CN103207168A - 一种心肌细胞膜电位功能信息光学重构方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种心肌细胞膜电位功能信息光学重构方法，该重构方法主要解决目前在医学研究中图像时空分辨率低，传导旁路等病理现象不容易确认的难题。该方法的技术要点是：利用嵌在细胞膜上的电压敏感染料将细胞跨膜电位转变成荧光信号，然后结合优化算法反推出电兴奋的大小与时序，得到膜电位的实时分布，最后通过计算机图形处理进行显示。特别对于异常传导可以准确快速通过各种功能图形予以识别，为药物开发、电生理研究、除颤器和起搏器设计等提供参考手段。

Description

一种心肌细胞膜电位功能信息光学重构方法

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，涉及一种可用于生理或病理学细胞膜电位检测，尤其是一种心肌细胞膜电位功能信息光学重构方法，主要根据光学标测系统获取的荧光信号进行重构得到生理功能信息的方法。

背景技术

生物电指生物体的生命活动中表现的电活动现象，它普遍存在于各种生理功能的实现过程，因此生物电的检测显得相当重要。随着科技发展，检测这些生物电的工具有功能核磁共振成像、正电子发射断层成像、X光断层成像、心电图、脑电图、膜片钳技术等，它们从宏观到微观不同层面揭示了生命的奥秘。但需要快速实时地记录电活动过程，才能观察到生命活动中的重要信息，比如心律失常时心脏的心肌动作电位变化、电击除颤瞬间心脏功能变化等。

在这些生理机制动态过程中，研究微观变化时，要求达到一定的空间分辨率（微米/纳米级）和时间分辨率（微秒级），研究宏观变化时，要求空间分辨率（厘米级）和时间分辨率（分钟量级）。然而上述的检测工具虽各有优势，但也很难同时满足时间空间要求。因此，近年来发展起一种同时满足以上要求，且可连续动态进行观察的新型技术：基于电压敏感染料的荧光功能成像标测技术。

光学标测技术是一种基于电压敏感性染料的光学记录膜电位的方法，即荧光染料感受局部电场变化，细胞膜与染料分子相互作用，膜内外染料分子重新排列和旋转。在一定波长的光源激发下，荧光物质的能级发生变化，释放出光子和能量，这种发射光可被相关的检测装置记录下来。该技术具有多位点同时记录、时间空间分辨率高、广泛适用性等优于传统方法的特点，可以同时从不同层次着手研究各种细胞和组织的生理机制，也可通过脑部动作电位在体研究视觉神经、嗅觉神经，提高人们对脑部结构和功能的认知水平，提供丰富的研究信息。尤其对电除颤和心律失常的临床治疗有一定的指导意义。

目前国内尚无该方面的专利。国外专利中美国专利No.7611863德国申请，2009年11月3日授权，美国专利No.7173130，美国申请，2007年2月6日授权，这些方法或者关注于染料的合成方法，或者使用复杂的荧光共振能量转移来进行检测。近年来国外的一些公开发表的文献比如Brown NH,Dobrovolny HM,Gauthier DJ,etal  “A fiber-basedratiometric optical cardiac mapping channel using a diffraction grating andsplit detector”.Biophys j,2007,93:254-263利用光纤和光栅来进行波长选择，系统比较复杂，Zhang H,Wang J等“Short-term memory andelectrical restitution in the canine transmural ventricle”Physiol.Meas.2011,32:207–222利用光学标测技术进行心脏短期记忆研究。这些都未能实现系统的简便易用，造价昂贵，使得该技术的应用得到了限制。

本发明利用光学标测系统所获取得到的荧光信息，经过处理后重构得到电生理研究中所需要的各种功能信息图像，利用这些功能图像，可以对离体动物心脏生理信息进行研究，从而为研究人员提供了一种新的技术手段。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种心肌细胞膜电位功能信息光学重构方法，该方法利用镶嵌在细胞膜上的电压敏感染料将细胞跨膜电位转变成荧光信号，然后根据荧光信号重构功能图像，其定位离体心脏表层膜电位荧光并重构各种功能图像，为抗心律失常药物开发、除颤器起搏器等开发提供参考手段。

本发明的目的是通过以下技术方案来解决的：

这种心肌细胞膜电位功能信息光学重构方法，包括以下步骤：

1）通过光学标测系统得到离体心脏的实时荧光光强分布；

2）对于步骤1）得到的实时荧光光强分布进行反解，求解得出膜电位V_m；

光标测检测到的荧光光强F的变化量ΔF与细胞跨膜电位V_m的变化ΔV_m成线性关系，因此通过ΔF/F反解出光学动作电位；使用的荧光窗是>570nm，使用以下公式计算光学动作电位：

