CN103257233A - 一种同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的生物芯片及方法 - Google Patents

一种同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的生物芯片及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的生物芯片，所述生物芯片包括固定有一组检测目标物抗原的芯片载体，所述检测目标物为抗生素、非法添加剂和生物毒素，所述生物芯片由以下方法制成：以牛血清白蛋白为空白对照，将牛血清白蛋白和检测目标物抗原通过生物芯片制备系统在芯片载体上点样操作后，于20-37℃水浴中固定0.5-4h即得。还提供了利用上述生物芯片同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的方法。该生物芯片结构简单、制备工艺简单、成本低、多靶标、准确度高、灵敏度高、精密度高、检测时间短、操作简单易行，无需昂贵的检测仪器，适用于现场大规模样品的初筛。

Description

一种同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的生物芯片及方法
技术领域
本发明属于食品安全监督或食品分析的免疫分析技术领域，特别涉及多种抗生素、非法添加剂、生物毒素残留同时可视化检测的方法。
背景技术
抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质，现常用的抗生素有微生物培养液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。抗生素作为抗生素和饲料添加剂被广泛应用，可能会造成抗生素在动物源性食品中的残留。对于牛奶等乳制品，抗生素残留不仅会影响乳制品的品质，如严重影响发酵乳制品的生产，降低产量及破坏后期产品风味，给生产者造成经济损失；除此之外，抗生素残留会对人体造成极大的危害，如引起人体的过敏反应（如：皮疹、过敏性休克等），抑制肠道中正常的敏感菌群的生长，使致病菌、念珠菌大量增殖而导致全身或局部感染，并且会导致人体对抗生素产生抗药性，给临床治疗带来不可估量的危害。目前，牛奶、蜂蜜、家禽、水产中的抗生素残留已引起消费者的高度重视，因此，加强抗生素的残留检测尤为重要。
为改善食品品质和色、香、味以及为防腐、保鲜和加工工艺的需要而加入食品的人工合成或者天然物质则称为食品添加剂，但是过量摄取食品添加剂和禁用添加剂对人体健康危害非常大。如三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料，一般情况下较稳定，但在高温下可能会解放出氰化物。由于三聚氰胺的分子式中含氮量为66%左右，而蛋白质的平均含氮量为16%左右，因此，常被一些不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标，因此三聚氰胺被俗称为“蛋白精”。“苏丹红”是一种化学染色剂，它的化学成份中含有一种叫萘的化合物，该物质具有偶氮结构，由于这种化学结构的性质决定了它具有致癌性，对人体的肝肾器官具有明显的毒性作用。1995年欧盟(EU)等国家已禁止其作为色素在食品中进行添加，对此我国也明文禁止。
生物毒素是由各种生物（动物、植物、微生物）产生的有毒物质，为天然毒素，是指生物来源并不可自复制的有毒化学物质，包括动物、植物、微生物产生的对其它生物物种有毒害作用的各种化学物质。目前为止已经发现的真菌毒素有300多种，其中已经被分离出来证实有毒的有20多种。与食品相关的有：黄曲霉毒素、杂色曲毒素、岛青毒素、黄天精、桔青毒素、展青毒素、单端孢霉毒素、玉米赤霉毒素、丁烯酸内酯等。真菌毒素对人体危害重大，能引起人体肝脏、肾脏、神经中毒，以及引发严重皮炎。如黄曲霉毒素被世界卫生组织划定为1类致癌物，毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药，其中以B1毒性最大，比砒霜大68倍，仅次于肉毒霉素，是目前已知霉菌中毒性最强的。B1是最危险的致癌物，经常在玉米、花生、棉花种子、一些干果中能检测到，其中以花生和玉米污染最严重。M1是B1的代谢产物，主要存在于牛奶中。
目前国内外关于抗生素、非法添加剂、生物毒素残留常用的检测方法有以下两类：理化检测法和免疫分析法。理化检测法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定含量的方法，如高效液相色谱法、气相色谱法、比色法、荧光分光光度法，其中最常用的是高效液相色谱法（HPLC）和色谱质谱联用法（TLC-MS，GC-MS，LC-MS等）。理化检测法对设备要求高，技术难度大，对技术人员要求高，操作繁琐，需要大量复杂的样品前处理操作，不适合现场监控和大量样本的筛查。免疫分析法是基于抗原抗体识别或者受体配体识别来测定抗生素含量的分析方法，如酶联免疫吸附法（ELISA）和受体吸附分析法。这类方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单的优点，然而现有的免疫分析法如ELISA无法同时测定多个目标物。如需测定样品中的多种抗生素，则需要进行多次试验，需要耗费较多的时间与材料。此外，针对抗生素检测，使用较多的还有微生物法。微生物学检测方法是利用抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用来定性或定量确定样品中抗生素残留的方法，如微生物生长抑制法、微生物受体法、酶比色法等。这些方法都需要加热设备培养微生物，并且微生物法耗时很长，无法快速检测。因此，迫切需要发展一种灵敏、准确、快速并且可同时检测多种抗生素、非法添加剂、生物毒素的检测方法。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的生物芯片，本发明的第二目的是提供利用上述生物芯片同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂、生物毒素残留的方法，在于弥补现有抗生素、非法添加剂、生物毒素同时定量检测技术的空白，满足对动物源性食品中多种抗生素、非法添加剂、生物毒素同时进行快速检测的要求，具有多靶标、成本低、灵敏度高、检测时间短和操作简单易行等特点。
