CN103168234A - 用于分析被5，10，15，20四(4-羧基苯基)卟吩(tcpp)标记的样品的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的一个实施方案提供一种通过获得含有细胞的痰样品来确定痰样品是否含有发育异常的或癌性的细胞的方法。用TCPP标记所述痰样品，以将疑似为发育异常的或癌性的细胞染色。用约475nm+/-30nm的激发波长的光激发所述标记的痰样品，并检测来自被鉴定为巨噬细胞的细胞的、在约560nm+/-30nm的发射。将成像仪聚焦于一个或多个疑似为发育异常的或癌性的细胞的质膜上，并在聚焦于痰样品的细胞的质膜以后，检测所述痰样品的TCPP标记的细胞在约655nm+/-30nm的发射(如果存在的话)。测量传感器的每个像素的光子通量，以获得成像的细胞的值。将测得的值评分，以确定细胞是否是癌性的或发育异常的。

Description

用于分析被5,10,15,20四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)标记的样品的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年7月17日提交的标题为“System and Method forAnalyzing Samples Labeled with5，10，15，20，Tetrakis(4-Carboxyphenyl)Porphine(TCPP)(用于分析被5，10，15，20，四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)标记的样品的系统和方法)”的美国临时专利申请系列号61/226,646d的申请的优先权和权益，其说明书和权利要求书通过引用结合于此。
关于联邦资助的研究或开发的声明
不适用。
通过引用在光盘上呈送的材料的并入
不适用。
版权材料
不适用。
背景技术
研究疾病进展并分析组织样品的异常(包括癌症在内)的病理学家已经确定，一种被称为发育异常(dysplasia)的细胞状态可以潜在地鉴定处于癌前状态的细胞，所述发育异常是指细胞的异常形成或成熟。不被制止，发育异常可经由轻微的、中度的和严重的阶段进展，最后进展为癌症。中等发育异常的病例中大约有七分之一会进展为癌症，已经报道在严重发育异常的病例中多至83％会进展为癌症，取决于涉及的细胞的种类。但是，除去轻微和中度的发育异常可极大地减少癌症的发展。在肺中，发育异常的细胞的除去不但极大地减少了癌细胞的形成，而且在有些情况下，肺组织会恢复至正常的形态。
一般而言，越早地检测到癌症，患者存活的预后越好。如果乳腺癌在其仍局限于单一团块时被及早发现，五年存活率大于96％。当其已经扩散至远端区域时，五年存活率小于20％。对于肺癌，当其作为单一团块被发现时，五年存活大于46％。当其已经扩散时，五年存活小于14％。对于子宫颈癌，当在发展至更严重阶段之前发现癌前病变并予以治疗时，可实现存活的额外提高(Boring和Squires1993，CA Cancer J Clin43：7-26和Ferguson1990，Hematol Oncol Clin N Am4：1053-1168)。
肺癌目前是美国男性和女性的癌症死亡的首要原因(Wingo等人.1995，CA Clinical J Clin45.8-30)。在1997年，估计有160,000人死于肺癌，占美国男性总的癌症死亡的12％，占美国女性癌症死亡总人数的2％(Boring&Squires1993，出处同上)。肺癌也是最致命的癌症种类之一，正如五年存活率只有14％所反映的。与其他人癌症种类相比，肺癌患者的不良预后在很大程度上归因于缺乏有效的早期检测方法。在临床(症状的)呈现时期，所有患者中超过三分之二具有区域性结节累及或远端转移瘤(metastases)，这二者通常是无法治愈的。但是，在具有局限性(0期或1期)肺癌的患者的研究中，五年存活率已经介于40％至70％之间(Boring&Squires，1993，出处同上；Ferguson，1990，出处同上)。
