ES2680243T3 - Captura, identificación y uso de un nuevo marcador de tumores sólidos en fluidos corporales - Google Patents

Captura, identificación y uso de un nuevo marcador de tumores sólidos en fluidos corporales Download PDF

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Abstract

Un método de exploración de cáncer en un sujeto, que comprende detectar, en una muestra de sangre de un sujeto, células circulantes similares a macrófagos asociadas a cáncer (CAML), en donde dicha célula CAML tiene las siguientes características: (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 μm; (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros; y (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa.

Description

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DESCRIPCION
Captura, identificación y uso de un nuevo marcador de tumores sólidos en fluidos corporales Referencia cruzada con solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos N° 61/654.636, presentada el 1 de junio de 2012, de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos N° 61/773026, presentada el 5 de marzo de 2013, y de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos N° 61/787863, presentada el 15 de marzo de 2013.
Antecedentes
Campo de la invención
La presente invención se refiere, en general, a la identificación de un biomarcador en sangre, que puede utilizarse para la detección de tumores sólidos y para controlar la eficacia de los tratamientos de quimioterapia y radioterapia. La presente invención también se refiere al uso del biomarcador en combinación con células tumorales circulantes, con marcadores de cáncer de ADN sin plasma y suero, con marcadores de proteína asociados al cáncer y con otros biomarcadores.
Técnica relacionada
Cuando las células tumorales se separan de los tumores sólidos primarios, penetran en la circulación sanguínea o linfática, y finalmente abandonan la corriente sanguínea y entran en otro órgano o tejido para formar metástasis. El 90 % de las muertes relacionadas con el cáncer son causadas por el proceso metastásico. Los sitios metastásicos más comunes son el pulmón, el hígado, el hueso y el cerebro. Las células tumorales que se encuentran en la circulación reciben el nombre de células tumorales circulantes (CTC). Muchas publicaciones de investigación y ensayos clínicos muestran que las CTC tienen utilidad clínica (i) proporcionando información sobre supervivencia pronóstica y recurrencia del cáncer contando el número de células en la corriente sanguínea y (ii) proporcionando información sobre el tratamiento observando expresiones de proteínas, mutaciones genéticas y translocaciones en las CTC. Sin embargo, las CTC no pueden encontrarse sistemáticamente, incluso en pacientes en estadio IV.
Algunas afecciones médicas pueden diagnosticarse detectando la presencia de determinados tipos de células en el fluido corporal. En particular, las células indicativas o características de determinadas afecciones médicas pueden ser más grandes y/o menos flexibles que otras células encontradas en determinados fluidos corporales. En consecuencia, al recoger dichas células más grandes y/o menos flexibles de una muestra líquida de un fluido corporal, puede ser posible diagnosticar una afección médica en función de las células recogidas.
El documento WO2011 / 002649 enseña que se ha mostrado que las micropartículas relacionadas con tumores se correlacionan con el recuento de CTC y, por lo tanto, proporcionan un medio alternativo para evaluar la enfermedad metastásica. Leers et al (Am J Clin Pathol 2008; 129: 649-656) divulgan que los macrófagos circulantes que contienen antígeno prostático específico son una posible diana para la detección del cáncer de próstata. Caillou et al (PLoS ONE 2011; 6: e22567) investigaron el aumento de la densidad de los macrófagos asociados a tumores en cáncer anaplásico de tiroides. Wang et al (Cancer 2000; 88: 2787-2795) caracterizaron células circulantes de carcinoma de próstata aisladas de la sangre periférica.
Sumario
La presente invención se dirige a, y describe un, tipo de célula con características especiales que se encuentra en la sangre de pacientes con cáncer. En este documento se describe un tipo de célula denominada "célula circulante similar a macrófago asociada a cáncer" (CAML, Cancer Associated Macrophage-Like) y se demuestra que dicha célula está asociada a la presencia de tumores sólidos en un paciente. Los datos presentados en este documento muestran que este tipo de célula tiene utilidad clínica porque puede utilizarse como biomarcador para una variedad de aplicaciones médicas. A través de microfiltración, utilizando microfiltros de precisión, este tipo de célula se ha encontrado sistemáticamente en la sangre periférica de cáncer de origen epitelial de estadio I a estadio IV.
Las CAML pueden utilizarse como un biomarcador para proporcionar un diagnóstico de cáncer, en particular, una detección precoz del cáncer, una detección precoz de la recurrencia del cáncer y una determinación de la mutación del cáncer. Las CAML también pueden utilizarse como biomarcador para determinar los ciclos de terapia apropiados, en particular, las células pueden utilizarse en una determinación rápida de la eficacia de la respuesta al tratamiento de quimioterapia y radioterapia.
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Las CAML pueden utilizarse de forma independiente como un marcador de cáncer, y pueden utilizarse junto con las CTC, los ADN, las proteínas y otros biomarcadores libres en fluidos corporales para proporcionar una comprensión más completa de la enfermedad del paciente.
Más específicamente, y en una primera realización, la presente invención se refiere a métodos de exploración de cáncer en un sujeto, que comprenden detectar células circulantes similares a macrófagos asociadas a cáncer (CAML) en una muestra de sangre de un sujeto, en donde dicha célula CAML tiene las siguientes características: (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 pm; (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros; y (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa. En aspectos particulares, cuando en la muestra biológica se detectan las CAML, el sujeto se identifica como que posiblemente tiene un carcinoma o un tumor sólido. En otros aspectos, cuando en la muestra biológica se detectan las CAML, el sujeto se identifica como que tiene un carcinoma o un tumor sólido. En determinados aspectos, los métodos incluidos en esta realización también incluyen detectar células tumorales circulantes (CTC) en la muestra biológica. En aspectos particulares de esta primera realización, el sujeto es un sujeto que se sospecha que tiene cáncer.
En una segunda realización, la presente invención se refiere a métodos para diagnosticar cáncer en un sujeto, que comprenden detectar las CAML en una muestra de sangre de un sujeto, en donde cuando en la muestra de sangre se detectan las CAML, al sujeto se le diagnostica cáncer y en donde dicha célula CAML tiene las siguientes características: (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 pm; (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros; y (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa. En determinados aspectos, los métodos incluidos en esta realización también incluyen detectar las CTC en la muestra de sangre, en donde cuando en la muestra de sangre se detectan las CAML y las CTC, al sujeto se le diagnostica cáncer.
En una tercera realización, la presente invención se refiere a métodos para detectar la recurrencia de cáncer en un sujeto, que comprenden detectar las CAML en una muestra de sangre de un sujeto previamente tratado por cáncer, en donde cuando en la muestra de sangre se detectan las CAML, se detecta recurrencia de cáncer y en donde dicha célula CAML tiene las siguientes características: (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 pm; (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros; y (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa. En determinados aspectos, los métodos incluidos en esta realización también incluyen detectar las CTC en la muestra de sangre, en donde cuando en la muestra de sangre se detectan las CAML y las CTC, se detecta la recurrencia del cáncer.
En una cuarta realización, la presente invención se refiere a métodos para confirmar un diagnóstico de cáncer en un sujeto, que comprenden detectar las CAML en una muestra de sangre de un sujeto diagnosticado con cáncer, en donde cuando en la muestra de sangre se detectan las CAML, se confirma un diagnóstico de cáncer en el sujeto y en donde dicha célula CAML tiene las siguientes características: (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 pm; (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros; y (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa. En determinados aspectos, los métodos incluidos en esta realización también incluyen detectar las CTC en la muestra de sangre, en donde cuando en la muestra de sangre se detectan las CAML y las CTC, se confirma un diagnóstico de cáncer en el sujeto. En aspectos particulares, el diagnóstico inicial de cáncer es mediante mamografía, prueba de PSA, o presencia de CA125. En un aspecto particular, se sospecha que el sujeto tiene cáncer.
