CN1545557A - 应用5,10,15,20-四(羧苯基)卟吩检测细胞及组织样本中癌前期状态的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测哺乳动物细胞及组织样本中癌前期状态的方法，其包括应用增溶的5，10，15，20－四(羧苯基)卟吩(TCPP)培养样本，测定上述样本中TCPP的荧光，对样本加以分类，根据与各个细胞状态相关联的TCPP荧光将样本分类为非癌、癌前期和癌的样本。本发明还涉及一种与检测方法相结合的，创新的更有效的增溶TCPP的方法，以及一种含有用上述方法增溶的TCPP的组合物。

Description

应用5，10，15，20-四(羧苯基)卟吩检测细胞及组织样本 中癌前期状态的组合物和方法

有关申请

本申请要求审理中的临时申请60/249,505的优先权，该临时申请的提交日为2000年11月17日，题目为“应用5，10，15，20-四(羧苯基)卟吩检测人组织样本中癌前期状态的方法”，其全文引入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及某些卟啉用于在体外和原位检测各种组织样本中发育异常、能发展成癌和癌细胞的应用。

发明背景

在整篇本说明书中引用了许多科学和学术文献，标于括号中。这些文献引入本文作为参考用以描述与本发明有关的技术状况。

研究疾病发展并分析组织样本包括癌在内反常性的病理学家确定，一种被称为发育异常的细胞状态能潜在地确定细胞处于癌前期状态，所述发育异常的细胞状态被认为与细胞的异常形成或成熟有关。不加抑制的该发育异常可经由轻微的、中度的和严重的阶段最后发展为癌。中等程度发育异常的病例中大约有七分之一会发展为癌，而已有报道在严重发育异常中多至83％的病例会发展为癌，具体情形依赖于有关细胞的种类。不过，去除轻微和中度的发育异常可极大地减少癌的发展。在肺部切除发育异常的细胞不但极大地减少了癌细胞的形成，而且在一些病例中，肺部组织会恢复至正常的形态。

通常，癌被发现的越早，患者存活的预后就越好。如果乳腺癌在其仍局限于单一团块时被及早发现，患者五年存活率是96％以上。当其扩散至较远区域时，患者五年存活率是20％以下。对于肺癌，当其在单一团块时被发现，五年存活率是46％以上。当其已经扩散时，患者五年存活率是14％以下。对于子宫颈癌，当癌前期变化在发展至更严重阶段之前被发现并予以治疗时，可实现额外更久的存活(Boring和Squires 1993，CA Cancer J Clin 43：7-26和Ferguson 1990，Hematol OncolClin N Am 4：1053-1168)。

在目前美国男性和女性的癌症死亡人数中，肺癌是首要原因(Wingo等.1995，CA ClinicalJ Clin 45：8-30)。在1997年，估计有160,000人死于肺癌，占美国男性癌症死亡总人数的12％，占美国女性癌症死亡总人数的2％(Boring和Squires 1993，同上)。肺癌患者五年存活率只有14％也反映出它是最致命的癌症种类之一。相对于人类其他癌症种类，肺癌患者的预后是不佳的，这很大程度上归因于缺乏有效的早期检测方法。在临床(症状的)表现时期，超过三分之二的患者有区域性的节结缠绕或远程转移，这两种情形通常是无法治愈的。不过在对局限性(0期或1期)的肺癌患者的研究中，五年存活率介于40％～70％之间(Boring和Squires 1993，同上；Ferguson，1990，同上)。

在历史上，唯一用来在症状出现前检测肺癌的诊断试验是痰液细胞学和胸部X射线照相。因而在过去几十年的研究中，上述作为主要筛选手段的试验的效能被广泛评估。两种试验检测症状表现前的早期癌症，尤其是鳞片状细胞癌。

筛选方法的改进主要围绕通过显微镜方法技术的发展提高痰液细胞学的效用。痰液细胞学要求对细胞样本进行视觉检查，检查期间细胞的大小、形状、构造以及细胞核与细胞质的大小比值被用来确定该细胞的形态。因为这种细胞形态学的评估要求目测检查和分类，所以该技术要求作为临床观测者要具有极其大量的专业技术。许多调查实施后提出计算机辅助的高分辨率影像分析能够检测出与一些组织类型有关联的看似正常的细胞核中无法目测的变化(Montag等.1991，AnalQuant Cytol Histol 13：159-167；Haroske等.1988，Arch Geschwulstforsch，58：159-168；Hutchinson等.1992，Anal Quant Cytol Estol 4：330-334)。对细胞样本的DNA分布进行计算机辅助分析可提供74％正确率的细胞核形态学分类，与普通的细胞学试验相比，该方法无需人为检查材料，也无需细胞核表现出可目测的反常性。

由于对肺瘤病理学了解的深入，细胞学样本的形态学评估也有所改进。这方面的许多工作集中在“生物标记”的识别。生物标记涉及呼吸道粘膜的大范围进行性的表型和遗传反常性，该反常性可用于检测支气管上皮细胞完全地转变为恶性肿瘤的潜力。标记按其形态学改变主要分为用于差异表达的蛋白的免疫/组织化学标记、用于基因组不稳定性的标记、后生改变的标记(例如，反常的甲基化作用)和基因突变(Hirsh等.1997，Lung Cancer 17：163-174)。

这些标记的表达水平目前一直使用从高危群体中采集到的发育异常和瘤形成的细胞/组织学的组织样本进行评估。在这些样本中，通常作为探测性标记分析的对象是痰液。对于痰液样本用于生物标记研究的兴趣产生于长期持有的观点，该观点相信由于肺癌多数往往发生于支气管上皮细胞，因而在痰液中回收的表皮脱落细胞可能是初期癌症的最早征兆。通过应用高度发展的分子基因技术(例如基于PCR的分析)，研究证实，可在痰液中检测出经过选择的生物标记(Mao等.1994，Cancer Res 54：1634-1637；Mao等.1994，Proc Natl Acad Sci USA91：9871-9875；Sidransky 1995，J Natl Cancer Inst 87：1201-1202；Tockman等.1988，J Clin Oncol，11：1685-1693；Tockman等.1994，Chest，106：385s-390s)。

市场上可获得的筛分或检测癌症的业务依赖于经过培训的临床医师进行基于细胞形态学诊断的试验，所述医师观察各个样本并确定反常细胞类型的程度和性质。该过程不仅昂贵和费时，而且因采用人为判断而在程序中引入错误。最近，发展出了一种应用5，10，15，20-四(羧苯基)卟吩(TCPP)检测肺部癌细胞的方法(Cole等人的美国专利5,162,231)。该方法依赖于癌细胞具有比正常细胞从外界蓄积更大量的TCPP的倾向。当细胞样本用200μg/ml TCPP培养6-24小时后，所述TCPP进入到细胞内并与瘤形成细胞的核膜及线粒体结合。TCPP在紫外线照射下发射荧光，因此单独凭借荧光强度即可诊断出癌细胞，而无需参考形态学。推广上述化合物用于鉴定癌前期组织状态(例如发育异常的细胞)的应用可使筛分高危群体以识别出那些其组织正向扩散的癌发展的个体成为可能，从而便于在最佳治疗时期发现癌或发育异常。这种筛分方法具有令人满意的特点，其过程迅速、价廉并且对技术性的专业要求程度最低。

由于上述原因，需要有用于在其最早时期检测出发育异常细胞的技术和方法。另外，需要有能提供高度可靠性诊断结果的技术，该技术不依赖于临床医师进行诊断的主观分析。

发明概述

本发明来源于TCPP可用于检测发育异常、癌前期以及癌细胞的发现，其结合了创新的和更有效的增溶TCPP的方法、改良的染色方法和多种细胞分类的方法。TCPP是一种有荧光性的化合物，它现在被发现可与活的或固定的癌前期以及癌细胞的组分结合，该结合方式导致如下细胞和组织的状态，依据该细胞和组织的状态，可以实现对它们在疾病发展连续性上的分类。这种检测癌前期组织的方法同样适用于组织或细胞样本的体外诊断和原位诊断。

一方面本发明涉及一种检测癌前期细胞的方法，该方法最基本的组成包括以足够的时间在TCPP溶液中培养活的或固定的(即，死的)细胞，以使TCPP结合到特定细胞组分上，并用荧光测定法检测结合的TCPP。这种方法具有许多变化。在一种变化中，所述细胞被固定在一表面上，优选显微镜载物片，最优选单层形式。在另一种变化中，所述细胞用甲醛溶液或其它适宜的固定剂溶液处理，保持在悬浮液中，用TCPP处理，所述细胞与未结合的TCPP分开，然后通过流量细胞计数进行分析和分类。

培养步骤的优选实施方案包括应用含TCPP大约为4μg/ml～400μg/ml的TCPP溶液，温度介于大约23℃至大约42℃之间，时间介于大约0.2分钟至2小时之间。除去未结合的TCPP并且荧光检测剩余的TCPP。在一个优选实施方案中，所述TCPP在该实验进行后大约1至24小时检测。

