эфир №урацил-5-оксиуксусной кислоты, оксибутоксозин, псевдоизоцитозин, псевдоурацил, квеозин, урацил-5-оксиуксусную кислоту, мети- 13 031989 ловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусную кислоту и т.д. Многие нуклеотидные аналоги коммерчески доступны от таких поставщиков, как Sigma и Applied Biosystems.

На фиг. 6 показан обрабатывающий и управляющий жидкостью картридж 10, включающий кожух 12, содержащий множество камер 13. Располагающийся внутри регулятор потока (не показан) и ячеистая трубка 100 связаны с различными участками кожуха 12. Картридж 10 по мере необходимости обеспечивает ячеистую трубку пробной жидкостью и посредством сообщения по жидкости со средством 108 сопряжения по жидкости. Как правило, картридж, содержащий ячеистую трубку, применяется в системе GeneXpert® Cepheid® Sunnyvale, California, США. В некоторых вариантах осуществления картридж, содержащий ячеистую трубку, применяется в одном или нескольких модулях гетерогенной системы, как раскрывается в патентном документе US № 61/639820, включенной здесь посредством ссылки и прилагаемой как часть Приложения А. Дополнительные подробности системы 10 и способов применения описаны в патентных документах US №№ 8048386, 8187557, 8119352 и патентном документе US №20080038737, все из которых являются включенными посредством ссылки и прилагаются здесь в качестве Приложения А.

VI. Примеры

Примеры обеспечиваются только в качестве иллюстрации, а не для ограничения. Специалисты в данной области легко определят различные некритические параметры, которые могут быть изменены или модифицированы, приводя, по существу, к аналогичным или подобным результатам.

Пример 1. Анализ K-Ras SNP в кодонах 12 и 13.

При этом анализе однонуклеотидного полиморфизма использовался формат, включавший 8 зондов, по 8 параллельных реакций с распределением по четырем участкам, с применением реакционной трубки с картриджем GeneXpert. Более конкретно, общее размещение зондов представляло 4 участка из 8x8 заранее определенных меток на поверхности твердой подложки, представлявшей тонкую пленку, ограничивающую одну сторону рамки реакционной трубки. В каждом участке был осажден каждый из 8 олигонуклеотидных зондов определенных нуклеотидных последовательностей (всего 256 меток в трубке, диаметр меток 100 мкм, плотность меток 50 мкмоль и объем метки 0,5 нл) и иммобилизировался в кластеру из 8 заранее определенных меток, приводя к 8 дублирующим меткам для каждого отдельного зонда.

Каждый из 8 олигонуклеотидных зондов был сконструирован в его нуклеотидной последовательности так, чтобы он гибридизировался только с одной версией последовательности K-Ras. В этом конкретном исследовании 1 зонд был разработан так, чтобы гибридизироваться с диким типом (WT) K-Ras последовательности, окружающей кодоны 12 и 13; 1 зонд - чтобы гибридизироваться с 12Val мутантом; 1 зонд - чтобы гибридизироваться с 12Asp мутантом; 1 зонд - чтобы гибридизироваться с 12Arg мутантом; 1 зонд - чтобы гибридизироваться с 12Cys мутантом; 1 зонд - чтобы гибридизироваться с 12Ser мутантом; 1 зонд - чтобы гибридизироваться с 12Ala мутантом и 1 1 зонд - чтобы гибридизироваться с 13Asp мутантом. 8-зондовое расположение на поверхности подложки показано на фиг. 7 и последовательности зондов представлены в табл. 1. Табл. 2 представляет температуры плавления зондов.

Таблица 1. Последовательность зонда KRAS.