En aspectos de la primera a la cuarta realización, las CAML se detectan utilizando uno o más medios seleccionados del grupo que consiste en metodología de exclusión por tamaño, lisis de glóbulos rojos, FICOLL, una microplaca microfluídica y citometría de flujo, o una combinación de los mismos. En aspectos particulares, la metodología de exclusión por tamaño comprende el uso de un microfiltro. Los microfiltros adecuados pueden tener una variedad de tamaños y formas de poro. Los microfiltros que tienen un tamaño de poro de aproximadamente 7-8 micrómetros son aceptables e incluyen formas de poro redondas y rectangulares. Los microfiltros que tienen poros redondos de un tamaño de aproximadamente 7-8 micrómetros son especialmente óptimos cuando se utilizan microfiltros poliméricos.
En un aspecto preferido, el microfiltro tiene una geometría de poros de precisión y una distribución de poros uniforme.
En determinados aspectos de la primera a la cuarta realización, las CAML y las CTC se detectan simultáneamente utilizando un microfiltro que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 7-8 micrómetros de tamaño. Los microfiltros adecuados pueden tener una variedad de tamaños y formas de poro. Los microfiltros que tienen un tamaño de poro de aproximadamente 7-8 micrómetros son aceptables e incluyen formas de poro redondas y rectangulares. Los microfiltros que tienen poros redondos de un tamaño de aproximadamente 7-8 micrómetros son
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especialmente óptimos cuando se utilizan microfiltros poliméricos. En un aspecto preferido, el microfiltro tiene una geometría de poros de precisión y una distribución de poros uniforme.
En determinados aspectos de la primera a la cuarta realización, las CAML se detectan utilizando una microplaca microfluídica que se basa en la separación física en función del tamaño, separación hidrodinámica en función del tamaño, agrupación, atrapamiento, inmunocaptura, concentración de células grandes o eliminación de células pequeñas en función del tamaño.
En determinados aspectos de las realizaciones primera a cuarta, las CAML se detectan utilizando un ensayo de microfiltración a baja presión CellSieve™.
En aspectos de la primera a la cuarta realización, la muestra de sangre es sangre periférica. En el presente documento también se desvelan métodos en los que la muestra biológica es una o más seleccionada del grupo que consiste en ganglios linfáticos, médula ósea, líquido cefalorraquídeo, tejido y orina. En otros aspectos la sangre es sangre de la vena antecubital, sangre de la vena cava inferior o sangre de la vena yugular.
En aspectos de la primera a la cuarta realización, el cáncer es uno o más de un tumor sólido, cáncer en estadio I, cáncer en estadio II, cáncer en estadio III, cáncer en estadio IV, cáncer de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer pancreático y cáncer colorrectal.
En una quinta realización, la presente invención se refiere a métodos para controlar la eficacia de un tratamiento del cáncer, que comprende (a) determinar el número de CAML en una muestra de sangre de un sujeto antes del tratamiento del cáncer, y (b) comparar el número de CAML determinado en (a) con un número de CAML determinado a partir de una muestra de sangre similar del mismo sujeto en uno o más puntos temporales después del tratamiento. En determinados aspectos, los métodos comprenden además (c) determinar el número de CTC en la muestra de sangre de (a), y (d) comparar el número de CTC determinado en (c) con un número de CTC determinado a partir de la muestra de sangre de (b) y en donde dicha célula CAML tiene las siguientes características: (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 pm; (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros; y (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa.
En aspectos de la quinta realización, un cambio en el número de CAML es una indicación de la eficacia del tratamiento, en donde el cambio es un aumento o una disminución en el número de CAML.
En aspectos de la quinta realización, el tratamiento del cáncer es quimioterapia o radioterapia.
En aspectos de la quinta realización, el número de CAML se determina utilizando uno o más medios seleccionados del grupo que consiste en metodología de exclusión por tamaño, lisis de glóbulos rojos, FICOLL, una microplaca microfluídica y citometría de flujo, o una combinación de los mismos. En un aspecto particular, la metodología de exclusión por tamaño comprende el uso de un microfiltro. Los microfiltros adecuados pueden tener una variedad de tamaños y formas de poro. Los microfiltros que tienen un tamaño de poro de aproximadamente 7-8 micrómetros son aceptables e incluyen formas de poro redondas y rectangulares. Los microfiltros que tienen poros redondos de un tamaño de aproximadamente 7-8 micrómetros son especialmente óptimos cuando se utilizan microfiltros poliméricos.
En un aspecto preferido, el microfiltro tiene una geometría de poros de precisión y una distribución de poros uniforme. En un aspecto particular, el número de CAML se determina utilizando una microplaca microfluídica que se basa en la separación física en función del tamaño, separación hidrodinámica en función del tamaño, agrupación, atrapamiento, inmunocaptura, concentración de células grandes o eliminación de células pequeñas en función del tamaño. En un aspecto particular, el número de CAML se determina utilizando un ensayo de microfiltración a baja presión CellSieve™.
En determinados aspectos de la quinta realización, los números de CAML y CTC se determinan simultáneamente utilizando un microfiltro que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 7 a 8 micrómetros. Los microfiltros adecuados pueden tener una variedad de tamaños y formas de poro. Los microfiltros que tienen poros de un tamaño de aproximadamente 7-8 micrómetros son aceptables e incluyen formas de poro redondas y rectangulares. Los microfiltros que tienen poros redondos de aproximadamente 7-8 micrómetros de tamaño son especialmente óptimos cuando se utilizan microfiltros poliméricos. En un aspecto preferido, el microfiltro tiene una geometría de poros de precisión y una distribución de poros uniforme.
En aspectos de la quinta realización, la muestra de sangre es sangre periférica. En el presente documento también se desvelan métodos en los que la muestra biológica es una o más seleccionada del grupo que consiste en ganglios linfáticos, médula ósea, líquido cefalorraquídeo, tejido y orina. En otros aspectos la sangre es sangre de la vena antecubital, sangre de la vena cava inferior o sangre de la vena yugular.
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En aspectos de la quinta realización, el cáncer es uno o más de un tumor sólido, cáncer en estadio I, cáncer en estadio II, cáncer en estadio III, cáncer en estadio IV, cáncer de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer pancreático y cáncer colorrectal.
En una sexta realización, la presente invención se refiere a una célula circulante similar a macrófago asociada a cáncer (CAML), en donde la célula tiene las siguientes características: (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 pm; (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros; y (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa. En un aspecto de esta realización la célula tiene una o más o cada una de las siguientes características adicionales: (d) expresión de una o más de citoqueratina 8, 18 y 19, en donde la citoqueratina se difunde, o se asocia con vacuolas y/o material ingerido; (e) fenotipo CD45 positivo; (f) expresión de EpCAM (Epithelial cell adhesión molecule, moléculas de adhesión a células epiteliales) difusa con distribución casi uniforme; (g) expresión de uno o más marcadores de un tumor primario; (h) expresión de marcadores monocíticos CD11C y CD14; e (i) expresión de marcadores endoteliales CD146, CD202b y CD31. En un aspecto particular, la célula tiene cada una de las características (f) - (i) adicionales.
En el presente documento también se desvela una célula tumoral circulante (CTC) aislada patológicamente definible, en donde la célula tiene una o más de las siguientes características: (a) núcleo de tipo canceroso; (b) expresión de una o más de citoqueratina 8, 18 y 19, y en donde las citoqueratinas tienen un patrón filamentoso; y (c) fenotipo CD45 negativo.
En el presente documento también se desvela una célula tumoral circulante (CTC) aislada, apoptótica, en donde la célula tiene una o más de las siguientes características: (a) núcleo de tipo canceroso; (b) expresión de una o más de citoqueratina 8, 18 y 19, y en donde la citoqueratina está fragmentada en forma de manchas; y (c) fenotipo CD45 negativo.
Breve descripción de los dibujos
Se obtendrá fácilmente una apreciación más completa de la presente invención y muchas de sus ventajas concomitantes, ya que dicha invención se comprenderá mejor haciendo referencia a la siguiente descripción detallada cuando se tiene en cuenta en relación con los dibujos adjuntos, en los que:
Las FIGS. 1A-1D muestran células tumorales circulantes encontradas en la sangre de pacientes con cáncer. Las imágenes en color fusionadas se generaron con DAPI (azul), CQ (citoqueratinas 8, 18 y 19 (verde), EpCAM (rojo) y CD45 (violeta).
