ES2970741T3 - Utilización de biomarcadores celulares circulantes en la sangre para la detección y el diagnóstico de enfermedades y métodos para aislarlos - Google Patents
Utilización de biomarcadores celulares circulantes en la sangre para la detección y el diagnóstico de enfermedades y métodos para aislarlos Download PDFInfo
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Abstract
Se identifica en sangre un nuevo biomarcador celular sensible de tumores sólidos e infecciones virales. Este biomarcador se puede utilizar para determinar la presencia de carcinomas, sarcomas y virus, la determinación rápida de la respuesta al tratamiento, la detección temprana del cáncer, la detección temprana de la recurrencia del cáncer y se puede utilizar para determinar la terapia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Utilización de biomarcadores celulares circulantes en la sangre para la detección y el diagnóstico de enfermedades y métodos para aislarlos
Antecedentes
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general al descubrimiento y la caracterización de biomarcadores en la sangre y otros líquidos corporales que pueden utilizarse para supervisar la eficacia de los tratamientos antineoplásicos, entre otros objetivos importantes. Los métodos de la invención pueden utilizarse solos o en combinación con células tumorales circulantes, marcadores de cáncer de ADN libres en plasma y suero, marcadores proteicos asociados al cáncer y otros biomarcadores.
Técnica relacionada
Cuando las células tumorales se desprenden de los tumores sólidos primarios, penetran en la circulación sanguínea o linfática y, en última instancia, abandonan el torrente circulatorio y entran en órganos o tejidos para formar metástasis. El 90 % de las muertes relacionadas con el cáncer son provocadas por el proceso metastásico. Los sitios metastásicos más comunes son el pulmón, el hígado, los huesos y el cerebro. Las células tumorales que se encuentran en la circulación se denominan células tumorales circulantes (CTC). Muchas publicaciones de investigación y ensayos clínicos muestran que las CTC tienen utilidad clínica para (i) proporcionar información sobre el pronóstico de supervivencia y la recaída del cáncer a través de la enumeración de las CTC en el torrente sanguíneo y (ii) proporcionar información sobre el tratamiento mediante el examen de los niveles de expresión de proteínas y la aparición de mutaciones y translocaciones génicas en las CTC. Sin embargo, las CTC no se asocian coherentemente al desarrollo y/o la presencia de cáncer en un sujeto, incluso en pacientes con cáncer en estadio IV.
Existen afecciones médicas, además del cáncer, que pueden diagnosticarse mediante la detección de ciertos tipos de células en los líquidos corporales. En particular, las células indicativas o características de ciertas afecciones médicas pueden ser más grandes y/o menos flexibles que otras células presentes en líquidos corporales seleccionados. Por consiguiente, recogiendo dichas células más grandes y/o menos flexibles de una muestra de un líquido corporal, puede ser posible diagnosticar una afección médica tomando como base las células recogidas.
La identificación y caracterización de biomarcadores en la sangre y otros líquidos corporales que puedan utilizarse para cribar a un sujeto en busca de afecciones médicas proporcionaría herramientas adicionales a un facultativo. La presente invención se refiere a éstos y otros objetivos importantes.
Adams, D. L., et al., (2014),Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,777 (9), 3514-3519, analiza que los megamacrófagos circulantes son un biomarcador potencial de tumores sólidos.
Sumario
La presente invención utiliza un tipo de célula con características únicas que se encuentra en la sangre de pacientes con cáncer que tienen tumores sólidos, incluyendo carcinoma, sarcoma, neuroblastoma y melanoma. La célula, denominada "célula circulante similar a macrófago asociada al cáncer" (CAML), se describe en el presente documento y se muestra que está asociada a la presencia de tumores sólidos en un paciente. Se han caracterizado y descrito cinco morfologías asociadas a las CAM<l>(Adams, D., et al., Circulating giant macrophages as a potential biomarker of solid tumors.PNAS2014, 111 (9): 3514-3519 y el documento WO 2013/181532). A través de los datos presentados en el presente documento, se muestra que las CAML tienen utilidad clínica, ya que pueden utilizarse como biomarcadores para diversas aplicaciones médicas. Se han encontrado CAML coherentemente en la sangre periférica de sujetos que tienen cáncer en estadio I a estadio IV de origen epitelial mediante microfiltración utilizando microfiltros de precisión. En el presente documento se presentan morfologías adicionales de CAML encontradas en la sangre de pacientes con cáncer.
Las aplicaciones médicas asociadas a las CAML incluyen, pero sin limitación, el uso de la célula como biomarcador para proporcionar un diagnóstico de cáncer, en particular, en la detección temprana del cáncer, en la detección temprana de la recaída o reaparición del cáncer, y en la determinación de la mutación del cáncer. Las CAML también pueden utilizarse como biomarcador para determinar los tratamientos adecuados; en particular, las células pueden utilizarse en una determinación rápida de la eficacia de la respuesta al tratamiento de quimioterapia y radioterapia.
Las CAML pueden usarse independientemente como marcador de cáncer, o en combinación con CTC, ADN acelular, proteínas y otros biomarcadores para proporcionar una comprensión más completa de la enfermedad de un paciente.
Las realizaciones de la presente invención se definen en las reivindicaciones. En particular, en una primera realización, la invención se refiere a métodos para determinar el estadio del cáncer en un sujeto, lo que comprende la caracterización de características seleccionadas de las CAML en una muestra biológica de un sujeto que padece un cáncer, en donde dicha caracterización indica el estadio del cáncer en el sujeto, en donde las características seleccionadas son (i) cantidad de CAML y (ii) tamaño medio de las CAML, y en donde cuando se miden en una muestra de sangre periférica en un volumen de 7,5 ml, entonces 5 o más CAML y aproximadamente el 70 % de las CAML de más de 40 micrómetros de diámetro es indicativo de cáncer en estadio III; y 5 o más CAML y aproximadamente el 80 % de las CAML de más de 40 micrómetros de diámetro es indicativo de cáncer en estadio IV. La identificación del tipo específico de cáncer puede realizarse mediante métodos convencionales, tales como la tinción para marcadores de cáncer. La identificación del tipo específico de cáncer también puede realizarse mediante la tinción para marcadores de cáncer y la posterior repetición de la tinción de las mismas células para marcadores adicionales. En ciertos aspectos, los métodos englobados por esta realización también incluyen la caracterización de características seleccionadas de las CTC en la muestra biológica, en donde las características seleccionadas de las CTC son una o más características seleccionadas del grupo que consiste en (i) cantidad de CTC; (ii) cantidad de leucocitos unidos a las CTC; (iii) grado de expresión de la citoqueratina 8; (iv) grado de expresión de la citoqueratina 18; (v) grado de expresión de la citoqueratina 19; (vi) grado de expresión de EpCAM; (vii) grado de expresión de vimentina; (viii) grado de expresión de PD-L1; (ix) grado de expresión de la uroplaquina; (x) morfología de la citoqueratina; (xi) ubicación de los marcadores; y (xii) intensidad de la tinción del marcador, preferentemente, en donde las características seleccionadas de las CTC son una o más de: (i) cantidad de CTC; (ii) intensidad de la tinción del marcador; (iii) ubicación de los marcadores; y (iv) cantidad de leucocitos unidos a las CTC. En ciertos aspectos, las CAML y/o las CTC se recogen de la muestra biológica antes de su caracterización. En aspectos particulares de esta realización, se toma una decisión de tratamiento tomando como base el resultado del método. En aspectos particulares de esta realización, el método comprende además administrar un fármaco antineoplásico al sujeto después de determinar el estadio del cáncer en el sujeto.
En una segunda realización, la invención se refiere a métodos para supervisar la eficacia del tratamiento de un cáncer, que comprenden (a) el ensayo de características seleccionadas de las CAML en una muestra biológica de un sujeto sometido a tratamiento antineoplásico, y (b) la comparación de los valores del ensayo de las características seleccionadas determinados en (a) con los valores del ensayo de las mismas características ensayadas en una muestra biológica similar del mismo sujeto en uno o más puntos temporales antes, durante o después de completar el tratamiento, en donde un cambio en los valores del ensayo indica la eficacia del tratamiento antineoplásico en el sujeto, en donde las características seleccionadas son (i) la cantidad de CAML y (ii) el tamaño medio de las CAML, y en donde un cambio en la cantidad y el tamaño medio de las CAML indica la eficacia del tratamiento antineoplásico. En ciertos aspectos, los métodos englobados por esta realización también incluyen (a) el ensayo de una o más características seleccionadas de las CTC en la muestra biológica, y (b) la comparación de los valores del ensayo para la una o más características seleccionadas determinadas en (a) con los valores del ensayo para las mismas características ensayadas en una muestra biológica similar del mismo sujeto en uno o más puntos temporales antes, durante o después de completar el tratamiento, en donde las características seleccionadas de las CTC son una o más características seleccionadas del grupo que consiste en (i) cantidad de CTC; (ii) cantidad de leucocitos unidos a las CTC; (iii) grado de expresión de la citoqueratina 8; (iv) grado de expresión de la citoqueratina 18; (v) grado de expresión de la citoqueratina 19; (vi) grado de expresión de EpCAM; (vii) grado de expresión de vimentina; (viii) grado de expresión de PD-L1; (ix) grado de expresión de la uroplaquina; (x) morfología de la citoqueratina; (xi) ubicación de los marcadores; y (xii) intensidad de la tinción del marcador, preferentemente, en donde las características seleccionadas de las CTC son una o más de: (i) cantidad de CTC; (ii) intensidad de la tinción del marcador; (iii) ubicación de los marcadores; y (iv) cantidad de leucocitos unidos a las CTC. En ciertos aspectos, las CAML y/o las CTC se recogen de la muestra biológica antes de su caracterización. En aspectos particulares de esta realización, se toma una decisión de tratamiento tomando como base el resultado del método.
En la primera y la segunda realización, las características seleccionadas de las CAML de la muestra incluyen: (i) cantidad de CAML; y (ii) tamaño medio de las CAML (el tamaño de las células CAML varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros de diámetro); y puede incluir una o más características adicionales seleccionados del grupo que consiste en:
(i) tamaño individual de las CAML;
(ii) tamaño medio de los núcleos de las CAML (las CAML tienen un gran núcleo atípico que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 pm de diámetro);
(iii) forma morfológica de las CAML (las formas de las CAML incluyen ahusada, de renacuajo, redonda, oblonga, con dos piernas, con más de dos piernas, con piernas delgadas o amorfa);
(iv) fenotipo positivo para CD14;
(v) grado de expresión de CD45;
(vi) grado de expresión de EpCAM;
(vii) grado de expresión de vimentina;
(viii) grado de expresión de PD-L1;
(ix) grado de expresión del marcador CD11C monocítico;
(x) grado de expresión del marcador CD146 endotelial;
(xi) grado de expresión del marcador CD202b endotelial;
(xii) grado de expresión del marcador CD31 endotelial;
(xiii) grado de expresión del marcador RAD50;
(xiv) grado de expresión del marcador PD-1;
(xv) grado de expresión del marcador CCR;
(xvi) grado de expresión del marcador PDX-1; (xvii) grado de expresión del marcador CD10; (xviii) grado de expresión del marcador AR; (xix) grado de expresión del marcador ER; (xx) presencia de leucocitos en las CAML; (xxi) ubicación de los marcadores (los marcadores de ubicación aparecen en las CAML, por ejemplo, citoplasma frente al núcleo, pueden cambiar en los diferentes puntos temporales); (xxii) presencia de uno o más marcadores asociados al cáncer en las CAML, en donde el marcador normalmente difunde o se asocia a vacuolas y/o material ingerido (por ejemplo, para el cáncer epitelial, los marcadores son las citoqueratinas 8, 18 y 19); y (xxiii) intensidad de la tinción del marcador, preferentemente en donde las características adicionales de las CAML son una o más de: (i) Intensidad de la tinción del marcador; (ii) ubicación de los marcadores; (iii) tamaño individual de las CAML; (iv) grado de expresión del marcador PD-L1; y (v) grado de expresión del marcador CD31.