技术方案：本发明提供的一种同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的生物芯片包括固定有一组检测目标物抗原的芯片载体，所述检测目标物为抗生素、非法添加剂和生物毒素，所述生物芯片由以下方法制成：以牛血清白蛋白为空白对照，将牛血清白蛋白和检测目标物抗原通过生物芯片制备系统在芯片载体上点样操作后，于20-37℃水浴中固定0.5-4h即得。
其中，所述生物芯片为一组由检测目标物抗原组成的矩阵组成，所述矩阵为的列数为3的倍数；将矩阵设的列数设为3的倍数，从而每个检测目标物抗原可点3个重复点，使测定结果更直观更准确。
其中，所述的芯片载体为96孔板、384孔板、透明高聚物片基、膜或玻片。
其中，所述的抗生素为β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、四环素类抗生素、大环内酯类抗生素、磺胺类抗生素、喹诺酮类抗生素、硝基呋喃类抗生素和其他抗生素中的任意一种或几种；具体来说，所述的β-内酰胺类抗生素包括青霉素类抗生素和头孢类抗生素；所述的氨基糖苷类抗生素包括庆大霉素、卡那霉素、链霉素和新霉素；所述的四环素类抗生素包括四环素、土霉素、金霉素和多西环素；所述的大环内酯类抗生素包括红霉素、克拉霉素和罗红霉素；所述的磺胺类抗生素包括磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺多辛；所述的喹诺酮类抗生素包括诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、加替沙星、司帕沙星和莫西沙星；所述的硝基呋喃类抗生素包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林；所述的其他抗生素包括氯霉素、甲砜霉素、克林霉素和林可霉素。本发明所述的抗生素不局限于上述所列举的具体的抗生素，现有技术中已经存在的抗生素都可以采用本发明方法检测其含量。
其中，所述的非法添加剂为三聚氰胺、孔雀石绿、苏丹红中的任意一种或几种；
其中，所述的生物毒素为黄曲霉毒素、T-2毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、赭曲霉毒素A、杂色曲毒素、丁烯酸内酯、桔青毒素、展青毒素、单端孢霉毒素、肉毒毒素中的任意一种或几种；具体而言，所述的黄曲霉毒素为黄曲霉毒素M1、M2、B1、B2、G1或G2。本发明所述的生物毒素不局限于上述所列举的具体的生物毒素，现有技术中已经存在的生物毒素都可以采用本发明方法检测其含量。
本发明还提供了一种多种抗生素、非法添加剂及生物毒素残留同时可视化检测的方法，包括以下步骤：
(1)在生物芯片的部分反应孔内分别加入含有不同浓度梯度的检测目标物的混合标准溶液，在剩余反应孔内分别加入待测样品溶液，继续向所有反应孔中依次加入检测目标物所对应的单克隆抗体和标记的羊抗鼠IgG，于20～37℃水浴中反应10～20min，洗涤液洗涤；
(2)所有反应孔内继续加入显色剂，显色反应2～5min后，终止反应；
(3)使用CCD进行图像采集，根据检测目标物包被抗原的灰度值以及标准溶液的浓度对数制作标准曲线，采用外标曲线法定量，分别计算样品溶液中检测目标物的含量。
其中，所述的待测样品为动物源性食品，包括牛奶、奶粉、奶酪、饲料、尿液、动物组织（如猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝或鸡肝等）、血清、蜂蜜、蜂皇浆、鸡蛋和水产品（如鱼或虾等）。
其中，待测样品溶液的制备方法为：当待测样品为液体时，取50μL～1mL于10mL EP管中，用缓冲液稀释10～100倍即得待测样品溶液；当待测样品为固体时，取粉碎样品5g，加入8mL缓冲液，混合2～5min，置50℃水浴下放置10～30min，离心5～10min，取50μL上清液，加入450μL缓冲液混匀，取50μL～500μL即得待测样品溶液。
其中，步骤（1）中，所述检测目标物的混合标准溶液加入体积为10～200μL；所述待测样品溶液的加入体积与游离抗生素的标准溶液的加入体积相同；每个反应孔内加入的单克隆抗体的量10～200μL；每个反应孔内加入的标记的羊抗鼠IgG的量10～200μL；不同反应孔内加入的单克隆抗体的量相同，不同反应孔内加入的标记的羊抗鼠IgG的量相同。
其中，所述的标记的羊抗鼠IgG为纳米材料或者生物酶标记的羊抗鼠IgG，如纳米金颗粒（5～25nm）标记的羊抗鼠IgG、纳米银（5～25nm）颗粒标记的羊抗鼠IgG、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG或碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG。
其中，所述的洗涤液为缓冲液，具体而言，包括磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液。
其中，步骤（2）中，所述的显色剂为生物催化剂及其底物或者化学催化剂及其底物，显色剂的加入体积为10～100μL。可根据本领域公知合理选择显色剂，生物催化剂及其底物包括：辣根过氧化物酶及其底物邻苯二胺/过氧化氢体系或四甲基联苯胺/过氧化氢体系、碱性磷酸酶及其底物BCIP/NBT体系；化学催化剂及其底物包括：纳米金或纳米银，及其底物氯金酸/单宁酸体系或氯金酸/氢醌体系。生物催化剂对反应条件要求较高，例如部分催化剂在37℃的催化效率最高；而化学催化剂的稳定性高，适应范围广。
有益效果：本发明提供的一种同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的生物芯片结构简单、制备工艺简单、成本低、多靶标、准确度高、灵敏度高、精密度高、检测时间短、操作简单易行，无需昂贵的检测仪器，适用于现场大规模样品的初筛。
该生物芯片将检测目标物抗原固定于芯片载体上，使用时在反应孔内加入待测样品溶液及其检测目标物相应的单克隆抗体和标记的二抗，从而实现待测样品溶液中游离的抗生素、非法添加剂、生物毒素和生物芯片上固定的包被抗原之间发生竞争反应，待测样品溶液中游离的检测目标物越多，那么生物芯片上固定的包被抗原反应量越少，显色后生物芯片上固定的抗原阵列的不同位置上形成可目测的深浅不同的斑点，通过CCD对图像进行采集，最终可实现对多种抗生素、非法添加剂、生物毒素的同时定量检测。
