CN109821134A - 一种用于活体的三维网络生物探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于活体的三维网络生物探针及其制备方法与应用,属于生物、化学及材料领域。通过在金纳米管修饰的三维网络材料上修饰上生物分子,再将其裁剪成长条状拖拽嵌入中空细管使其部分裸露在细管外部,得到用于活体的三维网络生物探针。本发明的探针可广泛应用到生物医学中,如活体血液中循环肿瘤细胞等特定细胞的分离、外泌体的分离、游离RNA的分离、蛋白的分离等;其使用方法为:将将留置针穿刺进入活体静脉血管,拔出留置针的钢针,将探针封闭后通过留置针的软管插入到血管之中,后端用肝素帽密封。本发明探针具有三维网络结构、强韧性、生物相容性好等优点,其既可以固定大量的生物分子,又可以在激光照射下可产生光热效应。
Description
技术领域
本发明属于生物、化学及材料领域,具体涉及一种用于活体的三维网络生物探针及其制备方法与应用。
背景技术
循环肿瘤细胞是由癌症病人的原发病灶或者转移病灶脱落进入外周血液循环系统的肿瘤细胞,循环肿瘤细胞是一种重要的癌症标志物,对于癌症的早期检测、手术预后、药物敏感性测试等个性化诊疗具有重要意义。
当前针对循环肿瘤细胞的检测多集中于体外少量血液样本的检测分析,可用于活体内捕获循环肿瘤细胞的技术还鲜有报道公开。活体内检测理论上可以检测分析全身所有血液,其灵敏度远远高于体外检测技术。活体内检测肿瘤细胞可以在循环肿瘤细胞数目低于1个/mL时,实现对肿瘤细胞的检测。然而现在极其缺乏有效的活体内检测技术,亟需开发简单、高效、快速的分离循环肿瘤细胞的方法,以实现真正的癌症早期检测。
循环肿瘤细胞随血液循环转移到远端器官形成肿瘤转移病灶,在杀伤原位肿瘤的同时,辅以对血液中循环肿瘤细胞的杀伤,可能有效抑制肿瘤转移灶的形成,从而取得更好的抗肿瘤效果。当前的肿瘤治疗策略多针对肿瘤本身而忽略血液中循环肿瘤细胞的杀伤,亟待开发可以在活体内长时间有效杀伤循环肿瘤细胞的方法。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术存在的缺点与不足,提供一种用于活体的三维网络生物探针的制备方法及通过该方法得到的三维网络生物探针。
本发明的另一目的在于提供所述三维网络生物探针的应用。
本发明的再一目的在于提供所述三维网络生物探针的使用方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种用于活体的三维网络生物探针载体材料的制备方法,包括如下步骤:
(1)将泡沫金属浸入到液态高分子材料中,离心使高分子材料充分填充泡沫金属的空隙;再次离心,除去泡沫金属空隙中多余的高分子材料;将表面包裹高分子材料的泡沫金属加热固化;浸入到酸性溶液中除去泡沫金属,用水漂洗,烘干,得到三维网络材料。
其中,高分子材料包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、纤维素、壳聚糖、甲壳素、PMMA等;第一次离心的条件优选为3000-8000rpm离心1-10min,第二次离心的条件优选为1000-5000rpm离心1-10min;浸入到酸性溶液中除去泡沫金属的条件优选为浸入到5-14mol/L的酸性溶液中1-12h,酸性溶液包括硝酸、盐酸、硫酸等。
(2)将三维网络材料用O2plasma处理后浸入到多巴胺的Tris-HCl溶液中进行反应,反应结束后取出材料用水漂洗,得到聚多巴胺修饰的三维网络材料。
其中,三维网络材料用O2plasma处理的时间优选为1-10min;多巴胺的Tris-HCl溶液中多巴胺的浓度优选为0.1-10mg/mL,Tris-HCl的浓度优选为0.001-0.01mol/L、pH优选为7-12;进行反应的条件优选为静置反应1-24h。
(3)将聚多巴胺修饰的三维网络材料浸入到银纳米线异丙醇溶液(银纳米线分散到异丙醇中得到)中进行反应,反应结束后取出材料挥发掉其中的异丙醇,得到银纳米线修饰的三维网络材料。
其中,银纳米线异丙醇溶液的浓度优选为0.1-10mg/mL;进行反应的条件优选为静置反应1-100min。