在历史上，唯一用来在症状出现前检测肺癌的诊断试验是痰细胞学(sputum cytology)和胸部放射摄影术。结果，在过去几十年的研究中，已经广泛地评估了这些试验作为大规模筛选工具的效力。两种试验检测症状发生前的早期癌症，尤其是扁平细胞癌。
筛选方法的改进主要围绕通过显微术的技术进展来提高痰细胞学的效用。痰细胞学要求对细胞样品进行目检，在目检期间，用细胞大小、形状、构造以及细胞核与细胞质的大小比率来确定细胞的形态。因为这种细胞形态学的评估要求目检和分类，所以该技术要求临床观测者具有极其大量的专业技术。已经进行的多项研究的结果提示，计算机辅助的高分辨率图像分析能够检测出与若干组织类型有关联的看似正常的细胞核中无法目测的(subvisual)变化(Montag等人.1991，Anal Quant Cytol Histol13：159-167；Haroske等人.1988，Arch Geschwulstforsch，58：159-168；Hutchinson等人.1992，Anal Quant Cytol Estol4：330-334)。对细胞样品中的DNA分布进行计算机辅助分析，会提供74％正确的细胞核形态学分类，与标准的细胞学试验相比，该方法无需人工检查材料，也无需存在可目测的异常细胞核。
由于对肺肿瘤病理学理解的进展，也已经改善了细胞学样本的形态学评估。许多这样的工作已经集中在“生物标志物”的鉴别。生物标志物是指呼吸道粘膜的大范围进行性表型和遗传异常，其可用于确定支气管上皮完全地转变为恶性肿瘤的潜力。标志物被大致分为：形态学改变、差异表达的蛋白的免疫/组织化学标志物、基因组不稳定性的标志物、表观遗传改变(例如，异常的甲基化)的标志物和基因突变(Hirsh等人.1997，Lung Cancer17：163-174)。
现在，在从高危群体采集到的发育异常的和赘生性(neoplastic)细胞/组织学组织样品中评价这些标志物的表达水平。在这些样本中，目前作为探测性标志物分析的对象的是痰。对于痰样品用于生物标志物研究的兴趣源自长期持有的观点：由于肺癌最常见地发生于支气管上皮，因而在痰中回收的脱落细胞可以是初期癌症的最早的可能的指示。通过应用复杂的分子遗传学技术(例如，基于PCR的测定)，研究正在证实可在痰中检测出选定的生物标志物(Mao等人.1994，Cancer Res54：1634-1637；Mao等人.1994，Proc Natl Acad Sci USA91：9871-9875；Sidransky1995，J Natl Cancer Inst87：1201-1202；Tockman等人.1988，J Clin Oncol，11：1685-1693；Tockman等人.1994，Chest，106：385s-390s)。
商购可得的癌症筛选或检测服务依赖于经过培训的临床医师进行的基于细胞形态学诊断的试验，所述医师观察各个样品并确定异常细胞类型的程度和身份。该过程不仅昂贵和费时，它也引入人为判断，并因此在操作中引入误差。近年来，已经开发出了一种通过使用5，10，15，20-四(羧基苯基)-卟吩(TCPP)来检测肺癌细胞的方法(Cole等人的美国专利号5，162,231)。该方法依赖于癌细胞与非癌细胞相比以更大的量从它们的环境中累积TCPP的倾向。在用200μg/ml TCPP温育细胞样品6-24小时后，TCPP进入细胞内，并与赘生性细胞的核周膜及线粒体结合。TCPP在紫外线下会发荧光，因此单独凭借荧光强度即可诊断出癌细胞，而无需参考形态学。该化合物用于鉴定癌前组织状态(例如发育异常的细胞)的应用延伸，允许在高危群体中筛选以鉴别出其组织正向侵入性癌病症进展的那些个体，从而促进在最佳治疗时期发现癌症或发育异常。这种筛选方法的合乎需要的特点是：快速的过程、廉价和需要最低的技术性专门技能。
由于上述原因，需要用于检测处于其最早阶段的发育异常细胞的技术和方法。另外，需要可客观地提供高度可靠的诊断结果的技术，并且该技术不依赖于进行诊断的临床医师的主观分析。