具体而言，本发明相对于现有技术具有以下突出的特点：
（1）准确度高：利用本发明提供的芯片检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素，对牛奶加样回收率在80%-120%之间，准确度高，适于实际样品的检测。
（2）灵敏度高：利用本发明提供的芯片检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素，对氯霉素等抗生素物质在牛奶中的检测限最低达到0.05ng/mL，对三聚氰胺等非法添加剂在牛奶中的检测限最低达到5ng/mL，对黄曲霉毒素M1等生物毒素在牛奶中的检测限最低达到0.2ng/mL，灵敏度高。
（3）精密度高：利用本发明提供的芯片检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素，对抗生素、非法添加剂及生物毒素抗体的特异性较好，并且孔间CV值低于12%，孔内CV值低于8%，精密度高。
（4）效率高：利用本发明提供的芯片检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素，根据外标曲线可定量求出多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的浓度。使用该生物芯片可在一次实验中同时测得多种有害物质的含量，大大降低了操作步骤，减少试剂用量，降低了成本，无需特殊昂贵的实验仪器，同时也为现场快速检测提供了一种思路；与现有的ELISA方法相比，本发明根据生物芯片包被抗原的斑点颜色深浅不同来定量检测，克服了ELISA方法在溶液中显色一次只能测定单种有害物质的含量的缺陷。本发明方法可同时快速定量检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素，而现有方法只能检测一种抗生素，原因是现有方法通常会加入内标物从而干扰多种物质的检测，影响其他待测物质检测的准确度。
附图说明
图1a～图1o为本发明方法制作的标准曲线图。
1a为卡那霉素的标准曲线；卡那霉素的曲线在1ng/mL-20ng/mL范围内线性良好，R2>0.99，并且孔间CV值低于12%，孔内CV值低于8%，方法精密度高。且牛奶加样回收率在90%-120%之间，方法的准确度高。
1b为头孢氨苄的标准曲线；头孢氨苄的曲线在2ng/mL-50ng/mL范围内线性良好，R2>0.99，并且孔间CV值低于12%，孔内CV值低于8%，方法精密度高。且牛奶加样回收率在85%-105%之间，方法的准确度高。
1c为庆大霉素的标准曲线；庆大霉素的曲线在1ng/mL-20ng/mL范围内线性良好，R2>0.99，并且孔间CV值低于12%，孔内CV值低于8%，方法精密度高。且牛奶加样回收率在87%-112%之间，方法的准确度高。
1d为磺胺二甲基嘧啶的标准曲线；磺胺二甲基嘧啶的曲线在0.8ng/ml-20ng/mL范围内线性良好，R2>0.99，并且孔间CV值低于12%，孔内CV值低于8%，方法精密度高。且牛奶加样回收率在92%-109%之间，方法的准确度高。
1e为四环素的标准曲线；四环素的曲线在0.05ng/ml-1.5ng/mL范围内线性良好，R2>0.99，并且孔间CV值低于12%，孔内CV值低于8%，方法精密度高。且牛奶加样回收率在85%-110%之间，方法的准确度高。
1f为红霉素的标准曲线；红霉素的曲线在5ng/ml-150ng/mL范围内线性良好，R2>0.99，并且孔间CV值低于12%，孔内CV值低于8%，方法精密度高。且牛奶加样回收率在90%-110%之间，方法的准确度高。
1g为环丙沙星的标准曲线；环丙沙星的曲线在0.2ng/ml-16ng/mL范围内线性良好，R2>0.99，并且孔间CV值低于12%，孔内CV值低于8%，方法精密度高。且牛奶加样回收率在85%-115%之间，方法的准确度高。
1h为呋喃它酮的标准曲线；呋喃它酮的曲线在0.1ng/ml-8ng/mL范围内线性良好，R2>0.99，并且孔间CV值低于12%，孔内CV值低于8%，方法精密度高。且牛奶加样回收率在80%-120%之间，方法的准确度高。
1i为氯霉素的标准曲线；氯霉素的曲线在0.05ng/ml-4ng/mL范围内线性良好，R2>0.99，并且孔间CV值低于12%，孔内CV值低于8%，方法精密度高。且牛奶加样回收率在90%-120%之间，方法的准确度高。
1j为林可霉素的标准曲线；林可霉素的曲线在0.2ng/ml-16ng/mL范围内线性良好，R2>0.99，并且孔间CV值低于12%，孔内CV值低于8%，方法精密度高。且牛奶加样回收率在85%-105%之间，方法的准确度高。
1k为三聚氰胺的标准曲线；三聚氰胺的曲线在5ng/ml-200ng/mL范围内线性良好，R2>0.99，并且孔间CV值低于12%，孔内CV值低于8%，方法精密度高。且牛奶加样回收率在95%-105%之间，方法的准确度高。
1l为黄曲霉毒素M1的标准曲线；黄曲霉毒素M1的曲线在0.2ng/ml-4ng/mL范围内线性良好，R2>0.99，并且孔间CV值低于12%，孔内CV值低于8%，方法精密度高。且牛奶加样回收率在90%-110%之间，方法的准确度高。
1m为T-2毒素的标准曲线；T-2毒素的曲线在20ng/ml-250ng/mL范围内线性良好，R2>0.99，并且孔间CV值低于12%，孔内CV值低于8%，方法精密度高。且牛奶加样回收率在90%-112%之间，方法的准确度高。
1n为玉米赤霉烯酮的标准曲线；玉米赤霉烯酮的曲线在10ng/ml-100ng/mL范围内线性良好，R2>0.99，并且孔间CV值低于12%，孔内CV值低于8%，方法精密度高。且牛奶加样回收率在85%-110%之间，方法的准确度高。
1o为伏马毒素的标准曲线；伏马毒素的曲线在2.5ng/ml-200ng/mL范围内线性良好，R2>0.99，并且孔间CV值低于12%，孔内CV值低于8%，方法精密度高。且牛奶加样回收率在90%-112%之间，方法的准确度高。