(4)将银纳米线修饰的三维网络材料浸入到[Au(en)2]Cl3水溶液中进行金-银置换反应,反应结束后取出材料用水漂洗、烘干,得到金纳米管修饰的三维网络材料,即得到三维网络生物探针载体材料。
其中,[Au(en)2]Cl3水溶液的浓度优选为1-10mmol/L;金-银置换反应的条件优选为在鼓风干燥机中于1-100℃反应1-50h。
一种三维网络生物探针载体材料,通过上述制备方法得到。
一种三维网络生物探针材料的制备方法,包括如下步骤:
(1)将上述制备的金纳米管修饰的三维网络材料浸入到巯基乙酸溶液中避光反应,反应结束后取出修饰有巯基乙酸的金纳米管修饰的三维网络材料,用PBS漂洗后浸泡在PBS中备用。
其中,巯基乙酸溶液的浓度优选为1-100nmol/L;避光反应的条件优选为1-50h。
(2)将步骤(1)得到的三维网络材料用化学交联剂活化后,浸入到生物分子溶液中进行孵育,再经PBS充分洗涤后得到生物分子功能化修饰的三维网络生物探针材料。
其中,用交联剂活化优选在含有1-50mmol/L1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和1-50mmol/LN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液中活化,活化时间优选为10-100min;生物分子溶液的浓度优选为1~500mg/mL;孵育的时间优选为1~24h。所述的生物分子优选为用于特异性识别和捕获生物分子或细胞的蛋白或核酸,如特异性抗体、核酸适配体、链霉亲和素、凝集素、生长因子等。
一种三维网络生物探针材料,通过上述制备方法得到。
一种用于活体的三维网络生物探针的制备方法,包括如下步骤:将上述制备的生物分子功能化修饰的三维网络生物探针材料裁剪成1-5mm宽、1-10mm长、高0.5-3mm的长条状,用细线将裁剪好的材料一端拖拽嵌入直径为0.3-3mm、长度为3-10cm的中空细管之中,以使裁剪好的三维网络材料一部分嵌入到细管之中,另一部分裸露在细管外部1-5mm,使三维网络生物探针材料固定在细管的一端,得到用于活体的三维网络生物探针。其中,所述的细管包括中空的钢针、玻璃毛细管等。
一种用于活体的三维网络生物探针,通过上述制备方法得到。
所述的三维网络生物探针可广泛应用到生物医学中,根据所修饰的生物分子不同可用于不同的用途,如活体血液中循环肿瘤细胞等特定细胞的分离、外泌体的分离、游离RNA的分离、蛋白的分离等。
所述的三维网络生物探针的使用方法,包括如下步骤:将留置针穿刺进入活体静脉血管,之后拔出留置针的钢针,留下留置针的外层软管,将三维网络生物探针封闭后通过留置针的软管插入到血管之中,使三维网络生物探针前端的三维网络材料暴露在血管里的血液中,后端用肝素帽密封。所述的留置针的直径优选为0.3-3mm。
当所述的三维网络生物探针修饰的生物分子为特异性识别和捕获肿瘤细胞的生物分子,如抗上皮细胞粘附因子抗体时,则其可用于循环肿瘤的分离、原位杀伤。
一种基于上述三维网络生物探针分离血液中循环肿瘤细胞的方法,包括如下步骤:
(1)将修饰有特异性识别和捕获肿瘤细胞的生物分子的三维网络生物探针浸入到含牛血清白蛋白和表面活性剂的溶液中孵育封闭,之后PBS漂洗。其中,含牛血清白蛋白和表面活性剂的溶液中牛血清白蛋白的浓度优选为1-10%,表面活性剂的浓度优选为0.1-10%,表面活性剂包括血清、吐温、脱脂奶粉等;孵育封闭的时间优选为1-1000min。
(2)将留置针穿刺进入活体静脉血管,之后拔出留置针的钢针,留下留置针的外层软管。将步骤(1)封闭后的三维网络生物探针通过留置针的软管插入到血管中,使其前端的三维网络材料暴露在血管里的血液中,后端用肝素帽密封。
(3)含有肿瘤细胞的血液会多次流过三维网络生物探针,从而血液中的循环肿瘤细胞被特异性识别和捕获肿瘤细胞的生物分子捕获。
所述的三维网络生物探针插入到血管中捕获循环肿瘤细胞后,采用激光照射探针插入活体部位,由于材料表面金纳米管的受激光激发产生光热效应,可原位杀死捕获的肿瘤细胞。
本发明以三维网络材料为基础,在其表面修饰金纳米管,在金纳米管表面偶联生物靶向分子,得到生物分子功能化的三维网络生物探针,再利用细线将该三维网络材料嵌入到中空细管之中一部分,并使一部分三维网络材料暴露在外面。之后利用留置针将该三维网络生物探针内置于活体血管之中,并将其成功用于活体内循环肿瘤细胞的分离以及对捕获的肿瘤细胞原位光热杀伤。
