CN111189822A - 目标响应式水凝胶与智能手机集成的有机磷农药现场定量检测平台 - Google Patents
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Abstract
一种基于目标响应式水凝胶与智能手机集成的有机磷农药现场定量检测平台,属于生物传感器技术领域。载体为具备目标响应的水凝胶材料,其具有类似氧化酶活性的MnO2NFs,可使无色的3,3’,5‑,5’‑四甲基联苯胺显色剂氧化成蓝色的oxTMB,同时,H2O2的存在会分解MnO2NFs使其失去类酶活性。有机磷农药(对氧磷)作为AChE的抑制剂可抑制AChE催化乙酰胆碱生成H2O2,减少MnO2NFs的分解,从而刺激试剂盒的颜色响应,进一步结合智能手机实现对试剂盒图像数据的采集及分析。本发明能够快速对OPs进行现场手持化检测,其具有操作简便、灵敏度高、成本低廉等优势,为食品安全和人类健康的便携式监测提供了新的视角。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域,具体涉及一种基于目标响应式水凝胶与智能手机集成的有机磷农药现场定量检测平台。
背景技术
有机磷农药(OPs)是保证作物高产的必要物质,根据之前的数据调查,使用农药之后可以保证增加全球三分之一的农作物产量。然而,OPs的滥用和不当的处理使其渗入土壤、大气循环和水循环,导致水果、蔬菜等农作物中的有毒农药残留,进一步对生态系统乃至人类健康造成严重威胁。近年来对OPs的精确跟踪已成为建立正确管理农药、保护食品资源、减少OPs中毒的最令人担忧的挑战之一。因此准确检测OPs的方法应运而生,如高效液相色谱、光学检测和电化学方法等。尽管上述方法具有可接受的特异性和灵敏度,但一些缺点也十分明显,例如需要大型的检测仪器、受专业训练的操作者以及昂贵的生物分子试剂(抗体),使它们不能满足食品相关行业和环境问题的现场量化需求,特别是在紧急情况下。
近年来,研究人员开发用于检测OPs的灵敏、可靠和便携式传感器在探索现场技术方面做出了巨大努力。水凝胶智能手机传感器是即时检验(POCT)识别领域极具吸引力的方式,因其具备操作简便、价格低廉以及便携性等优势。然而,这些现阶段的现场检测仍然仅限于定性或半定量筛查,这些筛查手段对于POCT来说无法满足实际需求。更重要的是,由于信号指示器无法识别待测目标物的细微变化,简单的色度输出使传感器缺乏灵敏度,不适合痕量农药的监测。因此,迫切需要研发以准确和便携的方式构建生物传感器以规避这些限制。目前已多次尝试探索用于制造便携式设备的敏感试剂和新颖的识别元件。值得注意的是,近年来这种便携式设备已成功应用于食品样品中的OPs监测,为食品安全和人类健康的便携式监测提供了新的视角。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中存在的测试时间较长、误差较大、对农药浓度要求较高、测试方法繁琐以及检测灵敏度较低等问题,提供一种基于目标响应式水凝胶与智能手机集成的有机磷农药现场定量检测平台(简称为:试剂盒-智能手机平台),该平台可以简便、快速、高灵敏地检测有机磷农药的活性。
本发明所述的一种基于目标响应式MnO2纳米片(MnO2 NFs)水凝胶与智能手机集成的有机磷农药现场定量检测平台的制备方法,其步骤如下:
(1)首先,将5.0mL、0.25~1.5mg mL-1牛血清白蛋白(BSA)与5.0mL的MnCl2水溶液(MnCl2的浓度为1.0×10-3~5.0×10-3mol L-1)混合,将得到的混合物溶液在室温下连续搅拌1~2.5小时;随后用0.5~1.5mol L-1的NaOH溶液将混合物溶液的pH值调至10.0,再放置2~6小时后得MnO2 NFs并于4.0℃下保存;然后,将海藻酸钠(SA)充分溶解在pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中,海藻酸钠的浓度为15~25mg mL-1;将该将海藻酸钠(SA)溶液快速转移酶标板中,接下来将MnO2 NFs加入到含海藻酸钠(SA)溶液的酶标板中,其中MnO2 NFs和海藻酸钠(SA)的质量比为0.001~6.67:1;充分混合后,立即向上述混合液中滴加浓度为1.0~8.0mgmL-1的CaCl2溶液,从而在酶标板中得到均匀的BSA-MnO2 NFs-SA水凝胶,MnO2 NFs和CaCl2间的质量比为0.001~0.003:1;