图2为本发明实施例的生物芯片图；该生物芯片的每个反应孔内可同时检测卡那霉素、头孢氨苄、庆大霉素、磺胺二甲基嘧啶、四环素、红霉素、环丙沙星、呋喃它酮、氯霉素、林可霉素、三聚氰胺、黄曲霉毒素M1、T-2毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素15个项目。
图3为采用本发明同时检测牛奶中卡那霉素、头孢氨苄、庆大霉素、磺胺二甲基嘧啶、四环素、红霉素、环丙沙星、呋喃它酮、氯霉素、林可霉素、三聚氰胺、黄曲霉毒素M1、T-2毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素后的生物芯片图；其中，A-F孔为标准溶液反应孔，1-34孔为实际牛奶样本反应孔。
具体实施方式
根据下述实施例，可以使本领域的技术人员更好地理解本发明。然而，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
同时定量检测牛奶中卡那霉素、头孢氨苄、庆大霉素、磺胺二甲基嘧啶、四环素、红霉素、环丙沙星、呋喃它酮、氯霉素、林可霉素、三聚氰胺、黄曲霉毒素M1、T-2毒素、玉米赤霉烯酮和伏马毒素的含量。
实验中所使用的试剂如下：
（1）标准溶液：
本实施例中使用的混合标准溶液共6种，组成如下：
①混合标准溶液1：其中卡那霉素浓度为0ng/mL，头孢氨苄浓度为0ng/mL，庆大霉素浓度为0ng/mL，磺胺二甲基嘧啶浓度为0ng/mL，四环素浓度为0ng/mL，红霉素浓度为0ng/mL，环丙沙星浓度为0ng/mL，呋喃它酮浓度为0ng/mL，氯霉素浓度为0ng/mL，林可霉素浓度为0ng/mL，三聚氰胺浓度为0ng/mL，黄曲霉毒素M1浓度为0ng/mL，T-2毒素浓度为0ng/mL，玉米赤霉烯酮浓度为0ng/mL，伏马毒素浓度为0ng/mL。
②混合标准溶液2：其中卡那霉素浓度为1ng/mL，头孢氨苄浓度为2ng/mL，庆大霉素浓度为1ng/mL，磺胺二甲基嘧啶浓度为0.8ng/mL，四环素浓度为0.05ng/mL，红霉素浓度为5ng/mL，环丙沙星浓度为0.2ng/mL，呋喃它酮浓度为0.1ng/mL，氯霉素浓度为0.05ng/mL，林可霉素浓度为0.2ng/mL，三聚氰胺浓度为5ng/mL，黄曲霉毒素M1浓度为0.2ng/mL，T-2毒素浓度为20ng/mL，玉米赤霉烯酮浓度为10ng/mL，伏马毒素浓度为2.5ng/mL。
③混合标准溶液3：其中卡那霉素浓度为2.5ng/mL，头孢氨苄浓度为5ng/mL，庆大霉素浓度为2ng/mL，磺胺二甲基嘧啶浓度为2ng/mL，四环素浓度为0.15ng/mL，红霉素浓度为15ng/mL，环丙沙星浓度为0.6ng/mL，呋喃它酮浓度为0.3ng/mL，氯霉素浓度为0.15ng/mL，林可霉素浓度为0.6ng/mL，三聚氰胺浓度为20ng/mL，黄曲霉毒素M1浓度为0.5ng/mL，T-2毒素浓度为35ng/mL，玉米赤霉烯酮浓度为20ng/mL，伏马毒素浓度为7.5ng/mL。
④混合标准溶液4：其中卡那霉素浓度为5ng/mL，头孢氨苄浓度为10ng/mL，庆大霉素浓度为4ng/mL，磺胺二甲基嘧啶浓度为4ng/mL，四环素浓度为0.3ng/mL，红霉素浓度为30ng/mL，环丙沙星浓度为1.8ng/mL，呋喃它酮浓度为0.9ng/mL，氯霉素浓度为0.45ng/mL，林可霉素浓度为1.8ng/mL，三聚氰胺浓度为50ng/mL，黄曲霉毒素M1浓度为1ng/mL，T-2毒素浓度为75ng/mL，玉米赤霉烯酮浓度为40ng/mL，伏马毒素浓度为20ng/mL。
⑤混合标准溶液5：其中卡那霉素浓度为10ng/mL，头孢氨苄浓度为25ng/mL，庆大霉素浓度为10ng/mL，磺胺二甲基嘧啶浓度为10ng/mL，四环素浓度为0.6ng/mL，红霉素浓度为60ng/mL，环丙沙星浓度为5.4ng/mL，呋喃它酮浓度为2.7ng/mL，氯霉素浓度为1.35ng/mL，林可霉素浓度为5.4ng/mL，三聚氰胺浓度为100ng/mL，黄曲霉毒素M1浓度为2ng/mL，T-2毒素浓度为125ng/mL，玉米赤霉烯酮浓度为60ng/mL，伏马毒素浓度为60ng/mL。
⑥混合标准溶液6：其中卡那霉素浓度为20ng/mL，头孢氨苄浓度为50ng/mL，庆大霉素浓度为20ng/mL，磺胺二甲基嘧啶浓度为20ng/mL，四环素浓度为1.5ng/mL，红霉素浓度为150ng/mL，环丙沙星浓度为16ng/mL，呋喃它酮浓度为8ng/mL，氯霉素浓度为4ng/mL，林可霉素浓度为16ng/mL，三聚氰胺浓度为200ng/mL，黄曲霉毒素M1浓度为4ng/mL，T-2毒素浓度为250ng/mL，玉米赤霉烯酮浓度为100ng/mL，伏马毒素浓度为200ng/mL。
以上化合物标准品均购自中国药品生物制品检定所，使用时称重并用纯净水稀释至所需浓度。
（2）样品溶液：样品溶液为市售牛奶，经HPLC检测为阴性，往其中添加标准溶液至所需浓度。
（3）单克隆抗体：
①卡那霉素对应的单克隆抗体为鼠抗卡那霉素单克隆抗体，购自Abcam公司。
②头孢氨苄对应的单克隆抗体为鼠抗头孢氨苄单克隆抗体，购自Abcam公司。
③庆大霉素对应的单克隆抗体为鼠抗庆大霉素单克隆抗体，购自Pierce公司。
④磺胺二甲基嘧啶对应的单克隆抗体为鼠抗磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体，购自Biodesign公司。
⑤四环素对应的单克隆抗体为鼠抗四环素单克隆抗体，购自Santa Cruz公司。
⑥红霉素对应的单克隆抗体为鼠抗红霉素单克隆抗体，购自Sigma-Aldrich公司。
⑦环丙沙星对应的单克隆抗体为鼠抗环丙沙星单克隆抗体，购自Abcam公司。
⑧呋喃它酮对应的单克隆抗体为鼠抗呋喃它酮单克隆抗体，购自AbMart公司。
⑨氯霉素对应的单克隆抗体为鼠抗氯霉素单克隆抗体，购自eBioscience公司。
⑩林可霉素对应的单克隆抗体为鼠抗林可霉素单克隆抗体，购自杭州隆基生物技术有限公司。
⑾三聚氰胺对应的单克隆抗体为鼠抗三聚氰胺单克隆抗体，购自Biodesign公司。
⑿黄曲霉毒素M1对应的单克隆抗体为鼠抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，购自R-Biopharm公司。
⒀T-2毒素对应的单克隆抗体为鼠抗T-2毒素单克隆抗体，购自Biodesign公司。
