CN108519480A - 一种基于智能手机的兽药多残留免疫检测系统及检测方法 - Google Patents

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孙远明
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张东升
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Abstract

本发明公开了一种基于智能手机的兽药多残留（莱克多巴胺、β2‑兴奋剂、氯霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺）免疫检测系统，包括检测兽药多残留的免疫芯片、图像采集装置和安装有检测APP的移动设备；所述检测APP可采集免疫芯片显色图像并读取图像灰度值，检测APP采集免疫芯片显色图像的操作在图像采集装置中完成；所述检测APP中设定有免疫芯片显色图像灰度值与兽药残留标准含量之间的标准曲线。检测时，用免疫芯片检测目标待测物，待免疫芯片显色稳定后，利用图像采集装置，用检测APP采集免疫芯片的显色图像读取灰度值，从而分析出待测物含量，检测结果直接显示在移动设备屏幕上，从而实现现场快速检测多种兽药残留。

Description

一种基于智能手机的兽药多残留免疫检测系统及检测方法
技术领域
本发明涉及食品安全技术领域，更具体地，涉及一种基于智能手机的兽药多残留免疫检测系统及检测方法。
背景技术
兽药残留是影响食品安全的一个重要因素，其在动物源性食品中的残留严重的危害了消费者的身心健康，引起了人们的广泛关注。根据联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)兽药残留联合立法委员会的定义，兽药残留是指用药后蓄积或存留于畜禽机体或产品(如鸡蛋、奶品、肉品等)原形药物或其代谢物，包括与兽药有关的杂质的残留。动物在使用药物以后，药物以原型或代谢产物的方式通过粪便、尿液等排泄物进入生态环境，造成环境土壤、表层水体、植物和动物等的兽药蓄积或残留即兽药在生态环境中的残留，也属于兽药残留的范畴。兽药种类繁多，分类方式不一。国际食品添加剂联合专家委员会(JECFA)于1987年第32次会议报告了有关兽药残留的毒性评价，将目前残留毒理意义上比较重要的兽药按用途分为7类，分别为抗微生物类，驱肠虫类，生长促进剂类，抗原虫类，抗锥虫类，镇静剂类和β-肾上腺素能受体阻断剂类等，其中抗微生物类药物包括抗生素类和化学合成类抗菌药物。我国农业部2002年颁布的235号公告中根据最高残留限量(MRL)要求将兽药分为4大类，分别为允许使用且不需要制定MRL的药物(87种)、允许使用且已制定MRL的药物(96种)、允许作治疗使用但不得在动物性食品中检出的药物(9种)和禁止使用且在动物性食品中不得检出的药物(30种)。兽药的应用往往是多类兽药同时利用，不可能仅用一类兽药而且随着目前兽药的种类越来越多，每次只检测一种或一类残留的方法，显然已落后，建立一种快速简便的多类残留同时检测的方法迫在眉睫。
免疫芯片技术是近年来发展起来用于检测小分子物质的一种酶免疫检测技术，近几年有着突飞猛进的发展，在各个领域引起广泛的关注。它是将抗原或抗体包被在硝酸纤维素膜、PVDF膜等固相载体上，通过特异性免疫反应捕获样品中的目的蛋白，然后经过检测系统对标记物质信号强弱进行检测，来判定样品中靶分子的含量。抗原抗体反应采用浸泡的方式，保证了反应的充分性，避免了酶标板中每孔加液的繁琐步骤。免疫芯片置于一个反应容器中，实现了在一个反应孔中进行多种待测物的同步分析，即多元检测。其具有的高灵敏度、高通量、快速简便、低成本的优点在食品安全检测领域具有较大的发展前景，成为高通量检测技术的主体。目前，还未见有针对多种兽药残留的免疫芯片。
另外，免疫芯片通过形成抗原阵列，应用一种标记物实现了多种物质的同时检测，但图像的获取和信号处理依赖于扫描仪和计算机，仍不能满足现场检测的要求。智能手机与人们的生活密切相关，携带方便，操作灵活，能够处理数据，其强大的图像获取功能及图像处理软件APP的开发与免疫芯片检测体系结合，在食品安全现场快速筛查中具有极大的应用潜力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足和缺陷，提供一种基于智能手机平台的快速检测兽药多残留(莱克多巴胺、β2-兴奋剂、氯霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺)的免疫分析方法。通过将智能手机与免疫芯片结合作为检测工具运用到兽药多残留的的检测中，简单方便而且准确迅速，在现场就可以得到检测结果，具有十分广阔的应用前景。