Название олигонуклеотида	О лигонуклеотидная оследовательность* (5^3¹)	З'-мод.
KRAS WT ArryPrbl	CGCCACCAGCTCCAAC(S 18)(S 18)(S 18)(S 18)	Амино
KRAS 12ARG ArryPrbl	CGCCACGAGCTCCAAC(S 18)(S 18)(S 18)(S 18)	Амино
KRAS 12ASP ArryPrbl	CGCCATCAGCTCCAACT(S 18)(S 18)(S 18)(S 18)	Амино
KRAS 12VAL ArryPrbl	CGCCAACAGCTCCAACT(S 18)(S 18)(S 18)(S 18)	Амино
KRAS 12CYS ArryPrbl	CGCCACAAGCTCCAACT(S 18)(S 18)(S 18)(S 18)	Амино
KRAS 12SER ArryPrbl	CGCCACTAGCTCCAACT(S 18)(S 18)(S 18)(S 18)	Амино
KRAS 12ALA ArryPrbl	CGCCAGCAGCTCCAAC (S18)(S 18)(S 18)(S 18)	Амино
KRAS 13ASP ArryPrbl	CGTCACCAGCTCCAACT(S 18)(S 18)(S 18)(S 18)	Амино

- 14 031989

Таблица 2. KRAS зонды Tm (VisualOmp)

	Последовательность зонда
	WT	12 ASP	12V AL	12CYS	12SER	12 AL A	12 ARG	13 ASP
WT	62,2	57,9	58,9	55,8	57,0	58,1	54,3	57,2
12 ASP	52,9	61,3	55,4	48,1	49,0	56,5	44,9	46,0
12 VAL	52,1	54,0	61,5	47,5	48,9	55,2	44,2	45,5
12CYS	51,8	49,0	47,5	61,5	55,3	44,6	55,3	45,7
12SER	51,3	48,4	47,6	55,0	60,4	44,8	53,7	45,0
12 ALA	50,3	54,3	54,3	47,3	47,2	62,8	43,9	42,2
12ARG	51,3	49,0	47,3	53,2	53,8	44,5	62,4	44,9
13 ASP	50,8	44,6	46,2	42,6	44,3	45,1	40,3	60,4

Для иммобилизации зондов на поверхности подложки поверхность сначала была промыта способом гидроксилирования, так, чтобы поверхностная энергия составляла бы не менее 38 дин/см при краевом угле смачивания около 60° и чтобы реакционная способность и смачиваемость поверхности были улучшены для последующей функционализации.

Процесс функционализации включал введение в поверхность подложки глицидальной (эпокси) группы с использованием глицидоксипропилтриметоксисилана в качестве предшественника. В процессе нанесения меток между функциональной группой и олигонуклеотидным зондом на его 3' конце устанавливалась ковалентная связь.

После функционализации тонкопленочного субстрата и точечного прикрепления к нему зонда реакционная трубка была герметизирована с помощью пленки, наложенной на противоположную от субстрата сторону. Закупоренная реакционная трубка, содержащая 8-зондовый формат, как показано на фиг. 7, была затем заполнена пробой жидкости, полностью покрывшей все метки на поверхности подложки. Кодон 12/13 SNP анализ представленной в образце последовательности K-Ras начинается асимметричной реакцией амплификации TaqMan, которая включала ОТ4-маркированный прямой праймер и немаркированный обратный праймер, который гибридизируется с последовательностью K-Ras для охвата области SNP. Также в реакционную смесь были включены (1) зонд TaqMan, маркированный CF5 и содержащий последовательность, соответствующую сегменту последовательности K-Ras между прямым и обратными праймерами, для отображения прогресса ПЦР; и (2) немаркированный зонд BlockMelt для целей подавления WT ампликонов.

В этом конкретном исследовании нагревание/охлаждение обеспечивались на одной стороне реакционной камеры для процесса ПЦР и последующего процесса гибридизации. Прямой праймер (5'CF4) использовался в концентрации 1000 нмоль. Обратный праймер применялся в концентрации 100 нмоль. Зонд TaqMan (5'CF5) применялся в концентрации 50 нмоль. Немаркированный зонд ингибитор ±K-Ras WT применялся в концентрации 100 нмоль. После 60 циклов ПЦР температура реакционной камеры для выполнения гибридизации зонд-ампликон устанавливалась равной приблизительно 54°C в течение 1-2 ч в ПЦР элюирующем буфере (буфер Tris с рН=8). Реакционная камера затем промывалась по меньшей мере однократно и вплоть до 5 раз отмывочным буфером (Tube Wash Arraylt Wash Buffer 2) до удаления неспецифического остаточного сигнала CF4.