En la primera y la segunda realización, las características seleccionadas de las CTC de la muestra son una o más características seleccionadas del grupo que consiste en:
(i) cantidad de CTC;
(ii) cantidad de leucocitos unidos a las CTC;
(iii) grado de expresión de la citoqueratina 8;
(iv) grado de expresión de la citoqueratina 18;
(v) grado de expresión de la citoqueratina 19;
(vi) grado de expresión de EpCAM;
(vii) grado de expresión de vimentina;
(viii) grado de expresión de PD-L1;
(ix) grado de expresión de la uroplaquina;
(x) morfología de la citoqueratina;
(xi) ubicación de los marcadores (los marcadores de ubicación aparecen en las CTC, por ejemplo, citoplasma frente al núcleo, pueden cambiar en los diferentes puntos temporales); y
(xii) intensidad de la tinción del marcador.
En la primera y la segunda realización, las CAML pueden recogerse de la muestra biológica usando uno o más medios seleccionados del grupo que consiste en metodología de exclusión por tamaños, lisis de eritrocitos, FICOLL, un chip de microfluidos y citometría de flujo, o una combinación de los mismos, preferentemente en donde el microfiltro tiene una geometría de poros de precisión y una distribución de poros uniforme. La cantidad de CAML, CTC y/o leucocitos unidos a las CTC se determinan simultáneamente mediante un microfiltro. Los microfiltros adecuados pueden tener una diversidad de formas y tamaños de poros. En un aspecto, los microfiltros tienen poros con un tamaño que varía de aproximadamente 5 micrómetros a aproximadamente 10 micrómetros, y pueden incluir poros redondos, en pista de carreras, ovalados, cuadrados y rectangulares. En un aspecto preferido, el microfiltro tiene una geometría de poros de precisión y una distribución de poros uniforme.
En ciertos aspectos, las CAML y las CTC se recogen de la muestra biológica utilizando uno o más medios seleccionados del grupo que consiste en metodología de exclusión por tamaños, lisis de eritrocitos, FICOLL, un chip de microfluidos y citometría de flujo, o una combinación de los mismos, preferentemente en donde la metodología de exclusión por tamaños comprende el uso de un microfiltro que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 7-8 micrómetros, preferentemente en donde el microfiltro tiene una geometría de poros de precisión y una distribución de poros uniforme.
En ciertos aspectos, la cantidad de CAML y CTC se determina mediante un chip de microfluidos basado en clasificación por tamaño físico, clasificación hidrodinámica basada en el tamaño, agrupación, atrapamiento, inmunocaptura, concentrando células grandes o eliminando células pequeñas tomando como base el tamaño.
En ciertos aspectos, la cantidad de CAML y CTC se determina mediante un ensayo de microfiltración a baja presión.
En los aspectos y realizaciones pertinentes de la invención, la muestra biológica es una o más seleccionada del grupo que consiste en sangre periférica, sangre, ganglios linfáticos, médula ósea, líquido cefalorraquídeo, tejido y orina. La muestra puede ser una muestra reciente o una muestra crioconservada que se descongela. En un aspecto preferido, la muestra biológica es sangre periférica. En otros aspectos, la sangre puede ser sangre de la vena antecubital, sangre de la vena cava inferior o sangre de la vena yugular.
En los aspectos y realizaciones pertinentes de la invención, el cáncer es uno o más de un tumor sólido, cáncer en estadio I, cáncer en estadio II, cáncer en estadio III, cáncer en estadio IV, carcinoma, sarcoma, neuroblastoma, melanoma, cáncer de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal y otros cánceres de tumores sólidos.
En los aspectos y realizaciones pertinentes de la invención, el antineoplásico puede ser uno o más de quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, vacunoterapia, terapia dirigida y/o una combinación de terapias.
En los aspectos y realizaciones pertinentes de la invención, Las CAML se detectan y/o recogen utilizando uno o más medios seleccionados del grupo que consiste en la metodología de exclusión por tamaños, inmunocaptura, lisis de eritrocitos, empobrecimiento en leucocitos, FICOLL, electroforesis, dielectroforesis, citometría de flujo y chips de microfluidos, o una combinación de los mismos. En un aspecto particular, la metodología de exclusión por tamaños comprende el uso de un microfiltro.
Los microfiltros adecuados pueden tener una diversidad de formas y tamaños de poros. Cuando se detectan y/o recogen únicamente CAML, los tamaños de poro pueden variar de aproximadamente 15 micrómetros a aproximadamente 20 micrómetros. Cuando se detectan y/o recogen tanto CAML como CTC, los tamaños de poro pueden variar de aproximadamente 5 micrómetros a aproximadamente 10 micrómetros. Los tamaños de poro más grandes eliminarán la mayor parte de la contaminación por leucocitos en el filtro. Los poros pueden tener forma redonda, de pista de carreras, ovalada, cuadrada y rectangular. En un aspecto preferido, el microfiltro tiene una geometría de poros de precisión y una distribución de poros uniforme. En un aspecto particular, Las CAML se detectan y/o recogen mediante un chip de microfluidos tomando como base clasificación por tamaño físico, clasificación hidrodinámica basada en el tamaño, agrupación, atrapamiento, inmunocaptura, concentrando células grandes o eliminando células pequeñas tomando como base el tamaño. En un aspecto particular, las CAML se detectan y/o recogen mediante un ensayo de microfiltración a baja presión.
Breve descripción de los dibujos
Se obtendrá fácilmente una apreciación más completa de la presente invención y muchas de las ventajas que conlleva a medida que la misma se entienda mejor con referencia a la siguiente descripción detallada considerada en relación con los dibujos adjuntos, en donde:
Las FIGS. 1A-1I muestran una galería de células circulantes similares a macrófagos asociadas al cáncer que se encuentran en la sangre de pacientes con cáncer. Las imágenes en color fusionadas están generadas con DAPI (azul), CK 8, 18 y 19 (verde), EpCAM (rojo) y CD45 (violeta).
Las FIGS. 2A-2F muestran una CAML con un fragmento de ADN engullido en la cola.
Las FIGS. 3A-3F muestran una CAML en el proceso de engullir un fragmento de ADN.
Las FIGS. 4A-4F muestran una CAML en el proceso de engullir un fragmento de citoplasma.
Las FIGS. 5A-5F muestran una CAML con cuatro leucocitos engullidos.
Las FIGS. 6A-6F muestran una CAML con dos leucocitos engullidos.
Las FIGS. 7A-7F muestran una CAML en división.
Las FIGS. 8A-8F muestran dos CAML después de la división.
Las FIGS. 9A-9F muestran dos CAML después de la división.
Las FIGS. 10A-10F muestran una CAML con dos brazos pequeños.
Las FIGS. 11 A-11F muestran una CAML con dos patas en el mismo lado.
Las FIGS. 12A-12F muestran una CAML con dos patas en el mismo lado.
Las FIGS. 13A-13F muestran una CAML con patas muy delgadas y un núcleo bastante regular.
Las FIGS. 14A-14F muestran una CAML aislada de un sujeto que padece una infección vírica.
Las FIGS. 15A-15F muestran un leucocito unido a una CTC de un paciente con cáncer de mama.
Las FIGS. 16A-16F muestran un leucocito unido a una CTC de un paciente con cáncer de mama.
Las FIGS. 17A-17F muestran un leucocito unido a una CTC de un paciente con cáncer de mama.
Las FIGS. 18A-18F muestran un leucocito unido a una CTC de un paciente con cáncer de mama.
Las FIGS. 19A-19F muestran un leucocito unido a una CTC de un paciente con cáncer de vejiga.
Las FIGS. 20A-20F muestran un leucocito unido a una CTC de un paciente con cáncer de vejiga.
Las FIGS. 21A-21F muestran un leucocito unido a una CTC de un paciente con cáncer de vejiga.
Las FIGS. 22A-22F muestran un leucocito unido a una CTC de un paciente con cáncer de riñón. Las FIGS. 23A-23F muestran un leucocito unido a una CTC de un paciente con cáncer de riñón. Las FIGS. 24A-24F muestran un leucocito unido a una CTC de un paciente con cáncer de riñón. Las FIGS. 25A-25F muestran un leucocito unido a una CTC de un paciente con cáncer de riñón. Las FIGS. 26A-26F muestran un leucocito unido a una CTC de un paciente con cáncer de riñón. Las FIGS. 27A-27F muestran un leucocito unido a una CTC de un paciente con cáncer de riñón. Las FIGS. 28A-28F muestran un leucocito unido a una CTC de un paciente con cáncer de riñón. La FIG. 29 muestra la frecuencia de CTC y CAML en 105 pacientes con cáncer de mama, próstata, páncreas y pulmón y 30 controles sanos.
La FIG. 30 muestra la frecuencia de CAML en diferentes estadios de cáncer de 105 pacientes con cáncer de mama, próstata, páncreas y pulmón.
La FIG. 31 muestra la cantidad de CAML tras el tratamiento.
La FIG. 32 muestra la cantidad de CAML en la evaluación clínica prequirúrgica.
Las FIGS. 33A-33B muestran la cantidad de CAML tomando como base la evaluación patológica, mostrando la Fig. 33A la cantidad para la confirmación patológica y mostrando la Fig. 33B la variación del tamaño celular para los cuatro estadios diferentes de cáncer.
La FIG. 34 muestra la repetición de la tinción de las CAML.
La FIG. 35 muestra efecto de la radioterapia sobre el marcador de cáncer RAD50 en una CAML.
La FIG. 36 muestra efecto de la radioterapia sobre el marcador de cáncer RAD50 y PD-L1 en las CTC. La FIG. 37 muestra disminución de la cantidad de CAML tras el tratamiento del cáncer a lo largo del tiempo. La FIG. 38 muestra disminución del tamaño de las CAML con el tiempo.
Las FIGS. 39A-39E muestran una CAML con una fuerte tinción para PD-L1 con vimentina (máx. S-N = 880); PDL1 (máx. S-N = 880); CD45 (máx. S-N = 850); Longitud 107 pm.
Las FIGS. 40A-40E muestran una CAML con tinción débil para PD-L1 con vimentina (máx. S-N = 500); PDL1 (máx. S-N = 280); CD45 (máx. S-N = 820); Longitudes 62 pm.