Las FIGS. 2A-2D muestran células tumorales circulantes apoptóticas encontradas en la sangre de pacientes con cáncer. Las imágenes en color fusionadas se generaron con DAPI (azul), CQ 8, 18 y 19 (verde), EpCAM (rojo) y CD45 (violeta).
La FIG. La Fig. 3 muestra una célula circulante similar a macrófago asociada a cáncer (CAML) que se encuentra en la sangre de pacientes con cáncer. Esta imagen de color fusionada se generó con DAPI (azul), CQ 8, 18 y 19 (verde), EpCAM (rojo) y CD45 (violeta).
La FIG. 4 muestra una célula circulante similar a macrófago asociada a cáncer que se encuentra en la sangre de pacientes con cáncer. Esta imagen de color fusionada se generó con DAPI (azul), CQ 8, 18 y 19 (verde), EpCAM (rojo) y CD45 (violeta).
La FIG. 5 muestra una célula circulante similar a macrófago asociada a cáncer que se encuentra en la sangre de pacientes con cáncer. Esta imagen de color fusionada se generó con DAPI (azul), CQ 8, 18 y 19 (verde), EpCAM (rojo) y violeta CD45.
La FIG. 6 muestra una célula circulante similar a macrófago asociada a cáncer que se encuentra en la sangre de pacientes con cáncer. Esta imagen de color fusionada se generó con DAPI (azul), CQ 8, 18 y 19 (verde), EpCAM (rojo) y CD45 (violeta).
Las FIGS. 7A-7I muestran una galería de células circulantes similares a macrófagos asociadas a cáncer encontradas en la sangre de pacientes con cáncer. Las imágenes de color fusionadas se generaron con DAPI (azul), CQ 8, 18 y 19 (verde), EpCAM (rojo) y CD45 (violeta).
Las FIGS. 8A-8I muestran la expresión de distintas CQ 8, 18, 19, EpCAM y CD45, y el núcleo, y la imagen de color fusionada de cada una de las células en la FIG. 7. Las FIGS. 8B, 8C y 8D son de pacientes con cáncer de mama. Las FIGS. 8 A, 8F y 8G son de pacientes con cáncer de páncreas. Las FIGS. 8E, 8H y 81 son de pacientes con cáncer de próstata. Las imágenes de color fusionadas se generaron con DAPI (azul), CQ 8, 18 y 19 (verde), EpCAM (rojo) y CD45 (violeta).
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La FIG. 9 es una gráfica de bigotes de diámetros citoplasmáticos de glóbulos blancos (GB), células tumorales circulantes (CTC) y células circulantes similares a macrófagos asociadas a cáncer (CAML).
La FIG. 10 es una comparación de la presencia de células tumorales circulantes (CTC) capturadas mediante CellSearch ® y de CTC patológicamente-definibles aisladas por microfiltración con CellSieve™ y de células circulantes similares a macrófagos asociadas a cáncer (CAML) aisladas al mismo tiempo por microfiltración con CellSieve™.
La FIG. 11 es una gráfica del número de células circulantes similares a macrófagos asociadas a cáncer (CAML) encontradas en la circulación de pacientes con cáncer de mama, de próstata y pancreático en diferentes estadios de cáncer.
La FIG. 12 es una gráfica del número de células CAML y CTC encontradas en las muestras de pacientes con cáncer de próstata.
La FIG. 13 es una gráfica del número de células CAML y CTC encontradas en las muestras de pacientes con cáncer de páncreas.
La FIG. 14 es una gráfica del número de células CAML y CTC encontradas en las muestras de pacientes con cáncer de mama.
La FIG. 15 es una gráfica del número de células circulantes similares a macrófagos asociadas a cáncer (CAML) encontradas en la circulación de pacientes con cáncer de mama, de próstata, pancreático y de pulmón en diferentes estadios de cáncer.
Las FIGS. 16A y 16B son gráficas del número de células CAML y CTC encontradas en las muestras de pacientes con cáncer de próstata, respectivamente.
Las FIGS. 17A y 17B son gráficas del número de células CAML y CTC encontradas en las muestras de pacientes con cáncer de páncreas, respectivamente.
Las FIGS. 18A y 18B son gráficas del número de células CAML y CTC encontradas en las muestras de pacientes con cáncer de mama, respectivamente.
La FIG. 19 es una gráfica del número de células CAML y CTC encontradas en los pacientes con cáncer de pulmón.
La FIG. 20 es una gráfica del número de células CAML y CTC encontradas en los pacientes con cáncer colorrectal.
La FIG. 21 es un ejemplo de una CAML de un paciente con cáncer pancreático, con tinción también para PDX-1.
La FIG. 22 es un ejemplo de una CAML de un paciente con cáncer de próstata, con tinción también para PSMA.
Las FIGS. 23A-B muestran tinción con H & E de células CAML. Se muestran dos células CAML representativas (A) y (B) al microscopio óptico. La flecha negra es una vacuola redonda localizada dentro del citoplasma de la CAML. Las flechas blancas muestran los núcleos individuales y la subsiguiente naturaleza polinuclear de las CAML.
La FIG. 24A es una gráfica del número de células circulantes similares a macrófagos asociadas a cáncer (CAML) en pacientes con cáncer de mama sin tratamiento y con tratamiento hormonal o quimioterapia y radioterapia.
La FIG. 24B es una gráfica del número de células circulantes similares a macrófagos asociadas a cáncer (CAML) en pacientes con cáncer pancreático sin tratamiento, y con quimioterapia y radioterapia.
La FIG. 25A muestra una CTC asociado a una CAML.
La FIG. 25B muestra una CTC unida a una CAML.
La FIG. 25C muestra una CTC unida a una CAML con fusión de membrana.
La FIG. 25D muestra una CAML que absorbió una célula CQ positiva.
La FIG. 26A muestra ejemplos de CAML de pacientes con cáncer de mama con tinción para CD11c, CD14 y TIE- 2.
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La FIG. 26B muestra ejemplos de CAML de pacientes con cáncer pancreático con tinción para CD11c, CD14 y TIE-2.
La FIG. La Fig. 26C muestra ejemplos de CAML de pacientes con cáncer de mama con tinción para CD11c, CD14 y CD146.
La FIG. 26D muestra ejemplos de CAML de pacientes con cáncer pancreático con tinción para CD11lc, CD14 y CD146.
Descripción detallada
Las cuestiones definidas en la descripción, tales como una construcción detallada y elementos, no son más que las proporcionadas para ayudar a comprender globalmente a invención. Por consiguiente, los expertos habituales en la técnica reconocerán que pueden realizarse diversos cambios y modificaciones de las realizaciones descritas en el presente documento.
El cáncer es la enfermedad más temida en el mundo, que afecta a todas las poblaciones y etnias en todos los países. Solo en los Estados Unidos, hay más de 10 millones de pacientes con cáncer, con 1,5 millones de nuevos casos de cáncer y casi 0,6 millones de muertes al año. Se estima que la muerte por cáncer en todo el mundo es de unos 8 millones de personal al año, de las cuales 3 millones de muertes se producen en países desarrollados donde los pacientes disponen de tratamiento.
Idealmente, existe un biomarcador que puede (i) proporcionar detección precoz de todos los carcinomas, especialmente para grupos de riesgo, tales como fumadores, para el cáncer de pulmón, (ii) confirmar otros indicios de cáncer, tales como PSA alto, para el cáncer de próstata, y/o (iii) proporcionar una detección precoz de la recurrencia del cáncer.
Los oncólogos necesitan saber cómo mejorar el tratamiento de los pacientes con cáncer recién diagnosticados. El patrón de ensayo actual es una biopsia de tejido, que se utiliza para determinar el subtipo de cáncer, ya que los fármacos terapéuticos son frecuentemente eficaces solo para subtipos específicos. El método de la biopsia varía según la ubicación, pero es invasivo y puede ser arriesgado.