本发明具有如下优点和效果:
本发明制备的三维网络生物探针具有三维网络结构、强韧性、生物相容性好等优点。其三维网络结构表面修饰金纳米管既可以固定大量的生物分子,插入到静脉血管之后可由压缩状态自动恢复舒张状态,实现对活体内少量的待测物的高效率、高灵敏度的检测;又可以在激光照射下可产生光热效应,高效地原位杀死捕获的肿瘤细胞,实现高灵敏检测和原位杀伤双功能。本发明操作简便易行、成本低、重复性好。
附图说明
图1是金纳米管修饰的三维网络PDMS材料的扫描电镜图,图中显示金纳米管均匀地分布在三维网络材料表面。
图2是三维网络生物探针图。
图3是三维网络生物探针的扫描电镜表征图,三维网络材料集成在中空的钢针的一端。
图4是留置针的组成图。
图5是三维网络生物探针插入模拟血管的过程示意图。首先插入留置针,之后拔出留置针钢针,留下外层软管,之后将用于活体的三维网络生物探针经由留置的外层软管插入模拟血管中,进入模拟血管之后,三维网络生物探针自动恢复舒展状态。
图6是体外模拟血液循环装置图,主要由循环蠕动泵和橡胶管组成,由细钢管连接。
图7是三维网络生物探针内置于裸大鼠尾静脉血管图。
图8是三维网络生物探针B从荷瘤大鼠活体内捕获到的循环肿瘤细胞和白细胞的结果图。其中,a、b、c、d为捕获到的肿瘤细胞,e、f、g、h为白细胞,a、e为DAPI染色,b、f为CD45-PE染色,c、g为CK-FITC染色,d、h为前述三种染色的叠加图。
图9是活体内原位光热杀伤肿瘤细胞的结果图,三维网络PDMS表面细胞保持活力,金纳米管修饰的三维网络PDMS表面的细胞基本死亡。碘化丙啶染色为死亡细胞,钙黄绿素染色为活细胞。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
若未特别说明,本说明书中涉及溶液的浓度均为质量分数。
实施例1
(1)将泡沫镍浸入到液态聚二甲基硅氧烷(PDMS)中,8000rpm离心5min,使聚二甲基硅氧烷溶液充分填充泡沫镍的空隙;之后再次3000rpm离心3min,除去泡沫镍空隙中多余的聚二甲基硅氧烷溶液;将表面包裹聚二甲基硅氧烷溶液的泡沫镍70℃加热固化3小时;浸入到5mol/L的硝酸溶液中1h以刻蚀掉泡沫镍,超纯水漂洗,烘干,得到三维网络PDMS材料。
(2)将步骤(1)得到的三维网络PDMS材料用O2Plasma处理5min后浸入到浓度为5%的羧基乙基硅烷三醇钠盐的PBS溶液中4h,之后PBS漂洗,得到羧基化修饰的三维网络PDMS材料。
(3)将步骤(2)得到的羧基化修饰的三维网络PDMS材料浸入到含有10mmol/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和10mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液中活化1h,PBS漂洗三次;之后浸入到100μg/mL链霉亲和素(Sigma-Aldrich CAS.9013-20-1)的PBS溶液中,室温下孵育,之后PBS漂洗;接着将材料浸入到10μg/mL抗上皮细胞粘附因子抗体(eBioscience公司,Cat.No.:13-9326-82)的PBS溶液中孵育1h,PBS漂洗三次,得到抗上皮细胞粘附因子抗体修饰的三维网络PDMS材料,标记为三维网络探针材料A。
实施例2
(1)根据实施例1步骤(1)的方法得到三维网络PDMS材料。
(2)将三维网络PDMS材料用O2plasma处理5min,随后立刻浸入到现配好的浓度为1mg/mL的多巴胺的Tris-HCl(0.01mol/L,pH 8.5)溶液中,静置反应24h。反应后用超纯水漂洗,得到表面有聚多巴胺修饰的三维网络PDMS材料。
(3)将银纳米线用异丙醇稀释成浓度为1mg/mL的银纳米线溶液,将步骤(2)得到的三维网络PDMS材料浸泡其中,静置反应60分钟后置于70℃干燥箱,挥发掉其中的异丙醇,得到银纳米线修饰的三维网络PDMS材料。