Были проанализированы три различных образца: клеточная линия K-Ras WT (гомозиготная нормальная), клетки K-Ras CCL (гетерозиготные) и клетки K-Ras CCL блокированные (гомозиготные мутантные). На фиг. 8 показана кривая сигнала флуоресценции в ходе 60 циклов ПЦР. На фиг. 9А-С показаны прогнозируемые результаты от WT, гетерозиготных 13Asp мутантных и гомозиготных 13Asp мутантных клеточных образцов. На фиг. 10А-С представлены фактические, полученные на этих образцах результаты. Общее представление всей структуры размещения зондов показано на фиг. 11. На фиг. 12 показан общий вид всей структуры размещения зондов, наблюдаемой под интегрированным микроскопом после возбуждения.

Пример 2. Загрузка реагента в сухие лунки.

Ячеистая трубка 100, применяемая в этом исследовании, была изготовлена литьем под давлением. Деталь формуется с одной подложкой планшета 120 в ПЦР области. Нанолунки были созданы сверлением эксимерным лазером на 193 нм. Размер нанолунок, применяемых в этом исследовании, составляет 150 мкм в диаметре и около 150 мкм в глубину с шагом в 250 мкм. Эти лунки являются глухими отверстиями и могут удерживать вплоть до 2,6 нл.

Как показано на фиг. 3А, затем был нанесен зеленый пищевой краситель при использовании NanoPrint® от Arraylt® с микропечатающей иглой (номер модели #946МР3 со 100 мкм диаметром конца иглы). Каждая капля из такой иглы имеет объем 0,7 нл. NanoPrint® является серийно выпускаемым компанией Arraylt® принтером для микрочипов, программируется на различную величину шага и с использованием 946МР3 может обеспечивать количество жидкости при мультиплексировании в 0,7 нл. Имеется возможность выбора игл. Наименьшая печатающая микроигла способна поставлять всего лишь 0,35 нл на каплю. В практических условиях зеленый пищевой краситель может входить в набор праймера или набор праймера с ферментом для процесса ПЦР. Каждая индивидуальная нанолунка может содержать

- 15 031989 отдельный набор праймера для конкретной целевой нуклеиновой кислоты, предназначаемой для амплификации в ходе процесса ПЦР. После нанесения меток возможно выполнение сушки сублимацией или процесса лиофилизации для целей хранения.

Пример 3. Прерывное осушение для заполнения и закупоривания образца.

Применяемая в этом примере (и примере 4) ячеистая трубка 100 была изготовлена из полипропилена. Ячеистая трубка 100 формуется с одной поддерживающей подложкой планшета 120 в ПЦР области. Было получено множество нанолунок с помощью эксимерного лазера с длиной волны 193 нм. Размер нанолунок, применяемых в этом примере, составляет 150 мкм в диаметре и около 250 мкм в глубину с шагом в 250 мкм. Эти лунки являются сквозными отверстиями и могут удерживать вплоть до 4,4 нл. Ячеистая трубка 100 после этого была загерметизирована полипропиленовой пленкой с обеих сторон трубки. Каждая отдельная лунка не запечатывалась, но герметизировалась общая ромбовидная область (25 мкл область) для ПЦР. Ячеистая трубка 100 была подсоединена к картриджу 10, показанному на фиг.

6.

Буфер ПЦР (50 ммоль Tris, pH=8,6) вначале из-за гидрофобности полипропилена смешивался с поверхностно-активным веществом (0,1% Tween) для улучшения смачивания на полипропиленовой поверхности. Для усиления визуализации к ПЦР буферу по каплям добавлялось небольшое количество желтого пищевого красителя. Этот ПЦР буфер затем был добавлен в одну из камер 13 в картридже 10, показанном на фиг. 6. В другую камеру было добавлено минеральное масло (CAS#8042-47-5). Для управления картриджем 10 и руководства заполнения жидкостью ячеистой трубки 100 применялась коммерчески доступная система GeneXpert® Cepheid®.