Para controlar el tratamiento, los oncólogos necesitan saber cómo de bien está funcionando el fármaco en el paciente, si la dosis debe ajustarse y si la enfermedad se está propagando o remitiendo. Los métodos habituales para responder a estas cuestiones son la tomografía computarizada (TC) de rayos X y las imágenes por resonancia magnética (IRM), ambas costosas. Además, estos métodos no pueden proporcionar la información necesaria hasta que el tamaño del tumor haya cambiado de forma perceptible.
El 90 % de los pacientes con cáncer mueren por metástasis, no por el tumor primario. El proceso metastásico implica células tumorales que se separan de los carcinomas primarios (tumores sólidos de células epiteliales) y entran en la corriente sanguínea. Estas células cancerosas separadas se conocen como células tumorales circulantes (CTC). Las CTC tienen el potencial de ser útiles como una herramienta para determinar la terapia, controlar el tratamiento, determinar la recurrencia y proporcionar información pronóstica de supervivencia. Sin embargo, las CTC no pueden recogerse sistemáticamente de la sangre, incluso en cánceres de estadios III y IV.
En esta divulgación, se presenta un tipo de célula que se encuentra sistemáticamente en la sangre de pacientes con carcinoma en estadios I-IV. Estas células son células similares a macrófagos que contienen los mismos marcadores tumorales que el tumor primario y en este documento reciben el nombre de células circulantes similares a macrófagos asociadas a cáncer (CAML).
Las CTC y las CAML se pueden encontrar a partir de la misma muestra del paciente al mismo tiempo mediante métodos de exclusión por tamaño, tales como mediante métodos de microfiltración. Los microfiltros pueden formarse con poros lo suficientemente grandes como para permitir que todos los glóbulos rojos y la mayoría de los glóbulos blancos atraviesen y retengan células más grandes tales como las CTC y CAML. También han implementado métodos de exclusión por tamaño mediante microplacas microfluídicas.
Las CAML tienen muchas utilidades clínicas cuando se utilizan en solitario. Además, las CAML pueden combinarse con otros marcadores tales como CTC, ADN y proteínas libres en sangre para mejorar aún más la sensibilidad y la especificidad de un diagnóstico. Esto es especialmente cierto para las CAMLS y las CTC porque estas células pueden aislarse e identificarse al mismo tiempo.
Células tumorales circulantes
Las CTC expresan diversas citoqueratinas (CQ). Las CQ 8, 18 y 19 son las que más se utilizan habitualmente en el diagnóstico, pero el estudio no debe limitarse a estas tres. La superficie de las CTC de tumores sólidos normalmente
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expresa moléculas de adhesión a células epiteliales (EpCAM). Sin embargo, esta expresión no es uniforme ni consistente. Las CTC no deben expresar ningún CD45, porque este es un marcador de glóbulos blancos. En ensayos para identificar células asociadas a tumores, tales como CTC y CAML, basta con utilizar anticuerpos contra la CQ 8, 18 o 19 o anticuerpos contra CD45 o DAPI. Combinando la presencia de tinción con morfología, pueden identificarse CTC patológicamente definibles, CTC apoptóticas y CAML.
Las FIGS. 1A-1D muestran cuatro ejemplos de CTC patológicamente definibles. Una CTC patológicamente definible se identifica por las siguientes características:
• Tiene un núcleo "de tipo canceroso" teñido con DAPI. La excepción es cuando la célula está en división; el núcleo está condensado.
• Expresa al menos las CQ 8, 18 y 19. Las citoqueratinas tienen un patrón filamentoso.
• Carece de expresión CD45. Para evitar la pérdida de células CD45 de baja expresión, durante la adquisición de imágenes se utiliza una exposición prolongada.
Una CTC patológicamente definible, como se usa en la presente invención, incluye por tanto las CTC que tienen una, dos o tres de las siguientes características: (a) un núcleo de tipo canceroso; (b) expresión de una o más de citoqueratina 8, 18 y 19, y en donde las citoqueratinas tienen un patrón filamentoso; y (c) un fenotipo CD45 negativo.
La FIG. 1A muestra una CTC de cáncer de próstata patológicamente definible que expresa EpCAM bien definida y la FIG. 1B muestra una CTC de cáncer de próstata patológicamente definible que expresa muy poca o ninguna EpCAM. La FIG. 1C muestra una CTC de cáncer de mama patológicamente definible que expresa EpCAM bien definida y la FIG. 1D muestra una CTC de cáncer de mama patológicamente definible que expresa muy poca o ninguna EpCAM.
Las FIGS. 2A-2D muestran ejemplos de CTC apoptóticas. Una CTC apoptótica se identifica por las siguientes características:
• Tiene un núcleo canceroso.
• Expresa al menos las CQ 8, 18 y 19; las citoqueratinas no tienen un patrón filamentoso, sino que aparecen fragmentadas en forma de manchas.
• No expresa CD45.
Una CTC apoptótica como se usa en la presente invención incluye, por tanto, las CTC que tienen una, dos o tres de las siguientes características: (a) un núcleo de tipo canceroso; (b) expresión de una o más de citoqueratina 8, 18 y 19, y en donde la citoqueratina está fragmentada en forma de manchas; y (c) un fenotipo CD45 negativo (a) núcleo de tipo canceroso; (b) expresión de una o más de citoqueratina 8, 18 y 19, y en donde la citoqueratina está fragmentada en forma de manchas; y (c) fenotipo CD45 negativo.
Las FIGS. 2A y 2B muestran CTC apoptóticas de cáncer de mama que expresan muy poca o ninguna EpCAM en los estadios tempranos y centrales de la apoptosis, respectivamente. Las FIGS. 2C y 2d muestran CTC de cáncer de próstata en el estadio central de la apoptosis que expresa mucha y poca EpCAM, respectivamente.
Células circulantes similares a macrófagos asociadas a cáncer (CAML)
En las mismas muestras de pacientes, se identificó otro tipo de célula. Este tipo de célula recibió el nombre de CAML. Las CAML tienen las siguientes características:
• Las CAML tienen un núcleo grande, atípico; pudiendo encontrarse en las CAML múltiples núcleos individuales, aunque son habituales nucleolos alargados fusionados de aproximadamente 14 pm a aproximadamente 65 pm.
• Las CAML pueden expresar al menos la CQ (citoqueratina) 8, 18 o 19, y la CQ está difusa o asociada a vacuolas y/o a material ingerido. La CQ es casi uniforme en toda la célula.
• Las CAML son la mayor parte del tiempo CD45 positivas.
• Las CAML son grandes, de un tamaño de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros.
• Las CAML adoptan cinco formas morfológicas distintas (forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga o amorfa).
El análisis adicional de las CAML muestra que también tienen las siguientes características:
• Si la CAML expresa EpCAM, la EpCAM se difunde o se asocia a vacuolas y/o a material ingerido, y son casi uniformes en toda la célula, pero no todas las CAML expresan EpCAM, porque algunos tumores expresan muy poca o ninguna EpCAM.
• Las CAML expresan marcadores asociados a los marcadores del origen tumoral; por ejemplo, si el origen del tumor es de cáncer de próstata y expresa PSMA, entonces la CAML de este paciente también expresa PSMA.
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Otro ejemplo, si el origen del tumor primario es de cáncer pancreático y expresa PDX-1, entonces la CAML de este paciente también expresa PDX-1.
• Las CAML expresan marcadores monocíticos (por ejemplo, CD11c, CD 14) y marcadores endoteliales (por ejemplo, CD146, CD202b, CD31). Las CAML también tienen la capacidad de unirse fragmentos de Fc.
Las CAML de la presente invención incluyen, por lo tanto, las CAML que tienen las siguientes características: (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 pm; (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros; y (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa. Las CAML de la presente invención también incluyen las CAML que tienen una, dos, tres cuatro, cinco o seis de las siguientes características adicionales: (d) expresión de una o más de citoqueratina 8, 18 y 19, en donde la citoqueratina se difunde, o se asocia a vacuolas y/o a material ingerido; (e) fenotipo CD45 positivo (f) expresión de EpCAM difusa con distribución casi uniforme; (g) expresión de uno o más marcadores de un tumor primario; (h) expresión de marcadores monocíticos CD11C y CD14; e (i) expresión de marcadores endoteliales CD146, CD202b y CD31. En un aspecto particular, las CAML de la presente invención tienen cada una de las características (f) - (i) adicionales.