在本发明的另一个实施方案中，计算出了一个细胞样本中荧光性细胞的百分比。优选实施方案包括分析荧光性细胞的荧光强度和其他的细胞形态学特征。在一个尤其优选的实施方案中，根据一系列预先确定的荧光强度和细胞形态学特征对荧光性细胞进行分类，这有利于沿着连续性的分类对该细胞进行表征，所述连续性的分类从正常的到转化的(metaplastic)，到发育异常的(轻微至严重的)，到癌的(轻微至严重的)，并且应用本方法作出的诊断和预测提高了有效性和可靠性。本发明的其他实施方案包括在样本中区分正常或转化的细胞与发育异常或癌的细胞，所述区分以荧光强度为标准(例如通过荧光法流量细胞计数)。

为了便于上述检测方法的实施，本发明的另一方面提供了一种制备TCPP溶液的方法，其包括溶解TCPP于pH大于约8.5和小于约12.5的约50％～约90％醇溶液中。在一个优选实施方案中，所述醇为异丙醇，而在另一个优选实施方案中，所述溶液的pH用碳酸氢钠或氢氧化铵调节。

本发明的另一方面涉及一种组合物，其包括pH大于约8.5和小于约12.5的约50％～约90％醇溶液中的TCPP。在一个优选实施方案中，所述醇为异丙醇，而在另一个优选实施方案中，所述溶液的pH用碳酸氢钠或氢氧化铵调节。在一个实施方案中，所述组合物按上述制备TCPP溶液的方法制备。在一个有关实施方案中，用于上述检测方法的TCPP溶液被稀释。

在本发明的另一方面，细胞是存在于哺乳动物患者的原位。细胞暴露于TCPP溶液中并应用内窥镜检查技术检测荧光。

本发明的另一方面涉及一种用于检测癌前期细胞的试剂盒，其包括装于容器中的本发明组合物。在另一个实施方案中，所述试剂盒包括一种或更多附加组件，例如实施本发明检测方法的说明和试剂，或阳性和阴性的对照标准。

本发明的其他特征和优点将通过参照附图、详述和例子得到更好的了解。

发明详述

本发明包括应用5，10，15，20-四(羧苯基)卟吩(TCPP)检测人类细胞中癌前期状态的组合物和方法。本发明来源于对TCPP除癌细胞外还特异性结合癌前期反常细胞，而不结合正常(非癌的)细胞的发现。此外，发现在固定细胞中的这种有差别的结合与在活细胞中的一样。除了TCPP的这种新发现的有用特性外，本发明另外引入了一种增溶TCPP的改良方法，该方法更大程度地保留了其活性，并具有其他几个创新的方面使本方法更适用于筛分和自动化操作。与美国专利5,162,231相比，应用本发明所述的方法，需要较少的细胞结合TCPP的时间(例如0.2分钟-2小时相对于24小时)，并且要求较低的TCPP浓度(例如40μg/ml相对于200μg/ml)。另外，虽然也可使用细胞溶液，但使用单层细胞优于细胞溶液。

本检测方法方便和有效的关键在于所述创新的增溶TCPP的方法。先前的方法应用1M NaOH溶解卟啉。该方法要求用1M HCl滴定，这种滴定是不精确的，并要求每一溶液进行未溶解的TCPP的检查。另外，上述NaOH的方法将卟啉置于pH高至13.0的氧化环境，从而使该卟啉处于降解的高度危险中。本发明所述的增溶方法应用pH9.1结合创新加入90％醇以实现更完全和可靠的增溶。最后，本发明所述的方法应用一种缓冲液以稳定最终TCPP工作溶液的pH在优选的5.8～6.8范围内。

本发明涉及检测人类组织样本中癌前期和癌细胞，该检测应用这些细胞比健康细胞结合更大量的TCPP这种独特的倾向。在此所用的术语“癌前期”或“反常癌前期”涉及表现出轻微的至严重的发育异常的细胞，术语“癌的”涉及表现出轻微的至严重的癌的细胞。在此应用巴氏染色(PAP-染色)细胞学，依照用于确定细胞形态学的标准对这些细胞学状态予以形态学的界定。也可以应用本领域其他常用的针对特定细胞或组织的指示剂界定细胞形态(例如检测肺或痰液样本中肺炎的指示剂)。从“正常的”到“严重癌的”，在此细胞的状态被分为(1)正常(无显著的反常性)，(2)转化(鳞片状转化)，(3)轻微发育异常(鳞片状非典型)，(4)中度发育异常(鳞片状非典型)，(5)严重发育异常(显著的鳞片状非典型)，(6)原位鳞片癌(CIS，非扩散的)(也称为轻微至中度癌)，和(7)鳞片状细胞癌(明确区分的角质化-扩散性)(也称为中度至重度癌)。依据本发明，在暴露于TCPP后，上述的细胞状态可被测定，发育异常的和癌细胞显示TCPP荧光，而正常细胞显示极少量或没有TCPP荧光。一些转化的细胞可显示少量至中等程度的TCPP荧光，但在多数情况下，它们不显示TCPP荧光；因而，TCPP荧光作为转化的指示剂没有其作为发育异常和癌的指示剂那么可靠。

本方法包括(1)用TCPP培养固定的或活的细胞样本一段时间，所述时间应充足以允许TCPP与样本中可能存在的反常癌前期细胞或癌细胞的细胞组分结合，(2)除去未结合的TCPP，(3)用荧光法测定保留在样本中的TCPP含量，如果有；以及，取决于步骤(3)的结果，任选地(4)评估具有TCPP荧光的细胞从正常(或反常转化，但不是发育异常)状态向癌转变的情形。特别地，如上所述，本发明所述的方法实现了对含有发育异常(轻微至严重的)的细胞或癌(轻微至严重的)细胞的细胞样本的检测。

在一个示例性而非限制性的实施方案中，所述检测方法包括以下步骤：

1.细胞以单层固定于显微镜载物片上；

2.将细胞暴露于大约40μg/ml的TCPP溶液中一定时间，所述溶液中含有pH约为6.1的缓冲液，(例如，将载物片浸入到上述溶液中或将溶液液滴加到载物片上)，温度约为36℃，如下所述；

3.用pH约为6.1的缓冲液洗涤载物片；

4.至少等待1小时，但不超过24小时；和

5.在大约610-740nm下定量测定细胞经大约380-450nm光照激发下的荧光。

有关这个示例性方法的变化将在下面有更详细的描述。

在此用于描述实验用混合物的组分或本发明其他参数的术语“大约”指在应用标准方法操作本检测所通常允许的误差范围内。

第一步，用固定剂培养细胞，此步骤是任选的但也是优选的，因为已发现在此示例性实施方案及其他实施方案中，该步骤可以缩短培养要求的时间，并降低工作溶液中的TCPP浓度。

下面的章节描述了本发明多种其他的实施方案。

本发明所述的方法可应用于下述的多种细胞类型，另外同对人类一样，它还适用于对牲畜的诊断和病情预测。因此，在此所用的术语“患者”或“对象”是指人或动物。

所述检测方法可应用于检测体外细胞样本中癌前期细胞和癌细胞。细胞样本可通过现今细胞病理学领域中使用的任何方法获得。例如，细胞可采集于痰液样本(参见实施例1)、子宫颈拭子、支气管冲洗物、甲状腺和乳房的细针吸取和中心活组织检查、膀胱冲洗物、尿液、口腔冲洗物、灌肠液、以及本领域已熟知的其他活组织检查。细胞样本的其他来源列举一些，包括血液或其组分、淋巴液、脑脊液、骨和骨髓。本发明所述的方法可应用于来自体内任何组织或器官的任何细胞样本。

所述细胞样本在暴露于TCPP之前，可任选地用标准程序固定，包括但不限于含有甲醛、甲醇、乙醇或异丙醇的溶液。在一个实施方案中，细胞用95％乙醇固定。

所述实验可以通过测量每一细胞密度的所有荧光而在溶液中操作，或者通过将细胞粘着于表面上操作。细胞不需用固定剂处理，但在一些实施方案中，尤其是那些其中的细胞被粘着于固相载体上的实施方案中，固定细胞是优选的。在一个实施方案中，所述细胞以单层被粘着于载物片上。在另一个实施方案中，应用了基于液体的载物片制备系统MonoPrep2或MonoPrepG(MonoGen有限公司，Herndon，Va.)或Thinprep处理器(Cytyc公司，Marlborough，MA)。

本发明所述的方法还可应用于在原位检测癌前期细胞和癌细胞以及作为外科切除手术的辅助。例如，该方法可以通过注射含TCPP的适宜介质随后进行支气管镜检查荧光而用于在原位检测肺部发育异常的细胞。一个类似的方法还可用于在手术中检测切除的反常细胞。借由使用类似的内窥镜设备，在原位的应用可能会用于任何体内器官，包括但不限于乳房、前列腺、肺、子宫颈、咽喉、膀胱、口咽、皮肤和胃肠道。在这个实施方案中，上述TCPP的优选用量取决于施行的方式和输入的位置。例如，如果TCPP被注入血流中，TCPP的有效浓度将取决于它在盐水或血中的最大溶解度(例如大约100μg/ml)。对于直接注入染病的组织，TCPP的有效用量将取决于目标组织和注射位到该组织的接近度(例如大约1-20mg)。在肺部，气溶胶释放例如浓度为20-50μg/ml的5-10ml应当是适宜的。检测作为诊断试剂的TCPP数量的方法是药物化学家和相关领域中其他技术人员所熟知的。