本发明的第一个目的是提供一种检测兽药多残留的免疫芯片。
本发明的第二个目的是提供一种基于智能手机的兽药多残留免疫检测系统。
本发明的第三个目的是提供一种利用上述系统快速检测兽药多残留的免疫分析方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种检测兽药多残留的免疫芯片，包括固相载体，所述固相载体上分布有检测区、质控区和对照区组成的点阵列；所述检测区包括莱克多巴胺、β2-兴奋剂、氯霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺四种兽药残留包被抗原检测点；所述莱克多巴胺包被抗原的工作浓度为20mg/mL，β2-兴奋剂包被抗原的工作浓度为12.5mg/mL，氯霉素包被抗原的工作浓度为8.1mg/mL，氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺包被抗原的工作浓度为1mg/mL。
本发明所述免疫芯片采用竞争法进行兽药残留检测，通过将四种兽药残留的混合抗体溶液与待测样品等体积混合后与免疫芯片上包被的抗原反应，再加入酶标记的二抗，进行显色反应。
优选地，所述固相载体为硝酸纤维素膜或PVDF膜。
优选地，所述质控区的质控点为驴抗兔IgG。
优选地，所述免疫芯片还包括卡壳，所述卡壳用于装载固相载体，从而构成芯片反应盒。
优选地，所述兽药多残留免疫芯片的制备方法为：以硝酸纤维素膜为固相载体，将稀释到最佳工作浓度的莱克多巴胺、β2-兴奋剂、氯霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺四种兽药残留包被抗原及质控点点样在硝酸纤维素膜上，然后放置37℃恒温水浴箱孵育60min，洗涤液洗涤后，用封闭液封闭未结合区域，反应30分钟后再用洗涤液洗涤晾干，得到兽药多残留的免疫芯片。
本发明还请求保护上述免疫芯片在制备兽药多残留免疫芯片检测系统和/或基于智能手机的兽药多残留免疫检测系统中的应用。
本发明还提供一种兽药多残留免疫芯片检测系统，包括上述免疫芯片，兽药多残留的混合抗体溶液，HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠混合二抗溶液和显色液；所述兽药多残留的混合抗体溶液中莱克多巴胺抗体的工作浓度为0.22μg/mL，β2-兴奋剂抗体的工作浓度为0.15μg/mL，氯霉素抗体的工作浓度为0.022μg/mL，氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺抗体的工作浓度为0.025μg/mL。
一种基于智能手机的兽药多残留免疫检测系统，包括上述检测兽药多残留的免疫芯片与移动检测设备；所述移动检测设备具有采集免疫芯片显色图像并读取图像灰度值的功能；所述移动检测设备中设定有免疫芯片显色图像灰度值差与兽药残留标准含量之间的标准曲线。
优选地，所述检测系统还包括图像采集装置，所述图像采集装置记载在发明人前期的专利CN 107091838A中，用于移动检测设备更好的采集图像。
优选地，所述移动检测设备为带有摄像功能的智能手机。
一种利用上述检测系统快速检测兽药多残留的免疫分析方法，先将莱克多巴胺、β2-兴奋剂、氯霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺的抗体等体积混合，得混合抗体溶液；然后将待测样品液与抗体混合溶液等体积混合，得样品/抗体混合液；接着将上述兽药多残留免疫芯片与样品/抗体混合液反应，再弃去反应液，经洗涤后加入HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠混合二抗溶液反应，再弃去反应液，经洗涤后在免疫芯片上滴加紫色沉淀型显色液，稳定显色后，用移动检测设备记录免疫芯片显色图像并读取前后的图像灰度值差ΔI，通过移动检测设备中设定的显色图像灰度值差与兽药残留标准含量之间的标准曲线计算待测样品中兽药残留含量。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明制备的免疫芯片既可以肉眼定性分析也可以通过移动设备上的APP定量判断，而且可同时检测多种兽药残留具有成本低、操作简便、高通量、检测结果即时显现的优点。
(2)本发明首次建立了基于手机平台与膜芯片显色的同时快速检测四种兽药残留的系统，在用于现场实际样品的检测中，与传统检测兽药残留的方法相比，具有成本低、简单方便和即时得到结果的优点。