Las FIGS. 41A-41E muestran una CAML con tinción muy débil para PD-L1 con vimentina (máx. S-N = 75); PDL1 (máx. S-N = 100); CD45 débil (máx. S-N = 145) El punto brillante PDL1 es 1000; El CD45 no es liso; Longitud - 74 pm.
Las FIGS. 42A-42D muestran la tinción colorimétrica de las CAML.
Descripción detallada
El cáncer es una de las enfermedades más temidas en el mundo, que afecta a todas las poblaciones y etnias en todos los países. Solamente en Estados Unidos, hay más de 12 millones de pacientes con cáncer, con 1,7 millones de casos nuevos de cáncer y más de 0,6 millones de muertes al año. Se estima que la muerte por cáncer en todo el mundo es de aproximadamente 8 millones al año, de los cuales 3 millones se producen en países desarrollados donde los pacientes tienen acceso a un tratamiento.
Lo ideal sería que existiera un biomarcador que pudiera (i) proporcionar una detección temprana de todos los tumores sólidos, especialmente para los grupos de riesgo, tales como los fumadores para el cáncer de pulmón, (ii) confirmar otros indicios de cáncer, tal como un PSA elevado para el cáncer de próstata, y/o (iii) proporcionar una detección temprana de la recaída del cáncer.
Los oncólogos necesitan saber cuál es la mejor manera de tratar a los pacientes con cáncer recién diagnosticado. La prueba convencional actual es una biopsia tisular, que se utiliza para determinar el subtipo de cáncer, porque los fármacos antineoplásicos suelen ser eficaces únicamente para subtipos específicos. El método de biopsia varía según la ubicación, pero es invasivo y puede ser arriesgado.
Para supervisar el tratamiento, los oncólogos necesitan saber lo bien que está funcionando el fármaco en el paciente, si debe ajustarse la dosis, y si la enfermedad se está extendiendo o responde al fármaco. Los métodos habituales para responder a estas preguntas son la tomografía computarizada (TAC) y la resonancia magnética (RMN), ambos son caros. Adicionalmente, estos métodos no pueden proporcionar la información necesaria hasta que el tamaño del tumor haya cambiado de forma perceptible.
El noventa por ciento de los pacientes de cáncer muere por metástasis, no por el tumor primario. En el proceso metastásico intervienen células tumorales que se desprenden de los carcinomas primarios (tumores sólidos de células epiteliales) y penetran en el torrente circulatorio. Estas células cancerosas disociadas se conocen como células tumorales circulantes (CTC). Las CTC tienen el potencial de ser útiles como herramienta para determinar la terapia, supervisar el tratamiento, determinar la recaída y proporcionar información pronóstica de supervivencia. Sin embargo, las CTC no pueden recogerse sistemáticamente de la sangre ni siquiera en los cánceres en estadio III y IV.
En esta divulgación, se presenta un tipo de célula que se encuentra de manera más coherente en la sangre de pacientes con tumores sólidos en los estadios I-IV. Estas células circulantes son células similares a macrófagos que contienen los mismos marcadores tumorales que el tumor primario y se denominan células circulantes similares a macrófagos asociadas al cáncer (CAML) en el presente documento.
Se pueden encontrar CTC y CAML en la misma muestra del paciente al mismo tiempo mediante métodos de exclusión por tamaños, tales como mediante métodos de microfiltración. Se pueden formar microfiltros con poros lo suficientemente grandes como para dejar pasar todos los eritrocitos y la mayoría de los leucocitos y retener células más grandes tales como las CTC y las CAML. Los métodos de exclusión por tamaños también se han aplicado mediante chips de microfluidos.
Las CAML tienen muchas utilidades clínicas cuando se usan solas. Por otra parte, las CAML pueden combinarse con otros marcadores tales como las CTC, ADN acelular y proteínas libres en sangre para mejorar adicionalmente la sensibilidad y la especificidad de un diagnóstico. Esto es especialmente cierto para las CAML y las CTC porque pueden aislarse e identificarse al mismo tiempo.
Células tumorales circulantes
Las CTC de muchos tumores sólidos expresan una serie de citoqueratinas (CK). Las CK 8, 18, y 19 son las utilizadas más habitualmente en diagnóstico, pero el estudio no tiene por qué limitarse a estos marcadores. La superficie de las CTC de tumores sólidos por lo general expresa una molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM, por sus siglas en inglés). Sin embargo, esta expresión no es uniforme ni regular. Las CTC no deben expresar ningún CD45, porque es un marcador de leucocitos. En ensayos para identificar células asociadas a tumores, tales como las CTC y las CAML, es suficiente utilizar anticuerpos contra marcadores asociados al tumor sólido tales como las CK 8, 18, y 19, o anticuerpos contra CD45 o DAPI. Combinando la presencia de tinción con la morfología, pueden identificarse las CTC definibles patológicamente (PDCTC), las CTC apoptóticas y las CAML (Adams, D. L., etal.,Cytometric characterization of Circulating Tumor Cells captured by microfiltration and their correlation to the CellSearch® CTC test. Cytometry Parte A 2015; 87A: 137-144).
Las PDCTC de tumores sólidos expresan las CK 8, 18, y 19, y pueden identificarse por las siguientes características:
• Núcleos "similares al cáncer" teñidos por DAPI. Los núcleos por lo general son grandes con patrones de puntos. La excepción es cuando la célula está en división. El núcleo también puede estar condensado.
• Expresión de una o más de la CK 8, 18 y 19; las CTC de cánceres epiteliales por lo general expresan al menos las CK 8, 18 y 19. Las citoqueratinas tienen un patrón filamentoso.
• Ausencia de expresión de CD45.
Una CTC apoptótica de un cáncer que expresa las CK 8, 18 y 19 se identifica por las siguientes características:
• Núcleos en degradación.
• Expresión de una o más de la CK 8, 18 y 19; las citoqueratinas no tienen un patrón filamentoso, sino que aparecen fragmentadas en forma de puntos.
• Ausencia de expresión de CD45.
Una CTC apoptótica para tumores sólidos que expresan citoqueratinas incluye, por tanto, aquellas CTC que tienen una, dos o tres de las siguientes características: (a) núcleos en degradación; (b) expresión de una o más de las citoqueratinas 8, 18 y 19, y en donde la citoqueratina está fragmentada en forma de puntos; y (c) fenotipo CD45 negativo.
La detección de muchos carcinomas, sarcomas y melanomas puede ser a través de la identificación de una variedad de otros marcadores. Por ejemplo, las CTC del cáncer de células renales (CCR) y de los sarcomas expresan vimentina.
La CTC del cáncer de vejiga habitualmente expresa uroplaquina y la CK 8, 18 y 19 es débil. Es posible teñir las células para muchos marcadores de interés diferentes.
Las CTC para usar en los métodos de la presente invención pueden caracterizarse tomando como base una o varias de las siguientes características seleccionadas: (i) cantidad de CTC; (ii) cantidad de leucocitos unidos a las CTC; (iii) grado de expresión de la citoqueratina 8; (iv) grado de expresión de la citoqueratina 18; (v) grado de expresión de la citoqueratina 19; (vi) grado de expresión de EpCAM; (vii) grado de expresión de vimentina; (viii) grado de expresión de PD-L1; (ix) grado de expresión de la uroplaquina; (x) morfología de la citoqueratina; (xi) ubicación de los marcadores (los marcadores de ubicación aparecen en las CTC, por ejemplo, citoplasma frente al núcleo, pueden cambiar en los diferentes puntos temporales); y (xii) intensidad de la tinción del marcador. La cantidad de características de las CTC utilizadas en los métodos de la invención puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o las 12.
Células circulantes similares a macrófagos asociadas al cáncer (CAML)
Las CAML se caracterizan por tener una o más de las siguientes características:
• Las CAML tienen un gran núcleo atípico; en las CAML pueden encontrarse múltiples núcleos individuales, aunque los nucléolos fusionados agrandados son comunes. Los núcleos de las CAML generalmente varían en tamaño de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 70 pm de diámetro, más habitualmente de aproximadamente 14 pm a aproximadamente 64 pm de diámetro.
• Para muchos cánceres, las CAML expresan el marcador de cáncer de la enfermedad. Por ejemplo, las CAML asociadas a cánceres epiteliales pueden expresar las CK 8, 18 o 19, vimentina, etc. Los marcadores normalmente difunden o se asocian a vacuolas y/o material ingerido. El patrón de tinción de cualquier marcador difunde casi uniformemente por toda la célula. Para los sarcomas, neuroblastomas y melanomas, pueden usarse otros marcadores asociados a los cánceres en lugar de las CK 8, 18, 19.
• Las CAML pueden ser positivas para CD45.
• Las CAML son grandes, aproximadamente de 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros de tamaño por diámetro.
• Las CAML se encuentran en muchas formas morfológicas distintas, incluyendo ahusada, de renacuajo, redonda, oblonga, con dos piernas, con más de dos piernas, con piernas delgadas o formas amorfas.
• Las CAML normalmente tienen citoqueratinas difusas.
• Si las CAML expresan la EpCAM, la EpCAM normalmente difunde por toda la célula o está asociada a vacuolas y/o material ingerido, y es casi uniforme en toda la célula, pero no todas las CAML expresan la EpCAM, porque algunos tumores expresan muy poca o ninguna EpCAM.
• Si las CAML expresan un marcador, el marcador generalmente difunde por toda la célula o está asociado a vacuolas y/o material ingerido, y es casi uniforme en toda la célula, pero no todas las CAML expresan los mismos marcadores con la misma intensidad.
• Las CAML expresan marcadores asociados a los marcadores del origen del tumor; por ejemplo, si el tumor tiene su origen en un cáncer de próstata y expresa el PSMA, entonces las CAML de este paciente también expresan el PSMA. Otro ejemplo, si el tumor primario es de origen pancreático y expresa el PDX-1, entonces las CAML de este paciente también expresan el PDX-1. Si el tumor primario o las CTC del origen del cáncer expresan el CXCR-4, entonces las CAMl del paciente también expresan el CXCR-4.
• Si el tumor primario o las CTC del origen del cáncer expresan un biomarcador de un objetivo farmacológico, las CAML expresan marcadores asociados a los marcadores del objetivo farmacológico. Un ejemplo de un biomarcador de inmunoterapia es la PD-L1.
• Las CAML expresan marcadores monocíticos (por ejemplo, CD11c, CD14) y marcadores endoteliales (por ejemplo, CD146, CD202b, CD31). • Las CAML tienen la capacidad de unirse a fragmentos Fc.
