JP6650334B2 - 散乱媒体の拡散ルミネセンスイメージングまたは断層撮影の改善のためのシステム、方法、およびルミネセンスマーカー - Google Patents

Description

本発明は、一般に、吸収および散乱媒体の光ルミネセンスイメージングまたは光ルミネセンス断層撮影、ならびに散乱媒体のそのような光ルミネセンスイメージングまたは散乱媒体のそのような光ルミネセンス断層撮影のための光ルミネセンスマーカーの分野に関する。

光ルミネセンスイメージング（簡単に言えば、ルミネセンスイメージング）または光ルミネセンス断層撮影（簡単に言えば、ルミネセンス断層撮影）にとって興味のある散乱媒体の一例は生体組織である。組織光学は、光とそのような組織との相互作用の研究に専念する分野である。最近の数十年にわたり、この分野は急速に発展してきた。光−組織相互作用の知見が増大するとともに、組織光学を診断ツールとして応用することへの関心も出て来ており、基礎研究からの成果が得られている。

本開示が部分的に扱っている組織光学の分野は、ヒトまたは動物の生体内イメージングのための非侵襲的手法である光ルミネセンス断層撮影を含む光ルミネセンスイメージングである。これらのイメージング手法はルミネセンスベースであり、ルミネセンス生物学的マーカーの励起のための外部光源を必要とする。

光ルミネセンスは、物質が光子を吸収し、次に光子を再放射するプロセスである。ルミネセンスの特定の形態が蛍光であり、一般に放出される光子は照明に使用されたものよりも低いエネルギーのものである。したがって、蛍光では、蛍光波長が、照明した光の波長を基準としてより長い波長にストークスシフトされる。

蛍光イメージングは既知であり、例えば、ある期間にわたって小動物内での薬からの生物学的応答を研究するのに小動物を犠牲にする必要なしに使用することができる。

下村、Ｃｈａｌｆｉｅ、およびＴｓｉｅｎは、非常に重要な蛍光マーカーになった緑色蛍光タンパク質の発見および発展に対して２００８年にノーベル賞を授与された。

しかし、これまで、吸収および散乱媒体における拡散ルミネセンスイメージングまたは拡散ルミネセンス断層撮影のための蛍光分子イメージングおよび断層撮影システムにはいくつかの欠点がある。それらは例えば低い解像度またはコントラストを有し、そのため、イメージング結果に基づく診断作業が困難である。したがって、例えば、提供される２次元または３次元画像のコントラストおよび／または解像度を改善することによって、画像品質を改善したそのようなシステムの必要性がある。

さらに、これらのシステムは、測定結果を低下させる常に存在する内生組織自己蛍光に敏感である。蛍光生物学的マーカーからの蛍光信号とバックグラウンド自己蛍光とがしばしば重なるので、それらを分離するのは困難であり、多くの場合確実には可能でない。

ストークスシフトされた蛍光体を使用する場合、自己蛍光は蛍光信号を隠し、信号対バックグラウンド感度を事実上制限する。

Ｘ．Ｇａｏ等、"Ｉｎ ｖｉｖｏ ｃａｎｃｅｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔｓ"、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２２、８：９６９〜９７６、２００４ Ｇ．Ｙｉ等、"Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｚｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ＮａＹＦ４：Ｙｂ，Ｅｒ ｉｎｆｒａｒｅｄ−ｔｏ−ｖｉｓｉｂｌｅ ｕｐ−ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｓ"、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４、１１：２１９１〜２１９６、２００４ Ｃ．Ｔ．Ｘｕ、Ｊ．Ａｘｅｌｓｓｏｎ、およびＳ．Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ−Ｅｎｇｅｌｓ、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．９４、２５１１０７ （２００９） Ｊ．Ｐ．Ｃｕｌｖｅｒ、Ｖ．Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ、Ｍ．Ｊ．Ｈｏｌｂｏｋｅ、およびＡ．Ｇ．Ｙｏｄｈ、Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．２６、７０１（２００１） Ｅ．Ａｌｅｒｓｔａｍ、Ｓ．Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ−Ｅｎｇｅｌｓ、およびＴ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．１３、０４１３０４（２００８）

そのため、特に、コントラストの改善および／またはイメージング解像度の改善によって有効性を向上することができるようにするルミネセンスイメージングまたはルミネセンス断層撮影のための改善した拡散ルミネセンスイメージングまたはルミネセンス断層撮影のシステム、方法、またはルミネセンスマーカーの必要性がある。

したがって、本発明の実施形態は、好ましくは、単独または任意の組合せで、添付の特許請求の範囲によるシステム、方法、および使用法を提供することによって、上述で確認されたような当技術分野における１つまたは複数の欠陥、欠点、または問題を緩和、軽減、または除去しようと努力するものである。

本開示では、従来のストークスシフト型蛍光体を新しいタイプのルミネセンスマーカー、すなわち非線形マーカーに取り替えることによって、上述の目的および改善が達成されることが示される。

本発明の第１の態様によれば、拡散ルミネセンス分子イメージングによって散乱媒体中の領域を画像化する方法が提供される。この領域は、散乱媒体中でマーカー位置に配置された少なくとも１つのルミネセンスマーカーを含み、ルミネセンスマーカーは非線形ルミネセンスマーカーである。この方法は、少なくとも１つの光源位置から励起体積中に１つまたは複数の光源によって放出された励起光によってルミネセンスマーカーを励起する段階と、励起光によるルミネセンスマーカーからのルミネセンスを検出器によってルミネセンス光検出位置で検出する段階と、光源位置とマーカー位置との間で移動を行う段階と、検出されたルミネセンスの励起光強度への非線形依存と、マーカー位置に関連する光源位置とに基づいてルミネセンスマーカーを画像化する段階とを含む。

本発明の第２の態様によれば、散乱媒体中の注目する領域の拡散ルミネセンス分子イメージングのためのシステムが提供される。このシステムは散乱媒体のルミネセンス分子イメージングで使用するためのルミネセンスマーカーを含み、ルミネセンスマーカーは散乱媒体中に配置された非線形ルミネセンスマーカーである。このシステムは、１つまたは複数の光源によって励起体積中に放出された励起光によってルミネセンスマーカーを励起するために、少なくとも１つの光源位置によって位置づけられた１つまたは複数の光源を備える。このシステムは、励起光によるルミネセンスマーカーからのルミネセンスを検出するルミネセンス光検出位置における検出器を備え、ルミネセンス分子イメージングは、検出されたルミネセンスの励起光強度への非線形依存と、マーカー位置に関連する光源位置とに基づいてルミネセンスマーカーを画像化する段階とを含む。

実施形態では、ルミネセンスマーカーは、照明波長の入射光をアップコンバートするように構成された非線形ルミネセンスマーカーの群に含まれ、その結果、前記ルミネセンスマーカーが前記入射光で照明されると、ルミネセンスが前記照明波長よりも短いルミネセンス波長で生じる。

ルミネセンスマーカーは、いくつかの実施形態では、生物学的ルミネセンスマーカーである。

本発明の別の態様によれば、本発明の第２の態様のシステムの使用がタブレットのルミネセンスイメージングまたは断層撮影用に提供される。

本発明の別の態様によれば、本発明の第２の態様のシステムの使用が小動物の生体内または生体外ルミネセンスイメージングまたは断層撮影用に提供される。

本発明の別の態様によれば、本発明の第２の態様のシステムの使用が、前記ルミネセンスイメージングまたは断層撮影による癌診断などの機能的診断用に提供される。

一実施形態では、非線形マーカーが別のイメージングモダリティのために画像化造影剤に付加される。例えば、非線形マーカーは、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、Ｘ線などのような従来のイメージングモダリティで画像化するために造影剤に付加される。特定の実施形態では、非線形マーカーは、常磁性を有する有機ガドリニウム複合体またはガドリニウム化合物に付加される。

本発明のさらなる実施形態が従属クレームで規定され、本発明の第２およびそれに続く態様の特徴は準用して第１の態様と同様である。

いくつかの実施形態は、拡散ルミネセンス分子イメージングおよび蛍光分子断層撮影の解像度の向上を可能にする。

いくつかの実施形態はタブレットの成分の分布の決定を可能にする。例えば非線形ルミネセンスマーカーまたは蛍光体はタブレットの活性成分に付加することができる。それにより、活性成分の空間分布を有利には決定することができる。

いくつかの実施形態は、非線形マーカーがＭＲＩ造影剤として使用される場合、医用磁気共鳴映像のコントラストの増強を可能にする。同時に、ルミネセンスイメージングまたは断層撮影を行い、注目する生体内の全く同一の領域の高解像度ＭＲＩと組み合わせた機能的診断情報を可能にすることができる。

「備える、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）／備えている、含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用されるとき、述べられるフィーチャ、整数、段階、または構成要素の存在を明示するために使用されるが、１つまたは複数の他のフィーチャ、整数、段階、構成要素、またはそれらのグループの存在または追加を排除しないことが強調されるべきである。