⒁玉米赤霉烯酮对应的单克隆抗体为鼠抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体，购自Sigma-Aldrich公司。
⒂伏马毒素对应的单克隆抗体为鼠抗伏马毒素单克隆抗体，购自杭州隆基生物技术有限公司。
（4）标记的羊抗鼠IgG为胶体金（25nm）标记的羊抗小鼠IgG，可与以上所用的6种抗体结合，购自Sigma-Aldrich公司。
（5）显色剂：反应中所用的显色剂为纳米金及其底物体积比1:1的0.4M的HAuCl4和0.1M的单宁酸，其中HAuCl4和单宁酸均购自Sigma-Aldrich公司。
（6）缓冲液配方分别为：
磷酸盐缓冲液配方为：135mM NaCl,2.7mM KCl,1.5mM KH2PO4,和8mMK2HPO4，调节pH至7.4。
Tris缓冲液配方为：50ml0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与44.7ml0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。
检测步骤如下：
（1）生物芯片的制备：以牛血清白蛋白为空白对照，使用生物芯片制备仪（美国BioDot公司）在96孔板上点样制备微阵列芯片，将牛血清白蛋白、卡那霉素、头孢氨苄、庆大霉素、磺胺二甲基嘧啶、四环素、红霉素、环丙沙星、呋喃它酮、氯霉素、林可霉素、三聚氰胺、黄曲霉毒素M1、T-2毒素、玉米赤霉烯酮和伏马毒素抗原在96孔板上点样操作，37℃水浴中固定0.5h，在96孔板上形成微阵列结构，不同位置的阵列点对应不同的抗原；也可采用384孔板、透明高聚物片基、膜或玻片代替96孔板作为芯片载体；
（2）待测样品溶液的制备：取100μL牛奶样品于10mL EP管中，用PBS缓冲液（0.1M，pH7.4）稀释10倍，即为待测样品溶液；
（3）在96孔板的部分反应孔内分别加入50μL含不同浓度梯度的游离卡那霉素、头孢氨苄、庆大霉素、磺胺二甲基嘧啶、四环素、红霉素、环丙沙星、呋喃它酮、氯霉素、林可霉素、三聚氰胺、黄曲霉毒素M1、T-2毒素、玉米赤霉烯酮和伏马毒素的混合标准溶液，在剩余的反应孔内分别加入50μL待测样品溶液，向所述已经加入了混合标准溶液或样品溶液的反应孔内继续加入50μL所述卡那霉素、头孢氨苄、庆大霉素、磺胺二甲基嘧啶、四环素、红霉素、环丙沙星、呋喃它酮、氯霉素、林可霉素、三聚氰胺、黄曲霉毒素M1、T-2毒素、玉米赤霉烯酮和伏马毒素对应的单克隆抗体混合溶液以及25μL纳米银标记的羊抗鼠IgG，在37℃水浴反应20min，然后PBST洗涤；
（4）在每个反应孔内继续加入50μL显色剂及其底物，现配现用，显色反应5min后，终止反应；
（5）用CCD进行图像采集，根据卡那霉素、头孢氨苄、庆大霉素、磺胺二甲基嘧啶、四环素、红霉素、环丙沙星、呋喃它酮、氯霉素、林可霉素、三聚氰胺、黄曲霉毒素M1、T-2毒素、玉米赤霉烯酮和伏马毒素相应包被抗原位置的阵列灰度值信号，利用外标曲线法定量检测样品中卡那霉素、头孢氨苄、庆大霉素、磺胺二甲基嘧啶、四环素、红霉素、环丙沙星、呋喃它酮、氯霉素、林可霉素、三聚氰胺、黄曲霉毒素M1、T-2毒素、玉米赤霉烯酮和伏马毒素等物质的含量。
检测结果见图1a-1o、图2和图3。
本实施例对该方法的检测限和精密度进行了考察，从图中可以看出，该方法对于检测目标物的定量限分别为：卡那霉素的检测限为1ng/mL，头孢氨苄的检测限为2ng/mL，庆大霉素的检测限为1ng/mL，磺胺二甲基嘧啶的检测限为0.8ng/mL，四环素的检测限为0.05ng/mL，红霉素的检测限为5ng/mL，环丙沙星的检测限为0.2ng/mL，呋喃它酮的检测限为0.1ng/mL，氯霉素的检测限为0.05ng/mL，林可霉素的检测限为0.2ng/mL，三聚氰胺的检测限为5ng/mL，黄曲霉毒素M1的检测限为0.2ng/mL，T-2毒素的检测限为20ng/mL，玉米赤霉烯酮的检测限为10ng/mL，伏马毒素的检测限为2.5ng/mL；该方法精密度较高：孔间CV值低于12%，孔内CV值低于8%。
本实施例对利用该方法对牛奶样品中卡那霉素、头孢氨苄、庆大霉素、磺胺二甲基嘧啶、四环素、红霉素、环丙沙星、呋喃它酮、氯霉素、林可霉素、三聚氰胺、黄曲霉毒素M1、T-2毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素等物质的含量检测方法准确度、精密度等进行了考察，结果如下表：
表1牛奶样品中各物质的含量检测方法验证结果
Figure BDA00003284238700121
以上结果说明本发明提供的生物芯片及方法适于实际样品的检测，利用该生物芯片及方法也可检测其他动物源性食品，包括牛奶、奶粉、奶酪、饲料、尿液、动物组织（如猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝或鸡肝等）、血清、蜂蜜、蜂皇浆、鸡蛋和水产品（如鱼或虾等）。下面选择几种有代表性动物源性食品的作出进一步说明。
实施例2
同时定量检测猪肉中庆大霉素、四环素、土霉素、金霉素、克拉霉素、磺胺嘧啶、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、苏丹红、单端孢霉毒素、呕吐毒素的含量。
检测步骤如下：
（1）生物芯片的制备：以牛血清白蛋白为空白对照，使用生物芯片制备仪（美国BioDot公司）在96孔板上点样制备微阵列芯片，将牛血清白蛋白、庆大霉素、四环素、土霉素、金霉素、克拉霉素、磺胺嘧啶、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、苏丹红、单端孢霉毒素、呕吐毒素抗原在96孔板上点样操作，20℃水浴中固定4h，在96孔板上形成微阵列结构，不同位置的阵列点对应不同的抗原；
（2）待测样品溶液的制备：取粉碎猪肉样品5g，加入8mL缓冲液，混合5min，置50℃水浴下放置30min，离心10min，取50μL上清液，加入450μL缓冲液混匀，取50μL即得待测样品溶液；