Las CAML para usar en los métodos de la presente invención se caracterizan tomando como base las siguientes características seleccionadas: (i) cantidad de CAML; y (ii) tamaño medio de las CAML (el tamaño de las células CAML varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros de diámetro). Algunas características adicionales incluyen una o más de (i) tamaño individual de las CAML; (ii) tamaño medio de los núcleos de las CAML (las CAML tienen un gran núcleo atípico que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 pm de diámetro); (iii) forma morfológica de las CAML (las formas de las CAML incluyen ahusada, de renacuajo, redonda, oblonga, con dos piernas, con más de dos piernas, con piernas delgadas o amorfa); (iv) fenotipo positivo para CD14; (v) grado de expresión de CD45; (vi) grado de expresión de EpCAM; (vii) grado de expresión de vimentina; (viii) grado de expresión de PD-L1; (ix) grado de expresión del marcador CD11C; (x) grado de expresión del marcador CD146; (xi) grado de expresión del marcador CD202b; (xii) grado de expresión del marcador<c>D31; (xiii) grado de expresión del marcador RAD50; (xiv) grado de expresión del marcador PD-1; (xv) grado de expresión del marcador CCR; (xvi) grado de expresión del marcador PDX-1; (xvii) grado de expresión del marcador CD10; (xviii) grado de expresión del marcador AR; (xix) grado de expresión del marcador ER; (xx) presencia de leucocitos en las CAML; (xxi) ubicación de los marcadores (los marcadores de ubicación aparecen en las CAML, por ejemplo, citoplasma frente al núcleo, pueden cambiar en los diferentes puntos temporales); (xxii) presencia de uno o más marcadores asociados al cáncer en las CAML, en donde el marcador normalmente difunde o se asocia a vacuolas y/o material ingerido (por ejemplo, para el cáncer epitelial, los marcadores son las citoqueratinas 8, 18 y 19); y (xxiii) intensidad de la tinción del marcador. La cantidad de características de las CAML adicionales utilizadas en los métodos de la invención puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o las 23.
En ciertas situaciones, puede ser más adecuado teñir las CAML mediante H&E u otras tinciones colorimétricas.
La FIG. 1 contiene uncollagede CAML que muestra muchas de las diferentes morfologías de las CAML y la variación de señal de muestras individuales de pacientes de próstata, mama y páncreas (Adams, D., et al., Circulating giant macrophages as a potential biomarker of solid tumors.PNAS2014, 111 (9): 3514-3519): (FIG. 1A) de páncreas, (FIG.
<1B) de mama, (FIG. 1C) de mama, (FIG. 1D) de mama, (FIG. 1E) de próstata, (FIG. 1F) de páncreas, (FIG.>1<G) de>páncreas, (FIG. 1H) de próstata y (FIG. 1I) de próstata. Algunos ejemplos de variantes morfológicas son los siguientes:<amorfo (FIG. 1A), oblongo (FIGS. 1B y 1G), fusiforme (FIGS.>1<C, 1F, 1I, 3, 5, 6), redondo (FIG. 1D) y de renacuajo>(FIGS. 1E y 1H). Las diferencias de color se deben a los distintos grados de expresión de proteínas a partir de la reacción de los anticuerpos con EpCAM, citoqueratina y CD45.
Las FIGS. 2-13 muestran las CAML teñidas con DAPI, CD10, vimentina y CD45, donde en la (FIG. 2A) los recuadros muestran la imagen microscópica fusionada DAPI (azul), CD10 (verde), vimentina (rojo) y CD45 (violeta), en la (FIG.
2B) los recuadros muestran la imagen microscópica fusionada DAPI (blanco), CD10 (verde), vimentina (rojo) y CD45 (violeta), en la (FIG. 2C) los recuadros muestran DAPI (blanco), en la (FIG. 2D) los recuadros muestran CD10 (blanco), en la (FIG. 2E) los recuadros muestran vimentina (blanco) y en la (FIG. 2F) los recuadros muestran CD45 (blanco). El recuadro (FIG. 2B) con el núcleo en blanco proporciona una mejor calidad de imagen para algunas células. Esas células poseen las propiedades de las CAML descritas en los párrafos anteriores. La elección de la tinción se debe a que la fuente de las células son pacientes con cáncer de riñón.
Las FIGS. 2A-2F muestran material de ADN engullido en el extremo de la pata superior. Las FIGS. 3A-3F muestran una CAML en el proceso de engullir una célula, donde el material de ADN ya se encuentra en la CAML y parte del citoplasma celular degradado aún está parcialmente fuera de la CAML. Las FIGS. 4A-4F muestran una CAML en el proceso de engullir material celular degradado. Esto es lo más visible en el canal de la vimentina. Las FIGS. 5A-5F muestran una CAML con cuatro leucocitos positivos para CD45 engullidos. Las FIGS. 6A-6F muestran una CAML con dos leucocitos positivos para CD45 engullidos. Las FIGS. 7A-7F parecen mostrar una CAML en proceso de división. Las FIGS. 8A-8F muestran dos CAML similares una al lado de la otra, lo que sugiere que las dos células podrían proceder del mismo origen. Las FIGS. 9A-9F muestran otro ejemplo de dos CAML similares una al lado de la otra.
Las FIGS. 10-12 muestran morfologías adicionales de las CAML no identificadas en la FIG. 1. Las FIGS. 10A-10F muestran una CAML con dos pequeñas patas en el lado izquierdo de la célula. Las FIGS. 11A-11F muestran una CAML con dos patas en el mismo lado. Las FIGS. 12A-12F muestran una CAML con una pata en el lado derecho y dos patas en el lado izquierdo del núcleo. Las FIGS. 13A-13F muestran una CAML con patas muy delgadas y un único núcleo grande. Las FIG<s>. 14A-14F muestran una CAML hallada en un paciente con infección vírica por VHS-2.
Respuesta inmunitaria del organismo a las CTC - Linfocitos T unidos a las CTC
Cuando una célula tumoral entra en el torrente circulatorio, la CTC debe ser atacada por los linfocitos T, dando como resultado la muerte de la célula tumoral. Cuando esto sucede, uno o más linfocitos T se unirán a la CTC, dando como resultado la muerte de la CTC y su degradación final. Los linfocitos T son un subtipo de leucocito. El marcador CD45 tiñe los leucocitos y no es específico de los linfocitos T. Los linfocitos T pueden diferenciarse de los granulocitos por la morfología del núcleo. Los linfocitos T tienen un único núcleo aproximadamente redondo y menor de 8 micrómetros. La filtración de la sangre puede capturar leucocitos unidos a las CTC. La presencia de leucocitos unidos a las CTC en la sangre es un indicio de la presencia de un tumor sólido y también de la capacidad del organismo para eliminar los tumores sólidos. De este modo, la determinación de la cantidad de linfocitos T unidos a las CTC puede utilizarse en el diagnóstico.
Los marcadores de la célula tumoral y del linfocito T pueden intercambiarse entre las dos células cuando entran en contacto. Las FIGS. 15-18 muestran leucocitos unidos a CTC que se encuentran en la sangre de pacientes con cáncer de mama. Los marcadores utilizados para los pacientes con cáncer de mama son DAPI, CK 8, 18 y 19, EpCAM y CD45. Las FIGS. 15-16 muestran que las CTC son apoptóticas con las CK 8, 18 y 19 degradadas a puntos. La FIG.
18 muestra una CTC muy degradada que pierde los marcadores CK y EpCAM y carece de citoplasma. A menudo se observa que los núcleos de los leucocitos y de las CTC son atraídos el uno hacia el otro, como se muestra en la FIG.
16.
Las FIGS. 19-21 muestran la unión de los leucocitos a las CTC que se encuentran en la sangre de pacientes con cáncer de vejiga. Los marcadores utilizados para los pacientes con cáncer de vejiga son DAPI, CK 8, 18 y 19, EpCAM y CD45. En la FIG. 19E, La EpCAM se degrada hasta convertirse en puntos. El citoplasma del leucocito (marcado en la FIG. 19A) y de la CTC están en proceso de fusión, con la EpCAM alrededor del leucocito. Los leucocitos aún expresan CD45. Las FIGS. 20A-20F muestran una CTC aún relativamente intacta unida a un leucocito. Las FIGS.
21A-21F muestran un núcleo de CTC desnudo sin citoplasma y el leucocito (marcado en la FIG. 21A) que aún expresa CD45, pero mucho más débil que los leucocitos no unidos a la CTC (sin marcar en la FIG. 21A).
Las FIGS. 22-28 muestran leucocitos unidos a una CTC que se encuentran en la sangre de pacientes con cáncer de riñón. Los marcadores utilizados para estas muestras de pacientes son DAPI, CD10, vimentina y CD45. Las FIGS.
22A-22F muestran una CTC de cáncer de riñón mesenquimatoso con una alta expresión de vimentina. Está fuertemente unido al leucocito. Las FIGS. 23-28 muestran leucocitos unidos a una CTC que se encuentran en sangre de pacientes con cáncer renal no mesenquimatoso que expresan un nivel de vimentina inferior al mostrado en la FIG.
22. Los núcleos y el citoplasma de los leucocitos y las<c>T<c>se atraen entre sí. Los marcadores CD10, vimentina y CD45 se vuelven muy débiles después de que los glóbulos blancos se unan a las CTC. La cantidad de citoplasma disminuye y finalmente puede perderse todo.
Frecuencia de CTC y de CAML en la sangre de pacientes con cáncer
Las PDCTC rara vez se encuentran en los primeros estadios del cáncer. Aunque las PDCTC se encuentran con mayor frecuencia en pacientes con cáncer de mama y de próstata en estadio III y IV, se observan con frecuencias bajas en la mayoría de los demás tumores sólidos. Como un ejemplo, se analizaron 105 pacientes con cáncer (mama (n=34), próstata (n=25), páncreas (n=39) y pulmón (n=7)) y 30 controles sanos. La FIG. 29 muestra que no se encontraron PDCTC ni CAML en la sangre de los controles sanos. En cambio, se encontraron CAML en 98 de los 105 pacientes con cáncer. El porcentaje de pacientes con PDCTC y CAML es del 53 % y del 93 %, respectivamente. El estadio del cáncer de los 105 pacientes con cáncer era como sigue: estadio I (n=46), estadio II (n=18), estadio III (n=11) y estadio IV (n=30). La FIG. 30 muestra que el porcentaje de pacientes con CAML en los estadios I, II, III y IV son 87 %, 100 %, 91 % y 97 %, respectivamente. Se encontró que las CAML eran más comunes que las PDCTC. Se analizaron muestras de pacientes de 12 tumores sólidos diferentes: de mama, de próstata, pancreático, de pulmón, colorrectal, de útero, neuroblastoma, esofágico, de riñón, de vejiga, sarcoma y de ovario. Se encontraron CAML en todos esos tipos de cáncer (datos no mostrados).
La cantidad de CAML varía en función de la terapia
De los 105 pacientes indicados anteriormente, 44 pacientes no recibieron terapia, 12 recibieron la terapia objetivo y 49 recibieron quimioterapia. Se realizó un cribado de seguimiento para detectar las CAML en los pacientes tras la finalización de la terapia. La cantidad de CAML parece depender del tipo de terapia, como se muestra en la FIG. 31. La cantidad de CAML en pacientes que reciben quimioterapia es mucho mayor que la cantidad de CAML en pacientes que no reciben terapia o que reciben terapia dirigida.
Relación entre la cantidad de CAML y la estadificación y progresión de la enfermedad
La cantidad de CAML en pacientes sometidos a quimioterapia sólo se asocia débilmente con el estadio del cáncer en el momento de la evaluación clínica previa al tratamiento, FIG. 32, y es muy correlativa con el estadio tras la confirmación patológica, FIG. 33A. Para pacientes sometidos a quimioterapia, la cantidad de CAML se correlacionó exponencialmente con la confirmación patológica final: estadio II (3,2), estadio II (7,1), estadio III (14,6), estadio IV (35,1); R2 = 0,99.
