ES2651068T3

ES2651068T3 - Sistema y procedimiento de análisis de muestras marcadas con 5,10,15,20 tetraquis(4 carboxifenil)porfirina (TCPP)

Info

Publication number: ES2651068T3
Application number: ES10800677.6T
Authority: ES
Inventors: Constance Dorian; John Cousins; Gordon Bennett
Original assignee: Bioaffinity Tech Inc; Bioaffinity Technologies Inc
Current assignee: Bioaffinity Tech Inc; Bioaffinity Technologies Inc
Priority date: 2009-07-17
Filing date: 2010-07-19
Publication date: 2018-01-24
Anticipated expiration: 2030-07-19
Also published as: EP2596348B1; US20150160197A1; WO2011009137A1; US8877509B2; EP2596348A1; HK1186520A1; CN103168234A; CN103168234B; EP2596348A4; US20110014647A1

Abstract

Un procedimiento de determinación de si una muestra de esputo contiene células displásicas o carcinómicas, comprendiendo el procedimiento: obtener una muestra de esputo de un paciente humano sospechoso de contener células displásicas o carcinómicas, comprendiendo el procedimiento: marcar la muestra de esputo con 0,05-4,0 ug/ml de TCPP en un alcohol acuoso de solución de alcohol isopropanol entre un 50 % y un 90 % a un pH entre 6,0 y 10,5 para teñir las células sospechosas de ser displásicas o carcinómicas; excitar la muestra de esputo marcada con una longitud de onda de excitación desde una fuente de luz que tiene una tasa de emisión controlada para una longitud de onda de luz de aproximadamente 475 nm +/- 30 nm; focalizar un registrador de imágenes en la membrana plasmática de i) una o más células sospechosas de ser células displásicas o carcinómicas y ii) células normales para capturar una imagen de i) y ii) en un detector que tiene píxeles capaces de cuantificar el flujo de fotones en cualquier píxel dado en el detector, en el que el detector comprende un CCD; detectar dentro de la muestra de esputo la emisión a aproximadamente 560 nm +/- 30 nm de células identificadas como macrófagos; detectar la emisión a aproximadamente 655 nm +/- 30 nm, si está presente, para células marcadas con TCPP de la muestra de esputo después de focalizarse en la membrana plasmática de i) una o más células sospechosas de ser células displásicas o carcinómicas y ii) células normales; medir el flujo de iones en cada píxel del detector para obtener un valor cuantitativo para la célula en imágenes; y calificar con un procesador programado apropiadamente el valor cuantitativo medido para determinar si una célula es cancerosa o displásica basándose en una unión preferente de TCPP a la célula cancerosa o displásica en comparación con la célula no cancerosa.

Description

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DESCRIPCIÓN

Sistema y procedimiento de análisis de muestras marcadas con 5,10,15,20-tetraquis(4-carboxifenil)porfirina (TCPP) Introducción

Los patólogos, que examinan la progresión de las enfermedades y analizan muestras tisulares en busca de anomalías, incluyendo el cáncer, han determinado que una afección celular llamada displasia, que se refiere a formación o maduración anómala de las células, puede identificar potencialmente células en un estado precanceroso. Sin comprobar, la displasia puede progresar a través de fases leves, moderadas y graves y finalmente a cáncer. Aproximadamente uno de cada siete de los casos moderados de displasia progresará a cáncer, y se ha informado de que tanto como un 83 % de los casos con displasia grave progresan a cáncer, dependiendo de los tipos de células implicadas. Sin embargo, la eliminación de displasias leves y moderadas reduce enormemente el desarrollo de cáncer. En el pulmón, la eliminación de células displásicas no solamente reduce enormemente la formación de células cancerosas, sino que en algunos casos el tejido pulmonar vuelve a una morfología normal.

En general, cuanto más pronto se detectan los cánceres, mejor será el pronóstico para la supervivencia del paciente. Si se detecta cáncer de mama de forma prematura cuando aún está localizado en una única, masa, la tasa de supervivencia de 5 años es de más de un 96 %. Cuando se ha propagado hasta una ubicación distante, la tasa de supervivencia de 5 años es de menos de un 20 %. Para cáncer broncopulmonar, cuando se detecta como una única masa, la supervivencia de 5 años es de más de un 46 %. Cuando se ha propagado, la supervivencia de 5 años es de menos de un 14 %. Para cáncer de cuello uterino, se produce una mejora adicional en la supervivencia cuando se encuentran cambios precancerosos y se tratan antes de desarrollarse en una fase más grave (Boring y Squires 1993, CA Cancer J Clin 43:7-26 y Ferguson 1990, Hematol Oncol Clin N Am 4:1053-1168).

El carcinoma broncopulmonar actualmente es la causa principal de mortalidad por cáncer entre hombres y mujeres en Estados Unidos (Wingo y col. 1995, CA Clinical J Clin 45.8-30). En 1997, hubo 160 000 muertes estimadas por cáncer broncopulmonar, que representan un 12 % de todas muertes por cáncer en hombres de Estados Unidos y un 2 % en mujeres de Estados Unidos ((Boring y Squires 1993, supra). El cáncer broncopulmonar también es uno de los tipos más mortíferos de cáncer, como se refleja en una tasa de supervivencia de 5 años de únicamente un 14 %. El mal pronóstico de los pacientes con cáncer broncopulmonar, respecto a otros tipos de cáncer humano, se debe en gran medida a la ausencia de procedimientos de detección prematura eficaces. En el momento de la presentación clínica (sintomática), más de dos tercios de todos los pacientes tiene afectación de nódulos regionales o metástasis distante, ambos cuales habitualmente son incurables. En estudios de pacientes con cáncer broncopulmonar localizado (fase 0 o 1), sin embargo, las tasas de supervivencia de 5 años han variado de un 40 % a un 70 % (Boring y Squires, 1993, supra; Ferguson, 1990, supra).