(2)将10~30μL、0.0005~3.0μg mL-1对氧磷农药水溶液和10~30μL、4.0~10.0UmL-1乙酰胆碱酯酶水溶液混合后在37℃下孵育10~45分钟,实现对氧磷对乙酰胆碱酯酶活性的抑制;随后,向上述混合液中加入40μL乙酰胆碱和胆碱氧化酶水溶液,其中乙酰胆碱的浓度为10~200mmol L-1,胆碱氧化酶的浓度为1.0~6.0U mL-1,在37℃下孵育15~45分钟后;最后将该反应溶液加入到步骤(1)得到的BSA-MnO2 NFs-SA水凝胶中,从而得到MnO2 NFs水凝胶试剂盒;
(3)向步骤(2)得到的MnO2 NFs水凝胶试剂盒中滴加10~30μL的1.5mmol L-1的TMB显色剂,试剂盒显色反应被触发,可观察到随着农药浓度的增加,试剂盒颜色逐渐由无色变为蓝色,并呈现梯度变化(图1);使用智能手机自制的应用程序(APP)记录该颜色变化;将颜色信息转化为灰度值,建立灰色值与农药浓度对数的关系曲线,从而得到本发明所述的基于目标响应式水凝胶与智能手机集成的有机磷农药现场定量检测平台;再通过测量未知农药浓度的灰度值,由智能手机给出农药浓度的具体数值,从而完成农药浓度的测量。
智能手机自制的应用程序(APP)通过开发工具Android Studio完成设计。主要功能分为:Photo-拍照取样;File-打开样本照片所在目录;Analysis-后台分析灰度值与农药浓度之间的关系;Real sample-预测新的实际样本照片的农药浓度。
主要有如下模块:
Camera Activity:使用Take Picture方法完成拍照,并将照片存入指定文件中。
Data:首先,通过getPixe方法提取样本照片指定位置RGB值。为了减少由于反光、试剂浓度不均导致部分像素点明显与实际情况不符从而影响实验结果,选取以试剂中心为对称中心、相邻点相隔5像素的25个初始点。然后,由这25个初始点的RGB值计算灰度值,并且取中位数,使实验结果更加科学客观,这样就能得到一个试管中试剂的灰度值。RGB值转灰度值为Gray=0.299R+0.587G+0.114B,为了避免低速的浮点运算,加快转换速度,采用整数运算和位运算进行优化Gray=(313524R+615514G+119538B)>>20;最后,重复操作,计算出每个试管中试剂的灰度值。
Fore:根据若干组灰度值和农药浓度,运用回归分析拟合出关系曲线,并且计算出拟合度(R2)。
功能的实现:
Photo:采用Camera Activity模块。
File:通过用户输入的数据得到所需照片的路径,进行访问。
Analysis:采用Data模块得到样本中每个试管中试剂的灰度值,再采用Fore模块得到拟合曲线和R2。
Real sample:采用Photo得到样本照片,通过Data模块得到每个试管中试剂的灰度,再根据Fore模块得到的拟合曲线,预测试剂中的农药浓度。
该应用程序具有内置的图像处理程序,可将相应的图像信息转换为灰度值,建立灰度值与对氧磷浓度的对数呈线性关系,从而得到基于目标响应式MnO2 NFs水凝胶与智能手机集成的有机磷农药现场定量检测平台。
本发明机理如下:
该便携式试剂盒的载体为具备目标响应的水凝胶材料,其具有类似氧化酶活性的MnO2 NFs,可使无色的3,3’,5-,5’-四甲基联苯胺(TMB)显色剂氧化成蓝色的oxTMB。同时,乙酰胆碱(ACh)在乙酰胆碱酯酶(AChE)和胆碱氧化酶(ChO)的作用下会生H2O2,而H2O2的存在会分解MnO2 NFs,使其丧失类酶活性。有机磷农药(对氧磷,OPs)作为AChE的抑制剂可抑制AChE催化ACh生成H2O2,减少MnO2 NFs的分解,从而诱发试剂盒的颜色响应。实际应用上述试剂盒时,向试剂盒中加入未知浓度的对氧磷,其他条件不变;结合智能手机对试剂盒图像数据进行采集及分析,得到对应的灰度值数据,代入前面得到的“灰度值与对氧磷浓度对数”的线性关系曲线,从而计算出对氧磷的浓度,实现对Ops进行现场手持化检测
本发明具有以下特点:
(1)本发明制备的基于MnO2 NFs的OPs活性检测试剂盒具有酶活性高、易于制备等优点,利用其仿酶特性可对OPs进行定性定量分析。
