MXPA03004406A - Composiciones y metodos para detectar condiciones pre-cancerosas en muestras de celulas y tejidos usando 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxifenil) porfina. - Google Patents

Abstract

Se presenta un metodo para detectar estados precancerosos en muestras de celulas y tejidos de mamifero que comprende incubar una muestra con 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxifenil) porfina (TCPP) solubilizada, medir la fluorescencia de TCPP en la muestra y categorizar la muestra, y catagorizar la muestra como no cancerosa, precancerosa o cancerosa con base en la fluorescencia de TCPP, segun se correlaciona con los estados respectivos de las celulas. Junto con el metodo, se presenta un metodo de deteccion novedoso y mas eficiente de TCPP para solubilizar TCPP, asi como una composicion que comprende TCPP solubilizada mediante este metodo.

Description

COMPOSICIONES Y METODOS PARA DETECTAR CONDICIONES PRE- CANCEROSAS EN MU ESTRAS DE CÉLULAS Y TEJIDOS USANDO 5,10,15,20-TETRAKIS(CARBOXIFENIL) PORFINA Solicitudes relacionadas La presente solicitud reclama prioridad de la solicitud provisional pendiente 60/249,505, presentada el 17 de noviembre de 2000, titulada "Method of Detecting Pre-Cancerous Conditions in Human Tissue Samples Using 5, 10, 15,20-tetrakis (Carboxyphenil) Porphine" (Método para detectar condiciones pre-cancerosas en muestras de tejido humano usando 5, 10, 15,20-tetrakis(carboxifenil) porfina), cuya totalidad es incorporada en la presente por referencia.

Campo de la invención Esta invención se refiere al uso de ciertas porfirinas para detectar células diplásticas, pre-cancerosas y cancerosas a partir de varias muestras de tejido tanto in vitro como in situ.

Antecedentes de la invención Varios artículos científicos y escolares son referidos en paréntesis a lo largo de la especificación. Estos artículos son incorporados por referencia en la presente para describir el estado de la técnica a la cual pertenece esta invención. Los patólogos, quienes examinan la progresión de la enfermedad y analizan muestras de tejido por anormalidades, incluyendo cáncer, han determinado que una condición celular llamada displasia, la cual se refiere a la formación o maduración anormal de células, puede identificar potencialmente células en una condición pre-cancerosa. La displasia sin checar, puede progresar a través de etapas suave, moderada y severa y eventualmente a cáncer. Aproximadamente uno a siete de los casos moderados de displasia progresará a cáncer, y tantos como 83% de los casos con displasia severa han sido reportados como que progresan a cáncer, dependiendo de los tipos de células involucradas . Si n embargo, la remoción de displasias suaves y moderadas reduce enormemente el desarrollo de cáncer. En el pulmón , la remoción de células displásticas no solo reduce enormemente la formación de células cancerosas, pero en algu nos casos el tejido pulmonar regresará a la morfología normal. En general, mientras más pronto sean detectados los cánceres , mejor es el pronóstico para la supervivencia del paciente. Si un cáncer de pecho es detectado de manera tem prana cuando todavía está localizado en una sola masa. La tasa de supervivencia de cinco años es mayor que 96% . Cuando se esparce a una ubicación distante, la tasa de supervivencia de cinco años es menor que 20%. Para cáncer de pulmón, cuando es detectado como una sola masa, la supervivencia de 5 años es más de 46%. Cuando se ha esparcido, la supervivencia de cinco años es menor que 14%. Para cáncer cervical, una mejora adicional en la supervivencia ocurre cuando los cambios pre-cancerosos son encontrados y tratados antes de desarrollarse en una etapa más severa (Boring and Squires 1 993, CA Cáncer J Clin 43:7-26 y Ferguson 1990, Hematol Oncol Clin N Am 4: 1 053-1 68).

El carcinoma de pulmón es actualmente la causa principal de mortalidad por cáncer entre los hombres y las mujeres en Estados Unidos (Wingo et al. , 1995, CA Clínica! J Clin 45:8-30). En 1997, se estimaron unas 160,000 muertes por cáncer de pulmón, considerando 12% de todas las muertes por cáncer en hombres estadounidenses y 2% en mujeres estadounidenses (Boring & Squires 1993, supra). El cáncer de pulmón también es uno de los tipos de cáncer más letales, como es reflejado en una tasa de supervivencia de cinco años de solo 14%. El pobre pronóstico para pacientes con cáncer de pulmón, en relación a otros tipos de cáncer humano, es debido mayormente a la falta de métodos de detección temprana efectivos. En el momento de la presentación clínica (sintomática), alrededor de dos tercios de todos los pacientes tienen complicación de nodulos regionales o metástasis distante, ambas usualmente incurables. En estudios de pacientes con cáncer de pulmón localizado (Etapa 0 o 1 ), sin embargo, las tasas de supervivencia de 5 años han variado desde 40% hasta 70% (Boring & Squires, 1993, supra; Ferguson, 1990, supra). De manera histórica, las únicas pruebas diagnósticas usadas para detectar cáncer de pulmón antes de que ocurrieran los síntomas han sido citolog ía de esputo y radiografía de pecho. Como una consecuencia, la eficacia de estas pruebas como herramientas de clasificación de masa ha sido evaluada extensamente en estudios durante las varias décadas pasadas. Ambas pruebas detectan carcinoma presintomático, de etapa temprana, en particular carcinoma de células escamosas. Las mejoras en los métodos de clasificación se han centrado mayormente alrededor de mejorar la utilidad de la citología de esputo a través de avances tecnolgócios en microscopía. La citología de esputo requiere un examen visual de una muestra de células durante la cual, el tamaño, forma, organicación de células, y una proporción entre el tamaño del núcleo de la célula y el citoplasma, se usan para determinar la morfología de la célula. Debido a que esta valoración de la morfología celular requiere una insepcción y clasificación visual, la técnica requiere una cantidad significativa de experiencia a favor del observador clínico. Se han conducido varias investigaciones con resultados que sugieren que el análisis de imágenes de alta resolución, asistido por computadora, permite la detección de cambios subvisuales en núcleos visualmente normales asociados con varios tipos de tejido (Montag et al. 1991, Anal Quant Cytol Histol 13:159-167; Haroske et al. 1998, Arch Gesc wulstforsch, 58:159-168; Hutchinson et al. 1992, Anal Quant Cytol Estol 4:330-334). El análisis asistido por computadora de la distribución de DNA en muestras de células proporcionó 74% de la clasificación morfológica correcta de núcleos sin revisión humana del material y sin la necesidad de estar presentes núcleos visualmente anormales cuando se compara con pruebas citológicas estándares. La valoración morfológica de los especímenes citológicos también ha sido mejorada debido a los avances en el entendimiento de la patología de tumor de pulmón. Mucho de este trabajo se ha centrado en la identificación de "biomarcadores". Los biomarcadores se refiere a un amplio rango de anormalidades genéticas y fenotípicas progresivas de la mucosa respiratoria, las cuales pueden usarse para determinar el potencial del epitelio bronquial para transformarse completamente en un tumor malig no. Los marcadores han sido clasificados ampliamente como cambios morfológicos, marcadores inmuno/histoquímicos para proteínas expresadas diferencialmente, marcadores para inestabilidad genómica, marcadores de cambio epigenético (por ejemplo, metilación anormal) y mutaciones de genes (Hirsh et al 1997, Lung Cáncer 17: 163-1 74). Los niveles de expresión de estos marcadores están siendo evaluados ahora en muestras de tejidos cito/histológicos displásticos y neoplásticos recolectadas de poblaciones en alto riesgo. Entre esos especímenes actualmente siendo enfocados para análisis de marcadores exploratorios se encuentra el esputo. El interés en las muestras de esputo para investigación de biomarcadores ha sido generado a partir de la creencia sostenida durante mucho tiempo de que las células exfoliadas recuperadas del esputo pueden ser la indicación posible más tem prana de un carcinoma incipiente, debido a que el cáncer de pulmón muy frecuentemente se desarrolla en el epitelio bronquial. A través de la aplicación de técnicas genéticas moleculares sofisticadas (por ejemplo, ensayos basados en PCR) , los estudios están proporcionando evidencia de que los biomarcadores seleccionados pueden ser detectados en esputo (Mao et al . 1 994, Cáncer Res 54: 1 634-1 637; ao et al. 1994, Proc Nati Acad Sci USA 91 )9871 -9875; Sidransky 1 995, J Nati Cáncer Inst 87: 1201 -1202; Tockman et al. 1988, J Clin Oncol, 1 1 : 1 685-1693; Tockman et al . 1994, Chest, 106:385s-390s) . Los servicios de clasificación o detección de cáncer comercialmente disponibles se basan en pruebas basadas en el diagnóstico citomorfológico por médicos clínicos entrenados, quienes buscan en cada muestra y determinan el grado e identidad de tipos de células anormales. Este proceso no solo es costoso y lento, sino que también introduce el juicio humano y por lo tanto, error en el procedimiento. Recientemente, se ha desarollado un método para detectar células cancerosas del pulmón a través del uso de 5, 10, 15,20-tetrakis(carboxifenil)-porfina (TCPP) (patente estadounidense 5,162,231 para Col et al.). Este método se basa en la propensión de las células cancerosas a acumular TCPP de su ambiente en una mayor cantidad que las células no cancerosas. Sobre la incubación de una muestra celular durante 6-24 horas con 200 µ?/??? de TCPP, la TCPP entró a las células y se unión a la membrana perinuclear y mitocondrias de las células neoplásticas. La TCPP fluoresce bajo luz ultravioleta y las células cancerosas pueden ser diagnosticadas por ello únicamente por la intensidad de la fluorescencia, sin referencia a la morfología. La extensión del uso de este compuesto para identificar condiciones de tejido pre-canceroso (por ejemplo, células displásticas), sería permitir clasificar en poblaciones de alto riesgo para identificar aquellos individuos cuyos tejidos están progresando hacia condiciones de cáncer invasivo, y facilita por ello captar el cáncer o displasia en la etapa más tratable. Las características deseables de tal método de clasificación sería un procedimiento que fuera rápido, no costoso y que requiera un mínimo de experiencia técnica. Por las razones anteriores, existe la necesidad de una técnica y metodolog ía para detectar células displásticas en sus etapas más tempranas. Además, existe la necesidad de una técnica que pueda proporcionar resultados diagnósticos altamente confiables y que no se base en el análisis subjetivo del médico clínico que realiza el diagnóstico.