Históricamente, los únicos ensayos de diagnóstico usados para detectar cáncer broncopulmonar antes de que se produzcan los síntomas han sido citología de esputo y radiografía torácica. Como consecuencia, la eficacia de estos ensayos como herramientas de cribado en masa se ha evaluado ampliamente en estudios durante las últimas varias décadas. Ambos ensayos detectan carcinoma en fase prematura presintomático, particularmente carcinoma escamocelular.

Las mejoras en los procedimientos de cribado se han centrado en gran medida en mejorar la utilidad de la citología de esputo a través de avances tecnológicos en microscopia. La citología de esputo requiere un examen visual de una muestra celular durante la cual se usa el tamaño de las células, la forma, la organización y una relación entre el tamaño del núcleo de la célula y el citoplasma para determinar la morfología celular. Como esta evaluación de la morfología celular requiere una inspección visual y clasificación, la técnica requiere una cantidad significativa de experiencia por cuenta del observador clínico. Se han realizado diversas investigaciones con resultados que sugieren que el análisis de imágenes de alta resolución asistido por ordenador posibilita la detección de cambios subvisuales en núcleos visualmente normales asociados con varios tipos de tejido (Montag y col. 1991, Anal Quant Cytol Histol 13:159-167; Haroske y col. 1988, Arch Geschwulstforsch, 58:159-168; Hutchinson y col. 1992, Anal Quant Cytol Estol 4:330-334). El análisis asistido por ordenador de la distribución del ADN en muestras de células proporcionó un 74 % de clasificación morfológica correcta de los núcleos sin revisión humana del material y sin la necesidad de que hubiera núcleos visualmente anómalos presentes cuando se comparan con un ensayo citológico convencional.

La evaluación morfológica de las muestras citológicas también ha mejorado debido a los avances en la comprensión de la patología del tumor broncopulmonar. Gran parte de este trabajo se ha centrado en la identificación de "biomarcadores". Los biomarcadores se refieren a una amplia gama de anomalías fenotípicas y genéticas progresivas de la mucosa respiratoria que pueden usarse para determinar el potencial del epitelio bronquial de transformarse completamente en un tumor maligno. Los marcadores se han clasificado ampliamente como cambios morfológicos, marcadores inmuno/histoquímicos para proteínas expresadas de forma diferencial, marcadores para inestabilidad genómica, marcadores de cambio epigenético (por ejemplo, metilación anómala) y mutaciones génicas ((Hirsh y col. 1997, Lung Cáncer 17:163-174).

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Los niveles de expresión de estos marcadores ahora se están evaluando en muestras tisulares displásicas y neoplásicas cito/histológicas recogidas de poblaciones de alto riesgo. Entre esas muestras que actualmente se están abordando para el análisis de marcadores exploratorios está el esputo. El interés en las muestras de esputo para la búsqueda de biomarcadores se ha generado por la creencia largamente sostenida de que las células exfoliadas recuperadas en el esputo pueden ser la primera indicación posible de un carcinoma incipiente, ya que el cáncer broncopulmonar se desarrolla muy frecuentemente en el epitelio bronquial. A través de la aplicación de técnicas de genética molecular sofisticadas (por ejemplo, ensayos basados en PCR), los estudios están proporcionando evidencias de que pueden detectarse biomarcadores seleccionados en esputo (Mao y col. 1994, Cancer Res 54:1634-1637; Mao y col. 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:9871-9875; Sidransky 1995, J Natl Cancer Inst 87:1201-1202; Tockman y col. 1988, J Clin Oncol, 11: 1685-1693; Tockman y col. 1994, Chest, 106:385s-390s).

Los servicios de cribado o detección de cáncer disponibles en el mercado dependen de ensayos basados en el diagnóstico citomorfológico por médicos formados que observan cada muestra y determinan el grado e identidad de tipos celulares anómalos. Este procedimiento no solamente es caro y consume mucho tiempo, sino que también introduce el criterio humano y, por lo tanto, errores en el procedimiento. Recientemente, se ha desarrollado un procedimiento para detectar células cancerosas del pulmón a través del uso de

5,10,15,20-tetraquis(carboxifenil)porfirina (TCPP) (patente de Estados Unidos n.° 5.162.231 de Cole y col.). Este procedimiento depende de la propensión de las células cancerosas de acumular TCPP de su entorno en una cantidad mayor que las células no cancerosas. Tras la incubación de una muestra celular durante 6-24 horas con 200 |jg/ml de TCPP, la TCPP entraba en las células y se unía a la membrana perinuclear y las mitocondrias de células neoplásicas. La TCPP emite fluorescencia en luz ultravioleta, y las células cancerosas pueden diagnosticarse de ese modo únicamente por la intensidad de la fluorescencia, sin referencia a la morfología. La ampliación del uso de este compuesto para identificar estados tisulares precancerosos (por ejemplo, células displásicas) permitiría cribar poblaciones de alto riesgo para identificar aquellos individuos cuyos tejidos están progresando hacia afecciones cancerosas invasivas, y facilitar de ese modo la detección del cáncer o de la displasia en la fase más tratable. Las características deseables de dicho procedimiento de cribado sería un procedimiento que es rápido, barato y requiere un mínimo de experiencia técnica.

Por las razones anteriores, existe la necesidad de una técnica y metodología para detectar células displásicas en sus fases más prematuras. Además, existe la necesidad de una técnica que pueda proporcionar resultados de diagnóstico muy fiables de forma objetiva y que no dependa del análisis subjetivo del médico que realiza el diagnóstico.

