CN110320187A

CN110320187A - 基于二氧化锰纳米片响应的比率型荧光传感器检测有机磷农药的分析方法

Info

Publication number: CN110320187A
Application number: CN201910536022.2A
Authority: CN
Inventors: 卫伟; 姚田田; 卫敏; 刘松琴
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2019-06-20
Filing date: 2019-06-20
Publication date: 2019-10-11
Anticipated expiration: 2039-06-20
Also published as: CN110320187B

Abstract

本发明公开基于二氧化锰纳米片响应的比率型荧光传感器检测有机磷农药的分析方法，所述分析方法包括以下步骤：将有机磷农药与乙酰胆碱酯酶混合反应得到混合溶液，然后在混合溶液中加入氯化乙酰胆碱溶液和PBS缓冲溶液反应得到溶液，在溶液中加入二氧化锰纳米片溶液和PB缓冲溶液室温下反应得到混合物，最后将Scopoletin和Amplex Red加入上述混合物中在黑暗环境中反应，记录溶液荧光光谱，通过荧光强度得出有机磷农药的浓度。本发明不需要借助昂贵精密仪器检测，简化了检测方法，极大地降低了有机磷农药检测成本，本发明具有运行成本低、检测快速简便、选择性好等优点。

Description

基于二氧化锰纳米片响应的比率型荧光传感器检测有机磷农药的分析方法

技术领域

本发明生物技术领域，具体涉及基于二氧化锰纳米片响应的比率型荧光传感器检测有机磷农药的分析方法。

背景技术

作为常见农药，有机磷农药(OPs)广泛用于农业生产。OPs在提高作物产量和控制病虫害方面发挥着巨大作用。然而，过量使用OPs会导致食物，水和环境中存在不同程度的残留。OPs可以抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性，严重影响人体健康。乙酰胆碱酯酶(AChE)是一种主要存在于人和动物中枢神经系统中的乙酰胆碱水解酶。其基本功能是催化神经递质乙酰胆碱的水解，导致神经冲动传递的终止，从而维持胆碱能神经的正常生理功能。由于其与人类健康的紧密关系，用于检测和监测有机磷农药的可靠方法变得越来越重要。

传统检测有机磷农药的方法主要有液相色谱(LC)，气相色谱(GC)，气相色谱与质谱相结合测定法(GC/MS)，酶联免疫吸附测定(ELISA)测试等。这些方法中的大多数具有耗时且操作复杂的缺点。为了克服这些缺点，基于抑制OPs酶活性的方法引起了人们的注意。由于OPs可以更快速和简单地检测，其已被广泛用于荧光中，比色，电化学，表面增强拉曼等。在这些方法中，荧光方法更灵敏和方便。然而，大多数荧光测定集中于turn-off或turn-on用于检测，单个响应信号受到各种实验因素的干扰。比率荧光不仅可以提高检测的准确性，还可以大大减轻外部干扰。因此，比率荧光传感器用于灵敏检测OPs更精确。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种基于二氧化锰纳米片响应的比率型荧光传感器检测有机磷农药的方法。本发明不需要复杂的标记过程，简化了检测方法，极大地降低了OPs检测成本，具有运行成本低、检测快速、简便、选择性好等优点。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：基于二氧化锰纳米片响应的比率型荧光传感器检测有机磷农药的分析方法，所述分析方法包括以下步骤：将有机磷农药与乙酰胆碱酯酶混合反应得到混合溶液，然后在混合溶液中加入氯化乙酰胆碱溶液和PBS缓冲溶液反应得到溶液，在溶液中加入二氧化锰纳米片溶液和PB 缓冲溶液室温下反应得到混合物，最后将Scopoletin和Amplex Red加入上述混合物中在黑暗环境中反应，记录溶液荧光光谱，通过荧光强度得出有机磷农药的浓度。