（3）在96孔板的部分反应孔内分别加入10μL含不同浓度梯度的游离庆大霉素、四环素、土霉素、金霉素、克拉霉素、磺胺嘧啶、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、苏丹红、单端孢霉毒素、呕吐毒素的混合标准溶液，在剩余的反应孔内分别加入10μL待测样品溶液，向所述已经加入了混合标准溶液或样品溶液的反应孔内继续加入10μL所述庆大霉素、四环素、土霉素、金霉素、克拉霉素、磺胺嘧啶、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、苏丹红、单端孢霉毒素、呕吐毒素对应的单克隆抗体混合溶液以及10μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，在20℃水浴反应20min，然后磷酸缓冲液洗涤；
（4）在每个反应孔内继续加入10μL显色剂及其底物，显色剂为纳米银及其底物体积比为（1:1）氯金酸/氢醌体系，现配现用，显色反应5min后，终止反应；
（5）用CCD进行图像采集，根据庆大霉素、四环素、土霉素、金霉素、克拉霉素、磺胺嘧啶、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、苏丹红、单端孢霉毒素、呕吐毒素相应包被抗原位置的阵列灰度值信号，利用外标曲线法定量检测样品中庆大霉素、四环素、土霉素、金霉素、克拉霉素、磺胺嘧啶、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、苏丹红、单端孢霉毒素、呕吐毒素等物质的含量。
实施例3
同时定量检测虾肉中青霉素、链霉素、土霉素、金霉素、克拉霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、诺氟沙星、氧氟沙星、呋喃唑酮、甲砜霉素、孔雀石绿、黄曲霉毒素的含量。
（1）生物芯片的制备：以牛血清白蛋白为空白对照，使用生物芯片制备仪（美国BioDot公司）在96孔板上点样制备微阵列芯片，将牛血清白蛋白、青霉素、链霉素、土霉素、金霉素、克拉霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、诺氟沙星、氧氟沙星、呋喃唑酮、甲砜霉素、孔雀石绿、黄曲霉毒素抗原在96孔板上点样操作，30℃水浴中固定2h，在96孔板上形成微阵列结构，不同位置的阵列点对应不同的抗原；
（2）待测样品溶液的制备：取粉碎虾肉样品5g，加入8mL缓冲液，混合2min，置50℃水浴下放置10min，离心5min，取50μL上清液，加入450μL缓冲液混匀，取500μL即得待测样品溶液；
（3）在96孔板的部分反应孔内分别加入200μL含不同浓度梯度的游离青霉素、链霉素、土霉素、金霉素、克拉霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、诺氟沙星、氧氟沙星、呋喃唑酮、甲砜霉素、孔雀石绿、黄曲霉毒素的混合标准溶液，在剩余的反应孔内分别加入200μL待测样品溶液，向所述已经加入了混合标准溶液或样品溶液的的反应孔内继续加入200μL所述青霉素、链霉素、土霉素、金霉素、克拉霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、诺氟沙星、氧氟沙星、呋喃唑酮、甲砜霉素、孔雀石绿、黄曲霉毒素对应的单克隆抗体混合溶液以及200μL碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG，在30℃水浴反应10min，然后Tris缓冲液洗涤；
（4）在每个反应孔内继续加入100μL显色剂及其底物，显色剂为辣根过氧化物酶及其底物体积比为（1:1）邻苯二胺/过氧化氢体系，现配现用，显色反应5min后，终止反应；
（5）用CCD进行图像采集，根据青霉素、链霉素、土霉素、金霉素、克拉霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、诺氟沙星、氧氟沙星、呋喃唑酮、甲砜霉素、孔雀石绿、黄曲霉毒素相应包被抗原位置的阵列灰度值信号，利用外标曲线法定量检测样品中青霉素、链霉素、土霉素、金霉素、克拉霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、诺氟沙星、氧氟沙星、呋喃唑酮、甲砜霉素、孔雀石绿、黄曲霉毒素等物质的含量。
实施例4
同时定量检测血清中青霉素、头孢氨苄、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、新霉素、四环素、土霉素、金霉素、多西环素、红霉素、克拉霉素、罗红霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺多辛、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、加替沙星、司帕沙星、莫西沙星、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林、氯霉素、甲砜霉素、克林霉素和林可霉素的含量。
（1）生物芯片的制备：以牛血清白蛋白为空白对照，使用生物芯片制备仪（美国BioDot公司）在96孔板上点样制备微阵列芯片，将牛血清白蛋白、青霉素、头孢氨苄、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、新霉素、四环素、土霉素、金霉素、多西环素、红霉素、克拉霉素、罗红霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺多辛、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、加替沙星、司帕沙星、莫西沙星、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林、氯霉素、甲砜霉素、克林霉素和林可霉素抗原在96孔板上点样操作，37℃水浴中固定0.5h，在96孔板上形成微阵列结构，不同位置的阵列点对应不同的抗原；也可采用384孔板、透明高聚物片基、膜或玻片代替96孔板作为芯片载体；
（2）待测样品溶液的制备：取1mL血清样品于10mL EP管中，用PBS缓冲液（0.1M，pH7.4）稀释100倍，即为待测样品溶液；