本発明の実施形態が可能にするこれらおよび他の態様、特徴、および利点は、添付図面を参照する本発明の実施形態の以下の説明から明らかであり、解明されるであろう。

自己蛍光バックグラウンドによる典型的な信号を示すグラフである。 ヤブロンスキー図である。 いくつかの組織蛍光体からの蛍光スペクトルを示すグラフである。 ａ）放射および非放射エネルギー移動、ｂ）共振および非共振エネルギー移動、ならびにｃ）ＥＴＵ（左）およびＥＳＡ（右）アップコンバージョンの比較の概略図である。 ａ）単一励起蛍光およびｂ）アップコンバージョン蛍光における多重励起の概略図である。 アップコンバージョンナノ結晶のＹｂ^３＋−Ｔｍ^３＋イオン対のアップコンバージョンプロセスの概略図である。 図４Ａのアップコンバージョンナノ結晶の放出スペクトルを示すグラフである。 平面イメージング実施態様の概略図であり、すなわち、（ａ）蛍光体イメージングで使用されるセットアップ（エピ蛍光）、（ｂ）透照での蛍光体再構成に使用されるセットアップ、および（ｃ）蛍光拡散光学断層撮影のための別のセットアップの概略図である。 ａ）〜ｄ）は様々な蛍光強度分布を示す画像およびグラフである。 ａ）〜ｃ）は線形蛍光体による蛍光イメージングと非線形蛍光体による蛍光イメージングとの間の差の概略図である。 散乱媒体中の励起光および放出光の伝搬の概略図である。 線形蛍光体と非線形蛍光体との間の断層撮影再構成の比較を示す図である。 線形パワー依存を有する蛍光体の感度プロファイルを示す図である。 二次のパワー依存を有する蛍光体の感度プロファイルを示す図である。 蛍光断層撮影の問題の概略図である。 単一ビーム励起、および単一ビーム励起と二重ビーム励起との組合せに対する重み行列Ｗの正規化特異値分布を示すグラフである。 Ａ）単一ビーム画像のみを使用する（１０Ａ）アップコンバートナノ粒子の３次元再構成の図であり、Ｂ）単一ビーム画像および二重ビーム画像の両方を使用する（１０Ｂ）アップコンバートナノ粒子の３次元再構成の図である。 単一ビーム画像のみを使用する再構成での再構成された相対ナノ粒子分布（１４Ａ〜１４Ｃ）、および単一ビーム画像と二重ビーム画像との両方を使用する再構成での再構成された相対ナノ粒子分布（１４Ｄ〜１４Ｆ）の断面スライスを示す図である。 単一ビーム画像のみを使用する再構成での再構成された相対ローダミン６Ｇナノ粒子分布（１５Ａ〜１５Ｃ）、および単一ビーム画像と二重ビーム画像との両方を使用する再構成での再構成された相対ローダミン６Ｇナノ粒子分布（１４Ｄ〜１４Ｆ）の断面スライスを示す図である。 ａ）線形の従来の蛍光色素およびｂ）アップコンバートナノ粒子の蛍光画像、ならびにｃ）ａ）およびｂ）の画像の断面を示す図である。

本開示のいくつかの実施形態は、拡散ルミネセンスイメージングおよび断層撮影を扱う前述の組織光学の分野に関する。最も良く見える波長では、光は組織内に数ミリメートルを超えて透過しない。しかし、診断ウィンドウ（波長６００〜１６００ｎｍ）では、光透過は数センチメートルまでによるイメージングを可能にするのに十分である。これにより、組織中深くの蛍光造影剤を画像化する可能性が開かれる。拡散して散乱する光の蛍光イメージングは生物医学用途では注目すべき重要性を有する。

蛍光断層撮影は、ヒトまたは動物の内部の造影剤分布の３次元再構成に基づく。３次元再構成は蛍光イメージング技術に基づく。

上述のように、拡散的散乱光の蛍光イメージングおよび断層撮影の分野は常に存在する内生組織自己蛍光による悪影響を長い間受けてきており、低いコントラストおよび解像度であった。ストークスシフトされた蛍光体を使用する場合、自己蛍光は造影剤からの信号を隠し、信号対バックグラウンド感度を事実上制限する。

現実的な光学的性質をもつ組織ファントムへの実験が行われ、自己蛍光なしの信号を検出することが可能であることが示された。さらに、３次元断層撮影再構築にナノ結晶を使用することが開示される。

したがって、アップコンバートナノ結晶などの非線形マーカーは組織イメージングのための重要な生物学的マーカーであることが示される。

蛍光イメージングまたは断層撮影の生物医学的イメージングの範囲内のいくつかの用途が以下で説明される。これは散乱媒体の特定の場合である。

他の用途は非生物学分野で提供される。そのような分野の例は、タブレット、非線形マーカーをもつ媒体を流す液体または気体用のフィルタなどの品質管理を含む材料試験のためのルミネセンスイメージングまたは断層撮影である。

本発明の本用途および実施形態の関連において、蛍光イメージングはルミネセンスのすべてのタイプのイメージングを意味する。さらに、説明される任意のイメージングまたは断層撮影は高度に散乱する媒体中にあり、伝統的には、検出される光の拡散特性のために解像度が不十分である。本発明の実施形態は、有利には、ルミネセンス断層撮影を含むそのようなルミネセンスイメージングのコントラストおよび解像度を改善する。

次に、本発明の特定の実施形態が添付図面を参照しながら説明される。しかし、本発明は様々な形態で具現することができ、本明細書に記載される実施形態に限定されるように解釈されるべきでなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が詳細で完全なものとなり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるために提供される。添付図面に示される実施形態の詳細な説明で使用される術語は本発明を限定することを意図していない。図面において、同様の数字は同様の要素を参照する。

以下に、蛍光イメージングおよび組織光学の基本と、それに引き続きアップコンバートナノ結晶などの非線形マーカーおよびアップコンバートナノ結晶を使用する蛍光光学断層撮影の説明とが与えられる。さらに、実験およびシミュレーションからの結果が開示される。以下の本文では蛍光イメージングはルミネセンスのすべてのタイプのイメージングを意味する。さらに、説明される任意のイメージングまたは断層撮影は高度に散乱する媒体中にあり、検出される光の拡散特性のために解像度が不十分である。

蛍光コントラスト
蛍光を発する分子（蛍光体）からの光放出のプロセスはヤブロンスキー図で説明することができる（図１Ａを参照）。図１Ａは、分子の励起状態からの様々な減衰経路を示すヤブロンスキー図を示す。図の下部に、エタノール中のヘマトポルフィリンからの蛍光スペクトルが示される。省略形は、Ｓｎ：一重項状態、Ｔｎ：三重項状態、Ａｂｓ：吸収、Ｓｃ：散乱、ＩＣ：内部変換、Ｆ：蛍光、ＩＸ：項間交差、Ｐ：燐光、Ａ：他の分子への移動である。さらにいくつかのプロセスの近似の時間スケールが寿命（ＬＴ）として図１Ａに右下に示され、さらにτと表記される。

入射光子が分子の２つのエネルギー帯間のギャップに対応するエネルギーを有する場合、入射光子は吸収され得る。それによって、光子エネルギーはより高いエネルギー帯への分子の励起に使用されることになる。励起状態は不安定であり、分子は基底状態に戻ることになる。下方遷移は、図１Ａに示されるようにいくつかの異なる経路に従うことができる。ラベル付けされた準位は、原子のエネルギー準位に対応する電子レベルである。Ｓ０、Ｓ１などは、電子スピン量子数の和が０である一重項状態であり、一方、Ｔ０、Ｔ１などは、１個の電子のスピンが符号を変えている三重項状態である。大きい分子では準位間の間隔は非常に小さく、状態は分子相互作用のために重なる。光子が分子に吸収される場合、励起電子準位の最も低い振動準位に分子を必ずしも励起するのではなく、より高い振動状態に励起する可能性が高い。これは、迅速な（１０^−１５ｓ）吸収プロセスの間に、原子は振動運動中に場所を変えないことを述べるフランク−コンドン原理の結果である。分子が高エネルギー準位に励起されると、Ｓ１の最も低い回転−振動状態への迅速な緩和が後続することになる。この緩和の短い時間スケール（１０^−１２ｓ）は高密度の回転振動準位に起因する。分子は、Ｓ１から、無放射動力学的相互作用により状態Ｓ０に進むことができる。これは内部転換（ＩＣ）と呼ばれる。

代わりに、下方遷移は光子の放出をもたらすことができ、このプロセスは蛍光と呼ばれる。遷移はＳ０の回転振動状態のいずれかで終了することができるので、様々な光子のエネルギーは明確な値ではなくむしろ広い分布を有することになる。したがって、分子からの蛍光スペクトルはほとんど場合いかなる有意な構造もなしに幅広いものとなることになる。スペクトルの形態はより低い準位（Ｓ０）への遷移の確率を反映することになる。図１Ａの下部に、腫瘍マーカーまたは光感作物質であり、後に説明されるヘマトポルフィリンの蛍光スペクトルが示される。吸収−ＩＣ−蛍光の経路が完了した後、分子は当初の状態および構成に戻る。したがって、蛍光プロセスは非破壊であり、可逆的であり、それは例えば医学的診断では利点である。

スピン禁止であるが、三重項系への遷移が生じることがある。同様に、三重項系において、最も低い励起状態への迅速な内部転換が生じるはずである。Ｓ０への遷移はスピン禁止であるので、これは、遷移Ｓ１−Ｓ０よりも非常に遅い速さ（ｔ １０^−６〜１ｓ）で進行することになる。このプロセスは燐光と呼ばれ、室温ではそれほど頻繁には観察されない。

励起された分子には、いくつかの他の経路、例えば、他の分子へのエネルギー移動、電子移動、エキシマー形成、および分子の解離をもたらす反発状態への励起などがあり得る。これらのプロセスは図１ＡのＡで示される。

多くの蛍光分子は１つの重要な特徴を共通に有しており、それは、共役二重結合の完全な鎖である、すなわち、１つおきの結合が二重結合であることである。ヘマトポルフィリンの構造はこれの一例である（図示せず）。これは、腫瘍の蛍光診断および光線力学療法に使用される蛍光分子である。

重要な組織蛍光体の蛍光の性質についての知見により、未知のサンプルの蛍光記録は各蛍光体の相対的寄与をもたらすことになる。蛍光特性が、分離した蛍光体のものと同じである場合、蛍光体の濃度を推定することができる。しかし、常にそうであるわけではない。むしろ、蛍光の性質は、極性およびｐＨなどの環境要因に依存する。