发明内容
本发明的一个实施方案提供一种通过获得含有细胞的痰样品来确定痰样品是否含有发育异常的或癌性的细胞的方法。用TCPP标记所述痰样品，以将疑似为发育异常的或癌性的细胞染色。将成像仪聚焦于一个或多个疑似为发育异常的或癌性的细胞的质膜上，并在聚焦于痰样品的细胞的质膜上以后，检测所述痰样品的TCPP标记的细胞在约655nm+/-30nm的发射(如果存在的话)。测量传感器的每个像素的光子通量，以获得成像的细胞的值。将测得的值评分，以确定细胞是否是癌性的或发育异常的。
另一个实施方案提供一种通过获得疑似含有发育异常的或癌性的细胞的生物样品来确定细胞的生物样品是否含有发育异常的或癌性的细胞的方法。所述生物样品被TCPP标记。用约475nm+/-30nm的激发波长的光激发所述样品。将成像仪聚焦于疑似含有发育异常的或癌性的细胞的一个或多个细胞的质膜(plasma member)上，以获得图像。在聚焦于疑似含有发育异常的或癌性的细胞的生物样品的一个或多个细胞的质膜上以后，检测来自TCPP标记的细胞的在约655nm+/-30nm的发射(如果存在的话)。测量传感器的每个像素的光子通量，以获得成像的细胞的值。将测得的值评分，以确定细胞是否是癌性的或发育异常的。
另一个实施方案提供一种用于使计算机能够表征痰样品的计算机可读介质，所述计算机可读介质包含用于使计算机能够执行预定操作的软件指令或代码。所述预定操作步骤包括：用约475nm+/-30nm的激发波长的光激发用TCPP标记的痰样品；在所述标记的痰样品内检测来自被鉴别为巨噬细胞的细胞的、在约560nm+/-30nm的发射；将成像仪聚焦于疑似为发育异常的或癌性的一个或多个细胞的质膜上；在聚焦于痰样品的细胞的质膜以后，检测所述痰样品的TCPP标记的细胞在约655nm+/-30nm处的发射(如果存在的话)；测量传感器的每个像素的光子通量，以获得成像的细胞的测量值；和将测得的值评分，以确定细胞是否是癌性的或发育异常的。
在一个优选的实施方案中，所述TCPP是中-四(4-羧基苯基)卟吩。在另一个实施方案中，所述激发波长是约475nm+/-5nm。在另一个实施方案中，巨噬细胞的发射是约560nm+/-5nm。在另一个实施方案中，所述成像仪是荧光显微镜。在另一个实施方案中，TCPP标记的细胞的发射是约655nm+/-5nm。在另一个实施方案中，所述传感器是CCD照相机。在另一个实施方案中，所述评分还包括：将测得的值与癌性的、发育异常的和非癌性的细胞的储存值的数据库进行对比，以基于对比结果来指定评分。在另一个实施方案中，所述痰样品来自人。
本发明的一个方面提供用中-四(4-羧基苯基)卟吩或5，10，15，20四(4-羧基苯基)卟吩(在本文中定义为“TCPP”)标记生物样品以用于检测癌性的和癌前细胞。
本发明的另一个方面提供使用TCPP来检测痰中的癌细胞，因为TCPP优先结合癌性的和癌前细胞。
本发明的另一个方面提供一种系统和方法，其用于光学地验证和定量TCPP的光谱特征(spectral signature)，和/或定量TCPP在用作标记化合物时的光子发射速率。
本发明的另一个方面提供使用配有可调节的滤波器和电荷耦合器件(CCD)的荧光系统分析TCPP标记的样品。
结合附图，在以下的详细描述阅读中，本发明的其他目的和优点将是明显的。
附图简述
本专利的文件含有至少一幅彩色绘制的图。在请求并支付必要的费用后，含有彩图的该专利的复制件将由专利和商标局(Patent and TrademarkOffice)提供。
图1显示用TCPP标记的细胞的重建的21层图像。
图2显示TCPP标记的质膜的荧光光谱(未校正的单元)。
图3显示具有用红色标记的目标区域的细胞的荧光图像。
图4显示来自图1的光谱特征的图。
图5显示来自图6的蓝色突出显示区域的自身荧光的光谱特征的图。
图6显示对其进行自身荧光成像且用TCPP标记的细胞。
图7显示来自图6的蓝色突出显示区域的TCPP标记的细胞膜的图。