（3）在96孔板的部分反应孔内分别加入50μL含不同浓度梯度的游离青霉素、头孢氨苄、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、新霉素、四环素、土霉素、金霉素、多西环素、红霉素、克拉霉素、罗红霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺多辛、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、加替沙星、司帕沙星、莫西沙星、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林、氯霉素、甲砜霉素、克林霉素和林可霉素的混合标准溶液，在剩余的反应孔内分别加入50μL待测样品溶液，向所述已经加入了混合标准溶液或样品溶液的的反应孔内继续加入50μL所述青霉素、头孢氨苄、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、新霉素、四环素、土霉素、金霉素、多西环素、红霉素、克拉霉素、罗红霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺多辛、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、加替沙星、司帕沙星、莫西沙星、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林、氯霉素、甲砜霉素、克林霉素和林可霉素对应的单克隆抗体混合溶液以及25μL纳米金颗粒标记的羊抗鼠IgG，在37℃水浴反应20min，然后PBST洗涤；
（4）在每个反应孔内继续加入50μL显色剂及其底物，显色剂为辣根过氧化物酶及其底物体积比为1:1四甲基联苯胺/过氧化氢体系，现配现用，显色反应5min后，终止反应；
（5）用CCD进行图像采集，根据青霉素、头孢氨苄、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、新霉素、四环素、土霉素、金霉素、多西环素、红霉素、克拉霉素、罗红霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺多辛、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、加替沙星、司帕沙星、莫西沙星、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林、氯霉素、甲砜霉素、克林霉素和林可霉素相应包被抗原位置的阵列灰度值信号，利用外标曲线法定量检测样品中青霉素、头孢氨苄、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、新霉素、四环素、土霉素、金霉素、多西环素、红霉素、克拉霉素、罗红霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺多辛、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、加替沙星、司帕沙星、莫西沙星、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林、氯霉素、甲砜霉素、克林霉素和林可霉素等物质的含量。
实施例5
同时定量检测蜂蜜中新霉素、多西环素、罗红霉素、磺胺甲噁唑、磺胺多辛、加替沙星、司帕沙星、呋喃妥因、克林霉素、肉毒毒素的含量。
（1）生物芯片的制备：以牛血清白蛋白为空白对照，使用生物芯片制备仪（美国BioDot公司）在96孔板上点样制备微阵列芯片，将牛血清白蛋白、新霉素、多西环素、罗红霉素、磺胺甲噁唑、磺胺多辛、加替沙星、司帕沙星、呋喃妥因、克林霉素、肉毒毒素抗原在96孔板上点样操作，37℃水浴中固定0.5h，在96孔板上形成微阵列结构，不同位置的阵列点对应不同的抗原；也可采用384孔板、透明高聚物片基、膜或玻片代替96孔板作为芯片载体；
（2）待测样品溶液的制备：取50μL蜂蜜样品于10mL EP管中，用PBS缓冲液（0.1M，pH7.4）稀释50倍，即为待测样品溶液；
（3）在96孔板的部分反应孔内分别加入50μL含不同浓度梯度的游离新霉素、多西环素、罗红霉素、磺胺甲噁唑、磺胺多辛、加替沙星、司帕沙星、呋喃妥因、克林霉素、肉毒毒素的混合标准溶液，在剩余的反应孔内分别加入50μL待测样品溶液，向所述已经加入了混合标准溶液或样品溶液的的反应孔内继续加入50μL所述新霉素、多西环素、罗红霉素、磺胺甲噁唑、磺胺多辛、加替沙星、司帕沙星、呋喃妥因、克林霉素、肉毒毒素对应的单克隆抗体混合溶液以及25μL纳米银标记的羊抗鼠IgG，在37℃水浴反应20min，然后PBST洗涤；
（4）在每个反应孔内继续加入50μL显色剂及其底物，显色剂为碱性磷酸酶及其底物体积比为1:1BCIP/NBT体系，现配现用，显色反应5min后，终止反应；
（5）用CCD进行图像采集，根据新霉素、多西环素、罗红霉素、磺胺甲噁唑、磺胺多辛、加替沙星、司帕沙星、呋喃妥因、克林霉素、肉毒毒素相应包被抗原位置的阵列灰度值信号，利用外标曲线法定量检测样品中新霉素、多西环素、罗红霉素、磺胺甲噁唑、磺胺多辛、加替沙星、司帕沙星、呋喃妥因、克林霉素、肉毒毒素等物质的含量。
实施例6
同时定量检测饲料中赭曲霉毒素、杂色曲霉素、桔青毒素、展青毒素、黄曲霉毒素M1、M2、B1、B2、G1和G2的含量。
检测步骤如下：
（1）生物芯片的制备：以牛血清白蛋白为空白对照，使用生物芯片制备仪（美国BioDot公司）在96孔板上点样制备微阵列芯片，将牛血清白蛋白、赭曲霉毒素、杂色曲霉素、桔青毒素、展青毒素、黄曲霉毒素M1、M2、B1、B2、G1和G2抗原在96孔板上点样操作，20℃水浴中固定4h，在96孔板上形成微阵列结构，不同位置的阵列点对应不同的抗原；
（2）待测样品溶液的制备：取粉碎饲料样品5g，加入8mL缓冲液，混合4min，置50℃水浴下放置20min，离心8min，取50μL上清液，加入450μL缓冲液混匀，取200μL即得待测样品溶液；
（3）在96孔板的部分反应孔内分别加入200μL含不同浓度梯度的游离赭曲霉毒素、杂色曲霉素、桔青毒素、展青毒素、黄曲霉毒素M1、M2、B1、B2、G1和G2的混合标准溶液，在剩余的反应孔内分别加入200μL待测样品溶液，向所述已经加入了混合标准溶液或样品溶液的的反应孔内继续加入200μL所述赭曲霉毒素、杂色曲霉素、桔青毒素、展青毒素、黄曲霉毒素M1、M2、B1、B2、G1和G2对应的单克隆抗体混合溶液以及200μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，在20℃水浴反应20min，然后磷酸缓冲液洗涤；