Breve descripción de la invención La invención se deriva del descubrimiento de que TCPP puede ser usada para detectar células displásticas y precancerosas, así como cancerosas, en conjunción con un método novedoso y más eficiente de solubilizar TCPP, mejorar los procedimientos de manchado y una variedad de estrategias de clasificación celular. La TCPP es un compuesto fluorescente que se ha descubierto que se une a componentes de células precancerosas, así como cancerosas, vivas o fijas, en una manera que permite que el estado de las células y el tejido a partir del cual vienen, sea categorizado en un medio continuo de progresión de enfermedad. Este método de detección de tejidos precancerosos es adecuado para diagnóstivo in vitro de muestras de tejido o células, así como diagnóstico in situ. Un aspecto de la invención es un método para detectar células precancerosas, el cual en su forma más simple comprende incubar células vivas o fijas (es decir, muertas) en una solución de TCPP durante un tiempo suficiente para unirse a los componentes celulares, y detectar la TCPP unida con fluorimetría. Este método tiene muchas variaciones. En una variación, las células se fijan en una superficie, de preferencia, un portaobjetos de microscopio, y muy preferiblemente en una monocapa. En otra variación, las células son tratadas con formalina u otra solución fijadora adecuada, se mantienen en suspensión, se tratan con TCPP, las células son separadas de la TCPP uno unida y entonces son analizadas y clasificadas mediante citometría de flujo. Las modalidades preferidas de) paso de incubación incluyen usar una solución de TCPP con aproximadamente 4 µ?/G?? a 400 µg/m de TCPP, una temperatura entre aproximadamente 23°C y aproximadamente 42°C y un tiempo entre aproximadamente 0.2 minutos a 2 horas. La TCPP no unida es removida y la TCPP restante es detectada fluorimétricamente. En una modalidad preferida, la TCPP es detectada entre aproximadamente 1 y 24 horas después de que el ensayo es realizado. En otra modalidad de la invención, se calcula el porcentaje de células fluorescentes en una muestra celular. Las modalidades preferidas comprenden análisis de células fluorescentes por su intensidad de fluorescencia y otras características citomorfológicas. En una modalidad particularmente preferida, las células fluorescentes son clasificadas de acuerdo con un conjunto de características citomorfológicas e intensidad de fluorescencia pre-deteminadas, lo cual facilita la caracterización de las células a lo largo de un medio continuo que varía desde normal a metaplásticas a displásticas (suave a severamente) a carcinómicas (suave a severamente), y aumenta la eficiencia y confiabilidad del diagnóstico y pronósticos hechos usando los métodos de la invención. Otras modalidades de la invención comprenden separar las células normales o metaplásticas en una muestra de las células displásticas o carcinómicas, usando criterios de intensidad de fluorescencia (por ejemplo, vía citometría de flujo fluorométrico). Con el fin de facilitar la práctica del método de detección antes mencionado, otro aspecto de la presente invención proporciona un método para hacer una solución de TCPP que comprende disolver TCPP en aproximadamente 50% hasta aproximadamente 90% de alcohol a un pH mayor que aproximadamente pH 8.5 y menor que aproximadamente pH 12.5. En una modalidad preferida, el alcohol es isopropanol, y en otra modalidad preferida, el pH de la solución es ajustado con bicarbonato de sodio o hidróxido de amonio. Otro aspecto de la invención es una composición que comprende TCPP en aproximadamente 50% hasta aproximadamente 90% de alcohol a un pH mayor que aproximadamente pH 8.5 y menor que aproximadamente pH 12. En una modalidad preferida, el alcohol es isopropanol, y en otra modalidad preferida, el pH de la solución es ajustado con bicarbonato de sodio o hidróxido de amonio. En una modalidad, la composición es hecha mediante el método de hacer una solución de TCPP. En una modalidad relacionada, la solución de TCPP usada en el método de detección es diluida. En otro aspecto de la invención, las células están in situ dentro de un paciente mamífero. Las células son expuestas a solución de TCPP y la fluorescencia es detectada al usar técnicas endoscópicas. Otro aspecto de la invención es un conjunto para detectar células precancerosas, el cual comprende la composición de la invención en un recipiente. En otra modalidad, el conjunto comprende uno o más componentes adicionales, tales como instrucciones y reactivos para realizar el método de detección de la invención, o controles positivos y negativos.

Otras características y ventajas de la presente invención serán entendidas mejor por referencia a los dibujos, descripción detallada y ejemplos que sigue.

Descripción detallada de la invención La presente invención comprende composiciones y métodos para detectar condiciones precancerosas en células humanas usando 5, 10, 15,20-tetrakis(carboxifenil) porfina (TCPP). La presente invención se deriva del descubrimiento de que la TCPP se une específicamente a células anormales precancerosas, además de células cancerosas, pero no se une a células normales (no cancerosas). Más aún, esta unión diferencias es observada en células fijas, así como células vivas. Además de esta nueva y útil propiedad de TCPP, la invención incorpora adicionalmente un método mejorado para solubilizar TCPP que conserva su actividad a un mayor grado, así como varios aspectos novedosos para hacer al método más adecuado para clasificación y automatización. Usando los métodos de la invención, se requiere menos tiempo para que las células se unan a la TCPP cuando se compara con el método descrito en la patente estadounidense no. 5, 162,231 (por ejemplo; 0.2 min-2 horas versus 24 horas), y también se requiere una concentración menor de TCPP (por ejemplo, 40 g/ml versus 200 µg/ml). Además, puede usarse una monocapa de células en lugar de una solución de células, aunque también puede usarse una solución de células. La clave para la conveniencia y eficiencia del método de detección es el método novedoso para solubilizar la TCPP. Los métodos previos usaron NaOH 1 para disolver la porfirina. Ese método requirió titulación con HCI 1 M, la cual es imprecisa, y requirió que cada solución fuera verificada por TCPP no disuelta. Adicionalmente, el método de NaOH colocó la porfirina en un ambiente oxidante con pH tan alto como 13.0, exponiendo por ello a la porfirina a un alto riesgo de degradación. El método de solubilización de la presente invención usa pH 9.1 en conjunción con la novedosa adición de 90% de alcohol para efectuar una estabilización más completa y confiable. Finalmente, el método de esta invención usa un amortiguador para estabilizar el pH de la solución de TCPP de trabajo final en el rango preferido de 5.8 a 6.8. La invención involucra la detección de células precancerosas y cancerosas en muestras de tejidos humanos que usan la propensión única de estas células para unirse a TCPP en una mayor cantidad que las células saludables. Como se usa en la presente, los términos "precanceroso" o "precanceroso anormal" se refieren a células que exhiben displasia suave a severa, y el término "canceroso" se refiere a células que exhiben carcinoma suave a severo. Estos estados citológicos son definidos morfológicamente en la presente mediante los criterios usados para determinar la morfolog ía celular que usa citología manchada con Papanicalou ("mancha-PAP"). También puede definirse mediante otros indicadores comúnmente usados en la técnica para una célula o tejido particular (por ejemplo, indicadores de inflamación pulmonar en muestras de pulmón o esputo). De "normal" a "severamente carcinómico", los estados de una célula son clasificados en la presente como (1 ) normal (ninguna anormalidad significativa), (2) metaplasia (metaplasia escamosa), (3) displasia suave (atipia escamosa), (4) displasia moderada (atipia escamosa), (5) displasia severa (atipia escamosa marcada), (6) carcinoma in situ escamoso (CIS, no invasivo) (también referido como carcinoma suave a moderado), y (7) carcinoma de células escamosas (bien diferenciado, queratinizante, tipo invasivo) (también referido como carcinoma moderado a severo). Se ha determinado de acuerdo con la invención, que la siguiente exposición a TCPP, células displásticas y carcinómicas exhiben fluorescencia de TCPP, mientras que las células normales exhiben poca o ninguna fluorescencia de TCPP. Algunas células metaplásticas pueden exhibir fluorescencia de TCPP baja a moderada, pero en muchos casos no; de aquí que la fluorescencia de TCPP no es tan confiable como indicador para metaplasia como lo es para displasia y carcinoma. El método comprende (1 ) incubar una muestra de células fijas o vivas con TCPP durante un tiempo suficiente para permitir que la TCPP se una a componentes celulares de células precancerosas anormales o cancerosas, si alguna está presente en la muestra, (2) remover la TCPP no incorporada, (3) determinar mediante fluorimetría la cantidad de TCPP que queda en la muestra, si acaso; y de manera opcional, dependiendo de los resultados del paso (3), (4) evaluar las células fluorescentes de TCPP por su estado de divergencia hacia cáncer desde el estado normal (o meplástico anormal, pero o displástico). De manera específica, como se describe antes, el método de la invención permite una determinación de que una muestra de células contiene células las cuales son displásticas (suave a severamente) o carcinómicas (suave a severamente).

En una modalidad ejemplar, pero no limitante, el método de detección comprende los siguientes pasos: 1 . fijar células en una monocapa en un portaobjetos de microscopio; 2. exponer células a la solución de TCPP a aproximadamente 40 µ?/ml en una solución amortiguada a aproximadamente pH 6.1 (por ejemplo, al sumergir portaobjetos en la solución o al colocar gotas de solución sobre los portaobjetos) a aproximadamente 36°C durante un tiempo específico, como se describe más adelante; 3. lavar los portaobjetos con una solución amortiguada a aproximadamente pH 6.1 ; 4. esperar al menos una hora, pero no más de 24 horas; y 5. cuantificar la fluorescencia de células a aproximadamente 610-740 nm cuando se excitan con aproximadamente luz de 380-450 nm. Variaciones de este método ejemplar son expuestas con mayor detalle más adelante. Cuando se usa en la presente para describir componentes de mezclas de ensayo u otros parámetros de la invención, el término "aproximadamente" significa dentro de un margen de error comúnmente aceptable para la determinación siendo hecha, usando métodos estándares. El primer paso, incubar las células con fijador, es opcional, pero preferido, ya que se ha encontrado que reduce el tiempo requerido para la incubación, así como la concentración de TCPP en la solución de trabajo, en esta modalidad ejemplar y en otras. Las secciones a continuación exponen una variedad de otras modalidades de la presente invención. Los métodos de la invención pueden ser usados en una variedad de tipos de células como se describe más adelante y además son aplicables a aplicaciones diagnósticas y pronosticas veterinarias así como humanas. De acuerdo con esto, el término "paciente" o "sujeto", como se usa en la presente, es pretendido para aplicarse a un humano o un animal. El método de detección puede usarse para detectar células precancerosas y cancerosas en muestras celulares in vitro. Las muestras de células pueden ser adquiridas mediante cualquiera de los métodos actualmente usados en el campo de citopatología. Por ejemplo, las células pueden ser recolectadas a partir de muestras de esputo (ver el Ejemplo 1), torundas cervicales, lavados bronquiales, aspiración de aguja fina y biopsias de núcleo de tiroide y pecho, lavados de vejiga, orina, lavado bucal, enemas y otras biopsias conocidas en la técnica. Otras fuentes de muestras de células incluyen sangre o fracciones de ella, linfa, fluido cerebroespinal, hueso y médula ósea, por nombrar algunas. El método de la invención es aplicable a cualquier muestra celular de cualquier tejido u órgano en el cuerpo. De manera opcional, las células pueden fijarse mediante procedimientos estándares antes de la exposición a TCPP, incluyendo pero no limitando a soluciones conteniendo formaldehído, metanol, etanol o isopropanol. En una modalidad, las células se fijan en 95% de etanol. El ensayo puede ser realizado en solución al medir la fluorescencia total por densidad celular, o al adherir las células sobre una superficie. Las células no necesitan ser tratadas con un fijador, pero se prefiere fijar células en algunas modalidades, en particular aquéllas en las cuales las células están adheridas a un soporte sólido. En una modalidad, las células son adheridas como una monocapa a un portaobjeto. En otras modalidades, se usa el sistema de preparación de portaobjetos basado en líquido MonoPrep2 o MonoPrepG (MonoGen, Inc. , Herndon, Va.) o el Thinprep Processor (Cytyc Corporation, Mariborough, MA). El método de la invención también puede ser usado para detectar células precancerosas y cancerosas in situ, así como un auxiliar en cirugía de resección. Por ejemplo, el método puede ser usado para detectar células displásticas en el pulmón in situ mediante inyección de TCPP en un medio adecuado seguido por broncoscopía de fluorescencia. Un método similar también puede ser usado para detectar células anormales para excisión durante cirugía. Las aplicaciones in situ pueden ser encontradas para cualquiera de los órganos del cuerpo, incluyendo pero no limitando a, pecho, próstata, pulmones, cerviz, garganta, vejiga, orofaringe, piel y tracto gastrointestinal mediante el uso de un dispositivo endoscópico similar. La cantidad de TCPP preferida para usarse en esta modalidad es determinada mediante el modo de administración y el sitio de entrega. Por ejemplo, si TCPP es inyectada en el torrente sanguíneo, la concentración efectiva de TCPP dependerá de su solubilidad máxima en solución salina o sangre' (por ejemplo, aproximadamente 100 µg/ml). Para inyección directamente en tejido afectado, una cantidad efectiva de TCPP dependerá del tejido objetivo y la proximidad de la inyección a ese tejido (por ejemplo, aproximadamente 1 -20 mg). En el pulmón, un suministro de aerosol de, por ejemplo, 5-10 mi a una concentración de 20-50 µg/ml debería ser adecuada. Los métodos para determinar tales cantidades de TCPP a ser administradas como un agente diagnóstico, son bien conocidos para químicos medicinales y otros de habilidad en la técnica relevante. La concentración de TCPP en la solución de trabajo y la duración de tiempo que las células son expuestas a solución de TCPP, son dos variables que pueden ser alteradas en una manera coordinada. La concentración de TCPP es de preferencia 4-100 µg/ml, más preferiblemente 4-40 µ9/?t?? y muy preferiblemente 20-40 µ9/???. El tiempo de exposición puede variar desde aproximadamente 0.2 minuto hasta aproximadamente 2 horas en una modalidad, y 10 a 60 minutos en una modalidad más preferida. Cuando se usan concentraciones bajas de solución de TCPP, un tiempo de exposición más largo es apropiado, y cuando se usan concentraciones altas de TCPP, un tiempo de exposición más corto es apropiado. Por ejemplo, en modalidades preferidas, los portaobjetos son expuestos durante 10 minutos en 40 µ9/??? de TCPP, y de manera alternativa durante 60 minutos en 4 µg/ml de TCPP. El método para optimizar la concentración de TCPP en la solución de trabajo y el tiempo de exposición son bien concidos para aquéllos expertos en la técnica de citología, siendo el objetivo alcanzar la unión específica más alta de TCPP a los componentes celulares, mientras que se minimiza el medio y otra captación no específica y fluorescencia. La solución de TCPP es comprendida por TCPP en un medio acuoso amortiguado a aproximadamente 36°C. En una modalidad, la capacidad amortiguadora es debida a 100 mM MES; sin embargo, puede usarse un rango de concentración de 20 a 200 mM en el método con igual eficacia.