$V_n=-(F_n-\stackrel{\‾}{F})/\stackrel{\‾}{F}$

上式中，V_n表示某时刻某一点的细胞跨膜电位V_m，F_n表示该时刻该点荧光强度，表示该细胞静息时刻的平均荧光强度；通过公式计算得到每个点的细胞跨膜电位V_m，然后得到V_m随时间变化的曲线，当计算出一帧图像中每个点的动作电位，则重构出一个三维的图像序列，其中一维以时间为轴，另外两维表示心脏组织不同细胞跨膜电位的空间分布，这个图像序列中的某一帧表示该时刻的心脏组织的等电势图；

3）根据步骤2）获得的等电势图，经过滤波后处理并加伪彩得等电势伪彩图像。

进一步，以上基于连续多帧图像的计算在图像采集间隙中计算完成。

上述重构得到的三维图像序列，须经时空统一滤波算法处理后方可用于其他反映细胞或组织生理功能的重构功能图像计算方法，所述时空统一滤波算法是带权值的时空统一中值滤波。

本发明利用光学标测系统所获取得到的荧光信息，经过处理后重构得到电生理研究中所需要的各种功能信息图像，利用这些功能图像，可以对离体动物心脏生理信息进行研究，从而为研究人员提供了一种新的技术手段。

附图说明

图1是本发明重构得到的各种功能图像；其中（a）是跨膜动作电位V_m、（b）是等电势图、（c）是等时图、（d）是相位图、（e）是空间频谱图、（f）时间频谱图。

图2是本发明在电生理研究中的一个应用举例，

其中（a）是不同周期长度B_S1刺激下的动作电位，（b）是S1S2刺激后的APD局部恢复曲线，可以根据图1中的等时图计算得到。（c）是动态恢复曲线，可以根据图1中的等时图和频谱图通过计算图（b）中曲线的斜率和APD时程的关系得到。（d）是心脏短期记忆（M_s）和刺激周期关系图。

具体实施方式

本发明的心肌细胞膜电位功能信息光学重构方法，包括以下步骤：

1）通过光学标测系统得到离体心脏的实时荧光光强分布；

2）对于步骤1）得到的实时荧光光强分布进行反解，求解得出膜电位V_m；

光标测检测到的荧光光强F的变化量ΔF与细胞跨膜电位V_m的变化ΔV_m成线性关系，因此通过ΔF/F反解出光学动作电位；使用的荧光窗是>570nm，使用以下公式计算光学动作电位：

$V_n=-(F_n-\stackrel{\‾}{F})/\stackrel{\‾}{F}$

上式中，V_n表示某时刻某一点的细胞跨膜电位V_m，F_n表示该时刻该点荧光强度，

表示该细胞静息时刻的平均荧光强度；通过公式计算得到每个点的细胞跨膜电位V_m，然后得到V_m随时间变化的曲线，当计算出一帧图像中每个点的动作电位，则重构出一个三维的图像序列，其中一维以时间为轴，另外两维表示心脏组织不同细胞跨膜电位的空间分布，这个图像序列中的某一帧表示该时刻的心脏组织的等电势图；

3）根据步骤2）获得的等电势图，经过滤波后处理并加伪彩得等电势伪彩图像。

本发明基于连续多帧图像的计算在图像采集间隙中计算完成，以满足实时性要求。所述重构得到的三维图像序列，须经时空统一滤波算法处理后方可用于其他反映细胞或组织生理功能的重构功能图像计算方法，所述时空统一滤波算法是带权值的时空统一中值滤波，满足实时性要求。

所述三维图像序列，可重构得到某细胞或细胞群的动作电位时程图（action potential duration，APD），对某细胞的动作电位曲线求一次导数，可得到导数曲线最大值Y1，其对应的横坐标为X1，它对应的是动作电位开始除极处的时间；在一次求导的基础上，对曲线求二次导数，可得到导数中最大值Y2，其对应的横坐标为X2，它便是动作电位复极的时间；利用幅度法对求导坐标进行修正，去除噪声影响，动作电位曲线中与最大幅度90%阈值最接近的二阶导数最大值即为所求复极时间。两个时间间隔即为该细胞动作电位时程APD=X2-X1。类似可得静息间隔DI。