其中，所述机磷农药与乙酰胆碱酯酶的体积比0.2～0.25。

其中，所述乙酰胆碱酯酶的浓度为12.5mU/mL～0.75U/mL，所述氯化乙酰胆碱的浓度为1mM-10mM。

其中，所述PBS缓冲溶液为：137mM NaCl、10mM NaH₂PO₄、2.7mM KCl、2mM KH₂PO₄，pH6～9。

其中，所述二氧化锰纳米片溶液的合成步骤如下：

1)过氧化氢与四甲基氢氧化铵溶液混合后在15秒～30秒内快速加入MnCl₂溶液，悬浊液在室温下剧烈搅拌，将得到的溶液在离心机离心，然后用水洗和醇洗，干燥，得到块状二氧化锰；

2)称取块状二氧化锰溶于超纯水中并超声，使二氧化锰完全分散，将分散液在离心机离心，保留上清液。

其中，所述过氧化氢浓度为2wt％～3wt％，四甲基氢氧化铵浓度为1.1M～1.2M，氯化锰浓度为0.2M～0.3M。

其中，所述二氧化锰纳米片溶液的浓度为0.1mg/mL～1.5mg/mL。

具体地，所述二氧化锰纳米片的合成：10mL的3wt％过氧化氢与10mL 1.2M四甲基氢氧化铵溶液混合后在15秒内快速加入10mL 0.3M MnCl₂溶液，溶液立即变成深棕色，接着将这悬浊液在室温下剧烈搅拌12h，将得到的溶液在离心机离心20分钟(2000 rpm)，然后用水和甲醇分别洗涤三次，并在60℃的干燥烘箱中干燥，得到块状二氧化锰。称取10mg块状二氧化锰溶于10mL超纯水中并超声12h，使二氧化锰完全分散，将分散液在离心机离心30分钟(2000rpm)，保留上清液用于接下来的实验。

具体地，所述乙酰胆碱酯酶诱导MnO₂纳米片的分解及SC和AR的荧光变化：0.5U /mL的AChE(50μL)和5mM ATCh(20μL)与30μLPBS缓冲液混合。在37℃温育30分钟后，加入30μL MnO₂纳米片溶液(0.5mg/mL)和54μL PB缓冲液。将得到的混合物在室温下孵育30分钟。接下来，将6μL SC(50μM)和10μL AR(50μM) 加入上述混合物中，并确保最终体积为200μL。在室温下记录不同样品的荧光光谱。

具体地，有机磷农药检测步骤：将含有40μL AChE(0.25U/mL)和10uL不同浓度的OPs溶液混合后在37℃温育30分钟。接下来，将20μL ATCh溶液(5mM)和 30μL PBS缓冲溶液在37℃下再加入上述溶液中30分钟。然后，加入30μL MnO₂纳米片溶液(0.5mg/mL)和54μLPB缓冲溶液，并在室温下温育30分钟。最后，将6μL SC(50μM)和10μL AR(50μM)加入上述混合物中，并在黑暗环境中反应30分钟。在室温下记录荧光光谱。

其中，所述PB缓冲溶液为25mMNaH₂PO₄，pH 5～5.5。

其中，所述分析方法具体包括以下步骤：将含有乙酰胆碱酯酶和有机磷农药溶液混合后在37℃温育20～30分钟；接下来，将氯化乙酰胆碱溶液和PBS缓冲溶液再加入上述溶液中在35℃～40℃下反应25～30分钟；然后，加入MnO₂纳米片溶液和PB缓冲溶液，并在室温下温育30分钟；最后，将Scopoletin和Amplex Red加入上述混合物中，并在黑暗环境中反应30～40分钟，在室温下记录荧光光谱，通过荧光强度得出有机磷农药的浓度。