(2)本发明所应用的试剂盒具备构建过程简便、易于操作、响应速度快、成本低等优点。同时基于MnO2 NFs的OPs活性检测方法被用于构建试剂盒,结合智能手机采集及分析图像数据,实现对OPs进行现场手持化检测。
本发明基于MnO2 NFs的OPs活性检测试剂盒在构建便携式检测设备以实现即时检验(POCT)方面具有巨大的潜力。
附图说明
图1:实施例3中试剂盒颜色与农药的量的关系示意图;
图2:实施例4中手机分析的灰度值(Gray value)与对氧磷浓度对数的线性关系图;其中Paraoxon表示对氧磷浓度;
图3:实施例3中试剂盒-智能手机平台检测OPs示意图(其中高通量平台可以实现12组对氧磷样品同时检测)。
具体实施方式
实施例1:MnO2 NFs水凝胶的合成
首先将0.5mg mL-1BSA与5.0mL MnCl2(4.0×10-3mol L-1)水溶液混合,将混合物溶液在室温下连续搅拌1小时。随后,用1.0mol L-1NaOH溶液将反应混合物pH值调至10.0。反应后,放置4小时,将产品在4.0℃下保存。然后,将SA充分溶解在Tris-HCl缓冲液pH 8.0中,快速转移SA(20mg mL-1)放入96孔板中。接下来将0.025mg mL-1MnO2 NFs加入到SA中,充分混合后,立即向上述混合液中滴加CaCl2(5.0mg mL-1),制成均匀的BSA-MnO2 NFs-SA混合水凝胶;
实施例2:试剂盒的制作
将3.0μg mL-1对氧磷水溶液(20μL)和乙酰胆碱酯酶(8.0U mL-1)水溶液(20μL)混合后在37℃下孵育20分钟。随后添加40μL乙酰胆碱(100mmol L-1)和胆碱氧化酶(4.0U mL-1)水溶液。在37℃下孵育30分钟后,将反应溶液加入到实施例1得到的BSA-MnO2 NFs-SA混合水凝胶中,从而得到本发明所述的MnO2 NFs水凝胶试剂盒。向上述试剂盒中滴加TMB(1.5mmol L-1,20μL)显色剂,试剂盒显色反应被触发。在本例的对氧磷浓度下,试剂盒的颜色为深蓝色,灰度值为79.405。
实施例3:试剂盒对OPs检测的应用
根据实施例2的方法可以制备不同浓度OPs(0、0.0005、0.005、0.05、0.3、0.5、1.5和3.0μg mL-1,不同浓度下对应的灰度值分别是159.07、119.81、109.33、90.95、84.79、82.36、81.42、79.405)的MnO2 NFs水凝胶试剂盒,然后再分别滴加20μL、1.5mmol L-1TMB显色剂后,用肉眼即可观察到随着OPs浓度的增加,试剂盒的颜色从无色到深蓝色的变化,使用智能手机自制的应用程序(APP)记录了颜色变化,该应用程序具有内置的图像处理程序,可将相应的图像信息转换为灰度值,并进一步显示与对氧磷浓度的对数呈线性关系,从而实现对OPs进行现场手持化检测(如图2所示);
实施例4:对苹果汁中OPs的检测
表1.基于智能手机的试剂盒和酶标仪检测实际样品中的OPs。
利用本发明开发的试剂盒-智能手机平台,采用标准加入法,对食品样品中的对氧磷进行检测,探讨其实用性。具体样品为苹果汁,添加对氧磷标准液(5.0×10-3、5.0×10-2和50.0μg mL-1)。然后,用PBS缓冲液(pH=7.4)将样品稀释50倍以抵抗背景干扰,并利用本发明开发的试剂盒-智能手机平台进行检测。如表1所示,实际样品中对氧磷的添加回收率为92.84~106.24%,相对标准偏差(RSD)小于4.67%。所得结果与酶标仪结果基本一致,表明该检测策略在实际样品中具有潜在的适用性。
Claims (6)
1.一种基于目标响应式水凝胶与智能手机集成的有机磷农药现场定量检测平台,其特征在于:是由如下步骤制备得到,
(1)首先,将5.0mL、0.25~1.5mg mL-1牛血清白蛋白(BSA)与5.0mL的MnCl2水溶液混合,将得到的混合物溶液在室温下连续搅拌1~2.5小时;随后用0.5~1.5mol L-1的NaOH溶液将混合物溶液的pH值调至10.0,再放置2~6小时后得MnO2NFs并于4.0℃下保存;然后,将海藻酸钠(SA)充分溶解在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中,海藻酸钠的浓度为15~25mg mL-1;将该将海藻酸钠(SA)溶液快速转移酶标板中,接下来将MnO2NFs加入到含海藻酸钠(SA)溶液的酶标板中;充分混合后,立即向上述混合液中滴加浓度为1.0~8.0mg mL-1的CaCl2溶液,从而在酶标板中得到均匀的BSA-MnO2NFs-SA水凝胶;