在上述细胞动作电位时程基础上，可重构得到等时图（isochronalmap）。以图像序列中某一时刻开始，以该时刻为基准，按照上述计算方法计算整个心肌组织中每个细胞或细胞群APD，并进行归一化，将得到的归一化时间按照伪彩显示，可以得到等时图，是直观快速反应心脏表面激动顺序的功能图像；

按照上述等时图，可重构相位图，将跨膜电位V_m(t)做为V(t)，然后选择合适的时间延迟τ，得到时间延迟信号V(t+τ)，在同一个坐标系中研究以上两个变量的时候，可以看到这两个变量轨迹几乎和一个闭合的椭圆重合。利用公式：

$\mathrm{\θ}\left(t\right)=\arctan \left(\frac{V(t+\mathrm{n\τ})-\stackrel{\‾}{V}}{V\left(t\right)-\stackrel{\‾}{V}}\right)$

可以计算得到V(t)和V(t+τ)之间相位变化，

表示V(t)的平均值。延时τ的选取决定相位变化。如果延时选择太小，这样在动作电位的0期和3期，相位都会有剧烈变化，而在2期和4期，相位变化趋近于0。实际应用中的延时选择比较复杂，经验的选择是颤动周期的1/4，一般这个时候V(t)的自相关函数通过0点。相位一般情况下是连续的，但是在一些病理条件下，比如早期后除极发生时，相位的连续性将会被破坏。

按照本发明的重构方法所得图像序列，可以重构得到频谱图，对于图像序列的某点按时间轴做一维快速傅立叶变换（fast fourier transform，FFT）得到时间信号的频谱，对于图像序列中某帧图像，做二维FFT，得到空间信号的频谱。

在等电势图的基础上，重构得到的动作电位时程图（APD）。在静息电位基础上，心肌受阈上刺激后膜电位出现迅速的倒转和恢复称为动作电位。由于滤波无法完全滤去噪声，因此二阶差分最大值可以结合阈值法共同计算复极时间。与APD最大幅度90%阈值最接近的二阶导数最大值即为所求最大值。因为散射的影响，在心脏光学标测实验中，利用求导法确定的APD往往比利用幅度法确定的APD可靠，特别是在深层组织出现折返波的情况下。

将APD图经过归一化，对按照时间顺序排列的不同图像进行重构后，将兴奋波前传导或者APD按照相对某帧图像的延迟大小进行重构，可以提供一帧可以直观快速反应心脏表面激动顺序的功能图像，就是等时图（isochronal map）。

理论上的研究表明，自激动系统可以由相空间中激动核和恢复变量之间的关系来描述，但是在光学标测实验中，只有一个变量即跨膜电位可供观测。可以利用时间延迟创建第二个变量，F(t)和时间延迟信号F(t+τ)，利用这两个变量研究相空间的变化。相位图（phase map）就是F(t)和F(t+τ)之间的相位变化。延时的选择非常重要，如果延时选择太小，这样在动作电位的0期和3期，相位都会有剧烈变化，而在2期和4期，相位变化趋近于0。通过选择相位，可以重构出直观反映存在病理情况的相位图。相位图中相位剧烈变化的奇异点就是实际实验中折返发生的区域，奇异点即存在动作电位的0期也存在在动作电位的3期。

如果将光学标测实验所采集得到的信号看成一个整体信号的话，将是一个二维像空间在时间上的一个序列，这也就是光学标测信号的一个特征，在空间上说，它是一个二维信号，在时间上说，它是一个一维信号，从时－空统一看，是一个三维信号。因此，可以通过一维快速傅立叶变换（fast fourier transform，FFT）得到时间信号的频谱，也可以通过二维FFT，得到空间信号的频谱。

下面通过实例结合说明书附图对本发明做进一步阐述验证。

实施例：

本实例主要说明该发明专利所述方法在缺血性心律失常研究中的准确性。在诸如短期记忆特性研究中，传统的电极记录方式会受到起搏电场的影响，但是光学标测的荧光信号是不受刺激电极影响的。

具体步骤是：挑选2kg左右的家兔（雌雄不限），耳外侧静脉注射麻醉药戊巴比妥钠（35mg/kg）及肝素（1000单位/kg）。麻醉后开胸剪开心包，取出心脏，注意要留出一定长度的主动脉。将取出心脏迅速置于预先备好的4℃灌注液使其停博，并用手指轻压心室以利于排出残留血液，防止凝血形成血块。