在工作溶液中TCPP的浓度和细胞暴露于TCPP溶液中的持续时间是两个变量，这两个变量可以协调的发式变更。所述的TCPP浓度优选4-100μg/ml，更优选4-40μg/ml，最优选20-40μg/ml。在一个实施方案中，所述的暴露时间在大约0.2分钟到大约2小时范围内变动，并且在一个更优选的实施方案中，该时间在10-60分钟内变动。当使用低浓度的TCPP溶液时，较长的暴露时间是适宜的，而当使用高浓度的TCPP溶液时，较短的暴露时间是适宜的。例如，在优选的实施方案中，载物片可暴露于40μg/ml TCPP中10分钟，也可替代性地暴露于4μg/ml TCPP中60分钟。优化工作溶液中TCPP浓度和暴露时间的方法是为那些细胞学领域中的技术人员所熟知的，其目的是实现最大程度的TCPP与细胞组分特异性的结合，同时使背景及非特异性的摄取和荧光降低到最小。

所述TCPP溶液由大约36℃下处于含有缓冲剂的水性介质中的TCPP组成。在一个实施方案中，所述缓冲容量来自于100mM的MES；而在本方法中使用20-200mM范围的浓度可以获得相当的效力。在一个实施方案中，所述溶液的pH大约为6.1；而使用5.8-6.7范围的pH可以获得足够的效力。也可应用其他pH有效范围介于5.8-6.7的缓冲化合物。由于暴露步骤对温度不是特别敏感，所以稍高于室温的温度是理想的最佳条件。在一个优选实施方案中，所述暴露步骤的适宜温度范围介于大约23℃至大约42℃之间，而在一个更优选的实施方案中，该温度范围介于大约30℃至大约40℃之间。

可以加入其他化合物到所述工作溶液中以降低背景荧光、提高稳定性或者降低自动荧光或淬灭。例如，可以应用洗涤剂降低背景荧光，应用还原剂、抗氧化剂、和其他抑制活性氧类产生或扩散的抑制剂来防止TCPP发生氧化反应或降低光漂白。有益的化合物包括但不限于聚乙二醇(polyethlyne glycols)、tritons、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、2-巯基乙醇或由Molecular Probes有限公司(Eugene，OR，P-7481，S-2828，S-7461)提供的“Antifade试剂盒”。另外，可将苏木精加入到TCPP中，该苏木精作为光学显微镜法的复染剂和促进剂。

所述洗涤溶液通常类似于用于TCPP工作溶液的水溶液，但其中不含TCPP。如果使用显微镜载物片，该载物片应当洗涤至少一次，更优选洗涤三次，并且优选地在过量的洗涤溶液中搅拌洗涤。如果所述实验在溶液中进行，可通过离心细胞除去未结合的TCPP，轻轻倒出上层清液并将细胞再分散于新鲜缓冲液中。如果必要此步骤可以重复操作。也可应用其他可供选择的从染色液中分离细胞的方法，例如通过薄膜过滤或快速渗析(包括旋转渗析)捕获细胞。适当的洗涤条件可取决于监控所述细胞的荧光。所述洗涤应当有效去除背景和其他非特异性的结合，但不可过度，以致从细胞组分中去除了特异性结合的TCPP。洗涤步骤的优化方法是为细胞学领域中的技术人员所熟知的。可加入组合物到洗涤溶液中以提高效能或稳定性，该组合物包括但不限于醇、洗涤剂或低摩尔浓度的盐溶液。

本检测方法中一个重要的步骤是在载物片暴露于TCPP工作溶液中到该载物片读数之间，给予多于1小时但少于24小时的时间。当载物片在24小时后读数时，TCPP可能会发生过多的衰减以致无法获得准确的结果。当细胞在1小时之内读数时，背景荧光的水平可能会过高。

所述用于检测步骤的波长包含广阔的范围，其中特性峰的波长范围是最有效的。TCPP在pH为5.0-7.0的水溶液中的激发峰在大约415nm，一个发射峰出现在大约645nm，第二发射峰出现在大约706nm。通常，用紫外(UV)光对样本进行辐射照射并检测从该样本发射出的大约500nm以上的光来测定TCPP。本发明所述方法中用于激发TCPP的波长优选包含部分或全部的大约380至大约450nm的范围，并更优选在大约415nm附近的狭窄波段。同样的，检测波长包含部分或全部的大约610至大约740nm的范围，并更优选在大约650nm附近的狭窄波段。在荧光显微法领域中技术人员所熟知的一些情形下，在大约706nm附近的狭窄波段检测发射光是优选的。通过光学滤光器可以最容易地实现对波长的选择。例如，普通荧光染料的滤光器套件可从Molecular Probes(Eugene，OR)容易地获得。通过使用为检测异硫氰酸荧光素(以下简称“FITC”)设计的滤光器套件可以最容易地实现对本发明方法中激发和检测TCPP适宜波长的选择，所述滤光器套件通常具有400-490nm的激发滤光器和用于超过500nm的发射光的屏蔽滤光器。其他滤光器系统的选择是被显微镜法领域中那些技术人员所熟知的。

荧光检测可以经目测或机械地、人工或自动化手段进行。具有中等程度荧光的细胞与无荧光细胞相比，可以轻易地被人的肉眼区分。因此，本发明中的某些实施方案包括在荧光显微镜下简单观察TCPP处理过的细胞，并人工定量样本中荧光细胞的百分率。但优选的实施方案包括本领域熟知的自动化方法，以及本领域熟知的机械测定，其中当一细胞表现出超越已编入计数装置中预定阈值的荧光时，所述细胞“被计数”为荧光性细胞。例如，在包括粘着于显微镜载物片上单层细胞的实施方案中粘，自动载物片读数器可以编程为将任何具有预计与等价正常细胞相比具有统计显著性的荧光性的细胞计数为荧光性细胞，所述统计显著性用标准统计学方法测定(所述装置还可编程为计数具有一定形状的细胞，所述形状可提供癌前期或癌反常性的第二个指标)。可选择的，对于包括基于溶液实验的实施方案，经TCPP着色和洗涤的细胞样本可通过荧光激活细胞分类法(FACS)分析，其中所述FACS设计用于分离具有预定荧光水平的细胞，该细胞荧光水平可通过与正常细胞相比可进行统计学测定。

测定出现在样本中的细胞总数是为了计算该总数中有TCPP荧光细胞的百分率。此测定可以用本领域已知的多种方法完成。在一个实施方案中，所有细胞用苏木精染色并在白光显微镜下计数。在另一个实施方案中，所述细胞用适宜的荧光计数器染料染色(例如，一种染色细胞膜外部或内部膜的荧光计数器染料)，该染料荧光的波长不同于TCPP的荧光。在上述后者的实施方案中，TCPP荧光与细胞标记荧光的比率被定量测定。

如前所述，本发明方法的创新在于发明人认识到TCPP染色不仅如先前已知可鉴别癌细胞，还可鉴别癌前期发育异常的细胞。因此，上述方法产生出比先前认为可能的更多的信息。因而，所述TCPP荧光定量的结果将用于决定随后的分析步骤是否进行，和以什么方式进行。

例如，所述方法将确定样本中具TCPP荧光性细胞的百分率。如果样本中大约1-3％，尤其大约2-3％的细胞是荧光性的，则样本中含有至少反常癌前期(发育异常)细胞或癌细胞。因而，简单的分析方案包括测定样本中是否含有至少大约1％的TCPP荧光性细胞。如果不含，则该样本被诊断为阴性(正常)。如果含有，则建议患者进行进一步的测试。连同这个实施方案应当强调的是，即使样本中含有低于1％的荧光性细胞，其他因素(例如患者是易患癌的体质，或在其他组织中已存在癌)的存在也应建议患者进行进一步的测试。在以下有更详细描述的本发明的一个优点是，富含荧光性细胞的群体可经FACS分类由患者获得。

另外，已发现样本中指定细胞的荧光水平与该细胞的癌相关状态有关联(参见实施例1)。因而，单独的细胞或细胞群可以评估他们总体的荧光强度，而且决定是否进行进一步的测试可部分取决于该评估。

在此所用的术语“高度”、“中度”和“低度”荧光以及相关术语，作为比较用的术语会被本领域中的技术人员所理解，其中检测样本中单一细胞或细胞群的荧光强度被至少与来源相同(例如痰液)已知在癌方面正常的细胞(阴性对照)比较。所述比较可通过视觉判断完成，或在自动化系统中完成，该系统可运用统计学参数编程，例如在实施例2中描述的来自样本群体的中值荧光的变量。在优选的实施方案中，来自试验样本的细胞在荧光强度上与另外的对照细胞作比较，该对照细胞的癌状态已被预先测定并预先与TCPP荧光强度关联(例如，实施例1中所描述)。