图8显示在660nm聚焦的530nm层。
图9显示在660nm聚焦的660nm层。
发明详述
当在本文中使用时，“一个(种)”表示一个(种)或多个(种)。
当在本文中使用时，“CCD”是指电荷耦合器件。
当在本文中使用时，样品“生物样品”或“样品”或“样本”是指整个生物体或其组织、细胞或组件部分(体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、痰、血浆、精液、乳腺导管液、脑脊液、尿和排泄的粪便)的子集。
根据本发明的一个实施方案，提供一种系统和方法，所述系统和方法用于确定：相对于来自非癌细胞的TCPP的光子发射量，与被认为是癌性的目标细胞结合的TCPP的光子发射量。由于我们是在确定相对的荧光量，并且所有细胞是在相同的环境中，所以我们不受限于各个荧光团的实际量子产率。本发明的一个实施方案提供用等式1(Eq.1)确定来自样本的光子发射。
Φ R = Λ TCPPpos Λ TCPPneg Eq . 1
其中ΛTCPP pos是癌细胞的发射的光子数/秒光子通量/单位面积的细胞膜，ΛTCPP neg是正常细胞的发射的光子数/秒/单位面积。
根据本发明的一个实施方案，TCPP优先附着细胞的质膜，甚至更优先附着癌细胞。与非癌细胞相比，TCPP优先结合癌细胞或癌前细胞。已经观察到，癌细胞在它们的质膜上具有异常高浓度的低密度脂蛋白，由此在下述波长产生来自TCPP的可量化的更高的荧光发射：约200-900nm、优选约420-720nm、更优选约600-700nm、更优选约655nm+/-30nm。标记有TCPP的细胞相对于没有TCPP标记的那些细胞的光谱特征的差异，具有在420nm-720nm区域之间的显著光谱峰。另外，所述系统内的滤波器(filter)例如液晶可调谐滤波器(LCTF)不仅有助于关于细胞结构的TCPP结合和/或集中的位置的展示，而且还允许相对于来自所述细胞的其余荧光信号或并非由TCPP产生的其他信号来定量参照区中的光子发射。
图像捕获装置
本发明的一个实施方案提供一种传感器，例如，电荷耦合器件“CCD”传感器，例如CCD照相机(但不限于此)，以捕获TCPP染色的样本的图像。在一个实施方案中，CCD是由在硅衬底上生成的掺杂硅的外延层制成的半导体器件。通过建立与移位寄存器相连的分离的像素，可以电子地存储聚焦在这些像素的二维阵列上的图像。可以通过其尺寸和它可以保留的电子数目来描述像素。就本文中的一种用途而言，使用CCD传感器来确定撞击阵列中的特定像素的光子数。这通过以下方式实现：测量在给定的时间内跨每个像素的电容接合点(capacitive junction)形成的电压。造成电势差的电荷与机械地撞击每个像素量子的光子数目直接相关。就被掺杂硅吸收的每个光子而言，特定数目的电子被释放，并被激发至半导体的价级(valencelevel)中。通过与特定CCD传感器相关的量子效率曲线来表示CCD传感器的量子效率。
CCD传感器通过以下方式实现光子数目的测量：记录如通过移位寄存器的连续输出读取的跨各个像素接合点(junction)形成的电压，其基本上是一系列二进制编码的十六进制值，其按照移位寄存器输出像素电压的次序来排序。由于这些值中的每一个与在一段时间内撞击每个像素的光子数目直接成比例，所以这些值可以与光子源的光子发射通量相关联。
通过分离由细胞的特定结构或与细胞或其部分结合的探针或标记化合物如TCPP发射的发射光子的特定波长，可以收集关于细胞结构的组成的非常量的信息。例如，如果正常的自身荧光产生在560nm范围内，并且某种缺陷结构在590nm范围内发荧光，那么可以通过滤出除590nm波长以外的所有波长，然后使用选定的波长输出在CCD传感器上建立图像来观察所述缺陷结构的大小、形状和其他方面。然后可以如下确定每单位时间每单位面积的细胞结构的光子的实际数目：测量每个像素每单位时间形成的电压，并将该值与光学系统的放大率和个体组件的衰减相关联。
卟啉荧光基础