心脏停跳后，打开灌注系统的流量控制开关，将主动脉和灌流系统插管结扎固定，灌注首先采用37℃不含BDM的普通台氏液（浓度mM，NaCl 130,KCl 4.0,CaCl21.8,MgCl21.0,NaHCO324,NaH2PO41.2,葡萄糖5.6。实验前调整灌注液的PH值为7.4），心脏经温暖的充氧灌注液灌流后，一般可立即恢复跳动，但起初心率较慢并常伴有心律不齐，以后逐步恢复正常并稳定。用32导生理参数记录仪（Cadwell Easy Ⅱ）观察并记录三导联心电信号。观察电极记录的心电图，主要是查看心率。等心脏跳动稳定后再换用含BDM的灌注液，使心脏停止收缩但还保留电活动。加入BDM后不应立即加入染料，而应该观察一段时间，等待心电图上观察到的心率逐步恢复且稳定后再加注电压敏感染料di-4-ANEPPS 0.4μl(5mg染料溶入4μl DMSO中)。灌注染料15－20分钟后开始记录数据，并将灌流速度降低到正常速度的30％，同时记录时间，观察缺血现象。

心室壁细胞分为心内膜下心室肌细胞、心室壁中层M细胞和心外膜下心室肌细胞。它们共同构成心室壁，但具有不同的电生理特性，进而产生跨壁复极离散度。Coronel等人研究起搏诱发的心脏记忆时，发现心外膜APD延长，而心内膜和M细胞并无明显变化，且心外膜比心内膜要晚约12ms复极，导致跨壁复极离散度增大，使得T波向量改变，产生记忆现象。

心脏记忆根据T波改变时间维持的长短可以分为短期记忆和长期记忆。短期记忆指15min~2h所引起的T波改变，是心脏为适应起搏心率和心脏激动顺序变化，出现心内外膜离子通道电流的变化，并由此带来复极离散度的变化。长期记忆指起搏时间为2~3周所引起的T波改变，与胞内转录翻译和蛋白质合成有关。当然，两者也不是完全分开的，只是表现的程度和恢复时间不同。

研究表明心脏记忆与心脏起搏方式、节律关系密切。起搏节律的改变会引起一些离子通道活性的变化，使得离子流重新分布，产生电重构。这些离子通道多分布在心外膜，主要包括：瞬时外向电流钾通道、延迟整流钾电流通道、L型钙通道、牵张激活离子通道。新近实验发现心脏复极时间延长最明显的是受牵张力最大的心肌，而不是电活动改变最明显的起搏点心肌。用心肌细胞恢复曲线（动态恢复曲线，S1-S2恢复曲线）和其斜率来衡量心肌短期记忆，恢复曲线和其斜率取决于拟定的起搏协议。心肌细胞的恢复曲线是动作电位时程APD和期前舒张间期DI的变化关系曲线，在一定程度上包含了“记忆”效应，且此模型所需数据更易获得。

以下起搏方案用于获得心室肌起搏的恢复图像，并且同时显示不同周期长度B_S1时的动态和局部S1S2恢复曲线，如图2（a）和（b）所示：

（1）使用200个周期长度B_S1刺激以便APD达到稳定状态；

（2）提供同样的刺激去测量稳定APD，即A*；

（3）以B_S1+δ的较长间隔的一个刺激去记录长干扰APD，即A+；

（4）使用200个周期长度B_S1刺激以便APD达到稳定状态；

（5）以B_S1-δ的较短间隔的一个刺激去记录短干扰APD，即A-；

（6）使用200个周期长度B_S1刺激以便APD达到稳定状态；

此方案起始使用B_S1=900ms，完成步骤（1）到（6）后，S1减少100ms，重复步骤（1）到（6）。δ设置为50ms。DI记作B_S1或B_S1S2与A*的差值。标准上，S1S2恢复曲线指APD抵制超值范围的δ的图像。由于我们只测到了一个δ值，因此称恢复曲线为‘局部’恢复曲线，以区别于成熟的恢复曲线。

（7）斜率测量方法

以下方案用于测量不同周期长度B_S1时动态恢复曲线和恢复图像中局部S1-S2恢复曲线的斜率：

动态恢复曲线斜率S_dyn：指步骤（2）中的稳定响应A*的平均值。这些点利用多项式拟合，S_dyn在每一个S1稳态点都要分析计算，表达式如下：

$S_{\mathrm{dyn}}=\frac{A_{i-1}^{*}-A_{i+1}^{*}}{D_{i-1}^{*}-D_{i+1}^{*}}$

局部S1-S2恢复曲线斜率S₁₂：指方案步骤（2）（3）（4）中每一个B_S1值的S1S2恢复曲线的响应。这些点都用线性或二次函数拟合，S₁₂在每一个B_S1的动态恢复曲线交叉处计算，表达式如下：