Las imágenes de las CAML de un paciente con cáncer de mama se muestran en las FIGS. 3-5 y en la FIG. 6 se muestran las de las CAML de un paciente con cáncer de próstata. La FIG. 7 contiene un collage de células CAML que muestra las cinco diferentes morfologías de las CAML y la variación de señal de muestras distintas de pacientes con cáncer de próstata, mama y pancreático: (7 A) pancreático, (7B) mama, (7C) mama, (7D) mama (7E) próstata (7F) pancreático, (7G) pancreático, (7H) próstata y (71) próstata. Son ejemplos de variantes de morfología los siguientes: amorfa (7 A), oblonga (7B y 7G), huso (3, 5, 6, 7C, 7F y 7I), redonda (7D) y renacuajo (4, 7E y 7H). Las diferencias de color se producen a partir de los diversos grados de expresión de proteínas a partir de la reacción de los anticuerpos contra EpCAM, citoqueratina y CD45. La expresión de marcadores de cada una de las CAML en las Figs. 7A-I se muestran en detalle en las Figs. 8A-I.
La FIG. 9 muestra la gráfica de bigotes de los diámetros citoplasmáticos de glóbulos blancos (GB), CTC y CAML. La mediana de las diferencias de tamaño e intervalos entre GB, CTC y CAML capturados en el microfiltro de cáncer de próstata, mama y pancreático (n = 25 glóbulos blancos, n = 25 CAML y n = 25 CTC). Los diámetros se midieron utilizando la distancia entre los dos puntos más alejados de la célula utilizando el programa informático de medición Zen 2011. El valor medio de los glóbulos blancos fue de 12,4 pm, el de las CTC fue de 18,8 pm y el de las CAML de 43.5 pm.
Métodos de diagnóstico de uso de las CAML y las CTC
Como se sugirió anteriormente, las características exclusivas de las CAML y las CTC descritas en este documento las hacen muy adecuados para su uso en metodología clínica que incluyen métodos de exploración y diagnóstico de enfermedades tales como cáncer, y en el control del avance de la enfermedad.
La invención se refiere por tanto, en una primera realización, a métodos de exploración de cáncer en un sujeto, que comprenden detectar células circulantes similares a macrófagos asociadas a cáncer (CAML) en una muestra de sangre de un sujeto, en donde dicha célula CAML tiene las siguientes características: (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 pm; (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros; y (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa. En aspectos particulares, cuando en la muestra de sangre se detectan las CAML, el sujeto se identifica como que posiblemente tiene un carcinoma o un tumor sólido. En otros aspectos, cuando en la muestra biológica se detectan las CAML, el sujeto se identifica como que tiene un carcinoma o un tumor sólido. En determinados aspectos, los métodos incluidos en esta realización también incluyen detectar células tumorales circulantes (CTC) en la muestra de sangre. En aspectos particulares de esta primera realización, el sujeto es un sujeto que se sospecha que tiene cáncer.
En una segunda realización, la invención se refiere a métodos para diagnosticar cáncer en un sujeto, que comprenden detectar las CAML en una muestra de sangre de un sujeto, en donde cuando en la muestra de sangre se detectan las CAML, al sujeto se le diagnostica cáncer, y en donde dicha célula CAML tiene las siguientes características: (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 pm; (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros; y (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa. En determinados aspectos, los métodos incluidos en esta realización también incluyen detectar células tumorales circulantes (CTC) en la muestra de sangre, en donde cuando en la muestra de sangre se detectan las CAML y las CTC, al sujeto se le diagnostica cáncer.
En una tercera realización, la invención se refiere a métodos para detectar la recurrencia de cáncer en un sujeto, que comprenden detectar las CAML en una muestra de sangre de un sujeto previamente tratado por cáncer, en donde cuando en la muestra de sangre se detectan las CAML, se detecta recurrencia de cáncer, y en donde dicha célula CAML tiene las siguientes características: (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de
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aproximadamente 14-64 pm; (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a
aproximadamente 300 micrómetros; y (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa. En determinados aspectos, los métodos incluidos en esta realización también incluyen detectar las CTC en la muestra de sangre, en donde cuando en la muestra de sangre se detectan las CAML y las CTC, se detecta recurrencia de cáncer.
En una cuarta realización, la invención se refiere a métodos para confirmar un diagnóstico de cáncer en un sujeto, que comprenden detectar las CAML en una muestra de sangre de un sujeto diagnosticado con cáncer, en donde cuando en la muestra de sangre se detectan las CAML, se confirma un diagnóstico de cáncer en el sujeto, y en
donde dicha célula CAML tiene las siguientes características: (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de
aproximadamente 14-64 pm; (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a
aproximadamente 300 micrómetros; y (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa. En determinados aspectos, los métodos incluidos en esta realización también incluyen detectar las CTC en la muestra de sangre, en donde cuando en la muestra de sangre se detectan las CAML y las CTC, se confirma un diagnóstico de cáncer en el sujeto. En aspectos particulares, el diagnóstico inicial de cáncer es mediante mamografía, prueba de PSA o presencia de CA125. En un aspecto particular, se sospecha que el sujeto tiene cáncer.
En cada una de estas realizaciones, las CAML se detectan utilizando medios apropiados que incluyen, pero no se limitan a, una o más de metodología de exclusión por tamaño, lisis de glóbulos rojos, FICOLL, un microplaca microfluídica y citometría de flujo, o una combinación de los mismos. Cuando se utiliza la metodología de exclusión por tamaño, esta puede comprender el uso de un microfiltro. Los microfiltros adecuados pueden tener una variedad de tamaños y formas de poro. Los microfiltros que tienen poros de aproximadamente 7-8 micrómetros de tamaño son aceptables e incluyen formas de poro redondas y rectangulares. Los microfiltros que tienen poros redondos de un tamaño de aproximadamente 7-8 micrómetros son especialmente óptimos cuando se utilizan microfiltros poliméricos. En un aspecto preferido, el microfiltro tiene una geometría de poros de precisión y una distribución de poros uniforme.
Como alternativa, las CAML pueden detectarse utilizando un microplaca microfluídica que se basa en medios que incluyen, sin limitación, separación física en función del tamaño, separación hidrodinámica en función del tamaño, agrupación, atrapamiento, inmunocaptura, concentración de células grandes o eliminación de células pequeñas en función del tamaño.
En cada una de estas realizaciones, las CTC también pueden detectarse junto con las CAML. Dicha detección puede ser detección simultánea o secuencial, y puede utilizar los mismos medios o diferentes medios. Por ejemplo, puede utilizarse detección simultánea utilizando un microfiltro que tiene un tamaño de poro que selecciona para ambos tipos de células. Los microfiltros adecuados pueden tener una variedad de tamaños y formas de poro. Los microfiltros que tienen poros de aproximadamente 7-8 micrómetros de tamaño son aceptables e incluyen formas de poro redondas y rectangulares. Los microfiltros que tienen poros redondos de aproximadamente 7-8 micrómetros de tamaño son especialmente óptimos cuando se utilizan microfiltros poliméricos. En un aspecto preferido, el microfiltro tiene una geometría de poros de precisión y una distribución de poros uniforme.
Los métodos desvelados en el presente documento se pueden poner en práctica utilizando cualquier muestra biológica que se sospeche que contenga células CTC y/o CAML. Las muestras biológicas adecuadas incluyen, pero sin limitación, una o más seleccionadas del grupo que consiste en ganglios linfáticos, médula ósea, líquido cefalorraquídeo, tejido y orina. Los métodos de la invención se ponen en práctica utilizando una muestra de sangre. En un aspecto preferido, la muestra es sangre periférica. En otros aspectos, la sangre es sangre de la vena antecubital, sangre de la vena cava inferior o sangre de la vena yugular.