蛍光の別の重要な態様は励起状態ならびに基底状態における迅速な緩和である。分子は励起エネルギーの一部を緩和によって開放する。さらに、蛍光体のまわりの溶媒双極子の再分配、および水素結合などの特定の相互作用がこの緩和工程に寄与する。したがって、蛍光光子のエネルギーは励起のエネルギーよりも低い、言い換えれば、蛍光波長は励起波長よりも長い。これはストークシフトと呼ばれ、様々な分子環境で異なる。したがって、分子環境についての一般的知見が、十分な蛍光診断には必要である。

蛍光イメージング
ポイントモニタ装置とは対照的に、蛍光イメージングシステムは多数のポイントの蛍光信号を検出することができる。したがって、注目する区域の２次元画像が生成される。典型的なシステムはチューナブルフィルタと共にカメラを含む（図５ａを参照）。透照での同様のセットアップが図５ｂに概略的に示される。チューナブルフィルタにより所望の検出波長を容易に選択することができ、約２０ｎｍ幅のスペクトル解像度を達成することができる。

非線形蛍光体による蛍光イメージング
蛍光イメージングのうちの特に興味あるサブセクションは本実施形態の非線形蛍光体を使用するものである。本用途の関連において、「非線形マーカー」はルミネセンスマーカーであり、マーカーのルミネセンス（Ｌ）は励起光（Ｅ）の光束に線形には依存しない。したがって、非線形マーカーは、Ｌ＝ｋ×Ｅ＾ｘに従うルミネセンスを有し、ここで、ｘ＞１であり、ｋは正の定数である。非線形マーカーは、さらにＬ＝ｋ×Ｅ＾ｘ＋ｂ、Ｌ＝ｋ（Ｅ）×Ｅ＾ｘ＋ｂ、Ｌ＝ｋ（Ｅ）×Ｅ＾ｘ＋ｂ（Ｅ）、またはＬ＝ｋ×Ｅ＾ｘ＋ｂ（Ｅ）の関係に従うルミネセンスを有することがあり、ここで、ｋおよびｂは一定であるか、または励起光（Ｅ）の局所場に依存する（すなわちｋ（Ｅ）およびｂ（Ｅ））材料定数であるしたがって、従来のルミネセンスイメージングと比較して、非線形マーカー（または蛍光体）は励起に１つよりも多くの光子を必要とすることがある。これは励起体積を強烈に減少させ、より局在化した励起ポイントを与える。このようにして、以下で実証されるように、ルミネセンスイメージングのコントラストおよび解像度が改善される。さらに詳細には、吸収および散乱媒体のルミネセンスイメージングにおける散乱光のコントラストおよび解像度が改善される。本発明の実施形態はこの効果を利用する。

線形蛍光体による蛍光イメージングと非線形蛍光体による蛍光イメージングとの間の差を示すために、図７ａ〜ｃが参照される。図７ａはグレイスケールの線形蛍光画像を示す。各画素（７０５）は格子パターン（７０１）中の１つの励起ポイント（７０４）に対応する。図７ｂは、２光子非線形蛍光体、すなわち非線形ルミネセンスマーカー（７０２）で得られた画像を示す。図７ｃにおいて、蛍光体（７０２）は赤（より大きい円）（７０３）で示され、黒い点（７０４）は格子パターン（７０１）中の励起のポイントを示す。円（７０３）は、格子パターン（７０１）上のマーカー（７０２）の投影画像に対応する。励起ポイント（７０４）は、ルミネセンスマーカー（７０２）を走査するときの光源、すなわち、レーザ（５０３）の位置に対応する。非線形蛍光体を使用すると、蛍光画像のコントラストおよび解像度が向上することが明確に分かる。これは、以下で説明される図９および図１０Ａ、１０Ｂによってさらに支持される。特に、光源が、図７において、マーカー（７０２）、または格子パターン（７０１）上のマーカー（７０２）の対応する投影画像（７０３）の近くの７０６として印を付けられた位置にある場合、励起体積は十分に小さく、非線形マーカー用の光源位置（７０６）に局在化されており、その結果、ルミネセンスは図７ｂの対応する画素（７０８）で検出されない。図７ａの線形蛍光画像では、対応する画素（７０７）は、散乱媒体中での増大した励起体積に起因するルミネセンスを受け取る。２光子非線形依存は励起体積の狭い光子密度を与える。したがって、励起光強度への検出ルミネセンスの非線形依存に基づいてマーカー（７０２）を画像化することによって、解像度を向上させることができる。

蛍光分布自体の画像ではなくむしろ異なる励起場所の蛍光強度の画像を製作することによって、図１６（ａ）および（ｂ）のような画像を得ることができる。励起体積が非線形蛍光体ではより小さいので、蛍光マーカーのより小さい部分が光るようになり、したがって、従来の線形蛍光体と比較して解像度が向上することになる。

非線形蛍光体は、一般に、線形蛍光体と比較してより高い励起強度を必要とし、いくつかの非線形蛍光体はコヒーレント励起さえも必要とする。散乱媒体では、光は集束されるのではなくむしろ全方向に広がるので、高い強度を達成するのは困難である。このために、ある非線形蛍光体は他のものと比較して散乱媒体の蛍光イメージングにより好適になる。蛍光体は特別高い収率を有する必要があるが、コヒーレント励起を必要としないことがある。アップコンバートナノ粒子は、高い収率と非コヒーレント励起の１つのそのような非線形蛍光体である。

蛍光イメージングの用途
蛍光断層撮影
物体の表面から放出された蛍光の平面画像はいくつかの態様に関する情報を含む。分光の特徴は蛍光体のタイプをもたらし、強度は蛍光体の濃度に関連する。

これは、物体表面上に位置している、または物体表面上で励起される蛍光体に適用できる。深くに位置する蛍光体を考慮に入れると、複雑性は何倍にも増加する。これは、分光の特徴ならびに強度が物体のバルク組織、すなわち周囲の組織の光学的性質によって関連づけられ影響されるためである。いくつかの要因が考慮に入れられなければならない。すなわち、
・励起光の吸収および散乱。蛍光体は光を放出するために励起されなければならず、したがって、励起光は蛍光体の場所に達しなければならない。
・励起光源の位置。同じ励起光とすると、蛍光体の近くに位置づけられた光源は、その光源から遠くに位置づけられた光源と比較してより多くの蛍光体を励起することになる。
・蛍光体の位置およびサイズ。ここで、蛍光体は、内部構造をもつ、すなわち輪郭のはっきりした、蛍光マーカーの均一な分布を含む領域として扱われる。サイズおよび位置に応じて、放出された蛍光は境界上において異なる外観を有することになる。
・放出光の吸収および散乱。放出は、組織を通って伝搬するとき減衰させられる。通常、放出の光学的性質は励起光のものと同じではない。
・放出光の収集位置。収集された強度は、検出された場所（境界上の）に依存する。これは、放出部位（蛍光体の位置）からの伝搬経路、および収集部位（境界）の不均等に起因する。

これらの要因が絶えず変化する様式で関連づけられるために、収集した信号を解釈するためのツールの必要性が避けられない。次に、深くに位置する蛍光マーカーの蛍光イメージングに光学断層撮影技法を使用する際の基本の目標は吸収および散乱物体内の蛍光体を定量化し局在化することである。

「定量化する」という用語は蛍光体の真の濃度が求められることを意味し、一方、「局在化する」という用語は物体の３次元ボクセルごとの濃度が求められることを意味する。２つの用語は、さらに、蛍光体コントラストに基づいて、物体の内部の３次元画像を形成する可能性をもたらし、したがって、断層撮影という名称の使用の動機となる。

蛍光断層撮影の用途
小動物のイメージング
今日、医学的診断用にヒトの患者に使用するのにインドシアニン（ＩＣＧ）のみがＦＤＡ承認されているが、小動物のイメージングでは可能性のある蛍光体は多数ある。これは、細胞の生物医学的現象のイメージングに蛍光を利用する様々な顕微鏡的技法の使用によって開始された過去何年にもわたるプローブ開発における研究の加速の結果である。

蛍光体は活性プローブおよび活性化可能プローブ（ａｃｔｉｖａｔｅａｂｌｅ ｐｒｏｂｅ）に分類することができる。

活性プローブは、標的に専用の親和性リガンドに付加されている非特異的蛍光体である。これらのリガンドは抗体、ペプチド、およびラベル付けされた小さい分子である。活性プローブは、標的リガンドに付加されていない場合でさえ励起時に蛍光を放出する。これは、非特異的な、すなわち、画像化されるべき標的に関する情報がないバックグラウンド蛍光をもたらす。

活性化可能プローブは、「オンにされた」ときにのみ蛍光を放出するのでより特異的である。蛍光体は消光剤のすぐ近くに配置され、代替として、いくつかの蛍光体は互いに自己消光するように一緒に配置される。この構成は、酵素特異的ペプチド配列により可能である。酵素の存在下で、ペプチド配列は切断され、したがって、蛍光体は消光することなく自由に光を放出することができる。活性化可能プローブの使用が、生体内でのタンパク質分解酵素の識別に対して実証された。活性化可能プローブは、標的分子が存在する場合にのみ励起時に光を放出することができるのでスマートプローブまたは光学ビーコンと時には呼ばれる。蛍光プローブは特異的分子または特異的生物学事象を標的としており、それにより、その機能が画像化される。これは、血管新生および血管透過性を視覚化するのに使用される他の非標的蛍光色素、例えばＩＣＧと対照的である。コントラストを向上させる別の方法は遺伝学的にコード化されるプローブを使用することである。導入遺伝子（レポーター遺伝子）が細胞に挿入される。導入遺伝子は、転写時に動物の内部で本質的に生成されることになる蛍光タンパク質（ＦＰ）に対してコード化する。プローブは光学技法を使用して検出することができ、このモダリティは、放出された蛍光が遺伝子調節または遺伝子発現の存在を視覚化するので間接蛍光イメージングと呼ばれる。細胞はレポーター遺伝子にトランスフェクションを起こさせることができ、細胞追跡を画像化することができる。ＦＰを注目する遺伝子に融合させると、生体内のほとんど任意のタンパク質を画像化することが可能性になる。間接蛍光イメージングにおけるＦＰは、興味ある画像化能力、例えば、注目するタンパク質は影響を受けないが、ＦＰが蛍光を放出することによりタンパク質間相互作用を提供する。