卟啉是由通过4个甲烷桥连接的4个吡咯(pyrole)环组成的平面芳族大分子。它们是在植物、血红蛋白中发现的天然存在的化合物，且具有众多形式。当在本文中使用时，卟啉是探针或标记化合物。
当用正确波长的光照射时，大多数蛋白质会产生具有在约490nm至600nm范围内的波长的荧光光子。但是，卟啉具有非常不同的吸收和发射光谱。
通过用卟啉(例如TCPP)标记细胞，荧光显微术会实现被所述标记化合物突出显示的细胞结构的成像(参见图1)。定制标记化合物以连接到细胞中的特定靶标，会提供突出显示特定细胞结构的能力。现在参考图1，当用约465nm+/-30nm的激发波长照射细胞时，细胞内的结构表现出在绿波长中的自身荧光，而质膜发出在红波长中的荧光。图4显示从图1中的图像的光谱扫描得到的光谱图。
根据本发明的一个实施方案，在图2中显示这样的图，该图例示来自生物样本的细胞的TCPP标记的质膜的荧光光谱。
实验方案
根据本发明的一个实施方案，使用液基薄层涂片(thin prep)实验方案将生物样本(例如痰样品)处理到显微镜载玻片上。在基于甲醇的溶液中固定痰样品，所述溶液已经被证实对来自目标细胞群的细胞的质膜具有较少的腐蚀性。使对质膜的腐蚀效应最小是重要的，因为据显示TCPP定位在细胞表面的质膜上。处理细胞，以使所述细胞与粘液和细胞碎片分离。每个制备的载玻片含有单层的痰细胞。在制备载玻片以后，以0.05ug/ml-4.0ug/ml的浓度，将标记试剂TCPP溶解在含有50％至90％异丙醇醇溶液的醇水溶液中。用碳酸氢钠调节pH至6.0-10.5的pH。将载玻片浸入TCPP标记溶液中，冲洗，风干，并将盖玻片放在上面(参见例如Garwin的美国专利号7,670,799)。
成像仪
根据本发明的一个实施方案的系统使用成像仪，诸如观察仪器，例如，显微镜，优选荧光显微镜。
激发源
根据本发明的一个实施方案的系统还使用光源，例如，汞汽灯或优选地可调节至用户指定的波长的激光。
光学器件
具有蓝色可见频率陷波滤波器的荧光光学立方体(optics cube)。在一个优选的实施方案中，来自样本平台(例如，载玻片)上的样品的荧光然后穿过分光镜到达显微镜物镜，并到达CCD照相机。此外，所述系统也可以包含处理器、数据库和计算机可读指令，用于从图像获得评分并基于所述评分产生报告。
TCPP具有在400nm附近的显著的摩尔吸光系数，称作索雷谱带(Soretband)。尽管在该区域中是非常有效的，但还是会发生光漂白。因此，可以选择TCPP的吸收不是如此有效的光谱区域，由此消除大部分光漂白并延长样品可及的荧光寿命。
在一个实施方案中，在蓝色光谱475nm+/-30nm中的区域是选择的激发波长。使用以约475nm为中心的带通滤波器。荧光光学立方体还包含二色分光镜，其具有在500nm以上可见光中的相当一致的(flat)光透射频率响应，以及在以400nm附近为中心的峰下面的第二个显著透射峰，从而允许正好穿过激发滤波器的对应于索雷谱带的任何光通过且不被反射至样品。
图像捕获和获得图像的方法
根据本发明的一个实施方案，为了收集我们的数据，采用具有检测器的图像捕获系统，所述检测器能够定量来自TCPP标记的细胞的、在约350nm至约800nm的光谱内的光子发射。所述系统包括成像仪作为观察仪器，例如显微镜，更优选荧光显微镜。图像传感器和捕获装置，将所述图像传感器和捕获装置自动化以用于数据获取，以优化图像的发射捕获。图像捕获装置可以直接连接至成像仪如荧光显微镜。滤波器(例如但不限于液晶可调谐滤波器(LCTF))允许从不同的光频捕获图像并测量在那些不同频率的发射。然而，可以使用其他滤波器(定制的或成品的)，且可以使用其他过滤技术，而不限于LCTF。另外，光源(例如汞汽灯或更优选可调节至用户指定的波长的激光)可用于照射样本。在一个实施例中，在根据本发明的一个实施方案的系统中使用具有发光效能30lm/W、光通量3000h、发光强度300cd、亮度17000cd/cm2和已知光谱特征的汞汽灯。