En una modalidad, la solución tiene un pH de aproximadamente 6.1; sin embargo, un rango de pH de 5.8 a 6.7 puede ser usado con eficacia suficiente. Otros compuestos amortiguadores que son efectivos en el rango de pH 5.8-6.7 también pueden ser ser usados. Aunque el paso de exposición no es particularmente sensible a la temperatura, una temperatura un tanto por arriba de la temperatura ambiente es deseable para optimización. El rango de temperatura adecuado para el paso de exposición es aproximadamente 23°C hasta aproximadamente 42°C en una modalidad preferida y aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 40°C en una modalidad preferida. Otros compuestos pueden ser adicionados a la solución de trabajo para reducir la fluorescencia de medio, aumentar la estabilidad, o reducir la autofluorescencia o extinción. Por ejemplo, pueden usarse detergentes para bajar la fluorescencia de medio y reductores, antioxidantes y otros inhibidores de la generación o difusión de especie de oxígeno activo puede usarse para prevenir la oxidación de la TCPP o reducir el fotoblanqueo. Los compuestos de interés incluyen, pero no están limitados a, polietilenglicoles, tritones, ditiotreitol, ditioeritritol, 2-mercaptoetanol o los "Antifade kits", suministrados por Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR, P-7481, S-2828, S-7461). Además, la hematoxilina puede ser incluida con la TCPP, para actuar como un contramanchado y facilitar la microscopía de luz blanca. La solución de lavado es generalmente similar a la solución acuosa usada para la solución de trabajo de TCPP pero sin la TCPP. Si se usan portaobjetos de microscopio, los portaobjetos deberían ser lavados al menos una vez, muy preferiblemente tres veces, y de preferencia con agitación en exceso de solución de lavado. Si el ensayo se hace en solución , la TCPP no un ida puede ser removida al centrifugar las células, decantar el sobrenadante y resuspender las células en amortiguador fresco. Este paso puede ser repitido si es necesario. Medios alternativos para separar células de la solución de manchado también pueden ser usados, tales como, filtración con captura de células en una membrana o diálisis rápida (incluyendo diálisis por rotación) . Las condiciones apropiadas del lavado pueden ser determinadas al monitorear la fluorescencia de las célu las. El lavado debería ser suficiente para remover el medio y otra unión no específica, pero no tan excesivo como para remover la TCPP unida específicamente de los componentes celulares. La optim ización del paso de lavado es bien conocido para aquéllos en la técnica de citología. Las composiciones que pueden ser adicionadas a la solución de lavado para mejorar la eficacia o estabilidad incluyen , pero no están limitadas a, alcoholes, detergentes o soluciones de sales de baja molaridad . Un paso importante en el método de detección es permitir más de 1 hora, pero menos de 24 horas entre el tiempo en que el portaobjetos ha sido expuesto a la solución de trabajo de TCPP para el tiempo en que el portaobjetos es leído. Cuando el portaobjetos es leído después de 24 horas, puede haber demasiado deterioro en la TCPP para producir un resultado preciso. Cuando las células son leídas antes de 1 hora, el nivel de fluorescencia de medio puede ser excesivamente alta. Las longitudes de onda usadas para el paso de detección son abarcadas por rangos amplios en los cuales los rangos de picos específicos serán los más eficientes. El pico de excitación de TCPP en una solución acuosa de pH 5.0-7.0 ocurre a aproximadamente 415 nm, mientras que un pico de emisión ocurre a aproximadamente 645 nm y un pico secundario de emisión ocurre a aproximadamente 706 nm. En general, la TCPP puede ser detectada al iluminar la muestra con luz ultravioleta (UV) y detectar la luz emitida de la muestra por arriba de aproximadamente 500 nm . Las longitudes de onda usadas para excitar la TCPP en el método de la invención puede abarcar preferiblemente, parte o todo el rango desde aproximadamente 380 hasta aproximadamente 450 nm, y muy preferiblemente una banda estrecha de longitudes de onda cerca de aproximadamente 415 nm. De igual manera, las longitudes de onda detectadas pueden abarcar parte o todo el rango desde aproximadamente 610 nm hasta aproximadamente 740 nm y muy preferiblemente un rango estrecho cerca de aproximadamente 650 nm. Bajo ciertas circunstancias obvias para aquéllos expertos en la técnica de microscopía de fluorescencia, puede ser preferible detectar emisiones en un rango estrecho cerca de aproximadamente 706 nm. La selección de longitud de onda puede lograrse muy fácilmente mediante filtros ópticos. Los conjuntos de filtros para colorantes fluorescentes populares están fácilmente disponibles de Molecular Probes (Eugene, OR), por ejemplo. La selección de longitud de onda apropiada para excitar y detectar la TCPP en el método de la invención puede ser obtenida muy fácilmente al usar un conjunto de filtros diseñado para detectar isotiocianato de fluoresceína (de aquí en adelante "FITC"), el cual generalmente tiene un filtro de excitación de 400 a 490 nm y un filtro de barrera para emisión por arriba de 500 nm. La selección de otros sistemas de filtro es bien conocida para aquéllos expertos en la técnica de microscopía. La fluorescencia puede ser detectada visual o mecánicamente, de manera manual o por medios automatizados. Las células que tienen fluorescencia incluso moderada como se compara con células no fluorescentes, son fácilmente distinguibles por el ojo humano. De ahí, ciertas modalidades de la invención comprenden simplemente observar las células tratadas con TCPP bajo un microscopio de fluorescencia y cuantificar el porcentaje de células fluorescentes en la muestra de manera man ual . Sin embargo, las modalidades preferidas comprenden métodos automatizados bien conocidos en la técnica, y la cuantificación mecánica en donde una célula es "contada" como fluorescente, si exhibe fluorescencia sobre un nivel de umbral pre-determinado programado en el dispositivo contador, como es bien sabido en la técnica. Por ejemplo, en modalidades que comprenden una monocapa de células adheridas a un portaobjetos de microscopio, un lector de portaobjetos automatizado puede ser programado para contar como fluorescente cualquier célula que tiene fluorescencia pre-determinada para ser de significancia estadística comparada con una célula normal, equivalente, como es determinado mediante métodos estadísticos estándares (tales dispositivos . también pueden ser programados para contar células de una cierta forma, lo cual puede suministrar un segundo indicador de anormalidad precancerosa o cancerosa). De manera alternativa, para modalidades que comprenden un ensayo basado en solución, las muestras de células lavadas y manchadas con TCPP pueden ser analizadas por clasificación, de células activadas por fluorescencia (FSCS), en donde la FACS es programada para separar células que tienen un nivel pre-determinado de fluorescencia, como puede ser determinado estadísticamente mediante comparación con células normales. El número total de células presentes en una muestra es determinado con el fin de calcular un porcentaje de ese total que son TCPP-fluorescentes. Esta determinación puede lograrse en una variedad de formas conocidas en la técnica. En una modalidad, todas las células son manchadas con hematoxilina y son contadas bajo microscopía de luz blanca. En otra modalidad, las células son manchadas con una mancha de contador fluorescente adecuado (por ejemplo, una que mancha las membranas externas o internas de una célula) que fluoresce a una longitud de onda diferente de TCPP. En esta última modalidad, la proporción de fluorescencia de TCPP a fluorescencia de marcador celular es cuantificada. Como se menciona, la novedad de los métodos de la invención reside en la apreciación del inventor de que el manchado de TCPP identifica no solo células cancerosas, como es sabido previamente, sino que también identifica células displásticas. Debido a esto, el método descrito antes produce mucha más información que lo que se creía posible previamente. De acuerdo con esto, los resultados de la cuantificación de fluorescencia de TCPP será determinante de si se toman pasos analíticos subsecuentes, y en qué forma. Por ejemplo, el método identificará un porcentaje de células en una muestra que son fluorescentes de TCPP. Si aproximadamente 1 -3%, más particularmente aproximadamente 2-3% de las células en una muestra son fluorescentes, entonces la muestra contiene células que son al menos precancerosas anormales (displásticas) o cancerosas. De acuerdo con esto, un esquema analítico simple involucra determinar si una muestra contiene al menos aproximadamente 1 % de células fluorescentes de TCPP. Si no, la muestra es diagnosticada como negativa (normal). Si lo es, prueba adicional es recomendada al paciente. Se debería notar en relación con esta modalidad que, aún si una muestra contiene menos que 1 % de células fluorescentes, otros factores (por ejemplo, pre-disposición del paciente a cáncer, o un cáncer pre-existente en otro tejido), pueden sugerir que se realicen pruebas adicionales. Una ventaja de la invención que es descrita con mayor detalle más adelante es que una población enriquecida de células fluorescentes puede ser obtenida del paciente vía FACS. Además, se ha encontrado que el nivel de fluorescencia de una célula dada en una muestra se correlaciona con el estado asociado a cáncer de esa célula (ver el Ejemplo 1 ). De acuerdo con esto, las células individuales o grupos de células pueden