いくつかのタイプの蛍光タンパク質が存在するが、主な系統群は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に基づく。ＮＩＲ領域で放出および吸収するＧＦＰを開発するために、プローブ開発が進んでいる。今日、ＮＩＲ ＦＰは存在していないが、黄色および赤色蛍光タンパク質は報告されている（ＹＦＰおよびＲＦＰ）。コントラストは蛍光体濃度および蛍光体位置に依存する。コントラストは、さらに、いわゆる活性プローブによって制御される。蛍光体が活性でない場合蛍光は放出されないことになる。生体媒質で蛍光診断を使用することによる常に存在する問題は自己蛍光およびバックグラウンド蛍光である。

自己蛍光は内因性発色団によって放出される蛍光であり、一方、バックグラウンド蛍光は注目する領域の外部の蛍光プローブから生じる蛍光である。自己蛍光およびバックグラウンド蛍光を理論的に取り去る方法が報告されている。非特異的蛍光の存在は事実上コントラストを低減させる。

臨床癌診断
これまでの主な用途はＩＣＧまたはＩＣＧの誘導体を使用する乳癌診断である。蛍光タンパク質は、人体に用いる上での選択肢とならないのは明らかであり、したがって、蛍光体イメージングは非特異的分子プローブを機能化にすることによって達成されることになる。

非線形蛍光体断層撮影
例えばアップコンバートナノ結晶における放出蛍光の二次依存により、蛍光断層撮影は改善される。

図９は、線形蛍光体の使用と二次蛍光体の使用との間の差を示す。

図８は、散乱媒体中の励起光（８０１）および放出光（８０２）の伝搬の概略図である。

図１１は蛍光断層撮影問題の概要説明である。励起光（８０３）を放出する励起光源は境界上で移動させられるのに対して、放出される蛍光（８０４）は所定の位置で不変であるが、放出強度は光源の場所に応じて変化している。

図１０Ａおよび１０Ｂは、線形（１０Ａ）および二次（１０Ｂ）のパワー依存を有する蛍光体の感度プロファイルを示す。光源は図の左側にあり、検出器までの距離はＬである。計算は、無限均質媒体へのグリーン関数の解析表式を使用して行われた。図１０Ａおよび１０Ｂで分かるように、二次感度プロファイルは、光源近くの、ｘ軸を中心とした対称回転のまわりで非常に鮮明である。これは、１つの平面において高い感度（解像度）で情報を抽出することが可能であることを意味する。

より高い次数の非線形蛍光体、例えば３次の蛍光体の他の実施形態では、コントラスト増強はさらに改善される（図示せず）。

組織光学および組織の自己蛍光
組織光学の分野では、組織との光相互作用が研究される。光学的に、生体組織は、水よりわずかに高い屈折率をもつ不均質で吸収性の媒体である。光が組織と相互作用すると、多数の散乱および吸収事象が生じると予想され、これらの事象の可能性は高度に波長依存である。組織は高濃度の水を有するので、水からの吸収が低い波長領域からの光を使用するのが有利であり、これは使用可能波長に究極的制限を強いることになる。しかし、いくつかの実施形態におけるように経皮的非侵襲性用途では、光は肌を透過する必要があり、それは使用可能波長にさらなる制約を課することになる。

肌は、最上部の角質層と、それに続く表皮およびその下の真皮をもつ層状構造と見なすことができる。角質層および表皮は、主として芳香族アミノ酸、核酸、およびウロカニン酸からの３００ｎｍ未満の波長の高い吸収に起因して光の減衰に非常に効果的である。３５０〜１２００ｎｍのより長い波長では、表皮中のメラニンが主要な吸収体である。光が真皮に入るとき、散乱が吸収と比べて支配的になり始める。したがって、真皮は不明瞭な組織基質として記述することができる。真皮より下の組織タイプでは、散乱が吸収と比べて通常支配的である。粗い近似では、散乱はレイリー散乱を使用してモデル化することができる。これは、より短い波長の光はより長い波長の光よりもより多く散乱することを意味する。

組織の散乱および吸収の両方を考慮すると、経皮的診断ウィンドウはより長い波長範囲に存在し、６００ｎｍから１６００ｎｍにわたると考えることができる。

組織は、λ＜６００ｎｍで励起されたとき小さいストークシフトによる強力な蛍光を有するいくつかの内因性蛍光体を含む。診断ウィンドウのより長い波長では、組織からの内因性自己蛍光は一般に非常に弱い。しかし、多くのイメージングおよび断層撮影の用途では、信号自体も弱く、したがって、信号は、依然として、偽信号を引き起こすバックグラウンド自己蛍光によって制限される。自己蛍光バックグラウンドスペクトル（破線）をもつ典型的な信号（実線）が図１に示される。

前述の自己蛍光、または組織自体の内因性蛍光はいくつかの異なる蛍光体によってもたらされる。一般的な組織蛍光体のいくつかは、結合線維中にあるコラーゲンおよびエラスチン、大部分のタンパク質およびフラビン中にあるトリプトファン、および細胞の消化において活性なニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＨ）である（コラーゲン（１０１）、エラスチン（１０２）、ＮＡＤＨ（１０３）、およびカロテン（１０４）のスペクトルを示す図１Ｂを参照）。

スペクトルは、さらに、組織の光学的性質によって影響される。ヘモグロビンなどの強力な吸収体はいくつかの波長で蛍光光を吸収することがあり、それにより、蛍光スペクトルの外観を変化させ、偽のディップおよびピークを生成する。ヘモグロビンは、さらに、励起光を吸収することによって蛍光スペクトルの形状を変化させることなく蛍光スペクトルの全体的強度を減少させることがある。

外因性蛍光体
外因性蛍光体のいくつかの例は、蛍光タンパク質（ＦＰ）、ＮＩＲ色素（ＮＤ）、量子ドット（ＱＤ）、または光感作物質（ＰＳ）がある。

量子ドットは、組織自己蛍光よりも多くストークスシフトされた信号を放出する線形蛍光体である。量子ドットは、主として紫外線（ＵＶ）領域で吸収する蛍光体である。短い波長の光の照射を使用するのは経皮的測定には理想ではなく、ＵＶ光は浅い経皮的透過深さになりやすく、照明された組織にＤＮＡ損傷の危険性があるので、ＱＤは多くの用途にとって好適でない。さらに、量子ドットは、多くの場合、生物には非常に有毒である材料で製作される。さらに、研究によれば、量子ドットは、生物学的環境にさらされると反応する傾向があり、非常に有害となることがあることが示されている。

非線形蛍光体
非線形蛍光体の例はナノ粒子（ＮＰ）であり、以下でより詳細に説明される。

アップコンバージョン
アップコンバージョンは、２つ以上の光子が吸収され、入射光子よりも高いエネルギーの光子が解放されるときに生じる非線形プロセスである。

このプロセスは、例えば、長い時間の間１つの電子をトラップすることができる準安定状態を含み、別の到着光子との相互作用確率を増加させる材料で観測される。

実施形態によっては、異なる希土類元素イオンでドープされた固体の形態のルミネセンスマーカーがアップコンバージョンを得るために使用される。

固体アップコンバート材料は、例えば、希土類元素イオンで材料をドープすることによって製作される。希土類元素は外側の電子殻を内殻の前に充満し、それにより、希土類元素が固体材料に拘束されるときでさえ鮮明な原子様スペクトル線が与えられる。

アップコンバージョンは、イオン対および励起強度に応じてアップコンバージョンプロセスに違うように影響を与える多数のプロセスにより生じることができる。

いくつかのアップコンバージョンプロセスが図２ａ）〜ｃ）に示される。

プロセスのうちのいくつかはイオン間のエネルギー移動を含む。このエネルギー拡散は、放射性または非放射性、共振的または非共振的であることがある（図２ａおよび図２ｂを参照）。放射性の場合には、光子は感作物質から解放され、活性化物質によって吸収されるが、一方、非放射性の場合には、励起エネルギーは静電相互作用を介してあるイオンから他のイオンに飛び越えることになる。２つの場合は実験的に識別することができる。放射性移動はサンプルの形態に依存し、さらに、放出スペクトルならびに活性化物質の寿命に影響を与える。移動は、非共振的である場合、フォノン支援されなければならない。非共振的移動は、特に非放射性の場合に、他の固体材料と比較して希土類元素イオン間のより高いエネルギー差のために発生する。

さらに、エネルギー移動アップコンバージョン（ＥＴＵ）および励起状態吸収（ＥＳＡ）プロセスが、図２ｃで、図の左側と図の右側にそれぞれ示される。励起状態吸収は、励起状態にあるイオンがもう１つの光子を吸収するときに生じる。このプロセスの確率は通常小さく、コヒーレントポンピングの下でのみ観測することができる。エネルギー移動アップコンバージョンはイオン間のエネルギー移動を含むプロセスである。ここで、励起状態の活性化物質が考慮される。次に、エネルギーは感作物質から非放射的に移動することがある。これは、エネルギー差のみがエネルギーの保存において重要であるので可能である。