Sumario de la invención

Una realización de la presente invención proporciona un procedimiento de determinación de si una muestra de esputo contiene células displásicas o carcinómicas obteniendo una muestra de esputo que contiene células. La muestra de esputo se marca con TCPP para teñir las células sospechosas de ser displásicas o carcinómicas. Un registrador de imágenes se focaliza en la membrana plasmática de una o más células sospechosas de ser displásicas o carcinómicas y se detecta la emisión a aproximadamente 655 nm +/- 30 nm, si está presente, para células marcadas con TCPP de la muestra de esputo después de focalizarse en la membrana plasmática de las células de la muestra de esputo. Se mide el flujo de protones para cada píxel de un detector para obtener un valor de la célula de la que se han tomado imágenes. El valor medido se califica para determinar si una célula es cancerosa o displásica.

Otra realización proporciona un procedimiento de determinación de si una muestra biológica de células contiene células displasias o carcinómicas obteniendo una muestra biológica sospechosa de contener células displásicas o carcinómicas. La muestra biológica se mara con TCPP. La muestra se excita con una longitud de onda de excitación de luz de aproximadamente 475 nm +/- 30 nm. Un registrador de imágenes se focaliza en la membrana plasmática de una o más células sospechosas de contener células displásicas o carcinómicas para obtener una imagen. Se detecta la emisión a aproximadamente 655 nm +/- 30 nm, si está presente, de células marcadas con TCPP después de focalizarse en la membrana plasmática de una o más células de la muestra biológica sospechosa de contener células displásicas o carcinómicas. Se mide el flujo de fotones para cada píxel del detector para obtener un valor de la célula de la que se han tomado imágenes. El valor medido se califica para determinar si una célula es cancerosa o displásica.

Otra realización más proporciona un medio legible por ordenador para posibilitar que un ordenador caracterice una muestra de esputo, comprendiendo el medio legible por ordenador instrucciones de software o un código para posibilitar que el ordenador realice funciones predeterminadas. Las etapas de funcionamiento predeterminadas incluyen excitar una muestra de esputo marcada con TCPP con una longitud de onda de excitación de luz de aproximadamente 475 nm +/- 30 nm; detectar dentro de la muestra de esputo marcada la emisión a aproximadamente 560 nm +/- 30 nm de células identificadas como macrófagos; focalizar un registrador de imágenes en la membrana plasmática de una o más células sospechosas de ser displásicas o carcinómicas; detectar la emisión a aproximadamente 655 nm +/- 30 nm, si está presente, para células marcadas con TCPP de la muestra de esputo después de focalizarse en la membrana plasmática de las células de la muestra de esputo; medir el flujo de fotones para cada píxel de un detector para obtener un valor medido para la célula de la que se han tomado imágenes; y calificar el valor medido para determinar si una célula es cancerosa o displásica.

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En una realización preferida, la TCPP es meso tetra(4-carboxifenil)porfirina. En otra realización, la longitud de onda de excitación es de aproximadamente 475 nm +/- 5 nm. En otra realización más, la emisión de los macrófagos es de aproximadamente 560 nm +/- 5 nm. En otra realización más, el aparato de imágenes es un microscopio de fluorescencia. En otra realización más, la emisión de las células marcadas con TCPP es de aproximadamente 655 nm +/- 5 nm. En otra realización más, el detector es una cámara CCD. En otra realización más, la calificación comprende además comparar el valor medido con una base de datos de valores almacenados para células cancerosas, displásicas y no cancerosas para asignar una puntuación basándose en los resultados de la comparación. En otra realización más, la muestra de esputo es de un ser humano.

Un aspecto de la presente invención proporciona el marcaje de muestra biológicas con meso tetra(4-carboxifenil)porfirina o 5,10,15,20-tetraquis(4-carboxifenil)porfirina definida en el presente documento como "TCPP" para la detección de células cancerosas y precancerosas.

Otro aspecto de la presente invención proporciona el uso de TCPP para detectar células cancerosas en esputo ya que TCPP se unirá preferentemente con células cancerosas y precancerosas.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un sistema y procedimiento para verificar y cuantificar la identidad espectral de TCPP de forma óptica, y/o cuantificar las tasas de emisión de fotones de TCPP cuando se usan como compuesto de marcaje.

Otro aspecto de la presente invención proporciona el análisis de muestras marcadas con TCPP usando un sistema fluorescente equipado con un filtro óptico sintonizable y un dispositivo acoplado a carga (CCD).

Los objetivos y ventajas adicionales de la presente invención serán evidentes en la siguiente descripción detallada leída junto con las figuras de los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

El archivo de esta patente contiene al menos un dibujo ejecutado en color. Las copias de esta patente con uno o más dibujos en color se proporcionarán por la Oficina de Patentes y Marcas tras petición y pago de la tasa necesaria.

La figura 1 ilustra una imagen de 21 capas reconstruida de una célula marcada con TCPP.

La figura 2 ilustra el espectro óptico de fluorescencia de la membrana plasmática marcada con TCPP (unidades no corregidas).

La figura 3 ilustra la imagen fluorescente de células con el área de interés marcada en rojo.

La figura 4 ilustra un diagrama de identidades espectrales de la figura 1.

La figura 5 ilustra un diagrama de la identidad espectral de autofluorescencia de una región resaltada en azul de la figura 6.

La figura 6 ilustra células en una imagen para autofluorescencia y marcadas con TCPP.

La figura 7 ilustra un diagrama para la membrana celular marcada con TCPP de la región resaltada en azul de la figura 6.

La figura 8 ilustra la capa de 530 nm focalizada a 660 nm.

La figura 9 ilustra la capa de 660 nm focalizada a 660 nm.

Descripción detallada de la invención

Como se usa en el presente documento, "uno", "una" significa uno o más.

Como se usa en el presente documento "CCD" significa dispositivo acoplado a carga.