ser evaluados por su intensidad de fluorescencia global y una determinación de si se requiere prueba adicional puede estar basada en parte de esta evaluación. Los términos, fluorescencia "alta", "media" y "baja" y términos relacionados como se usa en la presente, serán entendidos por alguien de habilidad en la técnica como términos comparativos, en donde la intensidad de fluorescencia de una sola célula o grupo de células en una muestra de prueba es comparada al menos con células de una fuente equivalente (por ejemplo, esputo) conocido por ser normal con respecto a cáncer (control negativo). Esta comparación puede lograrse mediante estimación visual o, en sistemas automatizados, puede programarse usando parámetros estadísticos, tales como variación de la fluorescencia mediana de una población de muestras, como se describe en el Ejemplo 2. En modalidades preferidas, las células de una muestra de prueba son comparadas para intensidad de fluorescencia con células de control adicionales, cuyo estado canceroso ha sido pre-determinado y pre-correlacionado con una intensidad de fluorescencia de TCPP (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 1). Los términos "fluorescente" y "no fluorescente" también son usados en la presente. Para mantenerse con las definiciones discutidas antes antes de varios niveles de intensidad de fluorescencia, ios términos "no fluorescente" y "fluorescente" son usados como términos comparativos, en donde la fluorescencia es comparada contra células normales de una fuente equivalente, y/o contra fluorescencia de medio general que surge de los reactivos o equipo usado para detectar la fluorescencia. De ahí, si una célula o muestra de células es determinada "fluorescente", entonces la fluorescencia está presente en alguna intensidad por arriba de la fluorescencia de medio o fluorescencia observada en células normales conocidas. Si una célula o muestra celular es determinada "no fluorescente", entonces la fluorescencia observada es mínima o ninguna en absoluto en exceso de fluorescencia de medio o fluorescencia observada en células normales. Esta comparación sería entendida por alguien de habilidad en la técnica relevante. Una evaluación citomorfológlca combinada con fluorescencia de TCPP es particularmente útil con cultivos celulares que tienen un bajo nivel de fluorescencia, debido a una evaluación visual de las células con técnicas de evaluación estándares, puede diferenciar fácilmente la célula metaplástica (no cancerosa) ligeramente fluorescente de células displásticas (precancerosas). Una modalidad del método comprende un paso adicional de evaluación citomorfológica además de la cuantificación de fluorescencia, especialmente usando una mancha citológica estándar, tal como hematoxilina para ayudar a visualizar la célula y perfiles nucleares. Otra modalidad emplea la evaluación citomorfológica como un paso subsecuente, si ciertos requerimientos de umbral son cumplidos, por ejemplo, la muestra contiene más de 1% de células fluorescentes. En una modalidad particularmente preferida de la invención, características citomorfológicas seleccionadas son combinadas con intensidad de fluorescencia para producir un sistema de clasificación que es muy útil para un diagnóstico reproducible, eficiente, de las diversas etapas de metaplasia, displasia y carcinoma que pueden estar presentes en una muestra celular. Tal sistema de clasificación es descrito en detalle en el Ejemplo 1. En esta modalidad, las células TCPP-fluorescentes son asignadas una o más clases numéricas, con base en la intensidad de fluorescencia y características morfológicas simples que incluyen forma y tamaño de células, número o tamaño de núcleos, presencia de racimos celulares y degeneración de células o racimos celulares, presencia de células anisoides irregulares, visibilidad de la membrana celular y presencia y naturaleza de desechos nucleares. El técnico o científico que realiza la evaluación citomorfologica de células TCPP-fluorescentes puede usar la clasificación como una lista de verificación, es decir, una célula siendo examinada puede ser verificada como "más" o "menos" con respecto a cada una de las clases numéricas. El número de clases numéricas asignadas a una célula particular y el patrón de clases específicas asignado a una célula, son ambos informativos en cuanto a la condición cancerosa o precancerosa de esa célula. A manera de ilustración, el Ejemplo 1 expone un sistema de clasificación que comprende 14 clases numéricas. Como se muestra en la Tabla 2 de ese ejemplo, dichos el cual presenta ensayos de muestras de esputo, células negativas o metaplásticas generalmente son asignables a unas cuantas clases, mientras que las células severamente carcinómicas son asignables a varias. Como ilustración adicional, las células negativas o metaplásticas son asignadas frecuentemente como clase 1 1 , mientras que las células moderadamente displásticas a carcinómicas, y células carcinómicas son asignadas frecuentemente a la clase 6, mientras que las células normales, metaplásticas y displásticas no. En otra modalidad de la invención, las células tratadas con TCPP en solución de un solo paciente determinado por tener carcinoma, pueden ser separadas mediante citometría de flujo con base en su nivel de fluorescencia. Las células que muestran un mayor nivel de fluorescencia son consideradas cancerosas, mientras que las células con niveles moderados a bajos de fluorescencia son consideradas displásticas, y las células sin fluorescencia son consideradas normales. Este tipo de separación permite a células displásticas o cancerosas de un paciente ser comparadas contra las células normales propias del paciente, proporcionando así una población de control "interna" ideal. En otra modalidad, al separar células cancerosas y normales del mismo paciente, varios agentes quimio-terapéuticos pueden ser ensayados para probar su efectividad. Las células sepradas son dispensadas en alícuotas. Un agente terapéutico seleccionado puede ser mezclado entonces a la misma concentración con una alícuota de células altamente fluorescentes y una alícuota de células fluorescentes de bajo nivel. Este paso puede repetirse con alícuotas frescas y un agente terapéutico diferente. Las tasas de muerte celular pueden ser valoradas usando técnicas conocidas en el área. El agente terapéutico más preferido para trtamiento puede ser determinado entonces al elegir el agente quimio-terapéutico que mató el mayor número de células determinadas como cancerosas (es decir, células altamente fluorescentes) y mató el menor número de células normales (es decir, células con poca o ninguna fluorescencia después del tratamiento con TCPP). En conjunción con el método de detección diagnóstico o de clasificación de la invención, se ha desarrollado un método para disolver TCPP para usarse en el método así como otras aplicaciones. Este método comprende disolver TCPP en aproximadamente 50% hasta aproximadamente 90% de alcohol con un pH mayor que aproximadamente pH 8.5 y menor que aproximadamente pH 12.5. Se prefiere para usarse en la invención los alcoholes inferiores, tales como metanol, etanol, isopropanol y n-propanol. Más preferiblemente, el alcohol es isopropanol y su pH es ajustado con bicarbonato de sodio o hidróxido de amonio a un pH mayor que 8.5 y menor que 10.0. La concentración de isopropanol puede ser desde 50% hasta 90% y el bicarbonato de sodio puede ser desde 20 mM hasta 100 mM en algunas modalidades. La concentración de TCPP puede ser hasta aproximadamente 2 mg/ml. En una modalidad, la TCPP es disuelta a 1 mg/ml en una solución de 50% isopropanol 50 mM bicarbonato de sodio. La invención también comprende una composición útil en cualquier método que utiliza TCPP, que comprende TCPP en alcohol con un pH mayor que 7. Esta solución de preferencia se haría mediante el método para disolver TCPP detallado antes. Esta composición debería ser almacenada preferiblemente a aproximadamente 4°C en la obscuridad. La invención abarca adicionalmente conjuntos para la detección de células precancerosas y cancerosas comprendiendo TCPP en un recipiente, opcionalmente con instrucciones. En una modalidad, el conjunto es diseñado por ser usado con el método de detección de la invención. En una modalidad, el conjunto incluye la composición de la invención que comprende TCPP solubilizada en alcohol basificado en un recipiente. Esta solución de TCPP uede ser usada como una solución madre, la cual sería diluida en una solución acuosa amortiguada para el propósito de detectar células precancerosas y cancerosas. El conjunto puede contener los componentes para recolectar la muestra celular, como en el recipiente de recolección de esputo del Ejemplo 1 , o de manera alterna puede contener artículos para la detección de células precancerosas en muestras ya adquiridas. El conjunto puede ser diseñado para usarse con sistemas de preparación de portaobjetos, por ejemplo, onoPrep2 o MonoPrepG (Monogen, Inc., Herndon VA) o el Thinprep Processor (Cytyc Corporation, arlborough, A), por nombrar tres. Estos conjuntos también pueden ser diseñados para ser usados con formatos diferentes a portaobjetos de microscopio, tal como placas de mícrotítulo o dispositivos de citometría de flujo. En cualquiera de las modalidades anteriores, el conjunto puede comprender controles positivos o negativos o ambos, como sería empleado por alguien de habilidad en la técnica para conducir los ensayos de la invención. Los siguientes ejemplos son provistos para describir la invención con mayor detalle. Pretenden ilustrar y no limitar la invención.