La FIG. 33B desglosa la cantidad de CAML en función del tamaño para diferentes estadios. Las CAML en estadios posteriores tienen más CAML de mayor tamaño.
Cribado de cáncer de mama
Debido a que las CAML se pueden encontrar en altos porcentajes en todos los estadios de tumores sólidos, se evaluaron las CAML como un marcador de cribado del cáncer de mama. Se realizó un estudio anticipado con doble enmascaramiento de 41 sujetos en los que la mamografía se consideró anormal. Se realizó un ensayo con doble enmascaramiento: (i) se tomaron 7,5 ml de muestras de sangre periférica para analizar las CAML y (ii) se realizó un diagnóstico tisular mediante una biopsia con aguja gruesa. Aunque la mamografía no pudo distinguir las subpoblaciones en este grupo, la presencia de las CAML sí diferenció entre enfermedad mamaria benigna y maligna con una sensibilidad del 90 % y una especificidad del 72 % (datos no mostrados).
Tinción de los anticuerpos y repetición de la tinción de células aisladas
Los microscopios fluorescentes típicos suelen utilizar cuatro o cinco canales fluorescentes para minimizar la fuga de emisiones fluorescentes hacia canales fluorescentes no previstos. Un canal está ocupado por DAPI para obtener imágenes del núcleo. A menudo es necesario evaluar más de tres marcadores. Debido a estos inconvenientes, se desarrolló un método que permite el análisis de hasta aproximadamente 12 marcadores diferentes en la misma célula y que puede utilizarse junto con cada uno de los métodos divulgados en la presente divulgación. Tras el proceso de filtración y tinción de las células del filtro con un primer conjunto de marcadores, se identifican las células de interés y se obtienen imágenes. Para evaluar más marcadores en las mismas células, se desarrolló un paso de inactivación/desorción seguido de una técnica de repetición de la tinción. Esto requería que la célula permaneciera en el mismo lugar para permitir la repetición de la obtención de imágenes de la misma célula. Esto se puede repetir varias veces. La fila superior de la FIG. 34 muestra una CAML A con tinciones convencionales de CTC: DAPI, CK 8, 18, 19, EpCAM y CD45. La segunda fila muestra la repetición de la tinción de las mismas células tras la inactivación y la repetición de la tinción para los marcadores de interés: PD-L1, CCR y PD-1. La tercera fila de la FIG. 34 muestra una CAML B con tinciones convencionales de CTC. La cuarta fila muestra la repetición de la tinción de la misma CAML B tras la inactivación para los marcadores de interés: PD-L1, CCR y PD-1. Este método de repetición de la tinción es particularmente adecuado para las células fijadas en el microfiltro. Su ubicación es fija, por lo que se puede repetir la obtención de imágenes para evaluar diferentes marcadores. Las CTC y otras células del filtro también pueden teñirse de nuevo con esta técnica. Este método de repetición de la tinción es muy útil para analizar el tipo de cáncer, prueba diagnóstica para selección terapéutica, respuesta a la terapia, cribado del cáncer y varias aplicaciones de investigación.
Ensayos moleculares unicelulares con CAML y CTC
El análisis molecular de las CAML y las CTC puede utilizarse potencialmente para determinar la subtipificación del cáncer en función de mutaciones génicas, translocaciones y amplificaciones, mediante diversos ensayos de PCR, micromatrices, ensayos FISH y secuenciación. El análisis molecular unicelular se está generalizando, y los análisis unicelulares de las CAML son particularmente interesantes. Algunos ensayos requieren más de un núcleo y/o célula para reducir los errores. La presente invención incluye, por tanto, métodos de análisis molecular de una única célula CAML donde se obtiene una única célula CAML y se lleva a cabo el análisis molecular de la única célula. No hay ninguna limitación sobre el tipo particular de análisis molecular que puede realizarse en la célula única y dichos medios incluyen, pero sin limitación, secuenciación de ácidos nucleicos, técnica Northern y técnica de Southern.
Se describe un método para recoger CTC y CAML utilizando el dispositivo de microfiltración. Para esta aplicación, se desea que las células puedan extraerse fácilmente del filtro, lo contrario de la necesidad de que las células permanezcan en el filtro para repetir la tinción. La etapa importante para permitir la extracción de las células es recubrir el filtro para evitar que las células se peguen, por ejemplo, un recubrimiento con suero bovino fetal (FBS) o seroalbúmina bovina (BSA). También son aplicables otros revestimientos para evitar la adhesión celular. La muestra fluye a través del filtro para recoger las células más grandes que los poros. Hay dos métodos para recoger las células de interés. Método 1: retirar el filtro del portafiltros y colocarlo en un plato o portaobjetos de cristal con las células encima, y cubrirlo con un líquido apropiado, tal como PBS; las células pueden recogerse directamente del filtro utilizando micromanipuladores. Método 2: colocar una jeringa llena de PBS en la parte inferior del soporte con las células en el filtro y lavar a contracorriente para retirar las células del filtro. Las células pueden concentrarse mediante centrifugación y eliminación del sobrenadante. Es necesario teñir las células para poder visualizarlas al microscopio. Una opción no limitante de tinciones son los colorantes intercalantes fluorescentes. Otro ejemplo es la tinción de marcadores de la superficie celular, tales como EpCAM, CD45 y/u otros marcadores. Existen varias formas de recoger las células de interés del plato, tales como micromanipuladores o instrumentos tales como CellColector, y otros.
Prueba diagnóstica para selección terapéutica
Las CAML pueden utilizarse como fuente de tejido en pruebas diagnósticas para selección terapéutica con el fin de determinar el fármaco específico que debe prescribirse al paciente. En la actualidad, las pruebas diagnósticas para selección terapéutica utilizan biopsias tisulares para teñir marcadores de objetivos farmacológicos, realizar ensayos FISH y llevar a cabo otros ensayos moleculares para buscar mutaciones génicas, amplificación o translocaciones por PCR, micromatrices, secuenciación, etc. Algunos ejemplos de pruebas diagnósticas para selección terapéutica convencionales que utilizan biopsias tisulares son FISH para la amplificación de HER2, FISH para la translocación de ALK, PD-L1 en tejido, AR y ER en tejido, etc. A veces no hay suficiente tejido, o no hay tejido en absoluto, para evaluar una amplia variedad de fármacos. Las CTC y las CAML pueden recogerse repetidamente y utilizarse en lugar de las biopsias tisulares. También se puede volver a teñir repetidamente la misma muestra para evaluar la eficacia de múltiples fármacos.
Supervisar la respuesta al tratamiento
La biopsia celular líquida proporciona un método mínimamente invasivo para supervisar la respuesta al tratamiento en un paciente. Se pueden adoptar los siguientes enfoques para supervisar la eficacia de un tratamiento antineoplásico, que comprenden:
(a) supervisar el cambio en la cantidad de CAML y CTC del mismo sujeto en diferentes puntos temporales tras los tratamientos;
(b) supervisar los cambios de tamaño de las CAML y las CTC en los diferentes puntos temporales;
(c) supervisar los cambios de intensidad de los marcadores en las CAML y las CTC en los diferentes puntos temporales; y
(d) supervisar el cambio de ubicación de los marcadores, citoplasma frente al núcleo, en las CAML y las CTC en los diferentes puntos temporales.
Como ejemplo relacionado con la quimioterapia, la FIG. 31 muestra que los respondedores a la quimioterapia parecen mostrar un aumento de las CAML poco después del tratamiento con quimioterapia. En cambio, la cantidad de CAML de la terapia objetivo no mostró un aumento por encima del control sin tratamiento.
En un segundo ejemplo de radioterapia, la fila superior de la FIG. 35 muestra una CAML de un paciente con cáncer de pulmón antes de la radioterapia teñida para DAPI, PD-L1, RAD50 y PD-1. Las dos filas inferiores muestran dos CAML diferentes después de la radioterapia también teñidas para DAPI, PD-L1, RAD50 y PD-1. RAD50 migrando al sitio de daño del ADN en el núcleo.
Este cambio en RAD50 también se observa en las CTC. Un tercer ejemplo combina la repetición de la tinción para analizar la eficacia de la radioterapia. La fila superior de la FIG. 36 muestra un grupo de CTC de un paciente con cáncer de pulmón tras el tratamiento con radiación utilizando las tinciones convencionales de las CTC: DAPI, CK 8, 18, 19, EpCAM y CD45. La fila inferior muestra el mismo conglomerado de CTC tras su inactivación y repetición de la tinción para marcadores relacionados con la radioterapia y la respuesta inmunitaria: PD-L1, RAD50 y PD-1.
Un cuarto ejemplo está relacionado con la inmunoterapia. Las inmunoterapias que permiten al organismo eliminar un tumor han mostrado unos resultados impresionantes en muchos tipos de cánceres. Un ejemplo de fármaco de inmunoterapia es un anticuerpo contra la PD-L1 de la superficie de las células tumorales; y otro ejemplo de un fármaco de inmunoterapia es un anticuerpo contra la PD-1 de la superficie de los linfocitos T citotóxicos. Ambos tipos de fármacos de inmunoterapia permiten a los linfocitos T citotóxicos eliminar las células tumorales de algunos de los pacientes. La FIG. 37 muestra un ejemplo de la cantidad de CAML recogida en cuatro intervalos de tiempo repartidos aproximadamente entre dos y tres semanas. El tratamiento de la PD-1 fue en las fechas T1 y T3, después de proporcionar la muestra de sangre para la biopsia celular líquida. La disminución de la cantidad de CAML tras el tratamiento puede ser un indicio de que el paciente no está respondiendo al tratamiento. La FIG. 38 muestra los intervalos correspondientes de los tamaños de las CAML a medida que las CAML también van disminuyendo de tamaño. Esta información sugiere que podría haber una disminución de restos tumorales en la sangre como resultado del tratamiento, lo que sugiere que el paciente puede no estar respondiendo al tratamiento. La FIG. 39 es una CAML antes de T1 que muestra una PD-L1 muy brillante. La señal de la PD-L1 por encima del ruido de fondo es aproximadamente un factor de 8 del ruido de fondo. La FIG. 40 es una CAMl en T1 recogida justo antes del tratamiento. La señal de la PD-L1 es ahora débil. La señal de la PD-L1 por encima del ruido de fondo es inferior a un factor de 2 del ruido de fondo, lo que indica una potencial mala respuesta. La FIG. 41 es una CAML en T3. La señal de la PD-L1 es ahora muy débil. La señal de la PD-L1 por encima del ruido de fondo es inferior a un factor de 1 del ruido de fondo; esto es un indicio de pérdida del objetivo farmacológico, tal como la PD-L1.
Un quinto ejemplo está relacionado con la supervisión del éxito de la cirugía. La Figura S5 del artículo de Adams etal.(Circulating giant macrophages as a potential biomarker of solid tumors.PNAS2014, 111 (9): 3514-3519) mostraba que la cirugía reducía el número de CAML. La presencia continuada de CAML en la sangre del paciente podría indicar que el cáncer podría no estar completamente erradicado.