在此还使用了术语“荧光性的”和“非荧光性的”。与上述对不同水平荧光强度的定义一致，术语“非荧光性的”和“荧光性的”作为相比较的术语使用，其中荧光与来源相同的正常细胞作比较，和/或与通常来自用于检测荧光的试剂或装置的背景荧光作比较。因此，如果细胞或细胞样本被检测为“荧光性的”，则该荧光呈现出的强度高于背景荧光或已知正常细胞中观测到的荧光强度。如果细胞或细胞样本被检测为“非荧光性的”，则观测到的荧光为最低的背景荧光或正常细胞中所观测荧光，或根本不超过背景荧光或正常细胞中所观测荧光。这种比较会被相关领域的技术人员所了解。

与TCPP荧光相结合的细胞形态学评定对于含低水平荧光的细胞培养物是尤其有用的，因为用标准评估技术对细胞进行目测评估可以容易地区分轻微荧光性的转化(非癌的)细胞和发育异常的(癌前期)细胞。所述方法的一个实施方案除定量荧光以外还包括一个细胞形态学评估的附加步骤，尤其包括应用标准细胞学染色剂例如苏木精以使细胞和细胞核轮廓可见。另一个实施方案中，如果达到确定的阈值要求，例如样本含有超过1％的荧光性细胞，则使用细胞形态学评估作为随后的步骤。

在本发明的一个尤其优选的实施方案中，经筛选的细胞形态学特征与荧光强度相结合，形成了一套分类体系，该分类体系对于有效的、可重复的诊断细胞样本可能处于的转化、发育异常和癌的多种阶段是非常有用的。所述分类体系在实施例1中有详细描述。在该实施方案中，TCPP荧光性细胞设置有一个或多个数字类别，所述类别基于荧光强度和简单的形态学特征，包括细胞的形状和大小、细胞核的数量和大小、细胞丛的存在及细胞和细胞丛的退化、不规则anisoid细胞的存在、细胞膜的可见度、和细胞核碎片的存在和性质。进行对TCPP荧光性细胞的细胞形态学评估的技术人员或科学家可以应用上述分类作为一览表，即对于每一数字类别，可在查对后为被测细胞标上“正号”或“负号”。指派给某一种细胞的数字类别的编号和指派给一细胞的具体类别的模式都为该细胞癌的或癌前期的状态提供了信息。作为说明，实施例1提出了一种含有14个数字类别的分类体系。该实施例实验使用痰样本，如表2显示，阴性或转化的细胞通常可归属的类别极少，而严重的癌细胞可归属多个类别。作为进一步的说明，阴性或转化的细胞常被归为第11类，而中度发育异常到癌的细胞则不，癌细胞常被归为第6类，而正常的、转化的和发育异常的细胞则不。

在本发明的另一个实施方案中，溶液中的来自确定有癌的单一患者的经TCPP处理的细胞，可通过基于其荧光水平的流量细胞计数加以分离。显示高水平荧光的细胞被认为是癌的，而显示中等或低水平荧光的细胞被认为是发育异常的，不显示荧光的细胞被认为是正常的。这种区分方式可以使患者发育异常或癌的细胞区分于患者自身正常的细胞，因而提供了一种理想的“内部”对照体系。

在另一个实施方案中，通过从同一患者分离癌细胞和正常细胞，可检测各种化学治疗药物的效果。分离出的细胞被分为几等份。将经选择的治疗药物以相同浓度分别与高度荧光性细胞的等份试样及低水平荧光性细胞的等份试样混合。该步骤可以用新鲜等份样和不同的治疗药物重复进行。细胞死亡率可应用本领域已知的技术评定。通过选择杀死最高数量的已确定癌细胞(即高度荧光性细胞)并且杀死最低数量的正常细胞(即经TCPP处理后具有极低或没有荧光的细胞)的化学治疗药物，可以确定最优选的用于治疗的治疗药物。

连同本发明筛选或诊断检测方法一起，用于所述方法的溶解TCPP的方法以及其他应用得到了发展。该方法包括将TCPP溶解在pH大于约8.5但小于约12.5的大约50％至大约90％的醇中。本发明优选应用低级醇，例如甲醇、乙醇、异丙醇和正丙醇。更优选地，所述醇为异丙醇，并且用碳酸氢钠或氢氧化铵调节其pH为大于8.5且小于10.0。在一些实施方案中，所述异丙醇的浓度可从50％到90％，所述氢氧化钠可从20mM到100mM。所述TCPP的浓度可至多大约2mg/ml。在一个实施方案中，TCPP以1mg/ml溶解于50％异丙醇和50mM氢氧化钠的溶液中。

本发明还包括一种可用于任何利用TCPP的方法的组合物，该组合物包含TCPP在pH大于7的醇中。所述溶液优选用上述溶解TCPP的方法制备。所述组合物优选地在大约4℃下于黑暗处保存。

本发明另外涉及用于检测癌前期细胞和癌细胞的试剂盒，该试剂盒包括装于容器中的TCPP和任选的说明书。在一个实施方案中，所述试剂盒被设计成应用本发明的检测方法使用。在一个实施方案中，所述试剂盒包括装于容器中的本发明组合物，该组合物包含在碱化醇中增溶的TCPP。该TCPP溶液可作为储备液使用，该储备液被稀释于含有缓冲剂的水溶液中而用于检测癌前期和癌细胞的目的。所述试剂盒可能含有用于采集细胞样本的组件，例如实施例1中的痰液采集容器，或者也可能含有用于检测已获得的样本中癌前期细胞的组件。所述试剂盒可能被设计成与载物片制备系统例如MonoPrep2或MonoPrepG(Monogen有限公司，Herndon，VA)或Thinprep处理器(Cytyc公司，Marlborough，MA)一起应用。这些试剂盒还可设计成用于除显微镜载物片以外的其他格式，例如微量滴定板或流量细胞计数仪。在上述任何实施方案中，所述试剂盒可能含有阳性或阴性对照，或两者都含，该对照将被本领域的技术人员应用于本发明的实验操作。

下述例子用于详细描述本发明。这些例子是用来举例说明，但不限制本发明。

实施例1

用于以TCPP检测癌前期和癌细胞的玻璃载物片实验

这个例子比较了通过用PAP染色痰液载物片的标准细胞形态学分析获得的诊断结果和用TCPP处理载物片并进行荧光显微法分析获得的结果。该结果显示本发明的TCPP检测技术在检测瘤形成细胞(原位的发育异常和癌细胞)和明显的癌扩散上等同于传统的痰液细胞学。该结果还显示本领域的技术人员能够结合简单的分类原则使用本方法评估组织样本中表现出的发育异常的水平。

方法

用于制备单层载物片的痰液处理过程。本研究中用于分析的所有选出的单层载物片均由痰液样本制得，所述痰液采集于患者早晨自然咳出的物质。特别地，患者被指示于连续三天的早晨咳出无论什么物质到指定容器中，该容器中装有由50％醇/50％Saccomanno液体中2％Carbowax构成的固定剂和0.03-0.05mg/ml利福平。利福平作为防止患者携带有结核分枝杆菌(M.tuberculosis)或那些可能是无症状的脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitis)携带者的预防药而被加入到上述固定剂溶液中。

所述2％Carbowax溶液通过加入2ml熔化的Carbowax(150)到98ml 50％乙醇中并混合30分钟制备。将用于制备溶液的玻璃器皿保温以防止制备过程中其表面的蜡状物变硬而使测量不准确。在暴露于TCPP工作溶液之前，通过浸入95％醇中至少15分钟除去Carbowax。

利福平溶液(3mg/ml)通过溶解300mg利福平胶囊于100ml乙醇并在韦林氏搀合器里高速混合制备。每30ml Saccomanno溶液中加入1ml此溶液或每升Saccomanno溶液中加入20ml此溶液并彻底混合。Saccomanno溶液的制备依据细胞学领域中技术人员所熟知的标准方法操作。

以患者信息标记两个薄层制备的显微镜载物片(Cytyc公司，Marlborough，MA)和50ml的塑胶离心管。将所述痰液样本倾注到50ml的塑胶离心管中，如果需要另外加入50％乙醇溶液使体积达到50ml。将离心管内容物倾注到250ml的Eberbach半微量搀合器容器中，并均质化10-60秒，均质化时间取决于样本的目测检查和粘液样成分。粘稠的粘液样本有时要求更长的混合时间。然后将样本倾注回上述离心管中并在1850rpm下离心10分钟。轻轻倒出上层清液，留下1至2ml在离心管中与沉淀物(离心分离物)混合。将该离心管在漩涡混合器上震荡大约10秒钟。加入1至3滴该沉淀物到PreservCyt小瓶(Cytyc公司，Marlborough，MA)中。培养上述样本5分钟以灭活所有细菌和病毒的有机体。

依据厂商说明应用Thinprep处理器(Cytyc公司，Marlborough，MA)将样本的单细胞层固定于载物片上。在Thinprep处理器中，细胞被收集于聚碳酸酯过滤器(孔径0.5mm)上，并转移至玻璃载物片上。然后Thinprep处理器立即将载物片沉浸到含有95％乙醇的固定剂浴液中。