EJEMPLO 1 Ensayo de portaobjetos de vidrio para deteción de células pre- cancerosas y cancerosas con TCPP Este ejemplo compara los resultados diagnósticos alcanzados a través del análisis critomorfológico estándar de portaobjetos de esputo manchados con PAP tratados con TCPP y analizados mediante microscopía de fluorescencia. Los resultados indican que la técnica de detección de TCPP de esta invención es equivalente a citología de esputo convencional en la detección de células neoplásticas (displasia y carcinoma in situ) y carcinomas francos. Los resultados también indican que un experto en la técnica puede usar el método, en conjunción con las reglas de clasificación simples, para estimar el grado de displasia presente en una muestra de tejido.

Métodos Procedimientos de procesamiento de esputo usados en la producción de portaobjetos de monocapa. Todos los portaobjetos de monocapa seleccionados para análisis en este estudio fueron producidos de muestras de esputo recolectadas de pacientes realizando la técnica de tos espontánea, temprano en la mañana. De manera específica, los pacientes fueron instruidos para expectorar cualquier material que tosieran durante tres mañanas consecutivas en un recipiente lleno con fijador consistiendo de 2% de Carbowax en 50% de alcohol/50% de fluido de Saccomanno con 0.03-0.05 mg/ml de rifampin . Se adicionó rifampin a la solución fijadora para servir como un profiláctico contra pacientes alojando M. tuberculosis o esos pacientes quienes pueden ser portadores asintomáticos de N. meningitis. La solución de 2% de Carbowax se preparó al adicionar 2 mi de Carbowax fundida (150) a 98 mi de 50% de etanol y mezclar durante 30 minutos. Equipo de vidrio usado para hacer la solución se mantuvo caliente para prevenir el endurecimiento de cera en la superficie durante la preparación, el cual puede provocar una medición imprecisa. Se removió la Carbowax antes de la exposición a la solución de trabajo de TCPP mediante inmersión en 95% de alcohol durante al menos 15 minutos. Se hizo la solución de rifampin (3 mg/ml) al disolver 300 mg de cápsulas de rifampin en 100 mi de alcohol etílico y mezclar a alta velocidad en un mezclador de Waring. Un mi de esta solución se adicionó a cada 30 mi de solución de Saccomanno o 20 m i por litro de solución de Saccomanno y se mezcló profundamente. La preparación de la solución de Saccomanno se hizo de acuerdo a métodos estándares bien conocidos para aquéllos en la técnica de citología. Dos portaobjetos de microscopio de preparación delgada 8Cytyc Corporation, Marlborough, A) y un tubo de centrífuga de plástico de 50 mi, se etiquetaron con información del paciente. El espécimen de esputo fue vaciado en un tubo de centrífuga de plástico de 50 mi y se agregó solución de alcohol etílico a 50% para llevar el volumen a 50 mi si era necesario. Los contenidos del tubo de centrífuga fueron vaciados en un recipiente semi-micromezclador Eberbach de 250 mi y se homogeneizaron durante 10 a 60 segundos, dependiendo del examen visual del espécimen y contenido mucoide. Especímenes mucoides espesos requieron algunas veces tiempos de mezclado más largos. El espécimen fue vaciado nuevamente hacia el tubo de centrífuga y se centrifugó a 1850 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante fue decantado, dejando 1 a 2 mi en el tubo de centrífuga para mezclarse con el sedimento (centrifugado). El tubo fue agitado en un mezclador de vórtice durante aproximadamente 10 segundos. Una a tres gotas del sedimento se colocaron en un frasco PreservCyt (Cytyc Corporation, Marlborough, MA). El espécimen se incubó durante 5 minutos para desactivar todos los organismos microbianos y virales. Las capas monocelulares de las muestras se fijaron sobre portaobjetos usando el Thinprep Processor (Cytyc Corporation, Marlborough, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En el ThinPrep Processor, las células fueron recolectadas sobre un filtro de policarbonato (tamaño de poro 0.5 mm) y se transfirieron a un portaobjetos de vidrio. El ThinPrep Processor depositó entonces inmediatamente el portaobjetos en un baño fijador conteniendo 95% de etanol. Solución madre de TCPP. Se adicionaron 400 mg de bicarbonato de sodio a aproximadamente 90 mi del isopropanol al 50% (50 mM bicarbonato de sodio) y se mezclaron hasta que se disolvieron completamente para hacer isopropanol al 50% basificado. Cien m iligramos de TCPP se adicionaron lentamente al isopropanol al 50% basificado 850 mM bicarbonato de sodio) y se mezclaron durante 3 a 5 minutos hasta que se disolvió. La solución de TCPP se llevó a 100 mi volumétricamente con el isopropanol al 50% basificado, se mezclaron bien y se almacenaron en una botella de reactivo ámbar cubierta en hojuela en un área refrigerada. La concentración final de TCPP en la solución madre fue 1 mg/ml. Solución de trabajo de TC PP. Se preparó la solución de trabajo de TCCP fresca cada día. Aproximadamente 10 mi de solución madre de TCPP con concentración de 1 mg/ml se llevó a temperatura ambiente. Ocho mililitros de la solución madre de TCPP (1 mg/ml) se colocaron en un matraz volumétrico de 200 m i y aproximadamente 100 mi del amortiguador de MES se adicionó lentamente. La solución se mezcló suavemente. El amortiguador de MES adicional fue agregado para llevar la solución a 200 mi volumétricamente. La solución se mezcló durante 3 a 5 minutos y se almacenó a 2-4°C en una botella ámbar. La concentración final de TCPP en la solución de trabajo fue 40 µg/m l. Procedimiento de exposición a TCPP. Los portaobjetos se fijaron en 95% de alcohol durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos fueron expuestos a TCPP justo después de fijarse o hasta 3 días después. Los portaobjetos fueron sumergidos en 40 µ9/??? de solución de TCPP durante 10 minutos a 36°C, entonces se lavaron en 100 mM amortiguador de MES, un minuto cada vez, a temperatura ambiente con agitación. Los portaobjetos fueron vistos más de 1 hora pero no más de 24 horas después. Información de microscopio. El microscopio utilizado para observación de los portaobjetos de células de esputo tratadas con TCPP fue un microscopio Olympus modelo BH-1 con un iluminador de sub-etapa y una lámpara de mercurio de sobre-etapa para microscopía de fluorescencia de luz reflejada. La lámpara de mercurio tiene líneas de emisión primarias a 365 nm, 405 nm, 436 nm y 545 nm. El montaje de filtros de fluorescencia consistió de dos cubos dicróticos. El cubo verde (490 nm) contenía un sistema de filtros con un filtro de excitación pasando 400-490 nm y una emisión pasando el filtro de barrera por arriba de 500 nm. Procedimientos de manchado de portaobjetos de esputo mediante técnica de manchado de PAP modificada. La secuencia de procedimiento (no.), reactivo y tiempo (min:s) fueron como sigue: (1) 95% de alcohol 15:00; (2) agua corriente 1:00; (3) gil-i hemotox 2:30; (4) agua corriente 1:00; 5) reactivo azulante :30; (6) agua corriente 1:00; (7) 95% alcohol :10; (8) og-6 1:30; (9) 95% alcohol :10; (10) 95% alcohol :10; (11) ea-50 1:15; (12) 95% alcohol :20; (13) 95% alcohol :30; (14) 100% alcohol 1:00; (15) 100% alcohol 1:00; (16) 100% alcohol 1:30; (17) xileno 1:00; (18) xileno 1:00; y (19) xileno 1:00. Métodos para análisis citopatológico de rutina de portaobjetos manchados de Papanicolaou. Los portaobjetos manchados de PAP experimentaron evaluación citomorfológica semi-cuantitativa. (1 ) Células displásticas y neoplásticas fueron identificadas a través del uso de criterios morfológicos tradicionales , y (2) los niveles de expresión de varios indicadores fundamentales de inflamación pulmonar (macrófagos alveolares, neutrófilos, células de columna, moco, espirales mucosas , macrófagos pigmentados, células metaplásticas) fueron cuantificados. La metodolog ía para cuantificar estos indicadores de inflamación han sido discutidos previamente en la literatura (Roby et al. , 1989, Acta Cytol 34: 147-154; Roby et al. 1 990, Acta Cytol 34: 140-146; Schumann et al. , 1 989 , Am Rev Respr Dis 1 39:601 -603) . Los criterios usados para determinar la morfolog ía celular q ue usan citolog ía manchada con PAP se discuten a continuación . Anormalidades no sign ificativas. S identificaron células como que no tienen anormalidades significativas, si los siguientes criterios fueron satisfechos: 1 . Células epiteliales ciliadas, basofílicas, mezcladas con macrófagos con pigmento grado 1 -2 junto con 'células inflam atorias; 2. Núcleos redondos de epitelio basalmente orientado; 3. Cromatina uniformemente dispersa; 4. Membranas nucleares inconspicuos; 5. N ucléolos inconspicuos; y 6. Células no metaplásticas y no displáticas presentes. etaplasia escamosa (sin displasia). Las células fueron identificadas como metaplásticas escamosas sin displasia si los siguientes criterios fueron satisfechos: 1 . grupos de células basofílicas sin cilios ; 2. tamaño celular y nuclear uniforme; 3. baja proporción de núcleo/citoplasma (N/C); 4. cromatina nuclear finamente granular; y 5. nucléolos redondos pequeños (usualmente solos) pueden estar presentes. Displasia suave (atipia escamosa). Las células fueron identificadas como suavemente displásticas si los siguientes criterios fueron satisfechos: 1 . más pequeñas que las células metaplásticas; 2. vistas en racimos cohesivos, o de manera singular; 3. las cél ulas caen planas (lám inas) tanto núcleos como citoplasma en foco; 4. las células varían ligeramente en tamaño; 5. el citoplasma puede ser eosinófilo o basofílico; 6. bordes citoplásmicos agudos ; 7. los núcleos varían ligeramente en tamaño, usualmente de redondos a ovales, si si dividen 2 m itadas del núcleo son imágenes de espejo, la proporción N/C puede variar ligeramente; 8. mem brana nuclear suave; 9. cromatina nuclear (ligeramente incrementada) finamente granular, cromocentro ocasional; y 10. cél ulas de fibra, células alargadas con citoplasma estirado y núcleo diferente a la membrana nuclear - citoplasma reticular fino a granular usualmente amarillo naranja brillante - queratinizante simple, pueden formar espirales alrededor del núcleo central de q ueratina para hacer perlas epiteliales. Displasia moderada (atipia escamosa). Las células fueron identificadas como moderadamente displásticas si los siguientes criterios fueron satisfechos: 1 . variación en tamaño, usualmente mayor pero puede ser menor que la displasia suave; 2. más variación en la forma y proporción de N/C que la displasia suave; 3. citoplasma denso, predomina la acidofilia; número incrementado de células atípicas; 4. el núcleo puede tener mitades desiguales (no imágenes de espejo); 5. lobulaciones nucleares, grietas y nodulos están presentes; y 6. el material nuclear puede mostrar hipercromasia con un patrón más graneado - como cromatina. Displasia severa (atipia escamosa marcada). Las células fueron identificadas como severamente displásticas si los siguientes criterios fueron satisfechos: 1 . las células varían notablemente en tamaño y forma; 2. tamaño celular ligeramente mayor normalmente que la displasia moderada; 3. la proporción N/C es alta pero variable (con extremos); 4. las células simples predominan ; el núcleo es más central que CI S; 5. ei núcleo puede seguir la forma de citoplasma; el n úcleo muestra menos distorsión que CIS; 6. el pleomorfismo nuclear es incrementado con cromatina gruesa presente y la condensación a lo largo de la envoltura n uclear; 7. paracromatina, núcleo grande, membrana n uclear 'multi- nuclustered' focalmente engrosada; y 8. las células muestran citoplasma acidofílico predominante. Carcinoma escamoso in-situ (CIS, no invasivo). Las células fueron identificadas por ser carcinoma escamoso in situ si los siguientes criterios fueron satisfechos: 1 . células simples o en agregados (agrupamientos) ; 2. tamaño celular variable - puede ser menor o mayor que células de displasia notable, usualmente menores que carcinoma de células escamosas invasivas; 3. las células son grandes, redondas con núcleos simétricamente ubicados; 4. la degeneración celular puede estar presente; 5. el citoplasma escaso, distruibuido uniformemente, puede ser queratinizado o no queratin izado concéntricamente alrededor del núcleo (orangiofílico o basofílico); 6. proporción N/C variable - mayor o menor que la normal; 7. gránulos de cromatina nucleares densos, gruesos, pueden ser interrumpidos por zonas claras; 8. borde cromatínico uniformemente engrosado con ondulación de membrana nuclear; 9. pueden verse lobulaciones de núcleos; 10. puede verse canibalismo, pero es inusual; 1 1. pueden estar presentes células multinucleadas; 12. no hay nucléolos en el núcleo; una célula mitótica puede estar presente; y 13. soporte limpio. Carcinoma de células escamosas (tipo invasivo, queratinizante, bien diferenciado). Las células fueron identificadas como carcinoma de células escamosas si los siguientes criterios fueron satisfechos: 1 . las células usualmente solas, orangeofílicas, pero pueden estar en racimos, y degenerar; 2. células grandes o pequeñas, angulares, con núcleos bien conservados y límites celulares distintos; 3. las células usualmente son mayores que in situ y pueden ser pleomórficas, ambplio rango tanto de tamaño como de forma; 4. puede verse formación de perlas (perla de cáncer); 5. cantidad moderada de citoplasma con "colas" anormales (consistente con la invasión); formas de células bizarras, renacuajos, estrellas, husos; una cromatina nuclear angular, con agrupamiento impredecible con hipercromasia y paracromatina clarificante y cromatina claramente definida, interfase de paracromatina; 6. la cromatina está agrupada de manera gruesa, especialmente a lo largo de. la membrana nuclear; 7. ios nucléolos son grandes y acidofílicos, si están presentes; 8. la membrana nuclear por sí misma puede ser engrosada e irregular; irregularidad de espesor del borde de cromatina 5 nuclear; 9. la proporción N/C es muy alta; 1 0. irregularidad nucleolar notable en forma, tamaño, cantidades (nucléolos hijos); mitosis anormal, multi-nucleación; 1 1 . el canibalismo y multinucleación es común; y 10 12. el material de soporte necrótico es común.