Система GeneXpert® была запрограммирована для снабжения ПЦР-буфером планшетной ячейки 118 через канал для жидкости со скоростью 1 мкл/с. ПЦР-буфер заполнял каждую нанолунку в планшетной ячейке 118, а избытки ПЦР-буфера выводились через канал уровня жидкости. После заполнения камеры для ПЦР ячеистой трубки 100 ПЦР-буфер в трубке 100 был отведен со скоростью 5 мкл/с со дна планшетной ячейки в канал для жидкости. Буфер втягивался из канала уровня жидкости обратно во впускной канал 128 (самый нижний канал для жидкости). После отвода ПЦР-буфер оставался в каждой отдельной нанолунке благодаря капиллярным силам. Несмотря на процедуру отвода, находящийся в каждой нанолунке ПЦР-буфер не вытекал. После того, как ПЦР-буфер был полностью отведен через впускной канал 128, в планшетную ячейку 118 вводилось минеральное масло со скоростью 1 мкл/с. Зазор между герметизирующей пленкой и полипропиленовой подложкой с нанолунками был заполнен минеральным маслом, как показано на фиг. 4Е.

Пример 4. Непрерывное смачивание для заполнения и закупоривания образца.

С применением той же самой ячеистой трубки 100, как и в примере 3, нанолунки были заполнены ПЦР-буфером, используя прерывный способ осушения, обсуждавшийся в примере 3. Однако, после того, как индивидуальная нанолунка была заполнена ПЦР-буфером, в планшетную ячейку 118 ячеистой трубки вводилось минеральное масло для продолжения заполнения камеры ПЦР из впускного канала 128 со скоростью 5 мкл/с (вместо того, чтобы отводить ПЦР-буфер, как в примере 3). Минеральное масло вытесняло ПЦР-буфер в планшетной ячейке 118 (то есть между полипропиленовой подложкой и верхней герметизирующей пленкой) сверху нанолунки. Этот способ упоминается как непрерывное смачивание, поскольку две жидкости непрерывно смачивают поверхность. Первая жидкость (ПЦР-буфер) смачивает поверхность и наполняет нанолунки. Вторая жидкость (минеральное масло) непрерывно смачивает поверхность, но не заливается внутрь каждой нанолунки, поскольку поверхностное натяжение и капиллярные силы удерживают в нанолунке первую водосодержащую жидкость.

Оба способа, примененные в примерах 3 и 4, успешно вводили в нанолунку желаемый ПЦР-буфер и применяемое для изолирования ПЦР-буфера в каждой индивидуальной нанолунке минеральное масло. Колпачок из минерального масла обладает дополнительным преимуществом, заключающимся в том, что оно может предохранять водосодержащую жидкость в нанолунке от испарения во время процесса термоциклирования.

Все упоминаемые в данной заявке патентные документы и другие публикации, включая учетные номера GenBank, являются включенными во всей их полноте посредством ссылки.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Реакционная трубка (100) для мультиплексного анализа, содержащая плоскую рамку (102), ограничивающую проток (114) для жидкости между первой плоской поверхностью и второй плоской поверхностью; и средство (108) сопряжения по жидкости на одном конце плоской рамки (102), при этом данное средство (108) сопряжения по жидкости содержит впуск (110) для жидкости и выпуск (112) для жидкости;

в которой проток (114) для жидкости дополнительно включает планшетную ячейку (118) с подложкой (120) планшета, в которой образовано множество лунок, при этом планшетная ячейка (118) располагается в плоской рамке (102) между первой или второй поверхностью и подложкой (120) с лунками, и