(4)将步骤(3)得到的银纳米线修饰的三维网络PDMS材料浸入到浓度为2mmol/L的[Au(en)2]Cl3水溶液中,置于75℃鼓风干燥机中进行金-银置换反应1h。反应结束后,用超纯水漂洗,烘干,得到金纳米管修饰的三维网络PDMS材料(图1)。
(5)将步骤(4)得到的金纳米管修饰的三维网络PDMS材料浸入到浓度为60nmol/L的巯基乙酸溶液中,室温静置避光反应24h,之后PBS漂洗,得到修饰有巯基乙酸的金纳米管修饰的三维网络PDMS材料。
(6)将步骤(5)得到的修饰有巯基乙酸的金纳米管修饰的三维网络PDMS材料浸入到含有10mmol/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和10mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液中活化1小时,PBS漂洗三次;之后浸入到100μg/mL的链霉亲和素(Sigma-Aldrich CAS.9013-20-1)的PBS溶液中,室温下孵育,之后PBS漂洗;接着将材料浸入到10μg/mL抗上皮细胞粘附因子抗体(eBioscience公司,Cat.No.:13-9326-82)溶液中孵育1h,PBS漂洗三次,得到抗上皮细胞粘附因子抗体修饰的金纳米管修饰的三维网络PDMS材料,标记为三维网络探针材料B。
实施例3
(1)将实施例1、2得到的三维网络探针材料A、B均裁剪成1mm高、3mm宽、8mm长的条状,用细线将裁剪好的材料一端拖拽嵌入直径1mm、长度7cm的中空钢针之中,使三维网络探针材料一部分嵌入到钢针之中、另一部分裸露在钢针外部约3-4mm(图2、图3所示),将钢针和三维网络探针材料集成,分别得到三维网络生物探针A、B。
(2)将步骤(1)得到的三维网络生物探针浸入到含5%牛血清白蛋白和0.2%吐温的混合溶液中,室温下孵育封闭1h后用PBS漂洗三次备用。
(3)如图4-6,安装体外模拟血液循环装置,采用留置针穿刺进入模拟血管,之后拔出穿刺针,留下留置针的外层软管;将三维网络生物探针的钢针通过留置针的外层软管插入模拟血管中,之后尾部用肝素帽密封。
(4)取200个用DiI预染色的人乳腺癌细胞(MCF-7)分散于2mL PBS中,以10cm/s的线速度在模拟血液循环装置中循环流动,将三维网络生物探针置于模拟血管内部,捕获1h,之后拔出三维网络生物探针,将三维网络生物探针置于倒置荧光显微镜下观察计数。
按照上述方法重复3次,三维网络生物探针A的平均捕获率达到11.1±6.4%,三维网络生物探针B的平均捕获率达到23.8±4.7%。表明三维网络PDMS材料修饰金纳米管后,三维网络生物探针对肿瘤细胞的捕获率大大提升了。
实施例4
取皮下荷瘤裸大鼠,采用留置针穿刺进入裸大鼠尾静脉,之后拔出穿刺针,留下留置针的外层软管;将按实施例3中方法得到的三维网络生物探针封闭后通过留置针的外层软管插入裸大鼠尾静脉,使探针前端的三维网络PDMS材料暴露在血管之中;之后尾部用肝素帽密封,如图7所示。待三维网络生物探针在裸大鼠体内作用1h以后,拔出三维网络生物探针,立即用含有2.5%柠檬酸钠抗凝剂(质量分数)的PBS漂洗,之后浸入到4%的多聚甲醛中,室温下孵育30分钟;PBS漂洗之后,浸入到0.2%的Triton X100中,4℃孵育30分钟;PBS漂洗,浸入到5%的牛血清白蛋白中4℃封闭1h;之后PBS漂洗,浸入到含CK-FITC(绿色荧光)、CD45-PE(红色荧光)和DAPI(蓝色荧光)的溶液中4℃孵育2h,PBS漂洗之后置于倒置荧光显微镜下观察计数。可同时标记DAPI蓝色荧光和CK-FITC的绿色荧光(尺寸大于10μm)的细胞为循环肿瘤细胞,可以同时标记DAPI蓝色荧光和CD45-PE的红色荧光的细胞为白细胞,代表性的细胞如图8所示,表明该三维网络生物探针成功用于活体内循肿瘤细胞的捕获。按照上述方法利用三维网络生物探针捕获肿瘤细胞后,直接用激光照射探针插入部位10分钟,将捕获到细胞原位杀伤;并且继续留在活体内捕获肿瘤细胞,可重复多次捕获和杀伤肿瘤细胞,将探针出,PBS漂洗,用浓度为2μmol/L的钙黄绿素和4μmol/L的碘化丙啶试剂,进行染色。结果如图9所示,三维网络PDMS表面细胞保持活力,而金纳米管修饰的三维网络PDMS材料表面细胞几乎全部死亡。统计结果表明激光照射后对三维网络生物探针B所捕获的细胞杀伤率达到90%,对三维网络生物探针A所捕获的细胞没有杀伤,表明本发明实现了对捕获的循环肿瘤细胞的高效杀伤。