TCPP储备液。将400mg碳酸氢钠加入到大约90ml 50％异丙醇(50mM碳酸氢钠)中并混合至完全溶解，得到碱化的50％异丙醇。将100mg TCPP缓慢加入到上述碱化的50％异丙醇(50mM碳酸氢钠)中并混合3至5分钟直至溶解。用上述碱化的50％异丙醇将该TCPP溶液定容至100ml，混合均匀后存放于用箔包裹的棕色试剂瓶中，冷藏保存。最后储备液中TCPP的浓度为1mg/ml。

TCPP工作溶液。每天配制新鲜的TCPP工作溶液。将大约10ml浓度为1mg/ml的TCPP储备液移到室温下。取8ml的TCPP储备液(1mg/ml)至200ml容量瓶中，然后缓慢加入大约100ml MES缓冲液。轻轻混合上述溶液。加入额外的MES缓冲液定容至200ml。混合该溶液3至5分钟后装于棕色瓶中于2-4℃下存放。工作溶液中TCPP的终浓度为40μg/ml。

TCPP暴露过程。室温下于95％醇中固定载物片30分钟。在固定后立即或于3天后将载物片暴露于TCPP溶液中。将该载物片在36℃下浸没于40μg/ml的TCPP溶液中10分钟，然后于室温下在100mMMES缓冲液中震荡洗涤3次，每次1分钟。在一段时间后观察载物片，所述这段时间在1小时以上但不超过24小时。

显微镜资料。用于观察经TCPP处理的痰细胞载物片的显微镜是Olympus BH-1型显微镜，该显微镜具有用于反射光荧光显微法的台下照明灯和台上水银灯。所述水银灯主发射线在365nm、405nm、436nm和545nm。荧光的滤光器组合件包含两个二向色立方体。绿光立方体(490nm)包含可通过400-490nm的激发光滤光器和可通过500nm以上发射光的阻断滤光器的滤光系统。

通过改进PAP染色技术进行的痰液载物片染色程序。以下列出程序次序(序号)，试剂和时间(分钟:秒)：(1)95％醇15:00；(2)自来水1:00；(3)gil-i hemotox 2:30；(4)自来水1:00；(5)上蓝剂：30；(6)自来水1:00；(7)95％醇：10；(8)og-6 1:30；(9)95％醇：10；(10)95％醇：10；(11)ea-50 1:15；(12)95％醇：20；(13)95％醇：30；(14)100％醇1:00；(15)100％醇1:00；(16)100％醇1:30；(17)二甲苯1:00；(18)二甲苯1:00；和(19)二甲苯1:00。

巴氏染色载物片的常规细胞病理学分析方法。PAP染色载物片经历半定量的细胞形态学评估。(1)通过应用传统形态学标准识别发育异常的和癌的细胞，和(2)定量肺部炎症的7个基本指标(肺泡的巨噬细胞，嗜中性粒细胞，柱状细胞，粘液，粘液螺旋，被着色的巨噬细胞，转化细胞)的表达水平。定量这些炎症指标的方法已在之前的文献讨论过(Roby等，1989，Acta Cytol 34：147-154；Roby等，1990，Acta Cytol 34：140-146；Schumann等，1989，Am Rev Respr Dis139：601-603)。用于使用PAP染色细胞学检测细胞形态学的标准将在后文讨论。

无显著性的反常。如果满足以下标准，该细胞则被确定为无显著性的反常：

1.随同炎症细胞，还存在混有1-2级色素巨噬细胞的嗜碱性、有纤毛的上皮细胞；

2.基础取向的上皮细胞圆形细胞核；

3.均匀分布的染色质；

4.不明显的核膜；

5.不明显的核仁；和

6.不存在转化和发育异常的细胞。

鳞片状转化(无发育异常)。如果满足以下标准，该细胞则被确定为无发育异常的鳞片状转化：

1.无纤毛的嗜碱性细胞丛；

2.均一的细胞和核大小；

3.低的细胞核/细胞质(N/C)比例；

4.细胞核的染色质呈细粒状；和

5.可能存在小的圆形细胞核(通常为单一的)。

轻微发育异常(鳞片状非典型)。如果满足以下标准，该细胞则被确定为轻微地发育异常：

1.比转化细胞小；

2.可见为粘着的细胞丛，或单独形式；

3.细胞处于扁的(薄片)状态，其细胞核和细胞质清晰可见；

4.细胞大小有轻微变化；

5.细胞质可为嗜曙红的或嗜碱性的；

6.细胞质的边缘清晰；

7.细胞核大小有轻微变化，通常为圆形至卵圆形，分开时两半细胞核互为镜像，N/C比可能有轻微改变；

8.核膜平滑；

9.细胞核染色质(轻微增多)呈细粒状，偶然有染色中心；和

10.纤维细胞，具伸展的细胞质和清晰细胞核核膜的拉长细胞--精细网状至粒状的细胞质通常呈现出嫩黄橙色--个别角质化，可能在角蛋白中心周围形成螺纹而造成上皮珠状物。

中度发育异常(鳞片状非典型)。如果满足以下标准，该细胞则被确定为中度发育异常：

1.大小有改变，该变化通常比轻微发育异常的大，但也可能小；

2.在形状和N/C比方面比轻微发育异常有更大的变化；

3.细胞质密度大，嗜酸性占优势；非典型细胞数量增多；

4.细胞核可能具有不对称的两半(非镜像的)；

5.存在核小裂片、裂缝和结节；和

6.细胞核物质可能具有更多点刻样染色质图案而显示染色质过多。

严重发育异常(显著的鳞片状非典型)。如果满足以下标准，该细胞则被确定为严重地发育异常：

1.细胞的大小和形状发生显著改变；

2.细胞大小通常比中度发育异常的稍大；

3.具有高的但(极度)易变的N/C比；

4.单一细胞占优势；细胞核比CIS更居于中心；

5.细胞核可能随细胞质形状发生改变；细胞核显示低于CIS的变形；

6.细胞核同质多形现象增多，表现为粗糙的细胞质沿着细胞核包膜凝结；

7.副染色质，大细胞核，多核簇(multi-nuclustered)细胞核膜有焦点地增厚；和

8.细胞表现为嗜酸的细胞质占优势。

癌原位鳞片状(CIS，非扩散的)。如果满足以下标准，该细胞则被确定为癌原位鳞片状：

1.细胞单一存在或聚集(细胞丛)；

2.细胞大小有改变，可能小于或大于显著发育异常的细胞，而通常小于扩散的鳞片状癌细胞；

3.细胞巨大、呈圆形，并具有对称分布的细胞核；

4.可能表现出细胞退化；

5.不足的细胞质分布均一地集中在细胞核周围，其可能角质化或无角质化，(嗜橙黄或嗜碱性的)

6.N/C比有改变--高于或低于正常值；

7.粗而稠密的细胞核染色质颗粒可能被清晰的环带阻断；

8.染色质的边缘均匀增厚，而细胞核膜有波状起伏；

9.可见细胞核分成小裂片；

10.可见互相吞并，但不常见；

11.可存在多核细胞；

12.细胞核无核仁；可存在有丝分裂细胞；和

13.背景干净。

鳞片状细胞癌(充分区分的角质化型-扩散的)。如果满足以下标准，该细胞则被确定为鳞片状细胞癌：

1.细胞通常为单一、嗜橙黄性的，但也可能为细胞丛，并有退化；

2.细胞大或小，具棱角，具有保留完好的细胞核和清晰的细胞边缘；

3.细胞通常大于原位，并可能为多形的，大小和形状具有较大的范围；

4.可见珠状物形成(癌珠状物)；

5.中等数量的细胞质，有异常的“拖尾”(与扩散一致)；奇异的细胞形状-蝌蚪状，星状，纺锤状；细胞核染色质具棱角，具有不可预知的染色质过多和副染色质清除的团块，并具有清晰界定的染色质与副染色质的分界面；

6.染色质为粗糙的团块，尤其沿着细胞核核膜；

7.如果存在，细胞核仁是巨大并且嗜酸的；

8.细胞核核膜自身可能增厚且不规则；细胞核染色质边缘厚度不规则；

9.N/C比非常高；

10.核仁在形状、大小、数量(子核仁)上具有显著的不规则性；异常的有丝分裂，多核现象；

11.常见有互相吞并和多核现象；和

12.常见有坏死的背景物质。

结果

在一个有60个样本被检查的盲法研究中，其结果表明与PAP染色程序相比，反常细胞(轻微的、中度的或严重的发育异常或癌的)可用上述TCPP检测过程精确地检测(表1)。如果暴露于TCPP的细胞中有2-3％发荧光，则该样本至少与轻微发育异常的诊断可靠地相关。通过标准细胞形态学的PAP染色程序检测为轻微发育异常至癌的50例痰样本，同样也被TCPP检测法确定为是反常的。在10例被PAP染色程序确定为正常或转化的样本中，4例样本应用TCPP方法验证为相同的形态结构。诊断为正常的样本显示极低的或没有TCPP摄取。