- 16 031989 при этом планшетная ячейка (118) находится в сообщении по жидкости со впуском (110) для жидкости и выпуском (112) для жидкости, причем средство (108) сопряжения по жидкости выполнено с возможностью соединения по жидкости с внешним устройством управления жидкостью, чтобы облегчить заполнение и эвакуацию из планшетной ячейки (118) через средство (108) сопряжения по жидкости во время нахождения в соединении по жидкости с внешним устройством управления жидкостью.
2. Реакционная трубка (100) по п.1, в которой проток (114) для жидкости включает преамплификационную ячейку (116), расположенную в плоской рамке (102) между первой и второй плоскими поверхностями.
3. Реакционная трубка (100) по п.2, в которой преамплификационная ячейка (116) включает выход (122) из ячейки, находящийся в сообщении по жидкости с входом (124) в планшетную ячейку.
4. Реакционная трубка (100) по п.3, в которой выход (122) из преамплификационной ячейки отделен от входа (124) в планшетную ячейку проходом (126).
5. Реакционная трубка (100) по п.4, в которой выход (122) из преамплификационной ячейки расположен на самом верхнем участке преамплификационной ячейки при вертикальной ориентации первой и второй плоских поверхностей.
6. Реакционная трубка (100) по п.5, в которой вход (124) в планшетную ячейку расположен в самом нижнем участке планшетной ячейки.
7. Реакционная трубка (100) по п.6, в которой вход (124) в планшетную ячейку расположен ниже преамплификационной ячейки (116).
8. Реакционная трубка (100) по п.7, в которой проход (126) от выхода (122) из преамплификационной ячейки ко входу (124) в планшетную ячейку расположен с наклоном вниз.
9. Реакционная трубка (100) по п.1, в которой проток (114) для жидкости содержит извилистый канал.
10. Реакционная трубка (100) по п.1, в которой проток (114) для жидкости является бесклапанным.
11. Реакционная трубка (100) по п.1, в которой подложка (120) планшета содержит 100-1000 нанолунок.
12. Реакционная трубка (100) по п.1, в которой подложка (120) планшета содержит множество лунок, имеющих глубину от около 100 до около 500 мкм.
13. Реакционная трубка (100) по п.1, в которой подложка (120) планшета содержит множество лунок, имеющих диаметр от около 50 до около 500 мкм.
14. Реакционная трубка (100) по п.1, в которой подложка (120) планшета содержит множество лунок с объемом 0,8 нл.
15. Реакционная трубка (100) по п.1, в которой участок плоской рамки (102) ограничивает ячейку для масла, содержащую гидрофобный материал.
16. Реакционная трубка (100) по п.15, в которой ячейка для масла находится в сообщении по жидкости с планшетной ячейкой (118).
17. Реакционная трубка (100) по п.1, в которой плоская рамка (102) содержит каркасную структуру, продолжающуюся от участка основания.
18. Реакционная трубка (100) по п.17, в которой первая и вторая плоские поверхности содержат первую и вторую пленки, которые обеспечивают герметизацию каркаса по жидкости.
19. Реакционная трубка (100) по п.1, в которой плоская рамка (102) имеет сообщение по жидкости с контейнером для образцов через средство (108) сопряжения по жидкости.
20. Реакционная трубка (100) по п.1, в которой подложка планшета (120) содержит никелевый материал.
21. Реакционная трубка (100) по п.1, в которой первая и/или вторая поверхности являются прозрачными или светопроницаемыми для того, чтобы обеспечивать возбуждение и/или обнаружение флюоресценции пробной жидкости во множестве лунок с помощью по меньшей мере одного датчика, расположенного рядом или напротив первой и/или второй поверхностей реакционной трубки.
22. Реакционная трубка (100) по п.1, в которой по меньшей мере один край плоской рамки (102) вдоль планшетной ячейки (118) является прозрачным или светопроницаемым для того, чтобы обеспечивать возбуждение и/или обнаружение флюоресценции пробной жидкости во множестве лунок с помощью по меньшей мере одного датчика, расположенного вдоль по меньшей мере одного края плоской рамки (102).
23. Реакционная трубка (100) по п.1, в которой множество лунок содержит по меньшей мере один праймер нуклеиновой кислоты и/или пробу для амплификации и/или обнаружения специфической мишени.
24. Реакционная трубка (100) по п.23, в которой по меньшей мере один праймер нуклеиновой кислоты и/или проба находятся во множестве лунок с первой и второй поверхностями, являющимися первой и второй подложками, герметично прикрепленными к плоской рамке (102) для того, чтобы способствовать биологическим испытаниям пробной жидкости внутри множества лунок, введенной через впуск (110) для жидкости.
25. Реакционная трубка (100) по п.1, в которой проток (114) для жидкости включает в себя впуск-