図３ａ）およびｂ）はそれぞれ蛍光およびアップコンバージョンルミネセンスの多重励起の概略図である。図３ａ）において、放出波長（ＥＭ）は励起波長（ＥＸ）よりも長い。図３ｂ）は、ステップ１（ＥＸ１）およびステップ２（ＥＸ２）で生じる多重励起を示し、放出波長（ＥＭ）は励起波長よりも短い。

ナノサイズ化アップコンバート結晶
アップコンバートナノ結晶は、近赤外線（ＮＩＲ）励起時に反ストークスシフト光を効率的に放出する独特の性質のために生物医学的イメージング用途における蛍光体として本明細書で開示される。これは、自己蛍光が存在しない領域の蛍光信号の検出を可能にする。

ナノサイズ化アップコンバート粒子は、例えば、製作するのが容易であるランタニドドープ酸化物（Ｙ_２Ｏ_３）である。

他のナノサイズ化アップコンバート粒子は、例えば、Ｙ_２Ｏ_３よりも高い効率を有するフッ化物である。より高い効率は、非放射減衰の確率を低下させるフッ化物のフォノンエネルギーによって説明することができる。

さらに、ナノサイズ化アップコンバート粒子は、例えば、Ｙｂ^３＋／Ｅｒ^３＋またはＹｂ^３＋／Ｔｍ^３＋のいずれかと同時ドープされたナトリウムイットリウム四フッ化物（ＮａＹＦ_４）で製作される。

ＮａＹＦ_４は、それぞれα−ＮａＹＦ_４およびβ−ＮａＹＦ_４と呼ばれる２つの相、すなわち立方相および六方相で結晶化する。β相材料からのアップコンバートルミネセンスは、α相からのアップコンバートルミネセンスと比較して約１桁高い大きさである。現在、さらに、立方相または六方相のいずれかでナノサイズ粒子を製作することが可能である。

効率の差を無視すれば、粒子はさらに他のサイズ依存の性質を示す。例えば、異なる放出ライン間の比はナノ粒子とバルク材料では異なる。

独特な光学的性質のために、アップコンバートナノ粒子は様々なバイオイメージング用途の生物学的マーカーとして好適である。９８０ｎｍの励起波長の安価なレーザダイオードがあり、その励起波長は、光が比較的深く組織に透過し、そのため光損傷の危険性が低下するのでバイオイメージング用途に極めて好適な波長である。

アップコンバートナノ結晶により、ルミネセンスイメージングはいかなる自己蛍光も被らない。ルミネセンスイメージングは、例えばストークスシフト蛍光体の生物学的マーカーと比較してより良好なコントラストを有する。

さらに、アップコンバートナノ粒子などの非線形蛍光体は、さらに、生物的機能化することができ、それにより、例えば腫瘍探索能力を非線形蛍光体に付与することができる。

非線形蛍光体は水溶性とすることができ、静脈、経口、または腸への投与のための溶液などでいくつかの用途での投与を容易にすることができる。

アップコンバートナノ粒子を水溶性として提供する方法は、極性である構造をもつ粒子を被覆することである。被覆は、例えば、高分子またはシリカで行うことができる。合成高分子、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および天然高分子の両方を被覆に使用することができる。これらの高分子は生物学的環境で安定であり、顕著に悪い形でナノ結晶の光学的性質に影響を与えることはない。

粒子をシリカで被覆すると通常非常に頑強な被覆が付与され、それは、生物学的環境では特に有利である。

水溶性アップコンバートナノ粒子は被覆なしで供給することができる。化学結合または物理吸収のいずれかによって水酸基をアップコンバートナノ粒子の表面に付着させることができる。水酸基は当然のことながら共有結合によって形成され、最終構造は極性の性質を有する。

さらに、有利には、ナノ粒子を生物学的環境での使用に適するようにするために、安定な保護被覆をナノ粒子に塗布することができる。

機能化
アップコンバートナノ粒子の機能化は、全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれるＸ． Ｇａｏ等、Ｉｎ ｖｉｖｏ ｃａｎｃｅｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２２、８：９６９〜９７６、２００４に記載されているような量子ドットの機能化と同様の方法で行うことができる。Ｇａｏ等では、アップコンバート希土類元素ドープナノ粒子に適用可能である方法が記載されている。

本開示の一実施形態で使用されるアップコンバートナノ粒子は、Ｇ． Ｙｉ等、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｚｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ＮａＹＦ_４：Ｙｂ，Ｅｒ ｉｎｆｒａｒｅｄ−ｔｏ−ｖｉｓｉｂｌｅ ｕｐ−ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｓ、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４、１１：２１９１〜２１９６、２００４に記載されている方法に従って準備され、Ｙｂ^３＋およびＴｍ^３＋の組合せでドープされたＮａＹＦ_４結晶であった。２つのイオンのエネルギー準位図が図４Ａに示される。図４Ａは、Ｙｂ^３＋／Ｔｍ^３＋イオン対のアップコンバージョンプロセスの概略図である。非放射アップコンバートプロセスが破線矢印で示され、非放射減衰は明確にするために省略されている。図４Ｂはアップコンバートナノ粒子の放出スペクトルを示すグラフである。４７７ｎｍの青色放出ラインはより高いポンプ強度でのみ見える。８００ｎｍラインのポンプパワー依存は、ｘ軸に強度（Ｉ）およびｙ軸にカウント（Ｃ）を示し、適合ライン（４０１）の勾配（Ｓ）が２に等しい図４Ｂの差込み図で分かるように、低い強度を使用して二次であることが計測された。

一実施形態では、非線形マーカーが別のイメージングモダリティのために画像化造影剤に付加される。例えば非線形マーカーは、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、Ｘ線などのような従来のイメージングモダリティによる画像化のために造影剤に付加される。特定の実施形態では、非線形マーカーは、常磁性を有する有機ガドリニウム複合体またはガドリニウム化合物に付加される。ＭＲＩ造影剤として使用されると、医用磁気共鳴映像法のコントラストが強化される。同時に、ルミネセンスイメージングまたは断層撮影を行い、注目する生体内の全く同一の領域の高解像度ＭＲＩと組み合わせた機能的診断情報を可能にすることができる。

他の用途は非生物学分野で提供される。そのような分野の例は、タブレット、非線形マーカーをもつ媒体を流す液体または気体用のフィルタなどの品質管理を含む材料試験のためのルミネセンスイメージングまたは断層撮影である。

実験
ルミネセンスイメージングにおける非線形マーカーの適用可能性を確認するために、アップコンバートナノ結晶が実験セットアップで使用された。生体内用途で蛍光体として使用するための妥当性を実証するために、２つの実験が行われた。

最初に、従来のダウンコンバート蛍光体とアップコンバートナノ結晶の形態の二次蛍光体とを使用してコントラストの差が実証された。

第２に、アップコンバートナノ結晶の形態の二次蛍光体などの非線形蛍光体を使用する断層撮影再構築のために行われたシミュレーションが行われた。

データ収集に使用された平面イメージングシステムが図５ａおよび５ｂに概略的に示される。図５ａは蛍光体イメージング（エピ蛍光）のセットアップの概略図であり、図５ｂは透照での蛍光体再構成のセットアップである。

飛行時間型分光システム（５００）によって決定された光学的性質をもつイントラビッドインクの溶液からなる組織ファントム（５０１）が使用された。蛍光体（５０２）は２．４ｍｍの内径をもつ毛管に含まれた。蛍光体の濃度は、ナノ粒子に対して１重量％、およびタイプＤＹ−７８１の従来のダウンコンバートする蛍光体に対して１μＭであった。

ナノ粒子の濃度は、量子ドットの使用による調査と妥当な対応を有するように選ばれ、すなわち、１重量％の濃度が使用された。

ＣＮＣ機械からの２ステップモーターを使用して、ファイバ結合型レーザ（５０３）をラスター走査することができた。ラスター走査中のレーザの位置は図７に示されたような格子パターン（７０１）で記述することができる。画像は、８００ｎｍに中心がある２つの誘電体帯域通過フィルタの後ろに位置する空気冷却ＣＣＤ（５０４）カメラにより走査位置ごとに取得された。図５ｃはラスター走査セットアップ（５０７）を示し、レーザは下の位置（５０５）から組織ファントム（５０１）を走査している。ＣＣＤ（５０４）はレーザの位置（５０６）ごとに１つの画像を取り込むことができる。位置（５０６）は図７の格子パターン（７０１）と同様の格子パターン（５０８）を記述する。レーザの位置（５０６）ごとに、ファントム（５０１）の全側面から放出された蛍光、すなわち全ルミネセンス強度を測定し合計して、得られる画像中の１つの画素を構成した。したがって、画像中の画素の数は、ＣＣＤ画素の数によってではなく励起位置（５０６）の数によって与えられた。したがって、解像度は、蛍光放出光の光子密度によってではなくレーザ光源（５０５）からの励起光の光子密度によって決定することができる。このようにして、励起体積中の２光子の光子密度は単一光子の光子密度よりも狭いので、解像度を向上することができる。全ルミネセンス強度を合計するとき、検出されたルミネセンスに閾値値を適用することができる。このようにして、解像度を向上することができる。例えば、ルミネセンス強度が事前定義閾値よりも上にある場合にのみ全ルミネセンス強度に追加されることになる。閾値はＣＣＤ（５０４）の値として定義することができ、例えばルミネセンス強度がピーク値の３０％未満である場合バックグラウンド信号と見なすことができるので廃棄されることになる。さらに、画素、またはレーザの位置（５０６）で得られる全ルミネセンスが別の閾値値未満である場合バックグラウンド信号と見なして除去することができる。代わりに、ルミネセンス信号の二次強度を合計することができる。このようにして、解像度をさらに向上することができる。例えば、ＣＣＤのピーク強度値の定義による０と１との間の相対値を有することができるＣＣＤ（５０４）によって検出されたルミネセンス強度は、現在の画素または位置（５０６）の全ルミネセンス強度に追加される前にそれ自体を乗算することができる。さらに、全ルミネセンス強度は画素または位置（５０６）ごとにそれ自体を乗算することができる。図１６Ａから１６Ｃは走査イメージング技術の使用による画像を示し、画像中の各画素は、単一の励起ポイント、すなわち光源位置（５０６）によって誘起された蛍光に対応する。図１６Ａは線形の従来の蛍光色素の画像を示し、図１６Ｂは非線形アップコンバートナノ粒子からの画像を示し、図１６Ｃの比較の断面プロファイルはＦＷＨＭをそれぞれ１０．５ｍｍおよび８．０ｍｍとして表示し、１．３倍の改善を与えている。