El experto en la materia apreciará que los métodos proporcionados en estas realizaciones no están limitados a formas o a tipos de cánceres particulares, y que pueden ponerse en práctica junto con una amplia variedad de cánceres. Como ejemplos de cánceres se incluyen, pero sin limitación, tumores sólidos, cáncer de estadio I, cáncer de estadio II, cáncer de estadio III, cáncer de estadio IV, cáncer de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer pancreático y cáncer colorrectal.
Control de la eficacia del tratamiento utilizando las CAML y las CTC
Como se sugirió anteriormente, las características exclusivas de las CAML y CTC descritas en la presente memoria también hacen que sean muy adecuadas para su uso controlando la eficacia de tratamientos de enfermedades.
La presente invención se refiere por tanto, en una quinta realización, a métodos para controlar la eficacia de un tratamiento del cáncer, que comprenden:
(a) determinar el número de CAML en una muestra de sangre de un sujeto antes del tratamiento del cáncer, y
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(b) comparar el número de CAML determinado en (a) con un número de CAML determinado de una muestra de sangre similar del mismo sujeto en uno o más puntos temporales después del tratamiento.
Dadas las aptitudes de pronóstico asociadas a las CTC, los métodos de esta realización también pueden incluir las siguientes etapas adicionales:
(c) determinar el número de CTC en la muestra de sangre de (a), y
(d) comparar el número de CTC determinado en (c) con un número de CTC determinado a partir de la muestra de sangre de (b), y en donde dicha célula CAML tiene las siguientes características: (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 pm; (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros; y (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa.
El experto en la materia entenderá que un cambio en el número de CAML y / o CTC será una indicación de la eficacia del tratamiento, en donde el cambio puede ser un aumento o una disminución en el número de CAML y/o CTC.
El tratamiento del cáncer particular no está limitado por este método, pero generalmente comprenderá quimioterapia y/o radioterapia.
Estos métodos pueden ponerse en práctica determinando el número de CAML utilizando uno o más medios seleccionados del grupo que consiste en metodología de exclusión por tamaño, lisis de glóbulos rojos, FICOLL, un microplaca microfluídica y citometría de flujo, o una combinación de los mismos. Cuando se usa la metodología de exclusión por tamaño, esta puede comprender el uso de un microfiltro. Los microfiltros adecuados pueden tener una variedad de tamaños y formas de poro. Los microfiltros que tienen poros de aproximadamente 7-8 micrómetros de tamaño son aceptables e incluyen formas de poro redondas y rectangulares. Los microfiltros que tienen poros redondos de aproximadamente 7-8 micrómetros de tamaño son especialmente óptimos cuando se utilizan microfiltros poliméricos. En un aspecto preferido, el microfiltro tiene una geometría de poros de precisión y una distribución de poros uniforme. En un aspecto particular, el número de CAML se determina utilizando un microplaca microfluídica basada en medios que incluyen, pero sin limitación: separación física en función del tamaño, separación hidrodinámica en función del tamaño, agrupación, atrapamiento, inmunocaptura, concentración de células grandes, o eliminación de células pequeñas en función del tamaño. En otro aspecto particular las CAML se detectan utilizando un ensayo de microfiltración a baja presión CellSieve™.
Cuando se controlan ambos tipos de células, los números de las CAML y de las CTC se pueden determinar de manera secuencial o simultánea utilizando los mismos medios o medios diferentes. Por ejemplo, puede utilizarse detección simultánea utilizando un microfiltro con un tamaño de poro que seleccione ambos tipos de células. Los microfiltros adecuados pueden tener una variedad de tamaños y formas de poro. Los microfiltros que tienen poros de aproximadamente 7-8 micrómetros de tamaño son aceptables e incluyen formas de poro redondas y rectangulares. Los microfiltros que tienen poros redondos de aproximadamente 7-8 micrómetros de tamaño son especialmente óptimos cuando se utilizan microfiltros poliméricos. En un aspecto preferido, el microfiltro tiene una geometría de poros de precisión y una distribución de poros uniforme.
Los métodos desvelados en el presente documento pueden ponerse en práctica utilizando cualquier muestra biológica que se sospeche que contenga células CTC y/o CAML. Las muestras biológicas adecuadas incluyen, pero sin limitación, una o más seleccionadas del grupo que consiste en ganglios linfáticos, médula ósea, líquido cefalorraquídeo, tejido y orina. Los métodos de la invención se ponen en práctica utilizando una muestra de sangre. En un aspecto preferido, la muestra biológica es sangre periférica. En otros aspectos, la sangre es sangre vena antecubital, sangre de vena cava inferior o sangre de vena yugular.
El experto en la técnica apreciará que los métodos proporcionados en esta realización no están limitados a formas o a tipos de cánceres particulares y que pueden ponerse en práctica junto con una amplia variedad de cánceres. Como ejemplos de cánceres se incluyen, pero sin limitación, tumores sólidos, cáncer de estadio I, cáncer de estadio II, cáncer de estadio III, cáncer de estadio IV, cáncer de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer pancreático y cáncer colorrectal.
Análisis de los resultados biológicos y clínicos de las CAML
Los macrófagos asociados a tumores (MAT) son macrófagos diferenciados y especializados que se encuentran en la mayoría de los tumores y que pueden utilizarse como indicadores de pronóstico de invasividad o supresión tumoral. Los MAT, acumulados en el estroma de monocitos circulantes, son necesarios para la intravasación, migración, extravasación y angiogénesis de las células tumorales. Los tumores atraen a monocitos a través de quimioatrayentes (MCP-1, CCL-2). A su vez, los MAT secretan citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento (por ejemplo, MMP-1, CXCL12) que estimulan las células tumorales con el potencial de convertirse en células tumorales
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circulantes (CTC). Los MAT y las células tumorales migran después a través del sistema linfático, o se intravasan a través de las barreras capilares intratumorales en la circulación periférica.
La evidencia patológica que detalla las etapas de diseminación iniciales de las CTC a través de una cascada metastásica sigue sin ser concluyente. Típicamente, una cascada de diseminación de células cancerosas requiere 3 etapas: separación de CTC del tumor, alejamiento de la masa original y migración al sistema circulatorio. Aunque varias teorías explican aspectos selectos de esta cascada (células progenitoras endoteliales, células madre mesenquimáticas cancerosas, células cancerosas híbridas, etc.), ninguna explica completamente los tres procesos. Recientemente, los estudios in vivo han demostrado que las células monocíticas circulantes están intrincadamente implicadas en la invasividad, motilidad y potencial metastásico de las células tumorales. Se han documentado interacciones entre células del linaje mieloide y células tumorales en pacientes y se han modelado en ratones, lo que sugiere una ruta para la intravasación, aunque el mecanismo para la etapa de diseminación final aún no se ha establecido.
En el presente documento se describe la existencia de CAML, una célula circulante gigante muy diferenciada (de tipo macrófago) aislada de la sangre periférica de pacientes con cáncer de mama, próstata y pancreático, que en teoría podría ser un MAT diseminado (MATD). Este tipo de célula se aisló utilizando el microfiltro CellSieve™ (Creatv MicroTech) con dimensiones de poro de precisión y distribución uniforme. La microfiltración con CellSieve™ de 7,5 ml de sangre periférica completa se realiza a baja presión sin dañar a las células, lo que permite la identificación histológica de la morfología celular. Esta célula gigante se define como una célula circulante similar a macrófago asociada a cáncer" (CAML, Cáncer Associated Macrophage-Like), ya que exhibe una expresión de CD14 +, vacuolas de material fagocitado y se encuentra exclusivamente en pacientes con cáncer (figuras 3-7 y tabla 1). Se propone que esta población celular, que no se encuentra en individuos sanos, podría servir como un contundente biomarcador celular de una respuesta inmunitaria innata previamente indefinida a la agresividad del cáncer, y para controlar respuestas inducidas por la quimioterapia y la radioterapia. Las observaciones de estas células gigantes que interaccionan con las CTC en circulación confirman la evidencia de que la respuesta inmunitaria innata del paciente tiene un efecto observable en la migración de las CTC. Los marcadores TIE-2 positivos expresados por estos macrófagos sugieren un papel de CAML como iniciadores celulares de la neovascularización dentro de las metástasis tumorales. Se han descubierto evidencia de apoyo in vivo que CAML puede jugar un papel asociado en la migración de CTC en circulación. y controlar las respuestas inducidas por la quimioterapia y la radioterapia. Las observaciones de estas células gigantes que interactúan con los CTC en circulación confirman la evidencia de que la respuesta inmune innata del paciente tiene un efecto observable en la migración de los CTC. Los marcadores TIE-2 positivos expresados por estos macrófagos sugieren un papel de CAML como iniciadores celulares de la neovascularización dentro de las metástasis tumorales. Se han descubierto pruebas de confirmación in vivo de las CAML puede jugar un papel asociado a la migración de las CTC en circulación.