(3)本发明与ELISA方法相比，ELISA需要专业的操作人员，只能应对兽药单残留的检测，而且整个检测过程耗时长(90min)，且需要专业的洗板机和酶标仪等设备。本发明无需专业的人员操作和专业的仪器设备，可实现四种兽药残留的同时检测，整个检测过程仅需30min，简单快速方便。
(4)本发明与胶体金方法相比，胶体金试纸条的灵敏度不够，而且通常是通过肉眼来判断检测结果，能够实现定量检测的比较少。本发明不仅可以通过肉眼来定性判断，而且与智能手机结合，通过智能手机高速的分析处理和高清的图像采集能力来实现对检测对象的定量检测。
(5)国家尚未制定对同一样品在短时间内快速检测兽药多残留的标准，每次只检测一种或一类残留的方法给质监部门带来巨大的检测压力。本发明可同时针对四种兽药残留展开定量检测，能够在一定程度上缓解快检部门压力，满足市场需要。
附图说明
图1为单一检测对象免疫芯片设计图。
图2为四种兽药残留抗原的工作浓度梯度；A为莱克多巴胺抗原工作浓度梯度；B为β2-兴奋剂抗原工作浓度梯度；C为氯霉素抗原工作浓度梯度；D为氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺抗原工作浓度梯度，其中用框标注的为最佳工作浓度。
图3为四种兽药残留抗体的最佳工作浓度及灵敏度；A-1、2分别为莱克多巴胺抗体工作浓度及灵敏度优化；B-1、2分别为β2-兴奋剂抗体工作浓度及灵敏度优化；C-1、2分别为氯霉素抗体工作浓度及灵敏度优化；D-1、2分别为氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺抗体工作浓度及灵敏度优化；其中用框标注的为抗体的最佳工作浓度及灵敏度。
图4为多残留检测免疫芯片设计图。
图5为四种兽药残留的标准曲线。
图6为兽药多残留检测免疫芯片设计图。
图7位免疫芯片与其卡壳的组装图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
莱克多巴胺、β2-兴奋剂、氯霉素抗原均购自广州优抗多生物技术有限公司；氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺抗原为发明人实验室自制，发表在前期专利201711489726.6中。
莱克多巴胺、β2-兴奋剂、氯霉素抗体均购自广州优抗多生物技术有限公司；氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺抗体是实验室自制，发表在前期专利201711489726.6中。
羊抗鼠和羊抗兔购自广州优抗多生物有限公司；缓冲液、封闭液购自广州万联生物公司科技有限公司；显色剂为单组份紫色沉淀型TMB显色液，购自湖州英创生物生物科技有限公司，货号为EL0001。
实施例1
一种基于智能手机的兽药多残留免疫检测系统，所述检测系统的构建方法，按照如下步骤进行：
(1)确定四种兽药残留抗原的最佳工作浓度
将四种兽药残留的抗原的工作浓度分别设定不同的浓度梯度，并设置三个对照，按照芯片设计图(图1)依次点样到芯片上，制备成免疫芯片，分别与四种兽药残留的抗体进行竞争结合免疫反应，得到四种兽药残留抗原的最佳工作浓度和抗体较优的工作浓度，通过扫描仪记录结果，用Adobe Photoshop CC2015读取显色图像灰度值。其结果如图2所示，莱克多巴胺、β2-兴奋剂、氯霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺四种兽药残留包被抗原的最佳工作浓度分别为稀释1000、500、2500、100倍。使莱克多巴胺抗原浓度为20μg/mL；β2-兴奋剂抗原浓度为25μg/mL；氯霉素抗原浓度为3.2μg/mL；氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺抗原浓度为10μg/mL。
(2)确定四种兽药残留抗体的最佳工作浓度及灵敏度
按照上述结果分别配置四种兽药残留抗原的最佳工作浓度溶液，同样按照步骤(1)的芯片设计图依次点样至芯片上。再与配置的四种兽药残留抗体较优的工作浓度溶液和每种兽药残留标准品溶液进行免疫反应。用扫描仪记录结果，用Adobe PhotoshopCC2015读取显色图像灰度值，得到四种兽药残留的抗体最佳工作浓度以及每种兽药残留的检测灵敏度。其结果如图3所示，莱克多巴胺的最佳抗体工作浓度为稀释3w倍；β2-兴奋剂的最佳抗体工作浓度为稀释4w倍；氯霉素的最佳抗体工作浓度为稀释30w倍；氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺的最佳抗体工作浓度为稀释20w倍。使莱克多巴胺抗体的工作浓度为6.5mg/mL，β2-兴奋剂抗体的工作浓度为5.9mg/mL，氯霉素抗体的工作浓度为6.7mg/mL，氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺抗体的工作浓度为5.0mg/mL。