现在参考图1，根据本发明的一个实施方案用TCPP标记和染色的细胞。从在用户限定的光谱上在指定波长获得的多个图像重建图像，并将得到的图像重组。例如，从用TCPP标记的细胞获得21层的图像，其中每层在不同的波长获得。在绿通道560+/-30nm中检测细胞的自身荧光，并在红通道660+/-30nm中检测所述细胞上的TCPP标记化合物的荧光。本发明的系统和方法的一个实施方案提供分离用于细胞成像的特定频率和通过调节LCTF测量频率。通过在成像过程中将LCTF调至不同的频率，所述系统允许在宽的光谱上收集并分析信息。然后，在捕获特定波长范围的每个图像以后，可以提取具体的目标光谱。显示了具有光谱增强以突出显示来自图像的特定特征的图像。然后，测量灰度图像，其中LCTF被调节至适当频率，参见例如图3。从图像中的特定细胞结构测量光子通量(参见例如红色圆圈，其中靶心(bulls-eye)位于目标区域上)。然后确定相对阈值发射值，其用于确定细胞是否是癌性的。这也允许分离不同细胞结构的发射，并定量发射以产生值。另外，来自图像和或目标细胞的一个或多个下述特征也可以用于评分：ROI数、立方体(Cube)ID、平均信号(计数)、平均信号(标定的(scaled)计数/s)、平均信号(x10^6光子/cm2/s)、平均信号(OD)、标准偏差计数、标准偏差标定计数、标准偏差(x10^6光子/cm2/s)、标准偏差(OD)、总信号计数、总信号标定的计数(x10^6光子/cm2/s)、总信号(OD)、最大信号计数、最大信号标定的计数、最大信号(x10^6光子/cm2/s)、最大信号(OD)、面积像素、面积(um)2、长轴、短轴、x位置、y位置、光谱ID、立方体时间戳(Cube Time Stamp)、立方体(Cube)、可见荧光、细胞形态学(大小、形状，不限于种类、特征)、光谱特征(TCPP)、背景荧光、信号/背景比率、标准偏差、信号/背景比率、荧光(自身、TCPP))、捕获图像立方体(Cube)窄带宽、捕获图像立方体(Cube)完整光谱。
在本发明的一个实施方案中，将通过评分产生的值与癌细胞或非癌细胞相关联，以确定患者的健康。
所述系统允许基于特定波长来分离图像以及选择所述图像中的特定区域，以便测量得自CCD传感器的信号，然后输出光谱数据用于分析。
数据：TCPP的光谱特征
现在参考图6，该图像来自肺痰样品，所述肺痰样品根据上述操作放置在显微镜载玻片上。用来自汞汽源的、具有约475nm波长的光照射所述载玻片，所述光经过带通滤波器(具有大约500nm截止值(cutoff)的长带(long pass)分光镜)过滤。在标记操作之前采集图像，以便证实相对于细胞结构的正常自身荧光的TCPP光谱特征。使用颜色分析图6中的用蓝色突出显示的区域，图5的图显示所述图像的光谱组分。现在参考图5，显示的是来自图6中的蓝色突出显示区域的光谱特征或自身荧光的图。
然后用TCPP标记图6的样本，并重新成像。用CCD传感器对图6中的蓝色突出显示区域成像，并进行分析。图7中的图显示来自如成像的图6的蓝色突出显示区域的TCPP的荧光光谱输出(绿色线)。光子/秒/像素为任意单位。
将标尺设定至相同值，以便证实染色化合物的光谱特征。在660nm附近的峰是由于TCPP染色化合物。
数据：TCPP在细胞结构中的定位
本发明的另一个特征显示，TCPP化合物定位在细胞的质膜。通过光谱发射来分离图像，可以证实TCPP标记化合物的发射仅从质膜发射。可以将显微镜聚焦于以可见光范围内的特定波长发射的结构。获得发荧光的细胞结构的(内部或外部)特征的图像。图1中显示以不同波长发射光子的细胞、其部分以及细胞结构的图像。
图8是当LCTF被调节至约530nm时获得的灰度图像。该图像显示位于发射TCPP特征的层的下面的内部结构。获取图8，其中显微镜的焦点被设定在当LCTF被设定在660nm时看见的细胞结构。为了使该图像进入焦点，必须物理地降低焦点的范围。相比于图8，通过降低焦点范围产生的图像(未显示)表现了更高的清晰度，且处于更好的焦点，并且更好地确定了质膜。这是由于质膜会阻挡从下部细胞结构发射的一部分光。