通过细胞形态学诊断为阴性或转化的细胞中的TCPP摄取具有特有的荧光强度和模式，该特征可被识别并可用于诊断。表2显示了分别通过PAP染色细胞形态学和TCPP技术检测的细胞形态和荧光之间的比较。依据TCPP处理过的细胞样本的荧光强度和模式，将细胞归入与形态描述有关的14种可能的编号分类之一中。如果细胞应用TCPP检测法被分为第11类，并载物片上少于2-3％的细胞是高于背景水平荧光的，则该样本被确定为转化的而非发育异常的。转化的细胞通过其中度的荧光和几乎不可见的细胞膜可以容易地区分于正常细胞。在10例被PAP染色确定为阴性或转化的细胞样本中，6例基于TCPP荧光被确定为细胞描述第11类。这6例被确定为第11类的TCPP样本中，有3例还显示出了来自细胞核碎片的荧光(即第13类或者第14类)，有2例还显示出了第10类的指示(荧光仅来自细胞核)。

表2显示的另一个模式涉及数字分类6-不规则的anisoid细胞，低到中等的荧光。值得注意的是相对很少的发育异常的细胞被确定为该分类，而大部分癌细胞为分类6。因此，该分类被认为在应用本发明所述方法区分癌细胞与发育异常细胞中是特别重要的。

观测表2显示的数据得到的另一个重要的结论是，与细胞从正常到严重癌的形态学发展一样，每一检测细胞可归属的数字分类的总数目也相应增加。举例说明，具有阴性或转化形态的细胞归属平均2个数字分类，而呈现腺癌、鳞片状细胞癌和小细胞癌的细胞归属平均5个数字分类。因为该数字分类包含对不同种类细胞反常的描述，所以发育异常或癌的程度和细胞中观测到的不同反常的数目之间呈正相关是合理的。然而，这种相关性迄今为止还没有被系统化和应用于诊断细胞样本中癌前期和癌的状态。

表1.TCPP结果和细胞形态结果之间的相关性

                                         N＝60

                               应用TCPP测定形态的载物片/应

 诊断描述                      用细胞形态学测定形态的载物片

阴性或转化                               4/10

轻微发育异常                             12/12

中度发育异常                             9/9

严重发育异常                             8/8

原位癌                                   11/11

腺癌、鳞片状细胞和小细胞癌               10/10

表2.细胞描述：细胞形态学特征和TCPP荧光

                                               通过TCPP荧光显微法测定细胞数字描述的样本数量/通过细胞形态学测

                                                                    定细胞描述的样本数量

                                            阴性或转    轻微发育    中度发    严重发育    原位癌    腺癌、鳞片状细

                                             化          异常        育异常    异常                  胞和小细胞癌

      分类号＝细胞描述                       (n＝10)     (n＝12)     (n＝9)    (n＝8)      (n＝11)   (n＝10)

1＝大的细胞核，低度到中度荧光                3/10        12/12       9/9       7/8         10/11     6/10

2＝对称的二核细胞，中度荧光                  0/10        5/12        5/9       3/8         3/11      2/10

3＝小的椭圆细胞，中度到高度荧光              0/10        4/12        4/9       2/8         6/11      6/10

4＝小的圆形细胞，低度荧光                    0/10        0/12        0/9       0/8         0/11      2/10

5＝多核细胞，中度荧光                        0/10        0/12        3/9       6/8         9/11      7/10

6＝不规则的anisoid细胞，低度到中度荧光       0/10        0/12        1/9       1/8         10/11     7/10

7＝细胞丛，中度到高度荧光                    0/10        0/12        1/9       0/8         1/11      3/10

8＝退化的单一细胞，中度到高度荧光            0/10        0/12        0/9       0/8         4/11      7/10

9＝退化的细胞丛，中度到高度荧光              0/10        0/12        0/9       0/8         1/11      4/10

10＝细胞大小均一并具小的圆形细胞核，中       2/10        2/12        2/9       1/8         1/11      2/10

度荧光(仅来自细胞核)

11＝细胞膜几乎不可见，中度荧光               6/10        6/12        2/9       2/8         2/11      0/10

12＝细胞核碎片团块，无荧光                   0/10        1/12        0/9       0/8         0/11      0/10

13＝细胞核碎片背景，无荧光                   6/10        5/12        8/9       2/8         5/11      3/10

14＝细胞核碎片背景，中度荧光                 1/10        2/12        2/9       1/8         1/11      0/10

平均值#每一被检细胞的数字描述                1.80        3.08        4.11      3.13        4.82      4.90

每一细胞样本可用上述用于TCPP处理过细胞的14种数字细胞描述中的一种以上的描述来指定。

实施例2

应用TCPP检测并分离癌前期细胞和癌细胞的悬浮实验

此例子公开了TCPP染色结合荧光流量细胞计数与细胞形态学的载物片显微镜法用于检测痰样本中细胞反常性的应用。借由TCPP染色专属性的优点，结合流量细胞计数及随后的载物片显微镜法是特别有效的，并提供了一种用于细胞形态学的载物片对照的内部对照。

方法

制备悬浮液和单层载物片的过程中使用的痰处理程序。所有悬浮液和单层载物片均由痰样本制备，所述痰样本是患者于早晨以自然咳出方法采集到的。特别地，患者被指示于连续三天早晨咳出无论什么物质到指定容器中，该容器中装有由50％醇/50％Saccomanno液体中2％Carbowax组成的固定剂和0.03-0.05mg/ml利福平。利福平作为预防患者携带有结核分枝杆菌或那些可能是无症状的脑膜炎奈瑟氏球菌携带者的预防药而被加入到上述固定剂溶液中。

所述2％Carbowax溶液通过加入2ml熔化的Carbowax(150)到98ml 50％乙醇中并混合30分钟制备。将用于制备溶液的玻璃器皿保温以防止制备过程中表面的蜡状物变硬而使测量不准确。在暴露于TCPP T作溶液之前，通过浸入95％醇中至少15分钟除去Carbowax。

利福平溶液(3mg/ml)通过溶解300mg利福平胶囊于100ml乙醇并在韦林氏搀合器里高速混合制备。每30ml Saccomanno溶液加入1ml此溶液，或每升Saccomanno溶液加入到20ml此溶液并彻底混合。Saccomanno溶液的制备依据细胞学领域中技术人员所熟知的标准方法操作。

将所述痰样本倾注到50ml的塑胶离心管中，如果需要另外加入50％乙醇溶液使体积达到50ml。将离心管内容物倾注到250ml的Eberbach半微量搀合器容器中，并均化10-60秒，均化时间取决于样本的目测检查和粘液样成分。粘稠的粘液样本有时要求更长的混合时间。然后将样本倾注回上述离心管中并低速离心10分钟。轻轻倒出上层清液，留下1至2ml在离心管中与细胞颗粒混合。将该离心管在漩涡混合器上震荡大约10秒钟。将该样本再悬浮于100mM MES缓冲液，pH～6.15。所述细胞用100mM MES缓冲液旋转并漂洗两次以上，最后一次留下～1ml在所述用于细胞再悬浮的离心管中。然后在室温下(～20℃)将该细胞再悬浮于15ml 95％乙醇(5％100mM MES缓冲液)中30分钟，并缓慢搅拌。之后将该离心管低速离心10分钟。除留下1-2ml外其余上层清液全部除去。

TCPP储备液。将400mg碳酸氢钠加入到大约90ml 50％异丙醇(50mM碳酸氢钠)中并混合至完全溶解，得到碱化的50％异丙醇。将100mg TCPP缓慢加入到上述碱化的50％异丙醇(50mM碳酸氢钠)中并混合3至5分钟直至溶解。用上述碱化的50％异丙醇将该TCPP溶液定容至100ml，混合均匀后存放于用箔包裹的棕色试剂瓶中，冷藏保存。储备液中TCPP的终浓度为1mg/ml。

TCPP工作溶液。每天配制新鲜的TCPP工作溶液。将大约10ml浓度为1mg/ml的TCPP储备液移到室温下。取8ml的TCPP储备液(1mg/ml)至200ml容量瓶中，然后缓慢加入大约100ml MES缓冲液。轻轻混合上述溶液。加入额外的MES缓冲液定容至200ml。混合该溶液3至5分钟后装于棕色瓶中于2-4℃下存放。工作溶液中TCPP的终浓度为40μg/ml。

TCPP暴露过程。将预先在室温下暴露于95％醇中30分钟的悬浮细胞在固定后立即或于3天后暴露于TCPP中。将该细胞在36℃下再悬浮于10ml 40μg/ml的TCPP溶液中10分钟，并缓慢搅拌，然后用20ml室温下的100mM MES缓冲液洗涤3次，洗涤中使用离心操作在最小速度下处理不超过10分钟以使细胞颗粒疏松。将洗涤后的细胞颗粒再悬浮于15-10ml MES缓冲液中。将这些悬浮液，或其等份试样通过荧光流量细胞计数仪。