Como se usa en el presente documento, "una muestra biológica" o "muestra" o "espécimen" se refiere a un organismo completo o un subconjunto de su tejido, células o partes componentes (líquidos corporales, incluyendo, aunque sin limitación, sangre, moco, líquido linfático, esputo, plasma, líquido de eyaculación, líquido del conducto mamario, líquido cefalorraquídeo, orina y deposiciones fecales.

De acuerdo con una realización de la presente invención, se proporciona un sistema y procedimiento para determinar la cantidad de emisión de fotones desde TCPP unida a una célula de interés que se cree que es cancerosa respecto a la cantidad de emisión de fotones desde TCPP de células no cancerosas. Como se están determinando cantidades relativas de fluorescencia, con todas las células en el mismo entorno, no estamos limitados

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a los rendimientos cuánticos reales de los fluoróforos individuales. Una realización de la presente invención proporciona la determinación de emisión de fotones de muestras con la ecuación 1 (Ec. 1).

AtCPP pos

Ct>K= ------------------------------- Ec. 1

-AxC'PP neg

En la que ATCPP pos es el número de fotones emitidos por segundo, flujo de fotones, por unidad de área de la membrana celular para una célula cancerosa y Atcpp neg es el número de fotones emitidos por segundo por unidad de área para una célula normal.

De acuerdo con una realización de la presente invención, la TCPP se adhiere preferentemente a la membrana plasmática de una célula e incuso mas preferentemente a una célula cancerosa. La TCPP se une a una célula cancerosa o célula precancerosa preferentemente en comparación con una célula no cancerosa. Se ha observado que las células cancerosas tienen una concentración inusualmente alta de lipoproteínas de baja densidad en sus membranas plasmáticas, dando lugar de ese modo a la emision de fluorescencia altamente cuantificable desde TCPP a una longitud de onda entre aproximadamente 200-900 nm, preferentemente entre aproximadamente 420-720 nm más preferentemente entre aproximadamente 600-700 nm más preferentemente aproximadamente 655 nm +/- 30 nm. La diferencia en las identidades espectrales de las células marcadas con TCPP frente a aquellas con el marcador TCPP tienen un pico espectral pronunciado en la region entre 420 nm - 720 nm. Ademas, un filtro, por ejemplo, un filtro sintonizable de cristal líquido (LCTF) dentro del sistema facilita la demostracion de no solamente la localizacion del lugar en que se está uniendo TCPP y/o la concentración respecto a la estructura celular, sino que también permite la cuantifiacion de la emision de fotones en la región de referencia respecto al resto de la identidad fluorescente de la célula u otra que no se debe a TCPP.

Dispositivo de captura de imágenes

Una realización de la presente invención proporciona un detector, por ejemplo, un detector de dispositivo acoplado a carga "CCD", por ejemplo, una cámara CCD, pero sin limitación a ello, para capturar una imagen de una muestra teñida con TCPP. En una realización, un CCD es un dispositivo semiconductor fabricado por una capa epitaxial de silicio dopado desarrollado sobre un sustrato de silicio. Creando pixeles separados conectados a un registrador de desplazamiento, la imagen focalizada en una matriz bidimensional de estos píxeles puede almacenarse electrónicamente. Un píxel puede describirse por su tamaño y la cantidad de electrones que puede alojar. Para una aplicación del presente documento, el detector CCD se usa para determinar la cantidad de fotones que impactan en los píxeles específicos en la matriz. Esto se consigue midiendo el voltaje desarrollado a través de la unión capacitiva de cada píxel durante un tiempo dado. La carga que crea la diferencia en el potencial está directamente relacionada con la cantidad de fotones que impactan en cada cuanto de píxel mecánicamente. Para cada fotón que se absorbe por el silicio dopado, se libera una cantidad específica de electrones y se excitan en los niveles de valencia del semiconductor. La eficacia cuántica de un detector CCD está representada por una curva de eficacia cuántica asociada con un detector CCD específico.

Un detector CCD permite la medición de varios fotones registrando el voltaje desarrollado a través de cada unión de píxeles leído a través de la salida en serie del registrador de desplazamiento, básicamente una secuencia de valores hexadecimales en código binario ordenados de acuerdo con la secuencia en que el registrador de desplazamiento produce los voltajes de píxel. Como cada uno de estos valores es directamente proporcional a la cantidad de fotones que impactan en cada píxel durante un periodo de tiempo, estos valores pueden correlacionarse con el flujo de emisión de fotones de la fuente de los fotones.

Puede reunir una cantidad extraordinaria de información respecto a la composición de estructuras celulares aislando las longitudes de onda específicas de los fotones emitidos que se están emitiendo por estructuras específicas de las células o por sondas o compuestos de marcaje tales como TCPP que se unen a una célula o parte de la misma. Por ejemplo, si se produce autofluorescencia normal en el intervalo de 560 nm, y una determinada estructura defectuosa emite fluorescencia en el intervalo de 590 nm, puede observarse el tamaño, forma y otros aspectos de la estructura defectuosa filtrando todas las longitudes de onda diferentes de la longitud de onda de 590 nm y después usando la salida de longitud de onda seleccionada para crear la imagen en el detector CCD. La cantidad real de fotones por unidad de área de la estructura celular por unidad de tiempo puede determinarse entonces midiendo los voltajes desarrollados por unidad de tiempo por píxel y correlacionando ese valor con el aumento del sistema óptico y la atenuación de los componentes individuales.

Fundamentos de fluorescencia de porfirina

Las porfirinas son macromoléculas aromáticas planas que consisten en cuatro anillos de pirrol unidos por cuatro puentes de metano. Son compuestos de origen natural que se encuentran en plantas, hemoglobina y surgen en miríadas de formas. Una porfirina, como se usa en el presente documento, es una sonda o compuesto de marcaje.