获得图9中的图像，其中LCTF被调节至660nm。相对于530nm图像的焦点范围，升高焦点范围。由于激发光来自载玻片的上面，并考虑到在染色过程中仅细胞的暴露表面经受染色化合物，所述图像支持下述假定：TCPP仅附着于表面特征，并且不会迁移到内部细胞结构中。当将此与图9一起考虑时，证实发射530nm特征的物体在物理上定位于发射约660nm特征的那些物体的下面。对图9中的质膜聚焦。
数据：用TCPP标记的癌细胞的荧光通量的测量
基于CCD传感器的饱和水平和量子效率，确定来自发荧光细胞的光子通量。计算的值的基础如下：
根据本发明的一个实施方案，由发荧光的结构发射的光子在撞击CCD之前穿过12个介质。这些由以下组成：盖玻片、在物镜中的光学器件、光学立方体、用于显微镜的分光镜、LCTF和在各自之间的气隙。我们已经考虑到每种介质在相关波长的透射系数，以及LCTF的波长依赖性的衰减和CCD的量子效率，以便达到每秒到达CCD的每个像素的发射的光子数的值。当然，由于LCTF的带宽，要考虑带宽。所述的每个带宽具有20nm半峰全宽(full width at halfmax)(FWHM)的规格。
下面的等式给出所用表述的基础形式。
(PCCCD)/[(0.99)(MO)(OC)(LCTF)(QECCD)]＝来自细胞的光子通量/像素
其中，PCCCD是CCD的光子计数，MO是归因于显微镜光学器件的衰减，OC是在荧光光学立方体中的光学器件的衰减，LCTF是归因于液晶可调谐滤波器的衰减，QECCD是CCD芯片的量子效率。0.99项是为了补偿盖玻片中的光子吸收和散射以及由气隙和菲涅耳反射(Fresnel reflection)造成的其他损失。
使用20X物镜(具有0.7的数值孔径)，收集所有数据。这使得所述数据与细胞结构的发射区域的实际大小相关联。所述数据分析允许测量在图像的指定区域上的光子计数。在该具体情况下，图像捕获装置例如CCD可以由1392X1040像素阵列组成。确定测量区域的实际大小仅仅是几何学问题。
在捕获图像以后，分离相关的灰度层，并指定目标区域。获取在CCD传感器的每个元件上的电荷。基于所述电荷，确定所述元件在所述波长吸收的光子数的值。使用该值，可以利用上述关系估计由发荧光的源发射的光子的实际数目。相对于对照对所述值进行评分，并分配评分。分配的评分决定了筛选的细胞是否是癌性的或非癌性的。
计算关于指定区域中的下述方面的信息：指定的区域中的像素的数目，指定区域中的计数的总数，来自具有最高值的像素的计数的数目，和频率分布的标准差。
尽管已经具体地参照这些优选的实施方案详细描述了本发明，其他的实施方案可以实现相同的结果。本发明的变化和修改是本领域技术人员显而易见的，且意图在所附权利要求书中涵盖所有这样的修改和等效方案。例如，将波长提供为特定波长附近和特定波长范围附近。应当理解，一些实施方案允许+/-30nm通量。同样，虽然提供的是与痰样品有关的具体实施例，但是生物样品可以是任意类型，并可以通过不同方式得到，正如在Adair的美国专利号6,316,215中所指出的。上面引用的所有参考文献、申请、专利和出版物的整个公开内容通过引用结合于此。
已经通过优选的实施方案描述了本发明，但是，应当理解，可以对描述的实施方案做出各种修改和改进，而不脱离本发明的范围。以上和/或在附件中引用的以及对应申请的所有参考文献、申请、专利和出版物的整个公开内容通过引用结合于此。

Claims (20)

1.一种确定痰样品是否含有发育异常的或癌性的细胞的方法，所述方法包括：
获得含有细胞的痰样品；
用TCPP标记所述痰样品，以将疑似为发育异常的或癌性的细胞染色；
用约475nm+/-30nm的激发波长的光激发所述标记的痰样品；
在所述痰样品内检测来自被鉴定为巨噬细胞的细胞的、在约560nm+/-30nm的发射；
将成像仪聚焦于一个或多个疑似为发育异常的或癌性的细胞的质膜上；
在聚焦于所述痰样品的细胞的质膜上以后，如果存在的话，检测所述痰样品的TCPP标记的细胞在约655nm+/-30nm的发射；
测量传感器的每个像素的光子通量，以获得成像的细胞的值；和