Res ultados En un estudio ciego, en el cual se examinaron 60 muestras, los resultados indican que las células anormales (displasia suave, moderada o 15 severa o cancerosas) pueden ser detectadas de manera imprecisa con el procedimiento de detección de TCPP, comparado con el procedimiento de manchado de PAP (Tabla 1 ). Si 2-3% de las células expuestas de TCPP fueran fluorescentes, entonces la muestra es correlacionada de manera confiable con al menos el diagnóstico suavemente displástico. Cincuenta ijzo de cincuenta muestras de esputo determinadas mediante el procedimiento de manchado de PAP citomorfológico estándar, por ser suavemente displásticas a cancerosas, también fueron identificadas como anormales mediante detección de TCPP. Entre las diez muestras caracterizadas como normales o metaplásticas basadas en el procedimiento de manchado 25 de PAP, cuatro muestras demostradas que la misma morfología usando el método de TCPP. Las muestras diagnosticadas como normales, mostraron captación de TCPP mínima o ninguna. La captación de TCPP en células determinadas por ser negativas o metaplásticas mediante citomorfolg ía tuvieron intensidad de fluorescencia característica y patrones que fueron reconocibles y diangósticos. La Tabla 2 presenta una comparación entre la morfología celular y la fluorescencia, como se determinado medainte la citomorfología de manchado de PAP y técnicas de TCPP, respectivamente. Con base en la intensidad de fluorescencia y patrón en las muestras de células tratadas con TCPP, las células fueron categorizadas con una de 14 posibles clasificaciones numeradas en relación a una descripción morfológica. Si las células fueron clase 1 1 usando la determinación de TCPP y menos de 2-3% de las células en el portaobjetos fueron fluorescentes por arriba de los niveles de soporte, entonces esa muestra fue determinada por ser metaplástica y no displástica. Las células metaplásticas fueron diferenciadas fácilmente de células normales por su fluorescencia moderada con una membrana celular escasamente visible. De las diez muestras de células que fueron determinadas por ser negativas o metaplásticas por manchado de PAP, 6 fueron designadas con una descripción celular clase 1 1 en base a la fluorescencia de TCPP. De las seis muestras de TCPP con designación clase 1 1 , tres también indicaron fluorescencia de desechos nucleares (es decir, ya sea una clase 13 o 14), y dos también mostraron designación clase 1 0 (fluorescencia del núcleo solamente). Otro patrón mostrado en la Tabla 2 se refiere a la clasificación numérica 6 - células anisoides irregulares, fluroescencia baja a media. Es notable que relativamente pocas células displásticas fueron asignadas a esta clasificación, mientras que la mayoría de células carcinómicas recibieron la clasificación 6. De ahí, se espera que esta clasificación sea de particular importancia para distinguir carcinomas de displasias usando los métodos de la invención. Otra observación significativa revelada en la Tabla 2 es que, conforme la morfología celular progresó de normal a severamente carcinómica, el número total de clasificaciones numéricas que fueron asignables a cada célula examinada también aumentó. Como una ilustración, las células teniendo una morfología negtiva o metaplástica se les asignó un promedio de 2 clasificaciones numéricas, mientras que las células exhibiendo adenicarcinoma, células escamosas y carcinoma de células pequeñas se les asignó un promedio de 5 clasificaciones numéricas. Debido a que las clasificaciones numéricas contienen descripciones de diferentes clases de anormalidades celulares, una correlación positiva entre el grado de displasia o carcinoma y el número de diferentes anormalidades observadas en las células es lógica. Sin embargo, tal correlación no ha sido sistematizada y usada hasta ahora para diagnosticar condiciones precancerosas y cancerosas en una muestra de células.

Tabla 1 . Correlación entre resultados de TCPP y resultados citomorfológicos Descripción de diagnóstico Ñ=60 Portaobjetos con morfología usando TCPP/ Portaobjetos con morfología usando citomorfología 5 Negativa o metaplástica 4/10 Displasia suave 12/12 Displasia moderada 9/9 Displasia severa 8/8 Crcinoma in situ 1 1 /1 1 10 Adenocarcinoma, célula escamosa y carcinoma de 10/10 células pequeñas 15 Tabla 2: Descripciones celulares: características citomorfológicas y fluorescencia de TCPP Número de muestras con células teniendo descripción numérica por microscopía de fluorescencia de TCPP Número de muestras con descripción celular por citomorfología Adenicarcinoma, célula escamosa Negativa o Displasia Displasia Displasia Carcinoma y carcinoma de metaplástica suave moderada severa in situ célula pequeña Número de clasificación=descripc¡ón celular (n=10) (n=12) (n=9) (n=8) (n=11) (n=10) 1=núcleo o núcleos grandes, fluorescencia baja 3/10 12/12 9/9 778 0/11 6/10 a media 2=células binucleares simétricas, fluorescencia 0/10 5/12 5/9 3/8 3/11 2/10 media 3=células ovales pequeñas, fluorescencia media 0/10 4/12 4/9 . 2/8 6/11 6/10 a alta 4=células redondas pequeñas, fluorescencia 0/10 0/12 0/9 0/8 0/11 2/10 baja Número de muestras con células teniendo descripción numérica por microscopía de fluorescencia de TCPP Número de muestras con descripción celular por citomorfología Adenicarcinoma, célula escamosa Negativa o Displasia Displasia Displasia Carcinoma y carcinoma de metaplástica suave moderada severa in situ célula pequeña Número de clasificación=descripción celular (n=10) (n=12) <n=9) (n=8) (n=11) (n=10) 5=células multi-nucleadas, fluorescencia media 0/10 0/12 3/9 6/8 9/11 7/10 6=células anisoides irregulares, fluorescencia 0/10 0/ 2 1/9 1/8 10/1 7/10 baja a media 7=racimos celulares, fluorescencia media a alta 0/10 0/ 2 1/9 0/8 1/11 3/10 8=células simples degeneradas; fluorescencia 0/10 0/12 0/9 0/8 4/11 7/10 media a alta 9=racimos de células degeneradas; 0/10 0/12 0/9 0/8 1/11 4/ 0 fluorescencia media a alta Número de muestras con células teniendo descripción numérica por microscopía de fluorescencia de TCPP Número de muestras con descripción celular por citomorfología Adenicarcinoma, célula escamosa Negativa o Displasia Displasia Displasia Carcinoma y carcinoma de metaplástica suave moderada severa ¡n situ célula pequeña Número de clasificación=descripción celular (n=10) (n=12) (n=9) (n=8) (n=11) (n=10) 10=células uniformes en tamaño con núcleo 2/10 2/12 2/9 ?/8 ?7?? 2/10 redondo pequeño, fluorescencia media (solo el núcleo) 11=membrana celular escasamente visible, 6/10 6/12 2/9 . 2/8 2/11 0/10 fluorescencia media 12=agrupamientos de desechos nucleares, sin 0/10 1/12 0/9 0/8 0/11 0/10 fluorescencia 3=soporte de desechos nucleares, sin 6/10 5/12 8/9 2/8 5/11 3/10 fluorescencia Número de muestras con células teniendo descripción numérica por microscopía de fluorescencia de TCPP Número de muestras con descripción celular por citomorfología Adenicarcinoma, célula escamosa Negativa o Displasia Displasia Displasia Carcinoma y carcinoma de metaplástica suave moderada severa ¡n situ célula pequeña Número de clasificación=descripción celular (n=10) (n=12) (n=9) (n=8) (n=11) (n=10) 14=soporte de desechos nucleares, 1/10 2/12 2/9 ?/8 ?7?? 0/10 fluorescencia media Prom. # descripciones numéricas por célula 1.80 3.08 4.11 3.13 4.82 4.90 examinada Cada muestra celular puede ser designada con más de una de las 14 descripciones numéricas de células para células tratadas con TCPP.

EJEM PLO 2 Ensayo de suspensión para detección y separación de cél ulas pre- cancerosas y cancerosas usando TCPP Este ejemplo describe el uso de manchado de TCPP en conjunción con citometría de flujo de fluorescencia , en combinación con microscopía de portaobjetos citomorfológica para determinar la anormalidad de células encontradas en muestras de esputo . En virtud de la especificidad de manchado de TCPP, la combinación de citometría de flujo seguida por microscopía de portaobjetos es particularmente poderosa, proporcionando un control interno para comparaciones citomorfológicas de portaobjetos.

Métodos Procedimientos de procesam iento de esputo usados en la producción de suspensiones y portaobjetos de monocapa. Todas las suspensiones y portaobjetos de monocapa son producidos a partir de muestras de esputo recolectadas de pacientes que realizan la técnica de tos espontánea temprano en la mañana. De manera específica, los pacientes son instruidos a expectorar cualquier material que tosan durante tres mañanas consecutivas en un recipiente lleno con fijador consistiendo de 2% Carbowax en 50% alcohol/50% fluido de Saccomanno con 0.03-0.05 mg/m l de rifampin . El rifampin es adicionado a la solución fijadora para servir como un profiláctico contra pacientes que alojan M. tuberculosis o esos pacientes quienen pueden ser portadores asintomáticos de N. meningitis. La solución de 2% Carbowax es preparada al adicionar 2 mi de Carbowax fundido (150) a 98 mi de 50% etanol y mezclar durante 30 minutos. El equipo de vidrio usado para hacer la solución es mantenido caliente para prevenir el endurecimiento de la cera en la superficie durante la preparación, lo cual puede provocar una medición imprecisa. La Carbowax es removida antes de la exposición a la solución de trabajo de TCPP mediante inmersión en 95% alcohol durante al menos 15 minutos. La solución de rifampin (3 mg/ml) se hace al disolver 300 mg de cápsulas de rifampin en 100 mi de alcohol etílico y mezclar a alta velocidad en un mezclador Waring. Un mi de esta solución es adicionado a cada 30 mi de solución de Saccomanno o 20 mi por litro de solución de Saccomanno y se mezclaron profundamente. La preparación de solución de Saccomanno es de acuerdo con métodos estándares bien conocidos para aquéllos en la técnica de citología. El espécimen de esputo es vaciado en un tubo de centrífuga de plástico de 50 mi y solución de alcohol etílico al 50% adicional se agregó para llevar el volumen a 50 mi si es necesario. Los contenidos del tubo de centrífuga son vaciados en un recipiente de semi-micromezclador Eberbach de 250 mi y se homogeneizaron durante 10 a 60 segundos, dependiendo del examen visual del espécimen y contenido de mucoide. Especímenes de mucoide espesos algunas veces requirieron tiempos de mezclado más largos. El espécimen es vaciado nuevamente hacia el tubo de centrífuga y es centrifugado a baja velocidad durante 10 minutos. El sobrenadante es decantado, dejando 1 a 2 mi en el tubo de centrífuga para mezclar con la pella celular. El tubo es agitado en un mezclador de vórtice durante aproximadamente 10 segundos. La muestra es resuspendida en amortiguador MES 100 mM, H -6.15. Las célu las se hacen girar y son enjuagadas dos veces más con amortiguador MES 1 00 m M, dejando la última vez ~1 mi en el tubo de centrífuga en el cual se resuspenden las células. Las células son resuspendidas entonces en 15 mi de etanol al 95% (5% amortiguador MES 1 00 m M) a temperatura ambiente (~20°C) durante 30 m inutos, con agitación suave. El tubo de centrífuga es centrifugado entonces a baja velocidad durante 1 0 minutos. Todo menos 1 -2 mi del sobrenadante es removido. Sol ución madre de TC PP. Se adicionaron 400 mg de bicarbonato de sodio a aproximadamente 90 mi del isopropanol al 50% (50 mM bicarbonato de sodio) y se mezclaron hasta q ue se disolvieron completamente para hacer isopropanol al 50% basificado. Cien miligramos de TCPP se adicionaron lentamente al isopropanol al 50% basificado 850 mM bicarbonato de sodio) y se mezclaron durante 3 a 5 minutos hasta que se disolvió. La solución de TCPP se llevó a 1 00 mi vo lumétricamente con el isopropanol al 50% basificado, se mezclaron bien y se almacenaron en una botella de reactivo ámbar cubierta en hojuela en un área refrigerada. La concentración final de TCPP en la solución madre fue 1 mg/ml . Solución de trabajo de TCPP. Se preparó la solución de trabajo de TCCP fresca cada día. Aproximadamente 10 mi de solución madre de TCPP con concentración de 1 mg/ml se llevó a temperatura ambiente. Ocho mililitros de la solución madre de TCPP (1 mg/ml) se colocaron en un matraz volumétrico de 200 mi y aproximadamente 100 m i del amortiguador de MES se adicionó lentamente. La solución se mezcló suavemente. El amortiguador de MES adicional fue agregado para llevar la solución a 200 mi volumétricamente. La solución se mezcló durante 3 a 5 minutos y se almacenó a 2-4°C en una botella ámbar. La concentración final de TCPP en la solución de trabajo fue 40 µ?/???. Procedimiento de exposición a TCPP. Las células de suspensión, previamente expuestas a 95% de alcohol durante 30 minutos a temperatura ambiente, son expuestas a TCPP justo después de fijado o hasta 3 días después. Las células son resuspendidas en 10 mg de 40 µ9/??? de solución de TCPP durante 10 minutos a 36°C con agitación suave, entonces se lavaron con 20 mi de temperatura ambiente, amortiguador MES 100 mWI tres veces, usando centrifugación a velocidad mínima para peletear libremente las células dentro de 1 0 minutos. La pella celular lavada es resuspendida en 15-1 0 mi de amortiguador MES. Estas suspensiones, o alícuotas de las mismas, se pasan a través de un aparato de citometría de flujo de fluorescencia. Citometría de flujo de fluorescencia. Primer paso. Se pasó un mínimo de 10,000 células a través de un citometro de flujo con capacidad de clasificación celular. El citómetro de flujo debería ser equipado con una fuente de luz proporcionando radiación a aproximadamente 415 nm, con filtros para permitir el paso de luz entre aproximadamente 390 nm y 490 nm. La emisión de fluorescencia debería ser monitoreada entre aproximadamente 630 nm y 730 nm (emisión máxima a 645 nm y 706 nm). Una luz que pasa el filtro de barrera por arriba de 500 nm es satisfactoria. En el primer paso, las células individuales son contadas y su fluorescencia específica es medida. La fluorescencia promedio es calculada y la desviación estándar de ese promedio es calculada. Además, el valor medio es determinado (el valor de fluorescencia específico que es más pequeño que la mitad de los valoes y mayor que la mitad de los valores). Citometría de fl ujo de fluorescencia con clasificación celular.