Los macrófagos fusionados gigantes son una célula poco conocida que se encuentra en una multitud de tejidos. Son híbridos de células multinucleadas que se originan de linaje mieloide implicado en numerosos procesos fisiológicos y patológicos, que incluyen fagocitosis de tejido extraño y necrótico, reabsorción e inflamación tisular. Se descubre que las CAML son células gigantes que presentan núcleos agrandados, CD45+ y muestran características de tinción citoplasmática difusa de células epiteliales: citoqueratina 8, 18, 19 y moléculas de adhesión a células epiteliales (EpCAM) (Figuras 3-8). En las CAMl se pueden encontrar múltiples núcleos individuales, aunque son habituales los nucléolos fusionados grandes (de 14-64 pm de diámetro) (Figuras 3-8). El citoplasma de CAML, definido por un borde de citoqueratina, tiene una longitud que varía de 21-300 pm y en el filtro se encuentra con cinco fenotipos morfológicos distintos (forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga o amorfa) (Figuras 3-8).
Aunque la identificación de estas células es sencilla debido a su tamaño extremo, gran perfil nuclear y firma citoplasmática, tienen fenotipos muy heterogéneos. La expresión de citoqueratina, EpCAM y CD45 varía desde ausencia de expresión a expresión muy intensa (Figuras 8A-8H). Esta heterogeneidad se muestra también en las cinco estructuras celulares, en los intervalos de tamaño y en los diversos perfiles nucleares (Figuras 8A-8H). La alta heterogeneidad de expresión de los marcadores implica que las CAML representan estadios diferentes a lo largo de las rutas de diferenciación o que son el producto de una fagocitosis celular inespecífica con diferentes tipos de células. Esto no es sorprendente ya que los macrófagos son un tipo de células muy plásticas capaces de diferenciarse en numerosos fenotipos celulares.
El reconociendo de que las CAML podrían servir como un indicador de pronóstico independiente de la progresión del cáncer, similar a la enumeración de CTC, se comparó el número de CAML y CTC utilizando el ensayo de microfiltración a baja presión CellSieve™ (Creatv MicroTech, Inc) y la prueba de células tumorales circulantes con CellSearch® (Veridex, LLC). Ha sido un reto aislar las CTC debido a su rareza y aparición limitada (10-50 %) en pacientes con cáncer con enfermedad metastásica. La enumeración y el fenotipado del MAT podrían tener utilidad pronóstica, pero actualmente carece de pruebas secuenciales, rastreando la progresión primaria a metastásica, ya que esto requeriría numerosas biopsias invasivas de tumores. La enumeración de las CTC enriquecidas mediante los sistemas CellSearch® y CellSieve™ se compararon directamente con la enumeración de las CAML aisladas mediante CellSieve™ utilizando sangre de 29 pacientes con cáncer (Figura 10). Mientras que CellSearch® utiliza anticuerpos EpCAM para enriquecer las CTC, CellSieve™ utiliza exclusión por tamaño. Ambas tecnologías
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identifican fenotípicamente las CTC utilizando un panel de anticuerpos anti citoqueratina 8, 18 y 19, tinción nuclear DAPI y ausencia de anti CD45. Empleando un recuento de CTC de > 1, la sensibilidad del sistema CellSieve ™ fue del 72 % [21 de 29 pacientes; mama = 15/21 (71 %), próstata = 6/8 (75 %)], mientras que la del sistema CellSearch® fue del 58% [15 de 29 pacientes; mama = 9/21 (43 %), próstata = 6/8 (75 %)]. La captura de CAML fue positiva en el 97 % (28 de 29) de las muestras analizadas (Figura 10). Curiosamente, la única muestra CAML negativa fue un paciente con cáncer de mama tratado con bisfosfonatos, una clase de fármacos que inhiben la formación de osteoclastos, una célula mieloide gigante del hueso compuesta por células fusionadas. Por lo tanto, como la especificidad de las CAML es del 100 % para las muestras analizadas, la presencia de CAML puede proporcionar un método para pruebas secuenciales no invasivas para su uso como un indicador pronóstico de enfermedad metastásica para una amplia gama de pacientes con cáncer.
Para evaluar la sensibilidad y especificidad de las CAML para su aplicabilidad como una indicación pronóstica de enfermedad metastásica, se examinaron muestras de pacientes con cáncer en estadio temprano a tardío y de sujetos sanos. Las muestras de 76 pacientes se procesaron en microfiltros CellSieve™. La distribución de los estadios incluyó, estadio I (n = 8), estadio II (n = 9), estadio III (n = 13), estadio IV (n = 24), estadio desconocido (n = 22) en tres tipos de cáncer: mama (n = 29), pancreático (n = 27) y próstata (n = 20) (Tabla SI). Se incluyeron pacientes recién diagnosticados y no tratados (n = 36), así como pacientes sometidos a terapias no quirúrgicas (n = 40) (Tabla 1). El estudio incluyó sujetos sanos (n = 30), incluidos dos con enfermedad benigna, un fibroadenoma y un carcinoma de células basales. En este grupo de control no se encontraron CAML (Tabla 1). Se encontraron CAML en el 97 % (36 de 37) de los pacientes con cáncer en estadio III/IV, en el 77 % (13 de 17) en estadio I/II y en el 93 % (71 de 76) de todos los pacientes independientemente del tipo de cáncer (Figura 11). Se encontraron CAML en el 85 % (próstata) (figura 12), 93 % (pancreático) (figura 13) y 97 % (mama) (figura 14) de los pacientes. En muestras de cáncer de próstata las CAML fueron ligeramente inferiores en número, posiblemente debido al hecho de que 6 de 20 pacientes con cáncer de próstata estaban en estadio I. Aunque el análisis de CTC en microfiltros proporcionó una positividad global de 54 % en todos los pacientes evaluados, las CAML proporcionaron 93 % de sensibilidad en toda la misma cohorte (Figuras 12-14 y Tabla 1). Aunque se deben evaluar más estudios de pacientes con diversas dolencias, estos hallazgos demuestran que la presencia de CMAL podría proporcionar una evaluación contundente y ampliamente aplicable del estado del cáncer.

Claims (20)

  1. 5
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    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un método de exploración de cáncer en un sujeto, que comprende detectar, en una muestra de sangre de un sujeto, células circulantes similares a macrófagos asociadas a cáncer (CAML),
    en donde dicha célula CAML tiene las siguientes características:
    (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 pm;
    (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros; y
    (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde cuando en la muestra de sangre se detectan las CAML, el sujeto se identifica como que posiblemente tiene un carcinoma o un tumor sólido.
  3. 3. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, que adicionalmente comprende detectar células tumorales circulantes (CTC) en la muestra de sangre.
  4. 4. Un método para diagnosticar cáncer en un sujeto, que comprende detectar las CAML en una muestra de sangre de un sujeto, en donde cuando en la muestra de sangre se detectan las CAML, al sujeto se le diagnostica cáncer, y donde dicha célula CAML tiene las siguientes características:
    (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 pm;
    (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros; y
    (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa.
  5. 5. Un método para detectar la recurrencia del cáncer en un sujeto, que comprende detectar las CAML en una muestra de sangre de un sujeto previamente tratado por cáncer, en donde cuando en la muestra de sangre se detectan las CAML, se detecta la recurrencia del cáncer, y donde dicha célula CAML tiene las siguientes características:
    (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 pm;
    (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros; y
    (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa.