上述实例说明本发明可以实现活体内循环肿瘤细胞的分离检测以及原位高效光热杀伤双功能。
上述实施例表明本发明方法制备的三维网络生物探针具有较好的分离和原位杀伤循环肿瘤细胞的效果,可用于生物医学领域。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种三维网络生物探针载体材料的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)将泡沫金属浸入到液态高分子材料中,离心使高分子材料充分填充泡沫金属的空隙;再次离心,除去泡沫金属空隙中多余的高分子材料;将表面包裹高分子材料的泡沫金属加热固化;浸入到酸性溶液中除去泡沫金属,用水漂洗,烘干,得到三维网络材料;
(2)将三维网络材料用O2plasma处理后浸入到多巴胺的Tris-HCl溶液中进行反应,反应结束后取出材料用水漂洗,得到聚多巴胺修饰的三维网络材料;
(3)将聚多巴胺修饰的三维网络材料浸入到银纳米线异丙醇溶液中进行反应,反应结束后取出材料挥发掉其中的异丙醇,得到银纳米线修饰的三维网络材料;
(4)将银纳米线修饰的三维网络材料浸入到[Au(en)2]Cl3水溶液中进行金-银置换反应,反应结束后取出材料用水漂洗、烘干,得到三维网络生物探针载体材料。
2.一种三维网络生物探针载体材料,其特征在于:通过权利要求1所述的制备方法得到。
3.一种三维网络生物探针材料的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)将权利要求2所述的三维网络生物探针载体材料浸入到巯基乙酸溶液中避光反应,反应结束后取出材料,用PBS漂洗;
(2)将步骤(1)得到的材料用化学交联剂活化后,浸入到生物分子溶液中进行孵育,再经PBS充分洗涤后得到生物分子功能化修饰的三维网络生物探针材料。
4.一种三维网络生物探针材料,其特征在于:通过权利要求3所述的制备方法得到。
5.一种用于活体的三维网络生物探针的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:将权利要求4所述的三维网络生物探针材料裁剪成1-5mm宽、1-10mm长、高0.5-3mm的长条状,用细线将裁剪好的材料一端拖拽嵌入直径为0.3-3mm、长度为3-10cm的中空细管之中,以使其一部分嵌入到细管之中、另一部分裸露在细管外部1-5mm,得到用于活体的三维网络生物探针。
6.一种用于活体的三维网络生物探针,其特征在于:通过权利要求5所述的制备方法得到。
7.权利要求6所述的用于活体的三维网络生物探针在生物医学中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于:所述的用于活体的三维网络生物探针修饰的生物分子为特异性识别和捕获肿瘤细胞的生物分子时,其可用于循环肿瘤的分离或原位杀伤。
9.权利要求6所述的用于活体的三维网络生物探针的使用方法,其特征在于:包括如下步骤:将留置针穿刺进入活体静脉血管,之后拔出留置针的钢针,留下留置针的外层软管,将权利要求6所述的用于活体的三维网络生物探针封闭后通过留置针的软管插入到血管之中,使探针前端的三维网络材料暴露在血管里的血液中,后端用肝素帽密封。
10.一种基于权利要求6所述的用于活体的三维网络生物探针分离血液中循环肿瘤细胞的方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)将修饰有特异性识别和捕获肿瘤细胞的生物分子的三维网络生物探针浸入到含牛血清白蛋白和表面活性剂的溶液中孵育封闭,之后PBS漂洗;
(2)将留置针穿刺进入活体静脉血管,之后拔出留置针的钢针,留下留置针的外层软管;将步骤(1)封闭后的三维网络生物探针通过留置针的软管插入到血管中,使其前端的三维网络材料暴露在血管里的血液中,后端用肝素帽密封;
(3)含有肿瘤细胞的血液流过三维网络生物探针时会被特异性识别和捕获肿瘤细胞的生物分子捕获。
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