- 17 031989 ной канал (128), расположенный между впуском (110) для жидкости и планшетной ячейкой (118), и выпускной канал (130), расположенный между планшетной ячейкой (118) и выпуском (112) для жидкости.
26. Реакционная трубка (100) по п.1, в которой средство (108) сопряжения по жидкости выполнено таким образом, что при его нахождении в соединении по жидкости с внешним устройством управления жидкостью первая и вторая плоские поверхности ориентированы вертикально.
27. Реакционная трубка (100) по п.26, в которой устройство контроля жидкости содержит картридж (10) для образцов.
28. Способ заполнения реакционной трубки (100) по любому из пп.1-27, включающий в себя введение пробной жидкости через средство (108) сопряжения по жидкости реакционной трубки (100) во время нахождения средства (108) сопряжения по жидкости в соединении по жидкости с внешним устройством управления жидкостью, причем реакционная трубка (100) содержит плоскую рамку (102), ограничивающую проток (114) для жидкости между первой плоской поверхностью и второй плоской поверхностью, при этом средство (108) сопряжения по жидкости расположено на одном конце плоской рамки (102) и содержит впуск (110) для жидкости и выпуск (112) для жидкости;

заполнение планшетной ячейки (118) по протоку (114) для жидкости амплифицирующей жидкостью через средство (108) сопряжения по жидкости, при его нахождении в соединении по жидкости с внешним устройством управления жидкостью, таким образом, чтобы множество лунок планшетной ячейки было покрыто амплифицирующей жидкостью; и эвакуацию амплифицирующей жидкости из планшетной ячейки (118) через средство (108) сопряжения по жидкости при его нахождении в соединении по жидкости с внешним устройством управления жидкостью, таким образом, чтобы множество лунок оставалось смоченным, по меньшей мере, некоторой порцией амплифицирующей жидкости.
29. Способ по п.28, дополнительно включающий в себя заполнение преамплификационной ячейки (116) протока (114) для жидкости пробной жидкостью.
30. Способ по п.29, в котором преамплификационная ячейка (116) содержит самый верхний выход из преамплификационной ячейки и в котором преамплификационную ячейку (116) заполняют до уровня ниже выхода (122) из преамплификационной ячейки.
31. Способ по п.30, в котором выход (122) из преамплификационной ячейки находится в сообщении по жидкости со входом (124) в планшетную ячейку через ведущий вниз проход (126).
32. Способ по п.31, в котором проток (114) для жидкости является бесклапанным.
33. Способ по п.28, дополнительно включающий в себя заполнение откачанной планшетной ячейки (118) гидрофобным материалом.
34. Способ по п.32, в котором гидрофобный материал поступает из ячейки для масла плоской рамки (102), которая находится в сообщении по жидкости с планшетной ячейкой (118).
35. Способ по п.28, в котором пробную жидкость проводят по протоку (114) для жидкости извилистым путем.
36. Способ по п.28, дополнительно включающий в себя применение к первой и второй плоским поверхностям циклов нагревания и охлаждения.
37. Способ по п.28, в котором плоскую рамку (102) реакционной трубки ориентируют вертикально во время заполнения планшетной ячейки (118).
38. Способ по п.28, в котором введение пробной жидкости включает в себя продвижение пробной жидкости через впуск (110) для жидкости и впускной канал (128), расположенный по протоку (114) для жидкости между впуском (110) для жидкости и планшетной ячейкой (118), и эвакуация из планшетной ячейки (118) включает в себя дальнейшее продвижение пробной жидкости через выпускной канал (130) для жидкости, расположенный по протоку (114) для жидкости между планшетной ячейкой (118) и выпуском (112) для жидкости.
39. Способ по п.30, в котором заполнение и освобождение планшетной ячейки (118) облегчают путем прикладывания давления через средство (108) сопряжения по жидкости с помощью внешнего устройства управления жидкостью, соединенного по жидкости со средством (108) сопряжения по жидкости.