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Cuando se iluminan con luz de la longitud de onda correcta, la mayoría de las proteínas producirán fotones fluorescentes con longitudes de onda en el intervalo de aproximadamente 490 nm a 600 nm. Las porfirinas, sin embargo, tienen espectro de absorción y emisión bastante variados.

Marcando las células con porfirinas (por ejemplo, TCPP), la microscopia de fluorescencia permite la formación de imágenes de estructuras celulares que se resaltan por el compuesto de marcaje (véase la figura 1). Adaptar los compuestos de marcaje para que se adhieran a dianas específicas en la célula, proporciona la capacidad de resaltar estructuras celulares específicas. Con referencia ahora a la figura 1, las estructuras dentro de la célula muestran autofluorescencia en la longitud de onda verde mientras que la membrana plasmática emite fluorescencia en la longitud de onda roja cuando la célula se ilumina con una longitud de onda de excitación de aproximadamente 465 nm +/- 30 nm. La figura 4 ilustra el diagrama espectral obtenido de una exploración espectral de la imagen de la figura 1.

Se muestra un diagrama que ilustra el espectro óptico de fluorescencia de membrana plasmática marcada con TCPP de una célula de una muestra biológica en la figura 2 de acuerdo con una realización de la presente invención.

Protocolo experimental

De acuerdo con una realización de la presente invención, se procesa una muestra biológica, por ejemplo, una muestra de esputo usando un protocolo de preparación fina en un portaobjetos de microscopio. La muestra de esputo se fija en una solución basada en metanol que ha demostrado ser menos corrosiva para la membrana plasmática de una célula de una población de células de interés. Minimizar los efectos corrosivos a la membrana plasmática es importante ya que la TCPP ha demostrado estar localizada en la membrana plasmática de la superficie celular. Las células se procesan para separar las células del moco y los fragmentos celulares. Cada portaobjetos preparado contiene una monocapa de las células de esputo. Después de preparar los portaobjetos, el reactivo de marcaje TCPP se disuelve en concentraciones entre 0,05 ug/ml -4,0 ug/ml en un alcohol acuoso que contiene entre un 50 % y un 90 % de solución de alcohol isopropanol. El pH se ajusta con bicarbonato de sodio hasta un pH entre 6,0 y 10,5. El cubreobjetos se sumerge en la solución de marcaje de TCPP, se aclara, se seca al aire y se coloca un cubreobjetos sobre el mismo. (Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 7.670.799 de Garwin).

Registrador de imágenes

Un registrador de imágenes tal como un instrumento de visualización, por ejemplo, un microscopio, preferentemente un microscopio de fluorescencia, se utiliza por el sistema de acuerdo con una realización de la presente invención.

Fuente de excitación

Una fuente de luz, por ejemplo, una lámpara de vapor de mercurio o preferentemente un láser que puede sintonizarse a las longitudes de onda especificadas por el usuario se utiliza adicionalmente por el sistema de acuerdo con una realización de la presente invención.

Óptica

Cubo óptico de fluorescencia con un filtro de muesca de frecuencia visible azul. Una luz fluorescente desde la muestra en un soporte de muestras, por ejemplo, un portaobjetos entonces pasa a través de un divisor de haz al objetivo del microscopio y a una cámara CCD en una realización preferente. Además, el sistema también puede comprender un procesador, una base de datos e instrucciones legibles por ordenador para obtener un valor de una imagen y producir un informe basado en el valor.

La TCPP tiene un coeficiente de absorción molar pronunciado en aproximadamente 400 nm, llamado banda Soret. Aunque es muy eficaz en esta región, se produce fotoblanqueo. Por lo tanto, puede seleccionarse una región del espectro en la que la absorción por TCPP no es tan eficaz, eliminando de ese modo la mayoría del fotoblanqueo y ampliando las vidas útiles fluorescentes para las que son viables las muestras.

En una realización, una región en el espectro azul de 475 nm +/- 30 nm fue la longitud de onda de excitación seleccionada. Se empleó un filtro de paso de banda centrado en aproximadamente 475 nm. Un cubo óptico fluorescente también contenía un divisor de haz dicroico que tiene una respuesta de frecuencia de transmisión óptica bastante plana en el visible por encima de 500 nm con un segundo pico de transmisión pronunciado por debajo del centrado en aproximadamente 400 nm que permite que algo de la luz correspondiente a la banda Soret que se produce para obtenerse a través del filtro de excitación pase a través y no se refleje en la muestra.

Captura de imágenes y procedimiento para obtener imágenes

Para recoger nuestros datos, se empleó un sistema de captura de imágenes que tiene un detector capaz de cuantificar la misión de fotones desde una célula marcada con TCPP a través del espectro de luz de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 800 nm de acuerdo con una realización de la presente invención. El

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sistema comprende un registrador de imágenes como un instrumento de visualización, por ejemplo, un microscopio, más preferentemente un microscopio de fluorescencia. Un detector de imágenes y un dispositivo de captura que pueden estar automatizados para la adquisición de datos para optimizar la captura de emisión de una imagen. El dispositivo de captura de imágenes puede adherirse directamente a un registrador de imágenes tal como un microscopio de fluorescencia. Un filtro, por ejemplo, un filtro sintonizable de cristal líquido (LCTF), aunque sin imitación a ello, permite la captura de imágenes desde diferentes frecuencias ópticas, y la medición de la emisión a esas diferentes frecuencias. Sin embargo, pueden utilizarse otros filtros (personalizados o los existentes) y pueden utilizarse otras técnicas de filtrado y no se limitan a LCTF. Además, una fuente de luz, por ejemplo, una lámpara de vapor de mercurio o más preferentemente un láser que puede sintonizarse a longitudes de onda especificadas por el usuario es útil para iluminar la muestra. En un ejemplo, se utilizó una lámpara de vapor de mercurio que tiene una eficacia luminosa de 30 lm/W, flujo luminoso de 3000 h, intensidad luminosa de 300 cd, luminancia de 17000 cd/cm2 y características espectrales conocidas en el sistema de acuerdo con una realización de la presente invención.