（4）在每个反应孔内继续加入10μL纳米显色剂及其底物，显色剂为纳米金及其底物体积比1:1的0.4M的HAuCl4和0.1M的单宁酸，现配现用，显色反应2min后，终止反应；
（5）用CCD进行图像采集，根据赭曲霉毒素、杂色曲霉素、桔青毒素、展青毒素、黄曲霉毒素M1、M2、B1、B2、G1或G2相应包被抗原位置的阵列灰度值信号，利用外标曲线法定量检测样品中黄曲霉毒素M1、M2、B1、B2、G1或G2等物质的含量。
实施例7
同时定量检测牛肉中庆大霉素、四环素、土霉素、金霉素、克拉霉素、丁烯酸内酯的含量，与实施例2相同。

Claims (10)

1.一种同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的生物芯片，其特征在于：所述生物芯片包括固定有一组检测目标物抗原的芯片载体，所述检测目标物为抗生素、非法添加剂和生物毒素，所述生物芯片由以下方法制成：以牛血清白蛋白为空白对照，将牛血清白蛋白和检测目标物抗原通过生物芯片制备系统在芯片载体上点样操作后，于20-37℃水浴中固定0.5-4h即得。
2.根据权利要求1所述的一种同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的生物芯片，其特征在于：所述的芯片载体为96孔板、384孔板、透明高聚物片基、膜或玻片。
3.根据权利要求1所述的一种同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的生物芯片，其特征在于：所述的抗生素为β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、四环素类抗生素、大环内酯类抗生素、磺胺类抗生素、喹诺酮类抗生素、硝基呋喃类抗生素和其他抗生素中的任意一种或几种；所述的非法添加剂为三聚氰胺、孔雀石绿、苏丹红中的任意一种或几种；所述的生物毒素为黄曲霉毒素、T-2毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、赭曲霉毒素A、杂色曲毒素、丁烯酸内酯、桔青毒素、展青毒素、单端孢霉毒素、肉毒毒素中的任意一种或几种。
4.根据权利要求3所述的一种同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的生物芯片，其特征在于：所述的β-内酰胺类抗生素包括青霉素类抗生素和头孢类抗生素；所述的氨基糖苷类抗生素包括庆大霉素、卡那霉素、链霉素和新霉素；所述的四环素类抗生素包括四环素、土霉素、金霉素和多西环素；所述的大环内酯类抗生素包括红霉素、克拉霉素和罗红霉素；所述的磺胺类抗生素包括磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺多辛；所述的喹诺酮类抗生素包括诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、加替沙星、司帕沙星和莫西沙星；所述的硝基呋喃类抗生素包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林；所述的其他抗生素包括氯霉素、甲砜霉素、克林霉素和林可霉素。
5.根据权利要求3所述的一种同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的生物芯片，其特征在于：所述的黄曲霉毒素为黄曲霉毒素M1、M2、B1、B2、G1或G2。
6.一种同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)在生物芯片的部分反应孔内分别加入含有不同浓度梯度的检测目标物的混合标准溶液，在剩余反应孔内分别加入待测样品溶液，继续向所有反应孔中依次加入检测目标物所对应的单克隆抗体和标记的羊抗鼠IgG，于20～37℃水浴中反应10～20min，洗涤液洗涤；
(2)所有反应孔内继续加入显色剂，显色反应2～5min后，终止反应；
(3)使用CCD进行图像采集，根据检测目标物包被抗原的灰度值以及标准溶液的浓度对数制作标准曲线，采用外标曲线法定量，分别计算样品溶液中检测目标物的含量。
7.根据权利要求6所述的一种同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的方法，其特征在于：所述的待测样品为动物源性食品，包括牛奶、奶粉、奶酪、饲料、尿液、动物组织、血清、蜂蜜、蜂皇浆、鸡蛋和水产品。
8.根据权利要求6所述的一种同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的方法，其特征在于：待测样品溶液的制备方法为：当待测样品为液体时，取50μL～1mL于10mL EP管中，用缓冲液稀释10～100倍即得待测样品溶液；当待测样品为固体时，取粉碎样品5g，加入8mL缓冲液，混合2～5min，置50℃水浴下放置10～30min，离心5～10min，取50μL上清液，加入450μL缓冲液混匀，取50μL～500μL即得待测样品溶液。
9.根据权利要求6所述的一种同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述检测目标物的混合标准溶液加入体积为10～200μL；所述待测样品溶液的加入体积与游离抗生素的标准溶液的加入体积相同；每个反应孔内加入的单克隆抗体的量10～200μL；每个反应孔内加入的标记的羊抗鼠IgG的量10～200μL；不同反应孔内加入的单克隆抗体的量相同，不同反应孔内加入的标记的羊抗鼠IgG的量相同；所述的标记的羊抗鼠IgG为纳米材料或者生物酶标记的羊抗鼠IgG，所述的洗涤液为磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液。
10.根据权利要求6所述的一种同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的显色剂为生物催化剂及其底物或者化学催化剂及其底物，显色剂的加入体积为10～100μL。
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