自己蛍光に感受性のない蛍光分子イメージング
エピ蛍光セットアップが本実験で使用された。ファントムの光学的性質は、小動物で見いだされるものの範囲内にある６６０ｎｍでμ’ｓ＝６．５ｃｍ^−１およびμａ＝０．４４ｃｍ^−１となるように選ばれた。

蛍光体、ＤＹ−７８１およびＮａＹＦ_４：Ｙｂ^３＋／Ｔｍ^３＋を含む毛管が５ｍｍの深さに沈められ、ここで、この深さは管の前面からファントムの表面までの距離として採られた。ＤＹ−７８１は、同様に８００ｎｍで放出し、より一般的に使用される色素、例えば、ローダミンクラスと同等の量子効率を有するので公平な比較を得るために選ばれた。

２つのダイオードレーザが蛍光体を励起するために使用された。ＤＹ−７８１は７８０ｎｍで励起され、ナノ粒子は９８０ｎｍで励起された。

レーザは、１２１個の位置からなる４．４×４．４ｃｍ^２の区域にわたってラスター走査された。次に、画像は合計され、表面の光子分布の表示が与えられた。これにより、蛍光性包有物が検出されるかどうかが行われる。カメラの不良画素の影響を抑制するために、３×３画素のカーネルをもつメジアンフィルタを合計された画像に適用した。自己蛍光をシミュレートするために、コントラストが極めて不十分なためにデータを実用的な方法で使用できなくなるポイントまでＤＹ−７８１がファントムに追加された。

使用された照明強度は組織に有害でないと見なされた。最終的に使用された励起光はファントムの表面で両方のレーザからの１ｃｍ^２のスポットサイズを有し、７８０ｎｍレーザでは４０ｍＷ／ｃｍ^２および９８０ｎｍレーザでは８５ｍＷ／ｃｍ^２の強度を与えた。

図６ａからｄ）は実験に由来する様々な蛍光強度分布を示す画像およびグラフである。さらに詳細には、比較の画像は、自己蛍光の有無により、図６（ａ）および（ｃ）に見られるＤＹ−７８１色素と、図６（ｂ）および（ｄ）に見られるナノ粒子に関して、それぞれ垂直方向に和を示すプロットと共に示される。画像中の白色の点は人為的に追加されたものであり、励起光で使用された位置を示す。左の列はＤＹ−７８１を使用した結果を示し、右の列はアップコンバートナノ粒子を使用した結果を示す。

図６（ａ）および６（ｂ）に示された画像はいかなる付加的な自己蛍光体もなしに得られ、図６（ｃ）および６（ｄ）に示された画像は、４０ｎＭのバックグラウンド自己蛍光体濃度で得られている。

さらに詳細には、図６ａ）からｄ）は、断面プロファイルと共に自己蛍光の有無により得られた画像を示す。

図６（ｄ）から見て分かるように、図６（ｃ）と比較して自己蛍光バックグラウンドが低減し、アップコンバートナノ粒子の信号対バックグラウンドコントラストが改善されている。これらの図はダウンコンバート蛍光体の使用とアップコンバートナノ結晶の使用とのコントラスト差を明確に実証している。いかなる人為的な自己蛍光体の追加もない場合でさえ、イントラビッド自体の自己蛍光およびその効果は図６（ａ）の断面プロファイルで明白であることに注目するのは価値がある。

ナノ粒子を使用した最終結果は、主として、検出器の信号対雑音比によって制限されている。これは、励起パワーを増加させることによって、入手可能な画像品質を強化することが可能であることを意味する。

この状況はＤＹ−７８１色素では異なる。色素は非常に効率的であり、信号対雑音比によって一般に制限されない。しかし、信号対バックグラウンドコントラストによって制限される。これは、励起パワーの増加がより良好な画像品質をもたらさないことを意味する。

蛍光分子断層撮影（ＦＭＴ）
非線形蛍光体および従来の蛍光体の使用によるＦＭＴのシミュレーションが、図５ｂに示されるような透過蛍光セットアップで行われた。シミュレートされた組織ファントムは半径４３ｍｍの半無限円柱（５０８）としてモデル化された。光学的性質はλ＝６６０ｎｍでμ’ｓ＝１０ｃｍ^−１およびμａ＝０．４ｃｍ^−１であり、１６個の均一間隔の光源−検出器ポイント（５０９）が形状の１つの平面のまわりにあった。蛍光体は、図５ｂに示されるようにファントムの全体を通って延びる棒のように密に一緒にして配置された。

フォワードモデルは１７８５個のノードからなる一様なメッシュを使用した。再構成では、１７×１７画素の画素基準が使用された。再構成基準を選ぶためのいくつかの方策がある。２つ例は、第２のメッシュ基準（ｓｅｃｏｎｄ−ｍｅｓｈ ｂａｓｉｓ）および画素基準である。しかし、すべての方策は問題中の未知数の数を減らすことを目的とする。これは、解が平滑であると予想され、より粗い基準を使用すると不良設定が改善されるので動機づけされる。本実験では、１組の規則的に隔てられた画素である画素基準が選ばれた。この基準は、空間的な先験的情報がない問題に好適である。

再構成のための入力データはフォワードシミュレーションから得られた。放射源は、ファントム内部の１つの散乱事象の距離に位置し、１Ｗで放射する等方性点放射源としてモデル化された。

再構成の手順は簡単には以下のステップを行うことと見なすことができる。ｉ）励起位置の各々について励起場を計算する、ｉｉ）各検出位置について、前述の励起場による放出場を計算する、すなわち随伴法、ｉｉｉ）励起と検出の対ごとに励起場と放出場（励起場の随伴行列）との間の積を計算する。すなわち、Ｎ×Ｍを計算する、ここで、Ｎは励起位置の数であり、Ｍは放出位置の数である。後者は感受性プロファイルの計算と見なすことができる。得られる内部分布が記憶される。ｉｖ）例えば、｜｜Ａｘ−ｙ｜｜を最小にすることにより二乗問題を解くことによって、検出されるものを最も良く記述する内部蛍光体分布を見いだすが、ここで、Ａは感受性プロファイルを含む行列であり、ｘは蛍光体の内部分布であり、ｙは測定データである。

非線形マーカーでは、光伝搬（放出および励起）の非線形依存は、例えば関連する拡散方程式を解くことによりモデル化するか、またはモンテカルロシミュレーションを使用することができる。これは、断層撮影に非線形マーカーを利用するのに必須となることがある。励起場を計算してある場合、それを放出問題への入力データとして使用することができる。断層撮影再構成の前述のステップのうちの１つで、マーカーのパワー依存を考慮に入れることができる。例えば、ルミネセンス（Ｌ）の励起光（Ｅ）への特定のパワー依存を有する非線形マーカーでは、励起場の場強度は同じパワーまで引き上げられ、すなわち、非線形マーカーが二次パワー依存を有する場合励起場の二次積（ｑｕａｄｒａｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔ）が計算される。二次励起場強度は、放出問題における放出場を計算するための生成項として使用される。これは、より狭い感受性プロファイル、したがって向上した解像度をもたらすことができる。狭い感受性プロファイルは、前に扱った狭いまたは小さい励起体積に対応する。したがって、ルミネセンスマーカーの断層撮影画像を再構築することには、非線形依存に従って励起場の積（ｐｒｏｄｕｃｔ）を計算することを含むことができ、放出場の計算はこの積に基づく。さらに、積を計算することは、励起場の場強度を乗算して、非線形関係のパワー依存に対応するパワーまで引き上げられた場強度の積を形成することを含むことができる。

再構成の精度は、光源がルミネセンスマーカーに関連して移動される場合の光源位置ごとに得られる情報、例えば検出されたルミネセンスなどの量に依存し、逆もまた同様である。空間変化により再構成情報を得ることに加えて、ルミネセンスマーカーの多数の励起波長および放出波長を使用して、代わりのスペクトル変化による再構成情報を得ることができる。ＣＣＤは、この状況において、イメージングおよび断層撮影再構成の両方に利用するためにいくつかの波長のルミネセンスを検出することができる。後者の場合、空間およびスペクトル変化の両方を使用して、前述の感受性プロファイルを計算することができる。

再構築された結果
図９は、線形蛍光体（９０２）と非線形蛍光体（９０３）との間の断層撮影再構成の比較を示す。図９の図は二次蛍光体の一例として提示されている。（この場合二次であるように選ばれた）