Con referencia ahora a la figura 1, se tiene una célula marcada o teñida con TCPP de acuerdo con la realización de la presente invención. La imagen se reconstruye a partir de múltiples imágenes adquiridas sobre longitudes de onda indicadas sobre un espectro definido por el usuario y se recombinan las imágenes resultantes. Por ejemplo, se obtuvieron 21 capas de una imagen con cada capa adquirida a una longitud de onda diferente de la célula marcada con TCPP. La autofluorescencia de las células se detecta en el canal verde de 560 +/- 30 nm y la fluorescencia del compuesto marcado con TCPP en la célula se detecta en el canal rojo de 660 +/-30 nm. Una realización del sistema y procedimiento de la presente invención proporciona el aislamiento de frecuencias específicas para formar imágenes de la célula y medir frecuencias sintonizando el LCTF. Sintonizando el LCTF a diferentes frecuencias durante la formación de imágenes, el sistema permite que la información se recoja y analice sobre un amplio espectro. Entonces, después de capturar cada imagen para un intervalo de longitud de onda específico, pueden extraerse los espectros ópticos específicos de interés. Se presenta la imagen con potenciaciones espectrales para resaltar características específicas de la imagen. Entonces, se mide una imagen en escala de grises con el LCTF sintonizado a la frecuencia apropiada, véase, por ejemplo, la figura 3. El flujo de fotones se mide desde una o más estructuras celulares específicas en la imagen (véase, por ejemplo, el círculo rojo con el centro situado sobre el área de interés). La determinación de un valor de emisión umbral relativo para determinar si una célula es cancerosa o no se determina entonces. Esto también permite la separación de emisiones por diferentes estructuras celulares y cuantificar las emisiones para producir un valor. Además, uno o más de las siguientes características de la imagen y/o la célula de interés también pueden ser útiles en la calificación: número ROI, ID del cubo, señal promedio (recuentos), señal promedio (recuentos gradados/s), señal promedio, (x106 fotones/cm2/s), señal promedio (DO), desviación típica de los recuentos, desviación típica de los recuentos gradados, desviación típica (x106 fotones/cm2/s), desviación típica (DO), recuentos totales de la señal, recuentos gradados totales de la señal (x106 fotones/cm2/s), señal total (DO), recuentos máximos de la señal, recuentos gradados máximos de la señal, señal máxima (x106 fotones/cm2/s), señal máxima (DO), píxeles de área, área (um)2, eje mayor, eje menor, localización x, localización y, ID del espectro, marcador de tiempo del cubo, cubo, fluorescencia visual, morfología celular (tamaño, forma, no limitado al tipo, características), identidad espectral (TCPP), fluorescencia de fondo, relación de señal/fondo, desviación típica, relación de señal/fondo, fluorescencia (auto, TCPP)), ancho de banda estrecha del cubo de imágenes de captura, espectro completo del cubo de imágenes de captura.

En una realización de la presente invención, el valor producido por la calificación se correlaciona con una célula cancerosa o célula no cancerosa para determinar la salud de un paciente.

El sistema permite la separación de una imagen basándose en longitudes de onda específicas, así como la selección de regiones específicas en esa imagen para medir la señal del detector CCD, y después exporta los datos espectrales para el análisis.

Datos: Identidad espectral de TCPP

Con referencia ahora a la figura 6, la imagen es de una muestra de esputo broncopulmonar que se colocó en un portaobjetos de microscopio de acuerdo con el procedimiento numerado anteriormente. El portaobjetos se iluminó con luz que tenía una longitud de onda de aproximadamente 475 nm de la fuente de vapor de mercurio filtrada a través de un filtro de paso de banda, un divisor de haz de paso largo, de aproximadamente 500 nm de corte. La imagen se tomó antes del procedimiento de marcaje para demostrar la identidad espectral de TCPP respecto a la autofluorescencia normal de las estructuras celulares. Se analizó un área resaltada en azul de la figura 6, usando color y el gráfico de la figura 5, que muestra los componentes espectrales de la imagen. Con referencia ahora a la figura 5, se ilustra un diagrama de la identidad espectral o autofluorescencia de la región resaltada en azul de la figura 6.

La muestra de la figura 6 entonces se marcó con TCPP y se volvió a capturar en imágenes. El área resaltada en azul, de la figura 6, se capturó en imágenes con el detector CCD y se analizó. El diagrama de la figura 7 muestra el resultado espectral fluorescente de TCPP (la línea verde) de la región resaltada en azul de la figura 6 en imágenes. Los fotones por segundo por píxel están en unidades arbitrarias.

Las escalas se establecieron al mismo valor para demostrar la identidad espectral del compuesto de tinción. El pico a aproximadamente 660 nm se debe al compuesto de tinción TCPP-

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Datos: Localización de TCPP en estructuras celulares

Otra característica de la presente invención ilustra que el compuesto TCPP se localiza en la membrana plasmática de una célula. Separando las imágenes por emisión espectral, puede observarse que la emisión del compuesto de marcaje TCPP se emite exclusivamente desde la membrana plasmática. El microscopio puede focalizarse en las estructuras que están emitiendo a longitudes de onda específicas en el intervalo visibles. Se obtienen imágenes de características (internas o externas) de las estructuras celulares que emiten fluorescencia. Las imágenes de una célula, partes de la misma y estructuras celulares que emiten fotones a diferentes longitudes de onda se ilustran en la figura 1.