Captura de CAML y CTC
Las células más grandes y/o menos flexibles que otras células presentes en un líquido corporal pueden recogerse filtrando el líquido corporal. Por ejemplo, las células objetivo indicativas de una afección, por ejemplo, las CAML y las CTC, pueden recogerse haciendo pasar un líquido corporal a través de un filtro con aberturas que sean demasiado pequeñas para que las atraviesen las células objetivo, pero lo suficientemente grandes como para que otras células puedan atravesarlas. Una vez recogidas, puede realizarse cualquier cantidad de análisis de las células objetivo. Dichos análisis pueden incluir, por ejemplo, identificar, contar, caracterizar las expresiones de marcadores, obtener análisis moleculares y/o cultivar las células recogidas.
Las CAML, las CTC definibles patológicamente y las CTC apoptóticas son más grandes que los eritrocitos y la mayoría de los leucocitos. Se ha demostrado que el uso de un microfiltro de precisión que tenga un tamaño de poro y una distribución de poros precisos proporciona una alta eficacia de captura y una baja desviación estándar para estas células. Los microfiltros CellSieve™ (Creaty MicroTech) son un ejemplo de microfiltros de precisión. Los microfiltros CellSieve™ son transparentes y no fluorescentes, lo que los hace ideales para el análisis de imágenes al microscopio. Los tamaños de poro de 7-8 micrómetros eliminaron todos los eritrocitos y el 99,99 % de los leucocitos. En los documentos WO 2011/139445 y PCT/US12/66390 se describen métodos para fabricar microfiltros que producen un tamaño y una distribución de poros uniformes. Los microfiltros fabricados por un método de grabado de pistas tienen poros situados aleatoriamente que pueden solaparse, dando lugar a poros efectivamente grandes. Podrían perder algunas CAML y CTC.
Además de la microfiltración, existen otros muchos métodos para la captura de CTC, y algunos también pueden adoptarse para capturar CAML. Generalmente se dividen en las siguientes categorías:
• Dado que las CAML son grandes en comparación con la mayoría de las células sanguíneas, muchos métodos basados en el tamaño son adecuados para capturar las CAMl . Los microfiltros con poros de 7-8 micrómetros son ideales para la captura simultánea de CAML y CTC. Si interesan únicamente las CAML, no las CTC, entonces el tamaño de los poros puede ser mayor, de hasta aproximadamente 15-20 micrómetros. Los tamaños de poro más grandes eliminarán la mayor parte de la contaminación por leucocitos en el filtro.
• La inmunocaptura utiliza ferrofluidos, perlas magnéticas, chips de microfluidos, etc., recubiertos con anticuerpos para la selección de las CAML o la eliminación de otras células.
• La lisis de eritrocitos también puede utilizarse para recoger las CAML. El volumen de muestra resultante requiere la colocación en múltiples portaobjetos de vidrio.
• Empobrecimiento en leucocitos.
• FICOLL.
• Electroforesis.
• Dielectroforesis.
• Citometría de flujo.
• Tecnologías de chip de microfluidos que clasifican, seleccionan, agrupan, atrapan, concentran células grandes o eliminan células pequeñas según el tamaño, la utilización de una variedad de principios biológicos y físicos también es adecuada.
La filtración es el mejor método para identificar la unión de los leucocitos a una CTC. Dado que tanto los leucocitos como las CTC pierden sus marcadores y pierden citoplasma, la inmunocaptura y la citometría de flujo son métodos menos adecuados para aislarlos.
En los aspectos y realizaciones pertinentes de la invención, las CTC y los leucocitos unidos a las CTC pueden detectarse junto con la detección de las CAML. Dicha detección puede ser una detección simultánea o secuencial, y puede utilizar los mismos medios o medios diferentes. Por ejemplo, puede utilizarse la detección simultánea mediante un microfiltro que tenga un tamaño de poro que seleccione ambos tipos de células. Los microfiltros adecuados pueden tener una diversidad de formas y tamaños de poros. Son aceptables los microfiltros con poros de aproximadamente 7-8 micrómetros de tamaño, e incluyen formas de poro redondas, rectangulares y de pista de carreras. Los microfiltros que tienen poros redondos de aproximadamente 7-8 micrómetros de tamaño son especialmente óptimos cuando se utilizan microfiltros poliméricos. En un aspecto preferido, el microfiltro tiene una geometría de poros de precisión y una distribución de poros uniforme.
Aislamiento e identificación de CAML para una economía deficiente
Pueden utilizarse métodos para aislar las CAML y/o las CTC de una muestra biológica y contar las células aisladas utilizando una cámara, tal como la cámara de un teléfono móvil. Los métodos que utilizan cámaras, tales como las de los teléfonos móviles, puede utilizarse en aquellas circunstancias en las que no se disponga del equipo y los reactivos necesarios para el análisis detallado de las CAML y/o las CTC mediante la tinción con marcadores y la visualización. La capacidad para contar las CAML y/o las CTC basada en la tinción colorimétrica puede ser suficiente para algunas aplicaciones. Cuando faltan recursos en una comunidad, el cáncer tiende a diagnosticarse en fases avanzadas, lo que se traduce en opciones de tratamiento limitadas y resultados poco prometedores. Un método para proporcionar un diagnóstico de bajo coste basado en el recuento de las CAML y/o las CTC en una muestra puede adoptar uno o más de los siguientes conceptos.
(i) Utilizar filtros de bajo coste con un tamaño de poro de ~15-20 micrómetros.
(ii) Filtrar la muestra de sangre mediante extracción manual o una bomba de bajo coste.
(iii) Utilizar una tinción colorimétrica para visualizar las CAML y/o las CTC.
(iv) Tomar imágenes de las células utilizando la cámara de un teléfono móvil con/sin un pequeño objetivo portátil, o una variedad de microscopio de luz blanca con 10 aumentos o menos.
El gran tamaño de los poros de los filtros reducirá la contaminación por leucocitos. La extracción manual reducirá el coste. La tinción colorimétrica es de bajo coste. Las cámaras de los teléfonos móviles pueden visualizar las CAML debido al gran tamaño de las células.
Realizaciones de invenciones
Como se ha sugerido anteriormente, las características únicas de las CAML y las CTC descritas en el presente documento las hacen muy adecuadas para usar en metodología clínica, incluyendo métodos de cribado y diagnóstico de enfermedades tales como el cáncer, supervisión del tratamiento, supervisión de la progresión y recaída de la enfermedad.
Después de las CAML, se encuentran CTC o linfocitos T unidos a las células tumorales, puede ser posible identificar el tipo de tumor mediante tinción y, en algunos casos, repitiendo la tinción de estas células con marcadores asociados al tipo de tumor. La hoja informativa sobre marcadores tumorales del National Cancer Institute recoge muchos marcadores del cáncer (consúltese la página web del NCI cuya URL termina en "cancer.gov/cancertopics/factsheet/detection/tumor-markers" y "cancer.gov/about- cancer/diagnosisstaging/diagnosis/tumor-markers-fact-sheet#q5").
Los marcadores del cáncer no se limitan a esta lista. Unos pocos ejemplos de marcadores, indicados a continuación, pueden utilizarse para teñir las CAML y las CTC con el fin de proporcionar indicaciones iniciales del tipo de cáncer:
• Mutación BRAF V600E: Tipos de cáncer: Melanoma cutáneo y cáncer colorrectal
• CA15-3/CA27.29: Tipo de cáncer: Cáncer de mama
• CA19-9: Tipos de cáncer: Cáncer de páncreas, cáncer de vesícula biliar, cáncer de las vías biliares y cáncer gástrico
• CA-125: Tipo de cáncer: Cáncer de ovario
• Antígeno carcinoembrionario (ACE): Tipos de cáncer: Cáncer colorrectal y cáncer de mama
• Fragmentos de citoqueratina 21-1: Cáncer de pulmón
• Receptor de estrógeno (ER)/receptor de progesterona (PR): Tipo de cáncer: Cáncer de mama
• HE4: Tipo de cáncer: Cáncer de ovario
• HER2/neu: Tipos de cáncer: Cáncer de mama, cáncer gástrico y cáncer de esófago
• KIT: Tipos de cáncer: Tumor del estroma gastrointestinal y melanoma de la mucosa
• Antígeno prostático específico (PSA) y PSMA: Tipo de cáncer: Cáncer de próstata
• Tiroglobulina: Tipo de cáncer: Cáncer de tiroides
• Señal de la 5-proteína (oval): Tipo de cáncer: cáncer de ovario La elección de marcadores no se limita a esta lista.
Para identificar un tipo de cáncer, un marcador puede ser suficiente para algunos tipos de cáncer. Para cribar más de un tipo de cáncer en la misma muestra de sangre, tales como los cánceres de próstata, colorrectal y de pulmón en el varón, tras identificar las CAML y las CTC de interés, es necesario repetir la tinción de las CAML y las CTC para los marcadores de cáncer específicos para esos tipos de cáncer. A continuación se ilustra el análisis de las CAMl y las CTC para el cribado de hasta cuatro tipos de cáncer epitelial mediante el método de microfiltración:
• Recoger sangre.
• Aislar las CTC y las CAML del microfiltro.
• Teñir las células con DAPI, CK 8, 18, 19, CD14/CD45 y un marcador para un tipo de cáncer.
• Obtener imágenes de las células utilizando microscopios de fluorescencia e identificar las CAML y las CTC.
• Inactivar los tintes fluorescentes de las CAML y las CTC.
• Repetir la tinción de las células con DAPI y tres marcadores adicionales de interés.
• Volver a obtener imágenes de los nuevos marcadores en las mismas CTC y CAML de las que se obtuvieron imágenes anteriormente.
• Determinar el tipo de cáncer tomando como base los marcadores.
Los TAC de pulmón pueden mostrar hallazgos inusuales de un tamaño tan pequeño como 4 mm. Actualmente es un método de cribado recomendado para el cáncer de pulmón. Para verificar que un hallazgo inicial es cáncer de pulmón, se necesita una biopsia tisular. La biopsia de tejido pulmonar supone un gran reto y se asocia a un mayor riesgo de causar reacciones adversas. La presencia de CAML con marcadores de cáncer de pulmón asociados, tales como los fragmentos de citoqueratina 21-1 y otros marcadores, puede utilizarse para proporcionar una etapa no invasiva hacia la determinación del cáncer de pulmón.
Las personas portadoras de las mutaciones BRAC1 y BRAC2 tienen una alta probabilidad de padecer cáncer de mama y/o de ovario. Puede realizarse un análisis de sangre para las CAML que incluya los marcadores de CA125, Oval para el cáncer de ovario, y CEA, CA15-3/CA27.29, ER, PR y HER2 para el cáncer de mama.
Para detectar los cuatro tipos principales de cáncer en el varón, un posible conjunto de opciones de marcadores puede ser PSMA para el cáncer de próstata, CEA para el cáncer colorrectal, los fragmentos de citoqueratina 21-1 para el cáncer de pulmón y PDX-1 para el cáncer de páncreas.
El procedimiento y los marcadores pueden variar en función del método de aislamiento de las CAML y las CTC, el microscopio, los tipos de cáncer de interés, etc. En resumen, es posible cribar un cáncer específico, algunos cánceres o cualquier tumor sólido de la categoría de carcinomas, sarcomas, neuroblastomas y melanomas. Los marcadores no tienen por qué limitarse a los aquí descritos.