グラウンドトルースは図９では入力異常（９０１）として示される。２つの別個だが接近している異常がより大きい円内の不規則な点として示されている。

線形蛍光体（９０２）を使用して再構成する際、２つの接近して位置する異常は図９から明らかであるように識別することができない。

しかし、二次蛍光体（９０２）を使用する再構成は、２つの接近して位置する異常の間の良好な分離を示している。これは、図９で明確に見て分かる。

この比較は、非線形蛍光体の使用が提供する有利な効果、すなわち、線形蛍光体よりも高いコントラストおよび解像度を示している。この強化は、以下の式（１）で見られるような二次生成項を使用するときのより狭い感受性による。これは、異なる光源位置に対して収集された信号を考慮に入れることによって視覚化することができる。二次蛍光体を使用すると、光源位置が蛍光体自体の近くにある場合にのみ信号は強くなることになる。したがって、この信号は、線形蛍光体の場合よりも蛍光体の場所に関する多くの情報を提供することができる。これは、さらに、図９に示されるように、例えば、線形蛍光体を使用して分解できない２つの接近して位置する蛍光体を分解する可能性を与えることができる。

アップコンバートナノ粒子を使用するマルチビーム蛍光拡散光学断層撮影
さらに、本開示は、アップコンバートナノ粒子の独特な非線形パワー依存を利用して、同時に２つのビームで励起することを含むことによってラスター走査セットアップの情報量をさらに増加させるための蛍光拡散光学断層撮影の方法を実証する。情報の増加がより正確な再構成をもたらすことが見いだされた。

蛍光拡散光学断層撮影（ＦＤＯＴ）は、不明瞭な材料内部の蛍光プローブの濃度の空間分布を再構築しようする比較的新しいモダリティである。それは、イメージングツールとして、例えば、腫瘍、タンパク質分解酵素、薬効果を画像化するための生物医学的研究に良好な見通しを有する。ＦＤＯＴは数値的に極めて不良設定な問題を有する。この問題では、蛍光性標的の再構成の品質は、境界測定から得られた蛍光情報の量および品質によって直接決定される。計器雑音および組織自己蛍光が測定の主な擾乱であり、不十分な信号品質をもたらし、再構築結果に深刻な偽画像を引き起こすことがある。これを克服するために、例えば、低雑音の装置を使用すること、およびバックグラウンド除去またはスペクトル分離を使用することができる。しかし、そのような方法がすべての問題を解決できるとは限らないが、それは、そのような方法が、再構成の品質を改善するのに決定的である再構成のための新しい制約を追加する、すなわち、新しい独立した情報を追加するのではなく、より良好方法で現在の情報を利用しているだけであるからである。非接触ＣＣＤベースＦＤＯＴシステムにおいて、より多くの情報を獲得するための好ましい１つの方法は励起位置の数を増加させることによるものである。しかし、励起ビームの強度を妥当なレベル内に保持するために、励起ビームの最小サイズに限界がある。これは、別個の、すなわち重複しない励起位置が再構成には要望されるので、励起−位置の最高密度に対する現実的な上限を意味する。さらに、先験的構造情報を提供するために磁気共鳴映像法などの解剖学的イメージングモダリティを使用することが可能である。しかし、これは、システムの複雑さの著しい増加と柔軟性の低下とを犠牲にする。

本開示で、発明者は、ＦＤＯＴの励起のために２つのビームを同時に利用することによって追加情報を獲得するのにアップコンバートナノ粒子の二次パワー依存を利用する手法を提示する。二重ビーム励起で得られる画像（タイプＤ画像と命名される）のナノ粒子数密度分布ｎの再構成への効果が実証される。さらに、線形ローダミン６Ｇと二次アップコンバートナノ粒子との間で再構築結果の比較が行われる。

励起場および放出場は２つの結合拡散方程式によってモデル化することができる［非特許文献３］。二次蛍光体では、ｋ番目のビームの励起下で固定検出器位置で検出される蛍光信号は、フォワードモデル（１）によって記述することができ、

ここで、Ｎはボクセルの数を表し、

はそれぞれ光源、検出器、およびボクセルの座標を表し、ΔＶ_ｉはボクセルｉの体積である。励起光のフォワード解は、
［Ｕ_ｅ（ｒ_ｓｋ，ｒ_ｉ）］^２
によって示され、一方、フォワード蛍光問題への随伴行列解は、
Ｕ_ｆ ^＊（ｒ_ｄ，ｒ_ｉ）
によって示される。
２つのビームを同時に使用して媒体を励起すると、検出される信号は（２）によって与えられ、

これは交さ項の関与を示す。ラスター走査セットアップ（５００、５０７）では、２つの画像が２つの位置にわたって１つの励起ビーム走査で連続して得られ（タイプ−Ｓ画像と命名される）、第３の画像が前の２つの位置の上で２つのビーム励起（タイプＤ）で得られる場合、交さ項の関与は、タイプＤ画像が既存のタイプ−Ｓ画像からいかなる数学的操作によっても得ることができないことを意味し、タイプＤ画像は独立であり、追加情報を含むことを示している。しかし、線形蛍光体、例えばローダミン６Ｇでは、タイプＤ画像は既存のタイプ−Ｓ画像の線形結合のみであり、逆問題のためのより多くの制約を追加しないことになる。非線形蛍光体では、式（２）は多くの同時励起ビームを含むように一般化することができることが演繹される。

再構成における二重ビーム励起による測定の重要性は、重み行列Ｗの特異値解析によって確認されており、その要素は（３）によって与えられ［非特許文献３］、
Ｗ_{（ｓ，ｄ），ｉ}＝Ｕ_ｆ ^＊（ｒ_ｄ，ｒ_ｉ）［Ｕ_ｅ（ｒ_ｓ，ｒ_ｉ）］^γΔＶ_ｉ （３）
ここで、
二次蛍光体ではγ＝２、
線形蛍光体ではγ＝１である。
計算は有限要素法を実行するＮＩＲＦＡＳＴパッケージを使用して行われた。Ｗは（４）に従って因数分解され、
Ｗ＝ＵΣＶ^＊ （４）
ここで、ＵおよびＶはＷの左および右の特異ベクトルを含むユニタリ行列であり、
Σ
はＷの特異値を含む対角行列である。Ｖの列空間は画像空間モードによって張られ、一方、Ｕの列空間は検出空間モードによって張られる。Ｗの特異値は、どれくらい効率よく所与の画像像空間モードが実験装置によって検出され得るかを表す［非特許文献４］。

図１２は、Ｗの正規化特異値分布を示す。ｘ軸は特異値指数（１１２０）を示し、ｙ軸は正規化特異値強度（１１２１）を示す。明確にするために、１つおきの特異値のみが示されている。クロス符号（１１２２）およびプラス符号（１１２４）は線形蛍光体（γ＝１）を示し、前者は単一ビーム励起（１１２２）の場合であり、一方、後者は単一ビーム励起と二重ビームの励起（１１２４）の組合せの場合である。見て分かるように、二重ビームの励起（１１２４）による追加の特異値の正規化強度は機械精度まで降下しており、それは、二重ビーム励起による測定がＦＤＯＴの不良設定を緩和できないことを示している。言い換えれば、タイプＤ画像は既存のタイプ−Ｓ画像よりも多くの情報を提供できない。したがって、それは再構成の品質を改善できない。しかし、二次蛍光体（図１２のアスタリスク符号（１１２３）および点符号（１１２５）で表された）では、追加の特異値（１１２５）の強度は依然として効果がある。これは、タイプＤ画像が再構成の品質に寄与することになることを意味する。

実験は、飛行時間型分光システム［非特許文献５］で測定された６６０ｎｍでμａ＝０．２９ｃｍ^−１およびμ’ｓ＝１０．０ｃｍ^−１の光学的性質をもつゼラチンファントムで実行された。それぞれローダミン６Ｇ（ｃ＝０．１μＭ）およびＮａＹＦ_４：Ｙｂ^３＋／Ｔｍ^３＋ナノ粒子（ｃ＝０．１重量％）の溶液で充満された２つの毛管を使用して、蛍光性傷害がシミュレートされた。実験セットアップおよび対応する実行パラメータは、発明者の以前の研究［非特許文献３］で使用されたものと同様であった。調査中のファントムの面積制限のために、９個の励起位置（３×３格子）のみが本開示では使用された。２つの最近接位置の分離は３．５ｍｍであり、各励起ビームは約２．６ｍｍの直径を有していた。実験の間、最初に単一の励起ビームを使用して３×３格子にわたって走査し、１つの画像が走査位置ごとにＣＣＤカメラで取り込まれた。次のステップで、同じ格子の２つの最近接部位に位置づけられた２つの励起ビームを同時に使用してファントムを照明し、６個の追加のタイプＤ画像が与えられた。

図１３Ａ〜１３Ｂは再構築されたアップコンバートナノ粒子の３次元再現を示す。副図の赤い円柱は同一であり、真の蛍光性傷害を示す。図１３（ａ）の再構成では、タイプ−Ｓ画像のみが使用された。見て分かるように、蛍光性傷害の形状が過大評価されている。この過大評価は逆問題の不良設定によって説明することができる。タイプＤ画像を追加すると、図１３Ｂに示されるように、蛍光性傷害形状の再構成は著しく改善される。２つの再構成間の差を強調するために、再構築された相対蛍光体分布の断面スライスが図１４Ａ〜１４Ｆに示される。深さは両方の再構成とも蛍光性傷害（円で示された）の中心で比較的十分に再構築されているが、再構築された蛍光性傷害はタイプＳおよびＤ画像の両方を使用する場合ではさらに閉じ込められている。この結果から、タイプＤの画像は確かに逆問題に寄与しており、二次アップコンバートナノ粒子ではより良好な再構成をもたらすことが確認される。線形ローダミン６Ｇの対応する再構成も実行され、その断面スライスが図１５Ａ〜１５Ｆに提示される。ナノ粒子の結果と比較して、ローダミン６Ｇの再構成はタイプＤ画像の追加から利益を得ておらず、それは理論と一致している。蛍光性傷害の真の深さも再構築が不十分である。