La figura 8 es una imagen en escala de grises tomada con el LCTF sintonizado a aproximadamente 530 nm. La imagen muestra las estructuras internas que estaban localizadas por debajo de la capa que emitía la identidad de TCPP. La figura 8 se tomó con la focalización del microscopio establecida sobre las estructuras celulares que se observaron con el LCTF establecido a 660 nm. Para focalizar esta imagen, el campo de focalización tenía que bajarse físicamente. La imagen que se produjo (no mostrada) de bajar el campo de focalización demostró mayor definición y estaba mejor focalizada y la membrana plasmática está mejor definida que la figura 8. Esto se debe al hecho de que algo de la luz que se está emitiendo desde las estructuras celulares inferiores se ocluye por la membrana plasmática.

La imagen de la figura 9 se obtuvo con el LCTF sintonizado a 660 nm. El campo de focalización se elevó respecto al campo focal para la imagen de 530 nm. Como la luz de excitación proviene de la parte superior del portaobjetos, combinado con el hecho de que solamente la superficie expuesta de las células se está sometiendo al compuesto de tinción durante el procedimiento de tinción, las imágenes apoyan la premisa de que TCPP se adhiere solamente a los elementos superficiales y no migra a las estructuras celulares internas. Cuando se tiene esto en consideración con la figura 9, demuestra que los objetos que emiten una identidad de 530 nm estaban localizados físicamente por debajo de los que emiten una identidad a aproximadamente 660 nm. La membrana plasmática en la figura 9 está focalizada.

Datos: Medición del flujo de fluorescencia de una célula cancerosa marcada con TCPP

La determinación del flujo de fotones desde la célula que emite fluorescencia se basa en el nivel de saturación y la eficacia cuántica del detector CCD. La base para los valores calculados es la siguiente:

De acuerdo con una realización de la presente invención, los fotones emitidos por las estructuras fluorescentes pasan a través de 12 medios antes de impactar en el CCD. Estos consisten en el cubreobjetos, la óptica del objetivo, el cubo óptico, el divisor de haz para el microscopio, el LCTF y los espacios de aire entre cada uno. Se ha tenido en consideración los coeficientes de transmisión para cada uno de los medios a las longitudes de onda relevantes, junto con la longitud de onda dependiente de la atenuación del LCTF y la eficacia cuántica del CCD para llegar a un valor para la cantidad de fotones emitidos por segundo que llegan a cada píxel del CCD. Por supuesto, hay una consideración de ancho de banda debido al ancho de banda del LCTF. Cada uno de los anchos de banda en cuestión tiene una especificación de 20 nm de achura completa a la mitad del máximo (FWHM).

La siguiente ecuación da la forma básica de la expresión usada.

(PCCCD)/[(0,99)(MO)(OC)(LCTF)(QECCD)] = flujo de fotones desde la célula por píxel

En la que PCCCD es el recuento de fotones desde el CCD, MO es la atenuación atribuida a la óptica del microscopio, OC es la atenuación de la óptica en el cubo óptico fluorescente, LCTF es la atenuación debido al filtro sintonizable de cristal líquido y QECCD es la eficacia cuántica del chip CCD. El término 0,99 es para justificar la absorción de fotones en el cubreobjetos y la dispersión y otras pérdidas debidos a los espacios de aire y los reflejos Fresnel.

Todos los datos se recogieron usando un objetivo 20X con una abertura numérica de 0,7. Esto permite que los datos se correlacionen con el tamaño real del área de emisión de la estructura celular. El análisis de datos permite la medición del recuento de fotones sobre áreas especificadas de la imagen. En este caso particular, el dispositivo de captura de imágenes, por ejemplo, un CCD que puede consistir en una matriz de 1392x 1040 píxeles. La determinación de las dimensiones reales del área medida es simplemente una cuestión de geometría.

Una vez se ha capturado una imagen, se aísla la capa en escala de grises relevante y se específica una región de interés. Se adquiere la carga en cada elemento del detector CCD. Basándose en la carga, se determina un valor para la cantidad de fotones absorbidos por el elemento a esa longitud de onda. Usando este valor, puede estimarse la cantidad real de fotones emitidos por la fuente fluorescente con la relación anterior. El valor se califica frente a controles y se le asigna una puntuación. La puntuación asignada determina si la célula explorada es cancerosa o no cancerosa.

Se calcula la información para la región especificada en términos de la cantidad de pixeles en la región especificada, la cantidad total de recuentos en la región especificada, la cantidad de recuentos del píxel con el máximo valor y la desviación típica para la distribución de frecuencia.

Aunque la invención se ha descrito en detalle con referencia en particular a estas realizaciones preferidas, otras realizaciones pueden conseguir los mismos resultados. Serán obvias variaciones y modificaciones de la presente invención para los expertos en la materia y se pretende que estén cubiertas en las reivindicaciones adjuntas todas estas modificaciones y equivalentes. Por ejemplo, se proporcionan longitudes de onda como una longitud de onda 5 específica aproximada e intervalos especificados aproximados de longitudes de onda. Debe entenderse que algunas realizaciones permiten un flujo de +/- 30 nm. También se proporcionan ejemplos específicos que se refieren a muestras de esputo, pero las muestras biológicas pueden ser de cualquier tipo y obtenerse por diferentes medios como se identifica en la patente de Estados Unidos n.° 6.316.215 de Adair.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de determinación de si una muestra de esputo contiene células displásicas o carcinómicas, comprendiendo el procedimiento:

obtener una muestra de esputo de un paciente humano sospechoso de contener células displásicas o carcinómicas, comprendiendo el procedimiento:

marcar la muestra de esputo con 0,05-4,0 ug/ml de TCPP en un alcohol acuoso de solución de alcohol isopropanol entre un 50 % y un 90 % a un pH entre 6,0 y 10,5 para teñir las células sospechosas de ser displásicas o carcinómicas;