$S_{12}=\frac{A^{+}-A^{-}}{B^{+}-B^{-}}$

去除窦房结、左右心耳及左右心房，此时，未施加点刺激时测到的是室性心率，其值为67次/min；然后改变所施加电刺激频率，观察心脏跳动情况，刺激电极正极位于主动脉根部、负极位于正极偏上方约1mm处。由表可见，所测跳动心率与施加的刺激频率基本相符，可用于实验。

可以明显地看出，在一个固定起搏间隔B的恒BCL波形刺激时，心肌产生的是一系列稳定的动作电位，它们的动作电位时程APD和相应的舒张间隔DI都是相等的；但是当改变起搏间隔B时，心肌动作电位也会发生变化，随着起搏间隔B的增大，对应产生的动作电位时程APD和相应的舒张间隔DI也会增大，但是它们之间并不是线性的变化。

由图2（c）可以看出，APD与DI的变化关系是非线性的，且动态恢复曲线的斜率S_dyn随着舒张间隔DI的减小，也逐渐增大，而这其中的原因与离子通道的生理状态有关。在同一个S1刺激波形下，产生的A+，A*，A-各不相同，此现象也正说明了心肌短期记忆的存在，否则这三者应相等，即A+=A-＝A*；这三者相差程度的不同依赖于起搏间隔B_S1，当B_S1降低时，它们的差异更明显，即短期记忆现象更显著。

由图2（d）可见，Ms不是起搏间隔B_S1的单调函数，B_S1下降时，S_dyn和S12都会增加，与此相反，Ms的起搏频率依赖性是双向的，即B_S1降低时，Ms值增大，表明起搏历史的影响逐渐偏大。但有趣的是，继续降低B_S1，Ms值会减小，表明了恢复曲线不仅依赖于起搏方案。

我们的实验结果表明当B_S1的值为552.4ms时，短期记忆MS取得最大值，和期望的一致；B_S1=900ms时，家兔的Ms值很小，这是因为此时失活的离子流已经几乎全部恢复，因此起搏历史对APD和恢复曲线的影响微不足道。

由图2可以看出，本发明所述方法可以用于电生理研究，获取诸如电极记录等方法无法获得的高时空分辨率数据，为抗心律失常药物开发、除颤器起搏器等开发提供参考手段。

是家兔心脏缺血短期记忆特性研究。当离体家兔心脏全局性心肌缺血后，其短期记忆特性会发生明显变化，利用本发明所述各种功能图像重构算法，可以对这种短期记忆特性改变进行研究，从而为抗心律失常药物开发、除颤器起搏器等开发提供参考手段。

Claims (3)

1.一种心肌细胞膜电位功能信息光学重构方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）通过光学标测系统得到离体心脏的实时荧光光强分布；

2）对于步骤1）得到的实时荧光光强分布进行反解，求解得出膜电位V_m；

光标测检测到的荧光光强F的变化量ΔF与细胞跨膜电位V_m的变化ΔV_m成线性关系，因此通过ΔF/F反解出光学动作电位；使用的荧光窗是>570nm，使用以下公式计算光学动作电位：

$V_n=-(F_n-\stackrel{\‾}{F})/\stackrel{\‾}{F}$

上式中，V_n表示某时刻某一点的细胞跨膜电位V_m，F_n表示该时刻该点荧光强度，

表示该细胞静息时刻的平均荧光强度；通过公式计算得到每个点的细胞跨膜电位V_m，然后得到V_m随时间变化的曲线，当计算出一帧图像中每个点的动作电位，则重构出一个三维的图像序列，其中一维以时间为轴，另外两维表示心脏组织不同细胞跨膜电位的空间分布，这个图像序列中的某一帧表示该时刻的心脏组织的等电势图；

3）根据步骤2）获得的等电势图，经过滤波后处理并加伪彩得等电势伪彩图像。

2.根据权利要求1所述的心肌细胞膜电位功能信息光学重构方法，其特征在于，基于连续多帧图像的计算在图像采集间隙中计算完成。

3.根据权利要求1所述的心肌细胞膜电位功能信息光学重构方法，其特征在于，所述重构得到的三维图像序列，须经时空统一滤波算法处理后方可用于其他反映细胞或组织生理功能的重构功能图像计算方法，所述时空统一滤波算法是带权值的时空统一中值滤波。

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