(2)将10~30μL、0.0005~3.0μg mL-1对氧磷农药水溶液和10~30μL、4.0~10.0U mL-1乙酰胆碱酯酶水溶液混合后在37℃下孵育10~45分钟,实现对氧磷对乙酰胆碱酯酶活性的抑制;随后,向上述混合液中加入40μL乙酰胆碱和胆碱氧化酶水溶液,其中乙酰胆碱的浓度为10~200mmol L-1,胆碱氧化酶的浓度为1.0~6.0U mL-1,在37℃下孵育15~45分钟后;最后将该反应溶液加入到步骤(1)得到的BSA-MnO2NFs-SA水凝胶中,从而得到MnO2NFs水凝胶试剂盒;
(3)向步骤(2)得到的MnO2NFs水凝胶试剂盒中滴加10~30μL、1.5mmol L-1的TMB显色剂,试剂盒显色反应被触发,可观察到随着对氧磷农药浓度的增加,试剂盒颜色逐渐由无色变为蓝色;使用智能手机自制的应用程序记录该颜色变化,将颜色信息转化为灰度值,建立灰色值与农药浓度对数的关系曲线,从而得到基于目标响应式水凝胶与智能手机集成的有机磷农药现场定量检测平台。
2.如权利要求1所述的一种基于目标响应式水凝胶与智能手机集成的有机磷农药现场定量检测平台,其特征在于:步骤(1)中MnCl2的浓度为1.0×10-3~5.0×10-3mol L-1,MnO2NFs和海藻酸钠(SA)的质量比为0.001~6.67:1,MnO2NFs和CaCl2间的质量比为0.001~0.003:1。
3.如权利要求1所述的一种基于目标响应式水凝胶与智能手机集成的有机磷农药现场定量检测平台,其特征在于:步骤(2)中乙酰胆碱的浓度为10~200mmol L-1,胆碱氧化酶的浓度为1.0~6.0U mL-1。
4.如权利要求1所述的一种基于目标响应式水凝胶与智能手机集成的有机磷农药现场定量检测平台,其特征在于:智能手机自制的应用程序通过开发工具Android Studio完成设计,分为Photo-拍照取样、File-打开样本照片所在目录、Analysis-后台分析灰度值与农药浓度之间的关系、Real sample-预测新的实际样本照片的农药浓度四个功能。
5.如权利要求4所述的一种基于目标响应式水凝胶与智能手机集成的有机磷农药现场定量检测平台,其特征在于:智能手机自制的应用程序有如下模块,
Camera Activity:使用Take Picture方法完成拍照,并将照片存入指定文件中;
Data:首先,通过getPixe方法提取样本照片指定位置RGB值。为了减少由于反光、试剂浓度不均导致部分像素点明显与实际情况不符从而影响实验结果,选取以试剂中心为对称中心、相邻点相隔5像素的25个初始点。然后,由这25个初始点的RGB值计算灰度值,并且取中位数,使实验结果更加科学客观,这样就能得到一个试管中试剂的灰度值。RGB值转灰度值为Gray=0.299R+0.587G+0.114B,为了避免低速的浮点运算,加快转换速度,采用整数运算和位运算进行优化Gray=(313524R+615514G+119538B)>>20;最后,重复操作,计算出每个试管中试剂的灰度值;
Fore:根据若干组灰度值和农药浓度,运用回归分析拟合出关系曲线,并且计算出拟合度(R2)。
6.如权利要求5所述的一种基于目标响应式水凝胶与智能手机集成的有机磷农药现场定量检测平台,其特征在于:
Photo:采用Camera Activity模块;
File:通过用户输入的数据得到所需照片的路径,进行访问;
Analysis:采用Data模块得到样本中每个试管中试剂的灰度值,再采用Fore模块得到拟合曲线和R2;
Real sample:采用Photo得到样本照片,通过Data模块得到每个试管中试剂的灰度,再根据Fore模块得到的拟合曲线,预测试剂中的农药浓度。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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