其中，所述Scopoletin浓度为45～50uM；所述Amplex Red浓度为45～50uM。

本发明利用有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，阻碍二氧化锰纳米片的分解，具体为：乙酰胆碱酯酶催化底物氯化乙酰胆碱，产生胆碱，胆碱在酸性条件分解二氧化锰纳米片；有机磷农药会抑制乙酰胆碱酯酶活性，导致胆碱产量降低，二氧化锰纳米片分解受阻；Scopoletin(SC)和Amplex Red(AR)这两个荧光探针在有无二氧化锰纳米片和不同含量二氧化锰纳米片具有不同的响应，因而是否存在有机磷农药以及含有不同浓度的有机磷农药会导致反应溶液有不同的颜色变化，当含有有机磷农药时，随着有机磷农药浓度的上升，在紫外灯照射下，反应溶液颜色由蓝色渐变为红色，达到可视化检测。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的特色及优点：本发明原理简单、实验周期短、所用原料成本较低，无需任何大型仪器，在相同条件下可以检测出更低含量的待测物。二氧化锰纳米片具有过氧化物酶样催化活性，可以淬灭SC的荧光，并通过氧化反应增强非荧光物质AR的荧光。在没有有机磷农药的情况下，乙酰胆碱酯酶 (AChE)将底物乙酰胆碱氯化物(ATCh)水解成胆碱(TCh)和乙酸。TCh导致二氧化锰纳米片分解为锰离子，增加SC信号，降低AR信号。在有机磷农药存在的条件下， AChE的活性受到抑制，二氧化锰纳米片的分解受到阻碍，因此SC的荧光强度较弱， AR的荧光强度明显增加。本发明不需要借助昂贵精密仪器检测，简化了检测方法，极大地降低了有机磷农药检测成本，本发明具有运行成本低、检测快速简便、选择性好等优点。

附图说明

图1显示了基于二氧化锰纳米片响应的比率型荧光传感器检测有机磷农药的分析方法的流程图；

图2显示了基于二氧化锰纳米片响应的比率型荧光传感器检测有机磷农药的分析方法的原理图；图2A为SC的荧光光谱和图2B为AR的荧光光谱，ATCh/MnO₂NS/SC /AR (a)，AChE/MnO₂NS/SC/AR(b)，ATCh/AChE/MnO₂NS/SC/AR(c)，ATCh /AChE/OPs/MnO₂NS/SC/AR(d)(插入相应荧光响应的照片。)

图3A显示了二氧化锰纳米片的透射电子显微镜(TEM)图像；图3B显示了二氧化锰纳米片的紫外可见吸收图；图3C显示了二氧化锰纳米片的粒径分布图像；

图4显示了有无乙酰胆碱酯酶情况下二氧化锰纳米片的紫外可见吸收图；

图5显示了定量检测DDVP的荧光强度变化图。图5A：在不同量的DDVP作用下，得到的SC荧光光谱谱图；图5B：在不同量的DDVP作用下，得到的AR荧光光谱谱图；

图6显示了比率荧光值(F₅₈₅/F₄₆₅)与不同浓度DDVP的校准曲线。(插图：荧光强度的比值和DDVP对数浓度之间的线性关系，范围为5pg/mL～500ng/mL。)。

具体实施方式

下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

本实验中用到的试剂和仪器：

四甲基氢氧化铵和氯化锰(MnCl₂)购自国药化学试剂公司(中国上海)。Scopoletin (SC)(98％)由J&K(中国北京)提供。Amplex Red(AR)(≥98％)和过氧化氢(H2O2) 购自Aladdin Industrial Corporation(中国上海)。AChE(来自Electrophoruselectricus (电鳗)的乙酰胆碱酯酶)和ATCh购自Sigma-Aldrich(中国上海)。有机磷农药标准品购自国家标准中心(中国北京)。

本发明实施例中有机磷农药统一选用的是敌敌畏，但本申请的方案在具体应用时不限于敌敌畏，还可用于对硫磷、甲基对硫磷等有机磷农药。

本发明实施例中的PBS缓冲溶液为：137mM NaCl、10mM NaH₂PO₄、2.7mM KCl、 2mMKH₂PO₄，pH 8.5。

本发明实施例中的PB缓冲溶液为25mMNaH₂PO₄，pH 5。

实施例1：二氧化锰纳米片(MnO₂NS)的合成

10mL的3wt％过氧化氢与10mL 1.2M四甲基氢氧化铵溶液混合后在15秒内快速加入10mL 0.3M MnCl₂溶液，溶液立即变成深棕色，接着将这悬浊液在室温下剧烈搅拌12h，将得到的溶液在离心机离心20分钟(2000rpm)，然后用水和甲醇分别洗涤三次，并在60℃的干燥烘箱中干燥，得到块状二氧化锰。称取10mg块状二氧化锰溶于10mL超纯水中并超声12h，使二氧化锰完全分散，将分散液在离心机离心30分钟 (2000rpm)，保留上清液用于接下来的实验。