En una primera realización, la invención se refiere a métodos para determinar el estadio del cáncer en un sujeto, lo que comprende la caracterización de características seleccionadas de las CAML en una muestra biológica de un sujeto que padece un cáncer, en donde las características seleccionadas son (i) cantidad de CAML y (ii) tamaño medio de las CAML, y en donde cuando se miden en una muestra de sangre periférica en un volumen de 7,5 ml, entonces 5 o más CAML y aproximadamente el 70 % de las CAML de más de 40 micrómetros de diámetro es indicativo de cáncer en estadio III; y 5 o más CAML y aproximadamente el 80 % de las CAML de más de 40 micrómetros de diámetro es indicativo de cáncer en estadio IV. La identificación del tipo específico de cáncer puede realizarse mediante métodos convencionales, tales como la tinción para marcadores de cáncer. La identificación del tipo específico de cáncer también puede realizarse mediante la tinción para marcadores de cáncer y la posterior repetición de la tinción de las mismas células para marcadores adicionales. En ciertos aspectos, los métodos englobados por esta realización también incluyen la caracterización de características seleccionadas de las CTC en la muestra biológica, en donde las características seleccionadas de las CTC son una o más características seleccionadas del grupo que consiste en (i) cantidad de CTC; (ii) cantidad de leucocitos unidos a las CTC; (iii) grado de expresión de la citoqueratina 8; (iv) grado de expresión de la citoqueratina 18; (v) grado de expresión de la citoqueratina 19; (vi) grado de expresión de EpCAM; (vii) grado de expresión de vimentina; (viii) grado de expresión de PD-L1; (ix) grado de expresión de la uroplaquina; (x) morfología de la citoqueratina; (xi) ubicación de los marcadores; y (xii) intensidad de la tinción del marcador, preferentemente, en donde las características seleccionadas de las CTC son una o más de: (i) cantidad de CTC; (ii) intensidad de la tinción del marcador; (iii) ubicación de los marcadores; y (iv) cantidad de leucocitos unidos a las CTC. En ciertos aspectos, las CAML y/o las CTC se recogen de la muestra biológica antes de su caracterización. La cantidad de CAML en los estadios III y IV del cáncer es normalmente de 5 o más en una muestra de sangre periférica en un volumen de 7,5 ml. El porcentaje de CAML mayores de 40 micrómetros de tamaño por diámetro es de aproximadamente el 70 % en los pacientes en estadio III y de aproximadamente el 80 % en los pacientes en estadio IV.
En una segunda realización, la invención se refiere a métodos para supervisar la eficacia del tratamiento de un cáncer, que comprenden (a) el ensayo de características seleccionadas de las CAML en una muestra biológica de un sujeto sometido a tratamiento antineoplásico, y (b) la comparación de los valores del ensayo de las características seleccionadas determinados en (a) con los valores del ensayo de las mismas características ensayadas en una muestra biológica similar del mismo sujeto en uno o más puntos temporales antes, durante o después de completar el tratamiento, en donde un cambio en uno o más valores del ensayo indica la eficacia del tratamiento antineoplásico en el sujeto, en donde las características seleccionadas son (i) la cantidad de CAML y (ii) el tamaño medio de las CAML, y en donde un cambio en la cantidad y el tamaño medio de las CAML indica la eficacia del tratamiento antineoplásico. En ciertos aspectos, los métodos englobados por esta realización también incluyen (a) el ensayo de una o más características seleccionadas de las CTC en la muestra biológica, y (b) la comparación de los valores del ensayo para la una o más características seleccionadas determinadas en (a) con los valores del ensayo para las mismas características ensayadas en una muestra biológica similar del mismo sujeto en uno o más puntos temporales antes, durante o después de completar el tratamiento, en donde las características seleccionadas de las CTC son una o más características seleccionadas del grupo que consiste en (i) cantidad de CTC; (ii) cantidad de leucocitos unidos a las CTC; (iii) grado de expresión de la citoqueratina 8; (iv) grado de expresión de la citoqueratina 18; (v) grado de expresión de la citoqueratina 19; (vi) grado de expresión de EpCAM; (vii) grado de expresión de vimentina; (viii) grado de expresión de PD-L1; (ix) grado de expresión de la uroplaquina; (x) morfología de la citoqueratina; (xi) ubicación de los marcadores; y (xii) intensidad de la tinción del marcador, preferentemente, en donde las características seleccionadas de las CTC son una o más de: (i) cantidad de CTC; (ii) intensidad de la tinción del marcador; (iii) ubicación de los marcadores; y (iv) cantidad de leucocitos unidos a las CTC. En ciertos aspectos, las CAML y/o las CTC se recogen de la muestra biológica antes de su caracterización.
En ciertos aspectos, las características seleccionadas de las CAML son: (i) cambio en la cantidad de CAML del mismo sujeto en diferentes puntos temporales tras los tratamientos; (ii) cambio en el tamaño medio de las CAML en los diferentes puntos temporales; y uno o más de (iii) cambio en la intensidad de los marcadores en las CAML en los diferentes puntos temporales; y (iv) cambio de ubicación de los marcadores del núcleo al citoplasma o viceversa en las CAML.
En ciertos aspectos, las características seleccionadas de las CTC son una o más de: (i) cambio en la cantidad de CTC en las muestras biológicas en diferentes puntos temporales tras el tratamiento; (ii) cambio en la intensidad de los marcadores en las CTC en los diferentes puntos temporales; (iii) cambio de ubicación de los marcadores del núcleo al citoplasma o viceversa; (iv) cambio en la cantidad de leucocitos unidos a las CTC en la muestra biológica; y (v) cambio en la cantidad de leucocitos unidos a CTC en las muestras biológicas en diferentes puntos temporales tras los tratamientos.
El experto entenderá que un cambio en la cantidad de CAML y/o de CTC y/o de leucocitos unidos a las CTC será una indicación de la eficacia del tratamiento, donde el cambio puede ser un aumento o una disminución de la cantidad de CAML y/o de CTC y/o de leucocitos unidos a las CTC. La información recopilada sobre las CAML, las CTC y las CTC unidas a leucocitos pueden utilizarse independientemente entre sí. La información recopilada sobre las CAML, las CTC y las CTC unidas a leucocitos también pueden utilizarse juntas.
El experto comprenderá que un cambio en el tamaño de las CAML y/o de las CTC puede ser un indicador de la eficacia del tratamiento, donde el cambio en el tamaño puede ser un aumento o una disminución de la cantidad de CAML y/o de CTC y/o de leucocitos unidos a las CTC. La información recopilada sobre las CAML y las CTC puede utilizarse de forma independiente o conjunta.
La capacidad de seguimiento de las CAML ofrece una oportunidad novedosa para supervisar de forma rutinaria la necrosis y la respuesta a la quimioterapia o a la radioterapia. Si la quimioterapia no está teniendo efecto, la cantidad de CAML no aumentará. Esto puede utilizarse en paralelo con la detección de las CTC. Si el tratamiento está teniendo efecto, la cantidad de CTC patológicamente definibles disminuirá y la cantidad de CTC apoptóticas aumentará. Sin embargo, no siempre pueden detectarse las CTC. Si las CTC se detectan al mismo tiempo que las CAML, la sensibilidad y la especificidad pueden mejorarse. Para muchos tipos de cáncer existe una gran variedad de agentes quimioterápicos. Si el paciente no responde a un tipo de quimioterapia, el paciente puede cambiar rápidamente a otra.
En los aspectos y realizaciones pertinentes de la invención, la muestra biológica puede ser una cualquiera sospechosa de contener CTC, leucocitos unidos a CTC y/o CAML. En ciertos aspectos, la muestra biológica es una o más seleccionada del grupo que consiste en sangre periférica, sangre, ganglios linfáticos, médula ósea, líquido cefalorraquídeo, tejido y orina. La muestra puede ser una muestra reciente o una muestra crioconservada que se descongela. En un aspecto preferido, la muestra biológica es sangre periférica. En otros aspectos, la sangre puede ser sangre de la vena antecubital, sangre de la vena cava inferior o sangre de la vena yugular.
Los monocitos circulantes tienen la capacidad de entrar en cualquier compartimento tisular del organismo, incluyendo ganglios linfáticos, médula ósea, la mayoría de los órganos e incluso atraviesan la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, la detección de CAML no se limita a la sangre, y las células también pueden encontrarse en ganglios linfáticos, médula ósea, líquido cefalorraquídeo, la mayoría de los órganos y orina.
En los aspectos y realizaciones pertinentes de la invención, el cáncer es uno o más de un tumor sólido, cáncer en estadio I, cáncer en estadio II, cáncer en estadio III, cáncer en estadio IV, carcinoma, sarcoma, neuroblastoma, melanoma, cáncer de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal y otros cánceres de tumores sólidos. El experto apreciará que los métodos de la invención no se limitan a formas o tipos particulares de cáncer y que pueden ponerse en práctica en asociación con una amplia diversidad de cánceres.
Dado que las CAML pueden encontrarse en los estadios I y II del cáncer, las CAML pueden utilizarse como cribado para la detección temprana de carcinomas, sarcomas, neuroblastomas y melanomas. Los carcinomas son cánceres de origen epitelial especialmente para pacientes con alto riesgo de cáncer de mama, próstata, pulmón, páncreas, colorrectal y otros. La especificidad del tipo de cáncer puede determinarse repitiendo la tinción para diversos marcadores específicos del sitio del cáncer en las mismas células capturadas en el microfiltro. Algunos ejemplos son (i) utilizar anticuerpos contra PSMA para identificar específicamente el cáncer de próstata, (ii) utilizar anticuerpos contra PDX-1 para identificar específicamente el cáncer de pulmón, (iii) anticuerpo contra CA125 para el cáncer de ovario, y (iv) clorotoxina para identificar el glioma.
Del mismo modo, las CAML pueden utilizarse para determinar la recaída temprana de un cáncer cuando el cáncer se encontraba en remisión. En la actualidad se utilizan la tomografía computarizada, la resonancia magnética y la tomografía por emisión de positrones para supervisar el tumor del paciente, lo que requiere que el tumor cambie sustancialmente de tamaño para notar la diferencia. Por lo tanto, los pacientes pueden perder un tiempo valioso al iniciar el tratamiento cuando únicamente se producen cambios sutiles de tamaño. Las CAML, en solitario o en combinación con las CTC, pueden proporcionar una detección temprana del regreso del cáncer. El análisis de sangre no invasivo de CAML y CTC tiene un coste mucho menor que la obtención de imágenes de TAC, RMN y PET.
Las CAML también pueden utilizarse potencialmente para determinar la subtipificación del cáncer o las mutaciones génicas, translocaciones o amplificación. En cada CAML hay varios núcleos cancerosos. Por lo tanto, el análisis molecular del núcleo en busca de una mutación genética, defectos genéticos y translocaciones génicas puede proporcionar información para determinar los tratamientos. Existen fármacos que se dirigen específicamente a ciertas mutaciones génicas, translocación o amplificaciones. Las CAML pueden utilizarse junto o en paralelo con las CTC para el análisis molecular.