对测得的值评分，以确定细胞是否是癌性的或发育异常的。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述TCPP是中-四(4-羧基苯基)卟吩。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述激发波长是约475nm+/-5nm。
4.根据权利要求1所述的方法，其中巨噬细胞的发射是约560nm+/-5nm。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述成像仪是荧光显微镜。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述TCPP标记的细胞的发射是约655nm+/-5nm。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述传感器是CCD照相机。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述评分还包括：将所述测得的值与癌性的、发育异常的和非癌性的细胞的储存的值的数据库进行对比，以基于所述对比的结果来分配评分。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述痰样品来自人。
10.一种确定细胞的生物样品是否含有发育异常的或癌性的细胞的方法，所述方法包括：
获得疑似含有发育异常的或癌性的细胞的生物样品；
用TCPP标记所述生物样品，以将疑似为发育异常的或癌性的细胞染色；
用约475nm+/-30nm的激发波长的光激发所述样品；
将成像仪聚焦于一个或多个疑似为含有发育异常的或癌性的细胞的质膜上，以获得图像；
在聚焦于疑似含有发育异常的或癌性的细胞的生物样品的一个或多个细胞的质膜上以后，如果存在的话，检测来自TCPP标记的细胞的、在约655nm+/-30nm的发射；
测量所述传感器的每个像素的光子通量，以获得成像的细胞的值；和
对测得的所述值评分，以确定细胞是否是癌性的或发育异常的。
11.根据权利要求10所述的方法，所述方法还包括：
检测被鉴别为目标细胞的细胞在约560nm+/-30nm的发射。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述TCPP是中-四(4-羧基苯基)卟吩。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述激发波长是约475nm+/-5nm。
14.根据权利要求10所述的方法，其中巨噬细胞的发射是约560nm+/-5nm。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述成像仪是荧光显微镜。
16.根据权利要求10所述的方法，其中所述TCPP标记的细胞的发射是约655nm+/-5nm。
17.根据权利要求10所述的方法，其中所述传感器是CCD照相机。
18.根据权利要求10所述的方法，其中所述评分还包括：将所述测得的值与癌性的、发育异常的和非癌性的细胞的储存的值的数据库进行对比，以基于所述对比的结果来分配评分。
19.根据权利要求10所述的方法，其中所述痰样品来自人。
20.一种用于使计算机能够表征痰样品的计算机可读介质，所述计算机可读介质包含使计算机能够执行下述步骤的预定操作的软件指令：
用约475nm+/-30nm的激发波长的光激发用TCPP标记的痰样品；
在所述标记的痰样品内检测来自被鉴别为巨噬细胞的细胞的、在约560nm+/-30nm的发射；
将成像仪聚焦于一个或多个疑似为发育异常的或癌性的细胞的质膜上；
在聚焦于所述痰样品的细胞的质膜上以后，如果存在的话，检测所述痰样品的TCPP标记的细胞在约655nm+/-30nm的发射；
测量传感器的每个像素的光子通量，以获得成像的细胞的值；和
对测得的值评分，以确定细胞是否是癌性的或发育异常的。
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