excitar la muestra de esputo marcada con una longitud de onda de excitación desde una fuente de luz que tiene una tasa de emisión controlada para una longitud de onda de luz de aproximadamente 475 nm +/- 30 nm;

focalizar un registrador de imágenes en la membrana plasmática de i) una o más células sospechosas de ser células displásicas o carcinómicas y ii) células normales para capturar una imagen de i) y ii) en un detector que tiene píxeles capaces de cuantificar el flujo de fotones en cualquier píxel dado en el detector, en el que el detector comprende un CCD;

detectar dentro de la muestra de esputo la emisión a aproximadamente 560 nm +/- 30 nm de células identificadas como macrófagos;

detectar la emisión a aproximadamente 655 nm +/- 30 nm, si está presente, para células marcadas con TCPP de la muestra de esputo después de focalizarse en la membrana plasmática de i) una o más células sospechosas de ser células displásicas o carcinómicas y ii) células normales;

medir el flujo de iones en cada píxel del detector para obtener un valor cuantitativo para la célula en imágenes; y

calificar con un procesador programado apropiadamente el valor cuantitativo medido para determinar si una célula es cancerosa o displásica basándose en una unión preferente de TCPP a la célula cancerosa o displásica en comparación con la célula no cancerosa.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la TCPP es meso tetra(4-carboxifenil)porfirina.
3. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la longitud de onda de excitación es de aproximadamente 475 nm +/- 5 nm,

o en el que la emisión de los macrófagos es de aproximadamente 560 nm +/- 5 nm, o en el que el registrador de imágenes es un microscopio de fluorescencia.
4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la emisión de las células marcadas con TCPP es de aproximadamente 655 nm +/- 5 nm, o en el que el detector es una cámara CCD.
5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la calificación comprende además comparar el valor medido con una base de datos de valores almacenados para células cancerosas, displásicas y no cancerosas para asignar una puntuación basándose en los resultados de la comparación.
6. Un procedimiento de determinación de si una muestra biológica de células contiene células displásicas o carcinómicas, comprendiendo el procedimiento:

obtener una muestra biológica sospechosa de contener células displásicas o carcinómicas de un paciente humano sospechoso de tener cáncer;

marcar la muestra biológica con 0,05-4,0 ug/ml de TCPP en un alcohol acuoso de solución de alcohol isopropanol entre un 50% y un 90% a un pH entre 6,0 y 10,5 para teñir las células sospechosas de ser displásicas o carcinómicas;

excitar la muestra con una longitud de onda de excitación de luz de aproximadamente 475 nm +/- 30 nm; focalizar un registrador de imágenes en la membrana plasmática de i) una o más células sospechosas de ser células displásicas o carcinómicas y ii) células normales para obtener una imagen de i) y ii) en un detector que tiene píxeles capaces de cuantificar el flujo de fotones en cualquier píxel dado en el detector, en el que el detector comprende un CCD;

detectar la emisión a aproximadamente 655 nm +/- 30 nm, si está presente, de las células marcadas con TCPP después de focalizarse en la membrana plasmática de una o más células de la muestra biología sospechosa de contener células displásicas o carcinómicas;

medir el flujo de fotones para cada píxel del detector para obtener un valor cuantitativo para la célula en imágenes; y

calificar con un procesador el valor cuantitativo medido para determinar si una célula es cancerosa o displásica basándose en una unión preferente de TCPP a la célula cancerosa o displásica en comparación con la célula no cancerosa.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, que comprende además:

detectar la emisión de células identificadas como células de interés a aproximadamente 560 nm +/- 30 nm.

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8. El procedimiento de la reivindicación 6 o 7, en el que la TCPP es meso tetra(4-carboxifenil)porfirina.
9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que la longitud de onda de excitación es de aproximadamente 475 nm +/- 5 nm, o en el que la emisión de macrófagos es de aproximadamente 560 nm +/- 5 nm.
10. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el registrador de imágenes es un microscopio de fluorescencia.
11. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la emisión de las células marcadas con TCPP es de aproximadamente 655 nm +/- 5 nm, y en el que el detector es una cámara CCD.
12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 6-11, en el que la calificación comprende además comparar el valor medido con una base de datos de valores almacenados para células cancerosas, displásicas y no cancerosas para asignar una puntuación basándose en los resultados de la comparación.
13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 6-12, en el que la muestra de esputo es de un ser humano.
14. Un medio legible en ordenador para posibilitar que un ordenador caracterice una muestra de esputo, comprendiendo el medio legible en ordenador instrucciones de software para posibilitar que el ordenador realice funciones predeterminadas de las siguientes etapas:

excitar una muestra de esputo marcada con 0,05-4,0 ug/ml de TCPP en un alcohol acuoso de solución de alcohol isopropanol entre un 50 % y un 90 % a un pH entre 6,0 y 10,5 con una longitud de onda de excitación de luz de aproximadamente 475 nm +/- 30 nm;

detectar dentro de la muestra de esputo marcada la emisión a aproximadamente 560 nm+/- 30 nm de células identificadas como macrófagos;

focalizar un registrador de imágenes en la membrana plasmática de i) una o más células sospechosas de ser células displásicas o carcinómicas y ii) células normales para obtener una imagen de i) y ii) en un detector que tiene píxeles capaces de cuantificar el flujo de fotones en cualquier píxel dado en el detector, en el que el detector comprende un CCD y en el que el registrador de imágenes comprende un microscopio de fluorescencia; detectar la emisión a aproximadamente 655 nm +/- 30 nm, si está presente, para células marcadas con TCPP de la muestra de esputo después de focalizarse en la membrana plasmática de las células de la muestra de esputo; medir el flujo de fotones para cada píxel de un detector para obtener un valor para la célula en imágenes; y calificar el valor medido para determinar si una célula es cancerosa o displásica.