アップコンバートナノ粒子の非線形パワー依存追加の独特の利点が開示される。この利点により、同時に２つ以上の励起ビームを用いて得られた画像を使用することによって逆問題のための追加情報を得る可能性が与えられる。発明者は、これが再構成の改善をもたらすことを見いだした。同じ利点は、線形蛍光体、例えばローダミン６Ｇを使用した場合には見いだすことができなかった。

本開示は、非線形ルミネセンスイメージングおよび断層撮影の実施形態を提示している。実験では、アップコンバートナノ結晶によるイメージングは生体組織に似ている散乱媒体で可能であることが示された。さらに、シミュレーションの示すところによれば、アップコンバートナノ結晶を取り扱うのに蛍光光学断層撮影で使用される理論を適応することが可能である。

本開示で使用されるアップコンバートナノ結晶粒子は、有機蛍光体と比較して、独特な光学的性質のために生物学的マーカー用などの様々な用途を有する。

本発明が特定の実施形態を参照して上述された。しかし、上述以外の実施形態が本発明の範囲内で同様に可能である。本発明の異なる特徴および段階は説明されたもの以外の組合せで組み合わせることができる。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

本方法は、生きているヒトまたは動物の体で生体内で行うことができる。この場合、マーカーは、血液循環への注入、または皮下的もしくは直接的な腫瘍への注入による、あるいは代替として、局所適用、肺性および他の非侵襲的方法によるなどの任意の方法で体に事前導入することができる。そのような事前導入は残りの方法とは別々に行うことができる。そのような事前導入は残りの方法に関連して、しかしその直前に行うことができる。

代替としてまたは追加として、本方法は、本方法が行われた後犠牲となるヒトまたは動物の体で行うことができる。

代替としてまたは追加として、本方法は、生きていないヒトもしくは動物の体、または体の一部、例えば脳死のヒトもしくは動物の体で生体外で行うことができる。

代替としてまたは追加として、本方法は、フィルタまたはタブレットなどの非医学的分野で行うことができる。

上記参考文献は、すべての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる。

１０１ コラーゲン
１０２ エラスチン
１０３ ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
１０４ カロテン
４０１ 適合ライン
５００ 飛行時間型分光システム
５０１ 組織ファントム
５０２ 蛍光体
５０３ レーザ
５０４ 空気冷却ＣＣＤ
５０５ 下の位置
５０６ レーザの位置、励起位置
５０７ ラスター走査セットアップ
５０８ 格子パターン
５０８ 半無限円柱
５０９ 光源−検出器ポイント
７０１ 格子パターン
７０２ 非線形ルミネセンスマーカー
７０３ 投影画像
７０４ 励起ポイント
７０５ 画素
７０６ 光源位置
７０７、７０８ 画素
８０１ 励起光
８０２ 放出光
８０３ 励起光
８０４ 蛍光
９０１ 入力異常
９０２ 線形蛍光体
９０３ 非線形蛍光体
１１２０ 特異値指数
１１２１ 正規化特異値強度
１１２２、１１２４ 線形蛍光体
１１２３、１１２５ 二次蛍光体

Claims (15)

1. 拡散ルミネセンス分子イメージングによって散乱媒体中の領域を画像化する方法であって、前記領域が前記散乱媒体中でマーカー位置に配置された少なくとも１つのルミネセンスマーカーを含み、前記ルミネセンスマーカーがアップコンバートナノ粒子である非線形ルミネセンスマーカーであり、
   単一ビーム励起及び二重ビーム励起の両方を得るために、少なくとも１つの光源位置から励起体積中に複数の光源によって同時に放出された励起光によって前記非線形ルミネセンスマーカーを励起する段階と、
   前記励起光による前記ルミネセンスマーカーからのルミネセンスを検出器によってルミネセンス光検出位置で検出する段階と、
   前記検出されたルミネセンスの前記励起光強度への非線形依存に基づいて前記ルミネセンスマーカーを画像化する段階と、を含み、
   前記ルミネセンスマーカーを画像化する段階が、
   各励起位置における励起光の強度を拡散方程式を用いて計算し、行列である励起場を得る段階と、
   ｘ次の前記非線形依存に従って前記励起場のｘ次積を計算する段階と、
   前記励起場のｘ次積に基づいて、行列である前記ルミネセンスマーカーからの放出場を計算する段階と、
   励起及び検出の対のそれぞれに関して前記励起場と放出場との間の積を計算して、感受性プロファイルを得る段階と、
   前記感受性プロファイルとマーカーの分布との積と測定データとの差を最小にすることにより二乗問題を解くことによって前記アップコンバートナノ粒子の内部分布を得る段階と、を含み、
   前記光源位置及び前記マーカー位置が互いに対して相対的に移動し、
   前記非線形依存が、
   Ｌ＝ｋ×Ｅ＾ｘ
   の関係によって与えられ、ここで、
   Ｅは前記励起体積中の励起光強度であり、
   Ｌは前記ルミネセンスマーカーからのルミネセンス光強度であり、
   ｋは正の定数であり、
   ｘは１よりも大きい正の数である、方法。
2. 前記移動を行う段階が、前記マーカー位置に関連して前記光源位置を移動させる段階を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記移動を行う段階が、前記光源位置に関連して前記マーカー位置を移動させる段階を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記光源位置が前記マーカー位置に関連して移動されるように、複数の位置の間で光源を移動させながら、前記複数の励起ビームを走査する段階を含む、請求項２に記載の方法。
5. 前記複数の光源位置の各々に対して前記ルミネセンスを検出する段階であり、
   それぞれの光源位置に対して、前記マーカーから放出された全方向における全ルミネセンス強度を決定するために前記ルミネセンスを合計する段階であって、それによって前記ルミネセンスが前記複数の光源位置の各々に対して前記ルミネセンスマーカーの全ルミネセンス強度を有する、段階と、
   前記複数の光源位置の各々に対して前記全ルミネセンス強度の画像を製作することによって前記ルミネセンスマーカーを画像化する段階と
   を含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記全ルミネセンス強度が前記ルミネセンスマーカーの前記ルミネセンスの合計によって与えられる、請求項５に記載の方法。
7. 第１の波長を有する第１の光源によって第１の光源位置から前記ルミネセンスマーカーを励起する段階と、
   第２の波長を有する第２の光源によって第２の光源位置から前記ルミネセンスマーカーを励起する段階と
   を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記第１の波長が前記第２の波長と実質的に同一である、請求項７に記載の方法。
9. 前記第１および第２の光源位置の少なくとも一方が前記マーカー位置に関連して移動される、請求項７に記載の方法。
10. 前記拡散ルミネセンスイメージングが拡散ルミネセンス断層撮影を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記光源位置が前記マーカー位置に関連して移動されるように、複数の異なる光源位置間で前記複数の光源を走査する段階と、
    前記複数の異なる光源位置の各々に対する前記ルミネセンスマーカーのルミネセンス画像を供給するために前記ルミネセンスを検出する段階と、
    を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 散乱媒体中の注目する領域の拡散ルミネセンス分子イメージングのためのシステムであって、前記散乱媒体の前記ルミネセンス分子イメージングで使用するためのルミネセンスマーカーを含み、前記ルミネセンスマーカーが前記散乱媒体中に配置されたアップコンバートナノ粒子である非線形ルミネセンスマーカーであり、
    単一ビーム励起及び二重ビーム励起の両方を得るために、複数の光源によって励起体積中に同時に放出された励起光によって前記ルミネセンスマーカーを励起するために、少なくとも１つの光源位置によって位置づけられた複数の光源と、
    前記励起光による前記ルミネセンスマーカーからのルミネセンスを検出するルミネセンス光検出位置における検出器と、を備え、
    前記ルミネセンス分子イメージングが、
    前記検出されたルミネセンスの前記励起光強度への非線形依存と、前記マーカー位置に関連する前記光源位置とに基づいて前記ルミネセンスマーカーを画像化することを含み、
    前記ルミネセンスマーカーを画像化することが、
    各励起位置における励起光の強度を拡散方程式を用いて計算し、行列である励起場を得ることと、
    ｘ次の前記非線形依存に従って前記励起場のｘ次積を計算することと、
    前記励起場のｘ次積に基づいて、行列である前記ルミネセンスマーカーからの放出場を計算することと、
    励起及び検出の対のそれぞれに関して前記励起場と放出場との間の積を計算して、感受性プロファイルを得ることと、
    前記感受性プロファイルとマーカーの分布との積と測定データとの差を最小にすることにより二乗問題を解くことによって前記アップコンバートナノ粒子の内部分布を得ることと、を含み、
    前記非線形依存が、
    Ｌ＝ｋ×Ｅ＾ｘ
    の関係によって与えられ、ここで、
    Ｅは前記励起体積中の励起光強度であり、
    Ｌは前記ルミネセンスマーカーからのルミネセンス光強度であり、
    ｋは正の定数であり、
    ｘは１よりも大きい正の数である、システム。
13. 前記非線形マーカーが、前記ルミネセンスイメージングのモダリティと異なるイメージングモダリティのための画像化造影剤に付加され、前記システムが、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）およびルミネセンス分子断層撮影によって前記注目する領域を同時に画像化するための磁気共鳴映像（ＭＲＩ）装置をさらに備える、請求項１２に記載のシステム。
14. 照明波長の前記入射光が同時に２つ以上の励起ビームで構成され、
    前記励起光が、第１の波長を有する第１の光源によって第１の光源位置から、および第２の波長を有する第２の光源によって第２の光源位置から供給され、
    前記励起光が前記第１および第２の光源によって同時に供給される、請求項１２に記載のシステム。
15. 前記画像化造影剤が、常磁性を有する有機ガドリニウム複合体またはガドリニウム化合物を含む、請求項１３に記載のシステム。