莱克多巴胺灵检测灵敏度为2ppb；β2-兴奋剂灵检测敏度为2ppb；氯霉素检测灵敏度为0.5ppb；氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺检测灵敏度为50ppb。
(3)制备兽药多残留免疫芯片
先分别将莱克多巴胺、β2-兴奋剂、氯霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺四种兽药残留包被抗原依次稀释1000、500、2500、100倍至最佳工作浓度，作为制作免疫芯片的点样液。然后将这四种点样液按照点样设计图依次点样至裁剪好的硝酸纤维素膜上，每点的点样量为1μl。将膜转移至实验室自制的芯片反应盒内后放置37℃恒温水浴箱孵育60min，然后用PBST洗涤两次、双蒸水洗涤一次后，用封闭液封闭未结合区域，反应30分钟后再用PBST洗涤两次、双蒸水洗涤一次，得到兽药多残留的免疫芯片。
(4)建立兽药多残留免疫芯片的标准曲线
首先配制好不同浓度的莱克多巴胺、β2-兴奋剂、氯霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺混合标准溶液和空白对照。然后按照各自最佳工作浓度配置好莱克多巴胺、β2-兴奋剂、氯霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺等体积混合抗体溶液。将混合标准溶液与混合抗体溶液按照1:1的比例依次加到芯片反应盒内。反应15min后，小心弃去反应盒中的液体后用PBST洗涤两次，双蒸水洗涤两次。再向每个反应盒中加入400倍和800倍稀释的HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠混合二抗溶液。反应15min后，小心弃去反应盒中的液体后用PBST洗涤两次，双蒸水洗涤两次。然后在每张芯片上滴加200μl紫色沉淀型显色液，显色3-4min后，用滤纸将表面液体吸干，记录芯片的显示图像，用Photoshop对所得图片进行数据处理，读取显色图像和芯片公开区域的灰度值，建立显色图像灰度值差(ΔI)与兽药残留标准含量之间的标准曲线，从而得到在一张芯片上同时检测四种兽药残留的标准曲线。
上述莱克多巴胺的标准浓度为0、0.25、0.5、1、2、4ng/ml；β2-兴奋剂的标准浓度为0、0.25、0.5、1、2、4ng/ml；氯霉素的标准浓度为0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1ng/ml；氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺的标准浓度为0、6.25、12.5、25、50、100ng/ml。
上述莱克多巴胺的最佳抗体工作浓度为稀释3w倍；β2-兴奋剂的最佳抗体工作浓度为稀释4w倍；氯霉素的最佳抗体工作浓度为稀释30w倍；氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺的最佳抗体工作浓度为稀释20w倍。
所述免疫芯片的图像灰度值差(ΔI)与兽药残留标准含量之间的标准曲线如图5所示。四种兽药残留的标准曲线已经通过多次实验得到确认，曲线方程均是ΔI与待测物含量成正比例的一次线性方程，标准曲线可以写进计算机程序中。
(5)将四种兽药残留的标准曲线写入到手机APP程序中
将上述所得的标准曲线写入到具体的兽药残留计算程序中。
(6)手机对图片颜色信号读取及转化的实现
采集具体对象的反应显色图片之后，利用手机APP程序中设定的程序将彩色图片转化为灰度图片。每检测一张膜芯片需先读取空白区域的灰度值I0，紧接着对相应对象检测的时候分别记录其灰度值In。针对每个检测样品，本发明采用灰度值差(ΔI)来表示检测卡显色后的颜色深浅信号的强弱，其计算公式为ΔI＝In-I0。
(7)添加回收试验
选取在检测范围内的三个浓度进行添加回收试验，经过样品前处理之后，并用本发明方法研制的兽药多残留免疫芯片对猪尿样品进行检测。