Segundo paso . Se pasó un mínimo de 100 ,000 células a través del citómetro de flujo de fluorescencia con capacidad de clasificación celular, equipado igual para el primer paso. Las células con fluorescencia menor que la fluorescencia media + 1 .3 desviaciones estándar del promedio (aproximadamente 90% de las células) son definidas operacionalmente como que tienen fluorescencia baja y son salvadas en un tubo de prueba y las células con fluorescencia específica mayor que o igual a la fluorescencia media + 1 .3 desviaciones estándar del promedio (aproximadamente 10% de las células) son definidas operacionalmente como q ue tienen alta fluorescencia y son salvadas en otro tubo de prueba. De manera alternativa, las células pueden ser clasificadas en tubos de acuerdo con su fluorescencia en relación a la fluorescencia específica media encontrada en el primer paso. Las células con menos de dos veces la fluorescencia específica media sería fluorescencia "normal" o baja, y entonces las células podrían ser depositadas con 2-4x la fluorescencia media, 4-6x, y más de 6x la fluorescencia media. Se esperaría que cada uno de los depósitos de fluorescencia de intensidad mayor estuviera más enriquecida mayormente en células anormales. Si más de 2-3% de las células poseían más de 3x la fluorescencia media, habría soporte para una suposición de al menos una condición precancerosa avanzada. Producción de portaobjetos de monocapa. Las muestras de células de fluorescencia baja y alta son centrifugadas durante 1 0 minutos a rpm baja para peletear las células. El sobrenadante es removido, dejando 1 -2 mi en el tubo de centrífuga para mezclar con la pella celular. El tubo es agitado en un mezclador de vórtice durante aproximadamente 1 0 segundos. Una a tres gotas del sedimento es colocada en un frasco PreservCyt (Cytyc Corporation, Marlborough, MA). El espécimen es incubado durante 5 minutos para desactivar todos los organismos microbianos y virales. Las capas monocelulares de las muestras se fijan sobre portaobjetos usando el Thinprep Processor (Cytyc Corporation, Marlborough, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En el ThinPrep Processor, las células son reclectadas sobre un filtro de policarbonato (tamaño de poro 0.5 mm) y se transfirieron a un portaobjetos de vidrio. El ThinPrep Processor deposita entonces inmediatamente los portaobjetos en un baño fijador conteniendo 95% de etanol (se mantienen durante 30 minutos). Procedimientos de manchado de portaobjetos de esputo mediante técnica de manchado de PAP modificada. La secuencia de procedimiento (no.), reactivo y tiempo (min:s) fueron como sigue: (1 ) 95% de alcohol 15:00; (2) agua corriente 1 :00; (3) gil-i hemotox 2:30; (4) agua corriente 1 :00; 5) reactivo azulante :30; (6) agua corriente 1 :00; (7) 95% alcohol : 10; (8) og-6 1 :30; (9) 95% alcohol : 1 0; (10) 95% alcohol : 10; (1 1 ) ea-50 1 : 15; (12) 95% alcohol :20; (13) 95% alcohol :30; (14) 100% alcohol 1 :00; (15) 100% alcohol 1 :00; (16) 100% alcohol 1 :30; (17) xileno 1 :00; (18) xileno 1 :00; y (19) xileno 1 :00. Métodos para análisis citopatológico de rutina de portaobjetos manchados de Papanicolaou. Los portaobjetos manchados de PAP experimentaron evaluación citomorfológica semi-cuantitativa. (1 ) Células displásticas y neoplásticas fueron identificadas a través del uso de criterios morfológicos tradicionales, y (2) los niveles de expresión de varios indicadores fundamentales de inflamación pulmonar (macrófagos alveolares, neutrófilos, células de columna, moco , espirales mucosas, macrófagos pigmentados, células metaplásticas) fueron cuantificados. La metodolog ía para cuantificar estos indicadores de inflamación han sido discutidos previamente en la literatura (Roby et al. , 1 989, Acta Cytol 34: 147- 154; Roby et al. 1 990, Acta Cytol 34: 140-146; Schumann et al. , 1989, Am Rev Respr Dis 1 39:601 -603). Los criterios usados para determinar la morfolog ía celular queusan citolog ía manchada con PAP se discuten a continuación. Anormalidades no significativas. Se identificaron células como q ue no tienen anormalidades significativas, si los siguientes criterios fueron satisfechos : 1 . Células epiteliales ciliadas, basofílicas, mezcladas con macrófagos con pigmento grado 1 -2 junto con células inflamatorias; 2. Núcleos redondos de epitelio basalmente orientado; 3. Cromatina uniformemente dispersa; 4. Membranas nucleares inconspicuos; 5. Nucléolos inconspicuos; y células no metaplásticas y no displáticas presentes. etaplasia escamosa (sin dispiasia) . Las células fueron identificadas como metaplásticas escamosas sin dispiasia si los siguientes criterios fueron satisfechos: 1 . grupos de células basofílicas sin cilios; 2. tamaño celular y nuclear uniforme; 3. baja proporción de núcleo/citoplasma (N/C); 4. cromatina nuclear finamente granular; y 5. nucléolos redondos pequeños (usualmente solos) pueden estar presentes. Displasia suave (atipia escamosa). Las células fueron identificadas como suavemente displásticas si los siguientes criterios fueron satisfechos: 1 . más pequeñas que las células metaplásticas; 2. vistas en racimos cohesivos, o de manera singular; 3. las células caen planas (láminas) tanto núcleos como citoplasma en foco; 4. las células varían ligeramente en tamaño; 5. el citoplasma puede ser eosinófilo o basofílico; 6. bordes citoplásmicos agudos; 7. los núcleos varían ligeramente en tamaño, usualmente de redondos a ovales, si si dividen 2 mitadas del núcleo son imágenes de espejo, la proporción N/C puede variar ligeramente; 8. membrana nuclear suave; 9. cromatina nuclear (ligeramente incrementada) finamente granular, cromocentro ocasional; y 10. células de fibra, células alargadas con citoplasma estirado y núcleo diferente a la membrana nuclear - citoplasma reticular fino a granular usualmente amarillo naranja brillante - queratinizante simple, pueden formar espirales alrededor del núcleo central de queratina para hacer perlas epiteliales. Dispiasia moderada (atipia escamosa). Las células fueron identificadas como moderadamente displásticas si los siguientes criterios fueron satisfechos: 1 . variación en tamaño, usualmente mayor pero puede ser menor que la dispiasia suave; 2. más variación en la forma y proporción de N/C que la dispiasia suave; 3. citoplasma denso, predomina la acidofilia; número incrementado de células atípicas; 4. el núcleo puede tener mitades desiguales (no imágenes de espejo); 5. lobulaciones nucleares, grietas y nodulos están presentes; y 6. el material nuclear puede mostrar hipercromasia con un patrón más graneado - como cromatina. Dispiasia severa (atipia escamosa marcada). Las células fueron identificadas como severamente displásticas si los siguientes criterios fueron satisfechos: 1 . las células varían notablemente en tamaño y forma; 2. tamaño celular ligeramente mayor normalmente que la dispiasia moderada; 3. la proporción N/C es alta pero variable (con extremos); 4. las células simples predominan; el núcleo es más central que CIS; 5. el núcleo puede seguir la forma de citoplasma; el núcleo muestra menos distorsión que CIS; 6. el pleomorfismo nuclear es incrementado con cromatina gruesa presente y la condensación a lo largo de la envoltura nuclear; 7. paracromatina, núcleo grande, membrana nuclear 'multi- nuclustered' focalmente engrosada; y 8. las células muestran citoplasma acidofílico predominante. Carcinoma escamoso in-situ (CIS, no invasivo). Las células fueron identificadas por ser carcinoma escamoso in situ si los siguientes criterios fueron satisfechos: 1 . células simples o en agregados (agrupamientos); 2. tamaño celular variable - puede ser menor o mayor que células de displasia notable, usualmente menores que carcinoma de células escamosas invasivas; 3. las células son grandes, redondas con núcleos simétricamente ubicados; 4. la degeneración celular puede estar presente; 5. el citoplasma escaso, distruibuido uniformemente, puede ser queratinizado o no queratinizado concéntricamente alrededor del núcleo (orangiofílico o basofílico); 6. proporción N/C variable - mayor o menor que la normal; 7. gránulos de cromatina nucleares densos, gruesos, pueden ser interrumpidos por zonas claras; 8. borde cromatínico uniformemente engrosado con ondulación de membrana nuclear; 9. pueden verse tabulaciones de núcleos; 10. puede verse canibalismo, pero es inusual; 1 1 . pueden estar presentes células multinucleadas; 12. no hay nucléolos en el núcleo; una célula mitótica puede estar presente; y 1 3. soporte limpio. Carcinoma de células escamosas (tipo invasivo, queratinizante, bien diferenciado). Las células fueron identificadas como carcinoma de células escamosas si los siguientes criterios fueron satisfechos: 1 . las células usualmente solas, orangéofílicas, pero pueden estar en racimos, y degenerar; 2. células grandes o pequeñas, angulares, con núcleos bien conservados y límites celulares distintos; 3. las células usualmente son mayores que in situ y pueden ser pleomórficas, amplio rango tanto de tamaño como de forma; 4. puede verse formación de perlas (perla de cáncer); 5. cantidad moderada de citoplasma con "colas" anormales (consistente con la invasión); formas de células bizarras, renacuajos, estrellas, husos; una' cromatina nuclear angular, con agrupamiento impredecible con hipercromasia y paracromatina clarificante y cromatina claramente definida, inferíase de paracromatina; 6. la cromatina está agrupada de manera gruesa, especialmente a lo largo de la membrana nuclear; 7. los nucléolos son grandes y acidofílicos, si están presentes; 8. la membrana nuclear por sí misma puede ser engrosada e irregular; irregularidad de espesor del borde de cromatina nuclear; 9. la proporción N/C es muy alta; 10. irregularidad nucleolar notable en forma, tamaño, cantidades (nucléolos hijos); mitosis anormal, multi-nucleación; 1 1 . el canibalismo y multinucleación es común; y 12. el material de soporte necrótico es común.