荧光流量细胞计数。首次通过。借助其细胞分类性能使最小量的10,000个细胞通过流量细胞计数仪。所述流量细胞计数仪应配备有提供发光在大约415nm的光源，和允许介于大约390nm到490nm之间的光通过的滤光器。监测介于大约630nm到730nm之间的荧光发射(最大发射在645nm和706nm)。可通过500nm以上光的屏蔽滤光器是符合要求的。在首次通过中，个别细胞被计数，并且其特定的荧光被测量。计算荧光平均值和与该均值的标准偏差。另外，测定中值(比一半数值小并比另一半数值大的特定荧光值)。

具细胞分类的荧光流量细胞计数。第二次通过。最小量的100,000个细胞通过所述有细胞分类性能的荧光流量细胞计数仪，与首次通过的配备相同。具有小于中值荧光+1.3相对于平均数标准偏差的细胞(约90％的细胞)在操作上被定为具有低度荧光，并贮存于一个试管中，而具有大于或等于中值荧光+1.3相对于平均数标准偏差的细胞(约10％的细胞)在操作上被定为具有高度荧光，并贮存于另一试管中。替代性地，可以根据其相对于首次通过时发现的中值特定荧光的荧光将细胞分类到试管中。具有少于两倍中值特定荧光的细胞是“正常”或低度荧光的，然后将具有2-4倍中值荧光、4-6倍中值荧光和大于6倍中值荧光的细胞分别集中于小池中。每个较高荧光强度的小池希望收集更多的反常细胞。如果多于2-3％的细胞具有超过3倍中值荧光，则可作为至少是癌前期状态晚期的推测依据。

单层载物片的制备。将上述具有低度-和高度荧光的细胞样本低转速离心10分钟使细胞成粒状。除去上层清液，留下1-2ml在离心管中和细胞颗粒混合。将该离心管在漩涡混合器上震荡大约10秒钟。加入1至3滴该沉淀物到PreservCyt小瓶(Cytyc公司，Marlborough，MA)中。培养上述样本5分钟以灭活所有细菌和病毒的有机体。

依据厂商说明应用Thinprep处理器(Cytyc公司，Marlborough，MA)将样本的单细胞层固定于载物片上。在Thinprep处理器中，细胞被收集于聚碳酸酯过滤器(孔径0.5mm)上，并转移至玻璃载物片上。然后Thinprep处理器立即将载物片沉浸到含有95％乙醇的固定剂浴液中(保持30分钟)。

通过改进PAP染色技术进行的痰液载物片染色程序。以下列出程序次序(编号)，试剂和时间(分钟:秒)：(1)95％醇15:00；(2)自来水1:00；(3)gil-i hemotox 2:30；(4)自来水1:00；(5)上蓝剂：30；(6)自来水1:00；(7)95％醇：10；(8)og-6 1:30；(9)95％醇：10；(10)95％醇：10；(11)ea-50 1:15；(12)95％醇：20；(13)95％醇：30；(14)100％醇1:00；(15)100％醇1:00；(16)100％醇1:30；(17)二甲苯1:00；(18)二甲苯1:00；和(19)二甲苯1:00。

巴氏染色载物片的常规细胞病理学分析方法。PAP染色载物片经历半定量的细胞形态学评估。(1)通过应用传统形态学标准识别发育异常的和瘤形成的细胞，然后(2)计数肺部炎症的7个基本指标(肺泡的巨噬细胞，嗜中性粒细胞，柱状细胞，粘液，粘液螺旋，被着色的巨噬细胞，转化细胞)的表达水平。定量这些炎症指标的方法已在之前的文献讨论过(Robyd等，1989，Acta Cytol 34：147-154；Roby等，1990，Acta Cytol 34：140-146；Schumann等，1989，Am Rev Respr Dis139：601-603)。用于使用PAP染色细胞学检测细胞形态学的标准将在后文讨论。

无显著性的反常。如果满足以下标准，该细胞则被确定为无显著性的反常：

1.除炎症细胞外还有混有1-2级色素巨噬细胞的嗜碱性、有纤毛的上皮细胞；

2.基础取向的上皮细胞圆形细胞核；

3.染色质均匀分布；

4.不明显的核膜；

5.不明显的核仁；且无转化和发育异常的细胞存在。

鳞片状转化(无发育异常)。如果满足以下标准，该细胞则被确定为无发育异常的鳞片状转化：

1.无纤毛的嗜碱性细胞丛；

2.均一的细胞和核大小；

3.低的细胞核/细胞质(N/C)比例；

4.细胞核的染色质呈细粒；和

5.可存在小的圆形细胞核(通常为单一的)。

轻微发育异常(鳞片状非典型)。如果满足以下标准，该细胞则被确定为轻微地发育异常：

1.比转化的细胞小；

2.可见粘着的细胞丛，或单独地；

3.细胞处于扁的(薄片)状态，其细胞核和细胞质清晰可见；

4.细胞大小有轻微变化；

5.细胞质可为嗜曙红的或嗜碱性的；

6.细胞质的边缘清晰；

7.细胞核大小有轻微变化，通常为圆形至卵圆形，分成两半时的细胞核互为镜像，N/C比可能有轻微改变；

8.核膜平滑；

9.细胞核染色质(轻微增多)呈细粒，偶然有染色中心；和

10.纤维细胞，具伸展的细胞质和清晰细胞核核膜的拉长细胞--精细网状至粒状的细胞质通常呈现出嫩黄橙色--个别角质化，可能在角蛋白中心周围形成螺纹而造成上皮珠状物。

中度发育异常(鳞片状非典型)。如果满足以下标准，该细胞则被确定为中度地发育异常：

1.大小有改变，该变化通常比轻微发育异常的大，但也可能小；

2.在形状和N/C比方面比轻微发育异常有更大的变化；

3.细胞质密度大，嗜酸性占优势；非典型细胞数量增多；

4.细胞核可能具有不对称的两半(非镜像的)；

5.存在细胞核小叶片、裂缝和结节；和

6.细胞核物质可能具有更多点刻样染色质图案而显示染色质过多。

严重发育异常(显著的鳞片状非典型)。如果满足以下标准，该细胞则被确定为严重地发育异常：

1.细胞的大小和形状发生显著改变；

2.细胞大小通常比中度发育异常的稍大；

3.具有高的但(极度)易变的N/C比；

4.单一细胞占优势；细胞核比CIS更居于中心；

5.细胞核可能随细胞质形状发生改变；细胞核显示低于CIS的变形；

6.细胞核同质多形现象增多，存在粗糙的细胞质和沿着细胞核包膜凝结；

7.副染色质，大细胞核，多核簇细胞核膜有焦点地增厚；和

8.细胞表现为嗜酸的细胞质占优势。

癌原位鳞片状(CIS，非扩散的)。如果满足以下标准，该细胞则被确定为癌原位鳞片状：

1.细胞单一存在或聚集(细胞丛)；

2.细胞大小可变，可能小于或大于显著发育异常的细胞，而通常小于扩散的鳞片状癌细胞；

3.细胞巨大、呈圆形，并具有对称分布的细胞核；

4.可能存在细胞退化；

5.不足的细胞质分布均一地集中在细胞核周围，其可能角质化或无角质化，(嗜橙黄或嗜碱性的)

6.N/C比可变--高于或低于正常值；

7.粗而稠密的细胞核染色质颗粒可能被清晰的区带间断；

8.染色质的边缘均匀增厚，而细胞核膜有波状起伏；

9.可见细胞核分成小裂片；

10.可见互相吞并，但不常见；

11.可存在多核细胞；

12.细胞核无核仁；可见有丝分裂细胞；和

13.背景干净。

鳞片状细胞癌(充分区分的角质化型-扩散的)。如果满足以下标准，该细胞则被确定为鳞片状细胞癌：

1.细胞通常单一存在，嗜橙黄，但也可能为细胞丛，并有退化；

2.细胞大或小，具棱角，具有保留完好的细胞核和清晰的细胞边缘；

3.细胞通常大于原位，并可能为多形的，大小和形状具有较大的范围；

4.可见珠状物形成(癌珠状物)；

5.中等数量的细胞质，有异常的“拖尾”(与扩散一致)；奇异的细胞形状-蝌蚪状，星状，纺锤状；细胞核染色质具棱角，具有不可预知的染色质过多和副染色质清除的团块，并具有清晰界定的染色质与副染色质的分界面；

6.染色质为粗糙的团块，尤其沿着细胞核核膜；

7.如果存在，细胞核仁是巨大并且嗜酸的；

8.细胞核核膜自身可能增厚且不规则；细胞核染色质边缘厚度不规则；

9.N/C比非常高；

10.细胞核仁在形状、大小、数量(子核仁)上具有显著的不规则性；反常的有丝分裂，多核现象；

11.常见有互相吞并和多核现象；和

12.常见有坏死的背景物质。

细胞病理学分析。因为痰样本中含有来自肺部许多部位的细胞，它们彼此之间散置，所以几乎没有用来判断特定细胞正常或反常的背景(不同于薄切片染色的情况)。低度荧光细胞收集的可能性提供了正常或基本正常的患者细胞的内部对照样品，以此比较高度荧光的TCPP染色细胞。应用标准PAP染色，本领域中的专业细胞病理学家可以容易地确定该具有高度TCPP荧光的细胞的反常程度，与未分级分离的单层相比，所述具有高度TCPP荧光的细胞富集10倍反常细胞。