En los aspectos y realizaciones pertinentes de la invención, el volumen de la muestra biológica variará en función de la fuente y/o la identidad de la muestra. Sin embargo, en el caso de una muestra de sangre periférica, el volumen de sangre puede variar de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 50 ml, de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 40 ml, de aproximadamente 2 ml a aproximadamente 30 ml, de aproximadamente 3 ml a aproximadamente 25 ml, de aproximadamente 4 ml a aproximadamente 20 ml, de aproximadamente 5 ml a aproximadamente 15 ml, de aproximadamente 6 ml a aproximadamente 10 ml o de aproximadamente 7 ml a aproximadamente 8 ml. Un volumen adecuado también incluye aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 o 10 ml. El volumen de sangre utilizado habitualmente para la detección de las CTC es de 7,5 ml. Los volúmenes más grandes de sangre proporcionarán más sensibilidad y uniformidad, pero volúmenes más pequeños, tales como 3,5 ml, pueden ser suficientes. Para muchos métodos de detección de CTC, los grandes volúmenes de sangre no son prácticos por diversas razones. Sin embargo, la microfiltración de la sangre para capturar CTC y/o CAML permite una mayor flexibilidad para aumentar el tamaño de la muestra. Se ha demostrado que se pueden analizar con éxito volúmenes de sangre de 50 ml utilizando microfiltros CellSieve™ con 160000 poros. El volumen de sangre adecuado para capturar las CAML sería de 7,5 ml.
En los aspectos y realizaciones pertinentes de la invención, el antineoplásico puede ser uno o más de quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, vacunoterapia, terapia dirigida y/o una combinación de terapias.
En los aspectos y realizaciones pertinentes de la invención, Las CAML se detectan y/o recogen utilizando uno o más medios seleccionados del grupo que consiste en la metodología de exclusión por tamaños, inmunocaptura, lisis de eritrocitos, empobrecimiento en leucocitos, FICOLL, electroforesis, dielectroforesis, citometría de flujo y chips de microfluidos, o una combinación de los mismos. En un aspecto particular, la metodología de exclusión por tamaños comprende el uso de un microfiltro. Los microfiltros adecuados pueden tener una diversidad de formas y tamaños de poros. Cuando se detectan y/o recogen únicamente CAML, los tamaños de poro pueden variar de aproximadamente 15 micrómetros a aproximadamente 20 micrómetros. Cuando se detectan y/o recogen tanto CAML como CTC, los tamaños de poro pueden variar de aproximadamente 5 micrómetros a aproximadamente 10 micrómetros, preferentemente 7-8 micrómetros. Los tamaños de poro más grandes eliminarán la mayor parte de la contaminación por leucocitos en el filtro. Los poros pueden tener forma redonda, de pista de carreras, ovalada, cuadrada y rectangular.
En un aspecto preferido, el microfiltro tiene una geometría de poros de precisión y una distribución de poros uniforme. En un aspecto particular, Las CAML se detectan y/o recogen mediante un chip de microfluidos tomando como base clasificación por tamaño físico, clasificación hidrodinámica basada en el tamaño, agrupación, atrapamiento, inmunocaptura, concentrando células grandes o eliminando células pequeñas tomando como base el tamaño. En un aspecto particular, las CAML se detectan y/o recogen mediante un ensayo de microfiltración a baja presión.
Los resultados comunicados en el presente documento respaldan la idea de que las CAML constituyen un indicador fiable de la presencia de cáncer. La sensibilidad y especificidad de la utilidad de las CAML puede mejorarse adicionalmente en combinación con la detección simultánea de las CTC y las CTC unidas a leucocitos. El cribado del cáncer es una estrategia utilizada en una población para identificar una enfermedad no reconocida en individuos sin signos ni síntomas, con enfermedad presintomática o sintomática no reconocida. Como tales, las pruebas de cribado son en cierto modo únicas en el sentido de que se realizan en personas aparentemente en buen estado de salud. Una prueba de cribado no es una prueba diagnóstica. Las pruebas diagnósticas son un procedimiento realizado para confirmar o determinar la presencia de una enfermedad en un individuo sospechoso de padecer la enfermedad. Las CAML pueden utilizarse como diagnóstico del cáncer para proporcionar diagnósticos no invasivos adicionales que confirmen otras técnicas de cribado, tales como mamografía, prueba del PSA, presencia de CA125, imágenes de t Ac , RMN o PET.
Claims (11)
1. Un método para determinar el estadio del cáncer en un sujeto, que comprende la caracterización de características seleccionadas de células circulantes similares a macrófagos (CAML) asociadas al cáncer en una muestra biológica de un sujeto que padece un cáncer, en donde dicha caracterización indica el estadio del cáncer en el sujeto, en donde las características seleccionadas son (i) cantidad de CAML y (ii) tamaño medio de las CAML, y en donde cuando se miden en una muestra de sangre periférica en un volumen de 7,5 ml, entonces 5 o más CAML y aproximadamente el 70 % de las CAML de más de 40 micrómetros de diámetro es indicativo de cáncer en estadio III; y 5 o más CAML y aproximadamente el 80 % de las CAML de más de 40 micrómetros de diámetro es indicativo de cáncer en estadio IV.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende además la caracterización de características seleccionadas de células tumorales circulantes (CTC) en la muestra biológica, en donde las características seleccionadas de las CTC son una o más características seleccionadas del grupo que consiste en (i) cantidad de CTC; (ii) cantidad de leucocitos unidos a las CTC; (iii) grado de expresión de la citoqueratina 8; (iv) grado de expresión de la citoqueratina 18; (v) grado de expresión de la citoqueratina 19; (vi) grado de expresión de EpCAM; (vii) grado de expresión de vimentina; (viii) grado de expresión de PD-L1; (ix) grado de expresión de la uroplaquina; (x) morfología de la citoqueratina; (xi) ubicación de los marcadores; y (xii) intensidad de la tinción del marcador,
preferentemente, en donde las características seleccionadas de las CTC son una o más de: (i) cantidad de CTC; (ii) intensidad de la tinción del marcador; (iii) ubicación de los marcadores; y (iv) cantidad de leucocitos unidos a las CTC.
3. Un método para supervisar la eficacia de un tratamiento antineoplásico, que comprende (a) el ensayo de características seleccionadas de las CAML en una muestra biológica de un sujeto sometido a tratamiento antineoplásico, y (b) la comparación de los valores del ensayo de las características seleccionadas determinados en (a) con los valores del ensayo de las mismas características ensayadas en una muestra biológica similar del mismo sujeto en uno o más puntos temporales antes, durante o después de completar el tratamiento, en donde un cambio en los valores del ensayo indica la eficacia del tratamiento antineoplásico en el sujeto, en donde las características seleccionadas son (i) la cantidad de CAML y (ii) el tamaño medio de las CAML, y en donde un cambio en la cantidad y el tamaño medio de las CAML indica la eficacia del tratamiento antineoplásico.
4. El método de la reivindicación 3, que comprende además (a) el ensayo de una o más características seleccionadas de las CTC en la muestra biológica, y (b) la comparación de los valores del ensayo para la una o más características seleccionadas determinadas en (a) con los valores del ensayo para las mismas características ensayadas en una muestra biológica similar del mismo sujeto en uno o más puntos temporales antes, durante o después de completar el tratamiento, en donde las características seleccionadas de las CTC son una o más características seleccionadas del grupo que consiste en (i) cantidad de CTC; (ii) cantidad de leucocitos unidos a las CTC; (iii) grado de expresión de la citoqueratina 8; (iv) grado de expresión de la citoqueratina 18; (v) grado de expresión de la citoqueratina 19; (vi) grado de expresión de EpCAM; (vii) grado de expresión de vimentina; (viii) grado de expresión de PD-L1; (ix) grado de expresión de la uroplaquina; (x) morfología de la citoqueratina; (xi) ubicación de los marcadores; y (xii) intensidad de la tinción del marcador,
preferentemente, en donde las características seleccionadas de las CTC son una o más de: (i) cantidad de CTC; (ii) intensidad de la tinción del marcador; (iii) ubicación de los marcadores; y (iv) cantidad de leucocitos unidos a las CTC.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las características seleccionadas de las CAML incluyen una o más características adicionales seleccionadas del grupo que consiste en (i) tamaño individual de las CAML; (ii) tamaño promedio de los núcleos de las CAML; (iii) forma morfológica de las CAML; (iv) fenotipo positivo para CD14; (v) grado de expresión de CD45; (vi) grado de expresión de EpCAM; (vii) grado de expresión de vimentina; (viii) grado de expresión de PD-L1; (ix) grado de expresión del marcador CD11C; (x) grado de expresión del marcador CD146; (xi) grado de expresión del marcador CD202b; (xii) grado de expresión del marcador CD31; (xiii) grado de expresión del marcador RAD50; (xiv) grado de expresión del marcador PD-1; (xv) grado de expresión del marcador<c>CR; (xvi) grado de expresión del marcador PDX-1; (xvii) grado de expresión del marcador CD10; (xviii) grado de expresión del marcador AR; (xix) grado de expresión del marcador ER; (xx) presencia de leucocitos en las CAML; (xxi) ubicación de los marcadores; (xxii) presencia de uno o más marcadores asociados al cáncer en las CAML, en donde el marcador normalmente difunde o se asocia a vacuolas y/o material ingerido; y (xxiii) intensidad de la tinción del marcador,
preferentemente en donde las características adicionales de las CAML son una o más de: (i) Intensidad de la tinción del marcador; (ii) ubicación de los marcadores; (iii) tamaño individual de las CAML; (iv) grado de expresión del marcador PD-L1; (v) y grado de expresión del marcador CD31.
6. El método de la reivindicación 1 o 3, en donde las CAML se recogen de la muestra biológica utilizando uno o más medios seleccionados del grupo que consiste en metodología de exclusión por tamaños, lisis de eritrocitos, FICOLL, un chip de microfluidos y citometría de flujo, o una combinación de los mismos
preferentemente en donde el microfiltro tiene una geometría de poros de precisión y una distribución de poros uniforme.
7. El método de la reivindicación 2 o 4, en donde las CAML y las CTC se recogen de la muestra biológica utilizando uno o más medios seleccionados del grupo que consiste en metodología de exclusión por tamaños, lisis de eritrocitos, FICOLL, un chip de microfluidos y citometría de flujo, o una combinación de los mismos, preferentemente en donde la metodología de exclusión por tamaños comprende el uso de un microfiltro que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 7-8 micrómetros, preferentemente en donde el microfiltro tiene una geometría de poros de precisión y una distribución de poros uniforme.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la cantidad de CAML y CTC se determina utilizando un chip de microfluidos basado en la clasificación por tamaño físico, clasificación hidrodinámica basada en el tamaño, agrupación, atrapamiento, inmunocaptura, concentrando células grandes o eliminando células pequeñas tomando como base el tamaño.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la cantidad de CAML y CTC se determina mediante un ensayo de microfiltración a baja presión.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la muestra biológica es una o más seleccionada del grupo que consiste en sangre periférica, sangre, ganglios linfáticos, médula ósea, líquido cefalorraquídeo, tejido y orina, preferentemente en donde la muestra biológica es sangre periférica.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el cáncer es un tumor sólido o el cáncer es cáncer de células epiteliales, carcinoma, sarcoma, neuroblastoma o melanoma, o el cáncer es cáncer de mama, de próstata, de pulmón, de páncreas o colorrectal.
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