Análisis de citopatolgía. Debido a que las muestras de esputo contienen células de muchas ubicaciones en el pulmón, intercalados unos con otros, existe poco contexto para juzgar la normalidad o anormalidad de una célula particular (a diferencia del caso de manchado de sección delgada). La disponibilidad de una recolección de células de baja fluorescencia proporciona una muestra de control interno de células de paciente normales o casi normales, con las cuales comparar las células manchadas con TCPP de alta fluorescencia. Usando la mancha de PAP estándar, un citopatólogo experto en la técnica, puede determinar fácilmente el grado de anormalidad de las células de TCPP de alta fluorescencia, las cuales son enriquecidas 10 veces para células anormales comparadas con una monocapa sin fraccionar. La presente invención no está limitada a las modalidades descritas y ejemplificadas antes, pero es capaz de variación y modificación dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un método para determinar si una muestra de células contiene células displásticas o carcinómicas, comprendiendo el método los pasos de: a) contactar la muestra con una solución de TCPP bajo condiciones que permiten la unión de la TCPP a componentes de las células precancerosas anormales o cancerosas, si están presentes; b) remover la TCPP no unida de la muestra; y c) detectar la fluorescencia de TCPP en la muestra, siendo indicativa la presencia de fluorescencia de TCPP de que la muestra contiene células displásticas o carcinómicas. 2. El método de la reivindicación 1 , en donde la muestra es seleccionada del grupo que consiste de muestras de esputo, torundas cervicales, lavados bronquiales, aspiración de aguja fina y biopsias de núcleo de tiroide y pecho, lavados de vejiga, orina, lavados bucales, muestras de heces, sangre o fracciones de la misma, linfa, fluido cerebroespinal, hueso y médula ósea. 3. El método de la reivindicación 1 , en donde la muestra se fija en un fijador seleccionado del grupo que consiste de formaldehído, metanol, etanol, isopropanol y cualquier combinación de los mismos. 4. El método de la reivindicación 3, en donde el fijador es 95% de etanol. 5. El método de la reivindicación 1 , en donde la muestra es adherida a un soporte sólido. 6. El método de la reivindicación 5, en donde el soporte sólido es un portaobjetos de microscopio. 7. El método de la reivindicación 1 , en donde la muestra es suspendida en un medio líquido. 8. El método de la reivindicación 1 , en donde la solución de TCPP comprende la TCPP pre-disuelta en alcohol basificado y diluida en una solución acuosa amortiguada. 9. El método de la reivindicación 8, en donde la solución de TCPP es amortiguada a un pH entre aproximadamente 5.8 y aproximadamente 6.7. 10. El método de la reivindicación 8, en donde la solución comprende además uno o más reactivos que reducen la fluorescencia de medio, previene la oxidación de la TCPP o previene la extinción de la fluorescencia de TCPP. 1 1 . El método de la reivndicación 1 , en donde la concentración de TCPP en la muestra está entre aproximadamente 4 y aproximadamente 100 9/???. 12. El método de la reivindicación 1 , en donde la muestra es contactada con la TCPP durante entre aproximadamente 0.2 minuto y aproximadamente 2 horas. 13. El método de la reivindicación 1 , en donde durante el contacto, la muestra es mantenida a una temperatura entre aproximadamente 23°C y aproximadamente 42°C. 14. El método de la reivindicación 5, en donde la fluorescencia de TCPP en la muestra es detectada visualmente. 15. El método de la reivindicación 5, en donde la fluorescencia de TCPP en la muestra es detectada con un lector de portaobjetos. 16. El método de la reivindicación 7, en donde la fluorescencia de TCPP es detectada con un citómetro de flujo fluorométrico. 17. El método de la reivindicación 1 , en donde el paso de detección es realizado entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 24 horas después del paso de remoción. 18. El método de la reivindicación 1 , que comprende además el paso de determinar el porcentaje de células en la muestra que son TCPP-fluorescentes. 19. El método de la reivindicación 18, en donde las muestras que comprenden más de aproximadamente 1 % de células fluorescentes sn categorizadas como que contienen células precancerosas anormales o cancerosas. 20. El método de la reivindicación 18, en donde el paso de determinar el porcentaje de células en la muestra que son TCPP-fluorescentes, comprende cuantificar la intensidad de fluorescencia de TCPP en la muestra en una manera que correlaciona la intensidad de fluorescencia con un porcentaje de células en la muestra conteniendo TCPP. 21 . El método de la reivindicación 20, en donde la fluorescencia de TCPP es cuantificada al contactar la muestra con un marcador detectable que se une a todas las células en la muestra, remover el marcador detectable no unido, y establecer una proporción de fluorescencia de TCPP y la cantidad del marcador detectable en la muestra. 22. El método de la reivindicación 21 , en donde el marcador detectable es un compuesto fluorescente. 23. El método de la reivindicación 1 , el cual comprende además, sobre detectar fluorescencia de TCPP en la muestra, caracterizar las células fluorescentes para metaplasia, displasia o carcinoma. 24. El método de la reivindicación 23, en donde la caracterización comprende clasificar la intensidad de fluorescencia de células fluorescentes y correlacionar la intensidad de fluorescencia con el estado metaplástico, displástico o carcinómico de las células. 25. El método de la reivindicación 23, en donde la caracterización comprende clasificar las células fluorescentes por uno o más rasgos morfológicos seleccionados del grupo que consiste de forma celular, tamaño celular, agrupamiento de células, cantidad de degeneración de células o racimos de células, número de núcleos, tamaño de núcleos, visibilidad de la membrana celular y presencia de desechos nucleares, y correlacionar los rasgos morfológicos con el estado metaplástico, displástico o carcinómico de las células. 26. El método de la reivindicación 23, en donde la caracterización comprende clasificar las células fluorescentes por intensidad de fluorescencia y por uno o más rasgos morfológicos seleccionados del grupo que consiste de forma celular, tamaño celular, agrupamiento de células, cantidad de degeneración de células o racimos de células, número de núcleos, tamaño de núcleos, visibilidad de la membrana celular y presencia de desechos nucleares, y correlacionar la intensidad de fluorescencia y rasgos morfológicos con el estado metaplástico, displástico o carcinómico de las células. 27. El método de la reivindicación 26, en donde el número total de los rasgos morfológicos e intensidad de fluorescencia exhibido por las células fluorescentes, es usado como un factor para caracterizar las células fluorescentes por metaplasia, displasia o carcinoma. 28. El método de la reivindicación 26, en donde el patrón de rasgos morfológicos e intensidad de fluorescencia es usado como un factor para caracterizar las células fluorescentes para metaplasia, displasia o carcinoma. 29. El método de la reivindicación 23, en donde las células fluorescentes en la muestra son comparadas con células no fluorescentes de la misma muestra o de una segunda muestra del mismo paciente. 30. El método de la reivindicación 29, en donde las células fluorescente son separadas de las células no fluorescentes mediante citometría de flujo fluorométrico. 31 . Un método para diagnosticar un paciente por cáncer de etapa temprana o condición pre-cancerosa de un tejido u órgano seleccionado, comprendiendo el método: a) obtener una muestra de células del tejido u órgano seleccionado; y b) determinar si la muestra de células contiene células precancerosas anormales o cancerosas mediante el método de la reivindicación 1 , una determinación positiva del mismo siendo indicativa de un diagnóstico positivo de cáncer de etapa temprana o una condición pre-cancerosa del tejido u órgano seleccionado del paciente. 32. Un método para pronosticar una respuesta de paciente a una terapia de cáncer, comprendiendo el método: a) antes de la terapia, realizar el método de la reivindicación 1 en una muestra de células del tejido u órgano del paciente siendo tratado por el cáncer; b) a intervalos durante la terapia y subsecuente a la terapia, realizar el método de la reivindicación 1 en otra muestra de células del tejido u órgano del paciente siendo tratado por el cáncer; y c) determinar si el porcentaje de células pre-cancerosas anormales o cancerosas en las muestras durante y subsecuente a la terapia, es reducido como se compara con la muestra probada antes de la terapia, siendo la reducción pronóstico de la respuesta del paciente a la terapia de cáncer. 33. El método de la reivindiación 32, que comprende además separar las células mediante citometría de flujo fiuorimétrico en una población que comprende células normales y una población comprendiendo células precancerosas anormales y cancerosas. 34. Un método para pronosticar una respuesta de paciente a una terapia de cáncer, comprendiendo el método los pasos de: a) antes de la terapia, realizar el método de la reivindicación 1 en una muestra de células sin fijar del tejido u órgano del paciente siendo tratado por el cáncer; b) separar las células por citometría de flujo de fluorescencia en poblaciones de baja fluorescencia o no fluorescentes y de alta fluorescencia, siendo normales o metaplásticas las poblaciones de baja fluorescencia o no fluorescentes, siendo displástica o carcinómica la población de alta fluorescencia; c) tratar las poblaciones de células separadas con un agente terapéutico de cáncer potencial in vitro; y d) observar el efecto del agente en cada una de las dos poblaciones de células, una observación de que el agente está ejerciendo su efecto negativo deseado en la población de células displásticas o carcinómicas y no, o en una cantidad reducida, en la población de células normales, siendo pronóstico de la respuesta del paciente a la terapia de cáncer. 35. Un método para detectar células displásticas o carcinómicas en un tejido objetivo seleccionado de un paciente, comprendiendo el método los pasos de: a) introducir en el tejido objetivo una solución de TCPP bajo condiciones que permiten la unión de la TCPP a componentes de las células displásticas o carcinómicas, si están presentes; b) remover TCPP no unido del tejido objetivo; y . c) detectar la fluorescencia de TCPP en las células del tejido objetivo, siendo indicativa la presencia de fluorescencia de TCPP en la presente de que el tejido objetivo contiene células displásticas o carcinómicas. 36. El método de la reivindicación 35, en donde el tejido objetivo es seleccionado del grupo que consiste de pulmón, pecho, glándula de la próstata, cerviz, garganta, vejiga, orofaringe, piel y tracto gastrointestinal. 37. Un método para hacer una solución de TCPP, que comprende disolver la TCPP en una solución alcohólica acuosa comprendiendo entre aproximadamente 50% y aproximadamente 90% de alcohol, a un pH entre aproximadamente 8.5 y aproximadamente 12.0. 38. El método de la reivindicación 37, en donde el alcohol es isopropanol. 39. El método de la reivindicación 37, en donde el pH es ajustado con bicarbonato de sodio o hidróxido de amonio. 40. El método de la reivindicación 37, en donde la TCPP disuelta es aproximadamente 2 mg/ml o menos. 41. Una composición que comprende TCPP disuelta en una solución alcohólica acuosa de aproximadamente 50% a aproximadamente 90% de alcohol a un pH de entre aproximadamente 8.5 y aproximadamente 12.0. 42. La composición de la reivindicación 41 , en donde la concentración de TCPP en la solución es aproximadamente 2 mg/ml o menos. 43. La composición de la reivindicación 41 , en donde el alcohol es isopropanol. 44. La composición de la reivindicación 41 , que tiene el pH ajustado con bicarbonato de sodio o hidróxido de amonio. 45. La composición de la reivindicación 41 , que comprende 1 mg/ml de TCPP en 50% de isopropanol y 50 mM de bicarbonato de sodio. 46. Un conjunto para la detección de células displásticas o carcinómicas en una muestra, comprendiendo el conjunto TCPP en un recipiente e instrucciones para su uso para la detección de células precancerosas anormales o cancerosas en una muestra. 47. El conjunto de la reivindicación 46, que comprende la composición de la reivindicación 41 . 48. El conjunto de la reivindicación 46, que comprende además uno o más de: a) componentes para recolectar la muestra de células; b) componentes para adherir la muestra a un soporte sólido; c) muestras de células de control de condición displástica, metaplástica o normal; y d) componentes para cuantificar la fluorescencia de TCPP. RES UMEN Se presenta un método para detectar estados precancerosos en muestras de células y tejidos de mamífero que comprende incubar una muestra con 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxifenil) porfina (TCPP) solubilizada, medir la fluorescencia de TCPP en la muestra y categorizar la muestra, y categorizar la muestra como no cancerosa, precancerosa o cancerosa con base en la fluorescencia de TCPP, según se correlaciona con los estados respectivos de las células. Junto con el método, se presenta un método de detección novedoso y más eficiente de TCPP para solubilizar TCPP, así como una composición que comprende TCPP solubilizada medíante este método.