  6. 6. Un método para confirmar un diagnóstico de cáncer en un sujeto, que comprende detectar las CAML en una muestra de sangre de un sujeto diagnosticado con cáncer, en donde cuando en la muestra de sangre se detectan las CAML, se confirma un diagnóstico de cáncer en el sujeto, y donde dicha célula CAML tiene las siguientes características:
    (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 pm;
    (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros; y
    (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa.
  7. 7. El método de la reivindicación 4, de la reivindicación 5 o de la reivindicación 6, que adicionalmente comprende detectar las CTC en la muestra de sangre, en donde cuando en la muestra de sangre se detectan las CAML y las CTC, al sujeto se le diagnostica cáncer, o se detecta recurrencia de cáncer, o se confirma un diagnóstico de cáncer en el sujeto.
  8. 8. El método de la reivindicación 6 o 7, en donde el diagnóstico inicial de cáncer fue mediante mamografía, prueba de PSA, o presencia de CA125.
  9. 9. El método de la reivindicación 1 o 4, en donde el sujeto es un sujeto que se sospecha que tiene cáncer.
  10. 10. Un método para controlar la eficacia de un tratamiento del cáncer, que comprende (a) determinar el número de CAML en una muestra de sangre de un sujeto antes del tratamiento del cáncer, y (b) comparar el número de CAML determinado en (a) con un número de CAML determinado a partir de una muestra de sangre similar del mismo sujeto en uno o más puntos temporales después del tratamiento, comprendiendo además opcionalmente dicho método (c) determinar el número de CTC en la muestra biológica (a), y (d) comparar el número de CTC determinado en (c) con un número de CTC determinado a partir de la muestra de sangre de (b), y donde dicha célula CAML tiene las siguientes características:
    (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 pm;
    5
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    (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros; y
    (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa.
  11. 11. El método de la reivindicación 10, donde un cambio en la forma de un aumento o una disminución en el número de CAML es una indicación de eficacia del tratamiento, donde preferentemente el tratamiento del cáncer es quimioterapia o radioterapia.
  12. 12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde dicha célula CAML tiene expresión del marcador monocítico CD14.
  13. 13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde dicha célula CAML tiene una o más o cada una de las siguientes características adicionales:
    (d) expresión de una o más de citoqueratina 8, 18 y 19, donde la citoqueratina se difunde, o se asocia con vacuolas y/o material ingerido; y/u
    opcionalmente, donde la célula tiene una o más o cada una de las siguientes características adicionales:
    (e) fenotipo CD45 positivo;
    (f) expresión de EpCAM difusa con distribución casi uniforme;
    (g) expresión de uno o más marcadores de un tumor primario;
    (h) expresión de marcadores monocíticos CD11C y CD14; e
    (i) expresión de marcadores endoteliales CD146, CD202b y CD31.
  14. 14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde las CAML se detectan utilizando uno o más medios seleccionados del grupo que consiste en metodología de exclusión por tamaño, lisis de glóbulos rojos, FICOLL, una microplaca microfluídica y citometría de flujo, o una combinación de los mismos, preferentemente en donde la metodología de exclusión por tamaño comprende el uso de un microfiltro;
    o preferentemente en donde las CAML se detectan utilizando una microplaca microfluídica que se basa en la separación física en función del tamaño, separación hidrodinámica en función del tamaño, agrupación, atrapamiento, inmunocaptura, concentración de células grandes, o eliminación de células pequeñas en función del tamaño; o en donde las CAML se detectan utilizando un ensayo de microfiltración a baja presión CellSieve™.
  15. 15. El método de la reivindicación 3 o reivindicación 7 o reivindicación 10, donde las CAML y las CTC se detectan simultáneamente utilizando un microfiltro que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 7-8 micrómetros, preferentemente donde el microfiltro tiene geometría de poros de precisión y distribución de poros uniforme.
  16. 16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde la muestra de sangre es sangre periférica.
  17. 17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en un tumor sólido, cáncer en estadio I, cáncer en estadio II, cáncer en estadio III, cáncer en estadio IV, cáncer de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer pancreático y cáncer colorrectal.
  18. 18. Una célula circulante similar a macrófago asociada a cáncer (CAML) aislada, donde la célula tiene las siguientes características:
    (a) un núcleo atípico grande que tiene un tamaño de aproximadamente 14-64 pm;
    (b) un tamaño de célula que varía de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros; y
    (c) una forma morfológica seleccionada del grupo que consiste en una forma de huso, de renacuajo, redonda, oblonga y amorfa.
  19. 19. La célula aislada de la reivindicación 18, en donde la célula tiene una expresión de marcador monocítico CD14.
  20. 20. La célula aislada de la reivindicación 18 o de la reivindicación 19, en donde la célula tiene una o más o cada una de las siguientes características adicionales:
    (d) expresión de una o más de citoqueratina 8, 18 y 19, en donde la citoqueratina se difunde, o se asocia con vacuolas y/o material ingerido; y/u
    opcionalmente, en donde la célula tiene una o más o cada una de las siguientes características adicionales
    (e) fenotipo CD45 positivo;
    (f) expresión de EpCAM difusa con distribución casi uniforme;
    (g) expresión de uno o más marcadores de un tumor primario;
    (h) expresión de marcadores monocíticos CD11C y CD14; e
    (i) expresión de marcadores endoteliales CD146, CD202b y CD31. 5
    imagen1
    FIG. 1
    4--------—-----------►
    30 (jrn
    Fusionada DAPI CQ 8. 18, 19 EpCAM
    CD45
    30 pm
    CQ 8 18. 19
    Fusionada
    DAPI
    EpCAM
    CD45
    imagen2
    FIG. 2
    30 |jm
    CQ 8. 18. 19
    Fusionada
    DAPI
    EpCAM
    CD45
    Fusionada
    CQ 8. 18, 19
    CD46
    DAP
    EpCAM
    imagen3
    imagen4
    imagen5
    imagen6
    imagen7
    imagen8
    imagen9
    imagen10
    Longitud (|im)
    imagen11
    Porcentaje de muestras positivas de los pacientes
    imagen12
    Número de células CAML por 7,5 mi de sangre
    imagen13
    kWWWWWW^WWXWWWI
    imagen14
    Número de células CTC y CAML
    imagen15
    Número de células CTC y CAML
    imagen16
    1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 121314 15161718 19 2021 22 23 24 2526 272829
    ID de paciente
    FIG. 14
    Número de células CAML por 7,5 mi de sangre
    □ Mama
    ffl Pancreático
    ^ Próstata
    imagen17
    i
    5
    9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 45 53 57 61
    Estadio I Estadio II
    65 69 73 77 SI Estadio lli
    85 89 93
    97 101 105 109 113 117 121 Estadio IV
    FIG. 15
    Número de células CTC Número de células CAML
    Cáncer de próstata
    imagen18
    ID de paciente
    FIG. 16A
    Cáncer de próstata
    imagen19
    ID de paciente
    FIG. 16B
    Número de células CTC Número de células CAML
    Cáncer pancreático
    imagen20
    FIG. 17A
    Cáncer pancreático
    80
    70
    60
    50
    40
    30
    20
    10
    0
    @ Células CTC
    I
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    1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76
    ID de paciente
    FIG. 17B
    Número de células CTC Número de células CAML
    Cáncer de mama
    imagen21
    ID de paciente
    FIG. 18A
    imagen22
    Número de células CTC y CAML
    Cáncer de pulmón
    imagen23
    1 2 3 4 5 6 7 8
    ID de paciente
    FIG. 19
    Cáncer de colon
    imagen24
    12 3 4
    ID de paciente
    FIG. 20
    imagen25
    imagen26
    imagen27
    imagen28
    FIG. 24B
    + Quimioterapia/
    radioterapia
    O Hormonoterapia
    A Sin tratamiento
    FIG. 24A
    ♦ Quimioterapia
    65 1
    'SSin tratamiento
    55 i
    imagen29
    imagen30
    Fusionada
    DAPI
    CD11
    CD14
    TIE
    30 um
    DAPI
    C011c
    Fusionada
    CD14
    CD 46
    I
    44 um
    80 um
    FIG. 26
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