本发明不限于上文描述和例举的实施方案，而是可以在所附权利要求范围内演变和修改的。

Claims (48)

1.一种检测细胞样本中是否含有发育异常或癌细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a.将样本与TCPP溶液在允许TCPP与可能存在的反常癌前期或癌细胞组分结合的条件下接触；

b.从上述样本中去除未结合的TCPP；和

c.检测该样本中的TCPP荧光，所述TCPP荧光的存在表示该细胞含有发育异常或癌细胞。

2.如权利要求1的方法，其中所述样本选自痰样本、子宫颈拭子、支气管冲洗物、甲状腺和乳房的细针吸取和中心活组织检查样本、膀胱冲洗物、尿液、口腔冲洗物、大便样本、血液或其组分、淋巴液、脑脊液、骨和骨髓。

3.如权利要求1的方法，其中所述样本被固定于固定剂中，该固定剂选自甲醛、甲醇、乙醇、异丙醇和它们的任一组合。

4.如权利要求3的方法，其中所述固定剂是95％乙醇。

5.如权利要求1的方法，其中所述样本被粘着于固相载体上。

6.如权利要求5的方法，其中所述固相载体是显微镜载物片。

7.如权利要求1的方法，其中所述样本被悬浮于液体介质中。

8.如权利要求1的方法，其中所述TCPP溶液包括预先溶解于碱化的醇中并稀释于含有缓冲剂的水溶液中的TCPP。

9.如权利要求8的方法，其中所述TCPP溶液用缓冲剂处理成pH介于大约5.8到大约6.7之间。

10.如权利要求8的方法，其中所述溶液还含有一种或多种试剂，所述试剂用于降低背景荧光、抑制TCPP氧化或抑制TCPP荧光淬灭。

11.如权利要求1的方法，其中所述样本中TCPP的浓度介于大约4到大约100μg/ml。

12.如权利要求1的方法，其中所述样本与TCPP接触时间介于大约0.2分钟到大约2小时。

13.如权利要求1的方法，其中，在接触期间，所述样本的温度保持在大约23℃到大约42℃之间。

14.如权利要求5的方法，其中所述样本中的TCPP荧光经目测检测。

15.如权利要求5的方法，其中所述样本中的TCPP荧光经载物片读数器检测。

16.如权利要求7的方法，其中所述TCPP荧光经荧光流量细胞计数仪检测。

17.如权利要求1的方法，其中所述检测步骤在去除步骤后大约1小时到大约24小时之间进行。

18.如权利要求1的方法，还包括检测样本中具有TCPP荧光的细胞百分比的步骤。

19.如权利要求18的方法，其中将含有多于大约1％荧光细胞的样本分类为含有反常癌前期或癌细胞。

20.如权利要求18的方法，其中所述检测样本中具有TCPP荧光的细胞百分比的步骤包括定量样本中的TCPP荧光强度，所用定量方式是使该荧光强度与样本中含有TCPP的细胞百分比相关联。

21.如权利要求20的方法，其中TCPP荧光的定量如下进行：将样本与可检测的可与样本中所有细胞结合的标记接触，除去未结合的可检测标记，并确定样本中TCPP荧光和上述可检测标记数量的比值。

22.如权利要求21的方法，其中所述可检测的标记是荧光性化合物。

23.如权利要求1的方法，该方法还包括在检测样本中TCPP荧光的基础上，将荧光性细胞表征为转化、发育异常或癌。

24.如权利要求23的方法，其中所述表征过程包括将荧光性细胞的荧光强度分类，并将该荧光强度与上述细胞的转化、发育异常或癌的状态相关联。

25.如权利要求23的方法，其中所述表征过程包括将荧光性细胞在一种或多种形态学特征方面分类，所述一种或多种形态学特征选自细胞形状、细胞大小、细胞成簇、细胞退化或细胞丛的数量、细胞核数量、细胞核大小、细胞膜可见性和细胞核碎片的在，以及将该形态学特征与上述细胞的转化、发育异常或癌的状态相关联。

26.如权利要求23的方法，其中所述表征过程包括将荧光性细胞在荧光强度方面和一种或多种形态学特征方面分类，所述一种或多种形态学特征包括细胞形状、细胞大小、细胞成簇、细胞退化或细胞丛的数量、细胞核数量、细胞核大小、细胞膜可见性和细胞核碎片的存在，以及将该荧光强度和形态学特征与上述细胞的转化、发育异常或癌的状态相关联。

27.如权利要求26的方法，其中所述荧光性细胞表现出的形态学特征和荧光强度的总数目作为一个因素应用于将该荧光性细胞表征为转化、发育异常或癌。

28.如权利要求26的方法，其中所述形态学特征和荧光强度的模式作为一个因素应用于将所述荧光性细胞征为转化、发育异常或癌。

29.如权利要求23的方法，其中将所述样本中的荧光性细胞与非荧光性细胞作比较，所述非荧光性细胞来自同一样本或来自同一患者的第二份样本。

30.如权利要求29的方法，其中所述荧光性细胞通过荧光流量细胞计数与非荧光性细胞分离。

31.一种诊断患者的选定组织或器官处于早期癌或癌前期状态的方法，其包括：

a.从选定的组织或器官中获取细胞样本；并且

b.用权利要求1的方法检测上述细胞样本是否含有反常癌前期或癌细胞，其中阳性检测表示患者的选定组织或器官有关早期癌或癌前期状态的诊断为阳性。

32.一种预测患者对癌治疗反应的方法，其包括：

a.在治疗前，对来自患者被视为癌的组织或器官的细胞样本实行权利要求1的方法；

b.在治疗中和治疗以后不时地对来自患者被视为癌的组织或器官的另一份细胞样本实行权利要求1的方法；并且

c.确定治疗中和治疗以后检测样本中反常癌前期或癌细胞的百分比是否比治疗前检测样本有所降低，降低预示患者对癌治疗有反应。

33.如权利要求32的方法，还包括通过荧光流量细胞计数将细胞分离为含有正常细胞的群体和含有反常癌前期和癌细胞的群体。

34.一种预测患者对癌治疗反应的方法，其包括以下步骤：

a.在治疗前，对来自患者被视为癌的组织或器官的未固定的细胞样本实行权利要求1的方法；

b.通过荧光流量细胞计数将上述细胞分离为低度或无荧光群体和高度荧光的群体，所述低度或无荧光的群体是正常或转化的细胞，高度荧光的群体是发育异常或癌细胞；

c.在体外用可能的癌治疗剂处理上述被分离的细胞群；并且

d.观察所述试剂对所述两细胞群中每一群的作用，如果所述试剂在发育异常的或癌细胞群中显示预期的抑制作用，并且不对正常细胞组有该作用或作用较小，则预示患者对癌治疗有反应。

35.一种在患者的选定靶组织中检测发育异常或癌细胞的方法，其包括以下步骤：

a.在允许TCPP与可能存在的发育异常或癌细胞组分结合的条件下向所述靶组织输入TCPP溶液；

b.从上述靶组织中除去未结合的TCPP；并且

c.检测该靶组织细胞中的TCPP荧光，此处TCPP荧光的存在可预示所述靶组织含有发育异常或癌细胞。

36.如权利要求35的方法，其中所述靶组织选自肺、乳房、前列腺、子宫颈、咽喉、膀胱、口咽、皮肤和胃肠道。

37.一种制备TCPP溶液的方法，其包括溶解TCPP于含水醇溶液中，该醇溶液含有大约50％到大约90％的醇，pH介于大约8.5到大约12.0之间。

38.如权利要求37的方法，其中所述醇是异丙醇。

39.如权利要求37的方法，其中所述pH用碳酸氢钠或氢氧化铵调节。

40.如权利要求37的方法，其中所述溶解的TCPP为大约2mg/ml或更少。

41.一种组合物，其包括溶解于含水醇溶液中的TCPP，该醇溶液含有大约50％到大约90％的醇，pH介于大约8.5到大约12.0之间。

42.如权利要求41的组合物，其中所述溶液中TCPP的浓度是大约2mg/ml或更低。

43.如权利要求41的组合物，其中所述醇是异丙醇。

44.如权利要求41的组合物，其中pH用碳酸氢钠或氢氧化铵调节。

45.如权利要求41的组合物，其包括溶于50％异丙醇和50mM碳酸氢钠的1mg/ml TCPP。

46.一种用于检测样本中发育异常或癌细胞的试剂盒，其包括装于容器中的TCPP和它用于检测样本中反常癌前期或癌细胞的用法说明书。

47.如权利要求46的试剂盒，其包括权利要求41的组合物。

48.如权利要求46的试剂盒，还包括下列一种或多种组件：

a.用于采集细胞样本的组件；

b.用于将样本粘着到固相载体上的组件；

c.已知的癌、发育异常、转化或正常状态的对照细胞样本；和

d.用于定量TCPP荧光的组件。