检测步骤：先将四种兽药多残留抗体混合，得混合抗体溶液；然后将待测样品液与抗体混合溶液等体积混合，得样品/抗体混合液；接着将兽药多残留免疫芯片浸泡在样品/抗体混合液中，反应15min后，小心弃去反应液后用PBST洗涤两次，双蒸水洗涤两次。再加入400倍和800倍稀释的HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠混合二抗溶液，反应15min后，小心弃去反应液后用PBST洗涤两次，双蒸水洗涤两次；然后在每张芯片上滴加200ul紫色沉淀型显色液，显色3-4min后，用手机记录免疫芯片显色图像并读取前后的图像灰度值差ΔI，通过APP中设定的显色图像灰度值差与兽药残留标准含量之间的标准曲线计算待测样品兽药残留含量。
结果如表1所示，各种样品批内回收率为70.40％～138.67％，变异系数为3.81％～33.35％，批间回收率为71.02％～137.60％，变异系数为4.54％～32.27％。各个样品回收率的变异系数均小于35％，说明该方法具有较好的准确性。
表1不同样品添加回收实验结果
(8)为了评价上述实施例建立的基于智能手机免疫芯片法检测样品中兽药残留含量的实用性与准确性，本实施例分别采用所建立起来基于智能手机免疫芯片法与Elisa方法和胶体金检测卡法对采集来的样品做了对比实验，其结果如表2所示：本发明建立的基于智能手机免疫芯片法与Elisa方法和胶体金检测卡法结果相近，结果可信度高，可用于实际检测。
表2基于智能手机免疫芯片法与Elisa法和胶体金法检测结果比较
“-”代表阴性；“+”代表阳性。

Claims (7)

1. 一种检测兽药多残留的免疫芯片，其特征在于，包括固相载体，所述固相载体上分布有检测区、质控区和对照区组成的点阵列；所述检测区包括莱克多巴胺、β2-兴奋剂、氯霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺四种兽药残留包被抗原检测点；所述莱克多巴胺包被抗原的工作浓度为20 mg/mL，β2-兴奋剂包被抗原的工作浓度为12.5 mg/mL，氯霉素包被抗原的工作浓度为8.1 mg/mL，氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺包被抗原的工作浓度为1 mg/mL。
2.根据权利要求1所述的免疫芯片，其特征在于，所述固相载体为硝酸纤维素膜。
3.根据权利要求1所述的免疫芯片，其特征在于，还包括装载固相载体的卡壳。
4.权利要求1～3任一项所述免疫芯片在制备兽药多残留免疫芯片检测系统和/或基于智能手机的兽药多残留免疫检测系统中的应用。
5. 一种兽药多残留免疫芯片检测系统，其特征在于，包括权利要求1所述免疫芯片，兽药多残留的混合抗体溶液，HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠混合二抗溶液和显色液；所述兽药多残留的混合抗体溶液中莱克多巴胺抗体的工作浓度为6.5 mg/mL，β2-兴奋剂抗体的工作浓度为5.9 mg/mL，氯霉素抗体的工作浓度为6.7 mg/mL，氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺抗体的工作浓度为5.0 mg/mL。
6.一种基于智能手机的兽药多残留免疫检测系统，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述检测兽药多残留的免疫芯片与移动检测设备；所述移动检测设备具有采集免疫芯片显色图像并读取图像灰度值的功能；所述移动检测设备中设定有免疫芯片显色图像灰度值差与兽药残留标准含量之间的标准曲线。
7.一种利用权利要求6所述检测系统快速检测兽药多残留的免疫分析方法，其特征在于，先将莱克多巴胺、β2-兴奋剂、氯霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺的抗体等体积混合，得混合抗体溶液；然后将待测样品液与抗体混合溶液等体积混合，得样品/抗体混合液；接着将权利要求1～3任一项所述兽药多残留免疫芯片与样品/抗体混合液反应，再弃去反应液，经洗涤后加入HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠混合二抗溶液反应，再弃去反应液，经洗涤后在免疫芯片上滴加紫色沉淀型显色液，稳定显色后，用移动检测设备记录免疫芯片显色图像并读取前后的图像灰度值差ΔI，通过移动检测设备中设定的显色图像灰度值差与兽药残留标准含量之间的标准曲线计算待测样品中兽药残留含量。
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