图3A显示了合成的MnO₂ NS的TEM图像，从图3A中可以看出，具有二维片状结构；图3B显示了MnO₂ NS的紫外-可见吸收光谱，在300nm至700nm的有一个宽的紫外吸收带，峰集中在366nm处；图3C是MnO₂ NS的DLS表征，动态光散射数据表明，MnO₂ NS的粒径主要分布在100nm。以上结果表明成功合成二氧化锰纳米片。

实施例2二氧化锰纳米片(MnO₂ NS)的合成

10mL的2wt％过氧化氢与10mL 1.1M四甲基氢氧化铵溶液混合后在30秒内快速加入10mL 0.2M MnCl₂溶液，溶液立即变成深棕色，接着将这悬浊液在室温下剧烈搅拌12h，将得到的溶液在离心机离心20分钟(2000rpm)，然后用水和甲醇分别洗涤三次，并在60℃的干燥烘箱中干燥，得到块状二氧化锰。称取10mg块状二氧化锰溶于10mL超纯水中并超声12h，使二氧化锰完全分散，将分散液在离心机离心30分钟 (2000rpm)，保留上清液用于接下来的实验。

实施例3乙酰胆碱酯酶诱导MnO₂纳米片(MnO₂ NS)的分解及SC和AR的荧光变化

0.5U/mL的AChE(50μL)和5mM ATCh(20μL)与30μL PBS缓冲液混合。在37℃ 温育30分钟后，加入30μL实施例1制备的MnO₂纳米片溶液(0.5mg/mL)和54μL PB缓冲液。将得到的混合物在室温下孵育30分钟。接下来，将6μL SC(50μM)和10μL AR (50μM)加入上述混合物中，并确保最终体积为200μL。在室温下分别在380nm和560nm 激发下记录不同样品的荧光光谱。图2A为SC的荧光光谱和图2B为AR的荧光光谱， ATCh/MnO2 NS/SC/AR(a)，ATCh/AChE/MnO2 NS/SC/AR(c)。

0.5U/mL的AChE(50μL)和5mM ATCh(20μL)与30μL PBS缓冲液混合。在 37℃温育30分钟后，加入30μL实施例1制备的MnO₂纳米片溶液(0.5mg/mL)和54μL PB 缓冲液。将得到的混合物在室温下孵育30分钟。在室温下记录溶液的紫外吸收光谱，图 4显示了在(a)不存在和(b)存在AChE的情况下MnO₂NS的紫外-可见吸收光谱。(插图：相应的照片是在紫外灯下拍摄的)。在乙酰胆碱酯酶存在的条件下导致二氧化锰纳米片的分解。

实施例4乙酰胆碱酯酶诱导MnO₂纳米片(MnO₂ NS)的分解及SC和AR的荧光变化

0.75U/mL的AChE(50μL)和1mM ATCh(20μL)与30μL PBS缓冲液混合。在37℃温育30分钟后，加入30μL实施例2制备的MnO₂纳米片溶液(0.5mg/mL) 和54μL PB缓冲液。将得到的混合物在室温下孵育30分钟。接下来，将6μL SC(50μM) 和10μL AR(50μM)加入上述混合物中，并确保最终体积为200μL。

实施例5不同浓度的有机磷农药检测

将含有40μL AChE(0.25U/mL)分别和10uL 15ug/mL、10uL 10ug/mL、10uL 1 ug/mL或10uL 100ng/mL、10uL 10ng/mL、10uL 1ng/mL、10uL 0.1ng/mL、10uL 0 ng/mL OPs溶液混合后在37℃温育30分钟。接下来，将20μL ATCh溶液(5mM)和 30μL PBS缓冲溶液在37℃下再分别加入上述溶液中30分钟。然后，分别加入30μL 实施例1制备的MnO₂ NS溶液(0.5mg/mL)和54μL PB缓冲溶液，并在室温下温育 30分钟。最后，将6μL SC(50μM)和10μL AR(50μM)分别加入上述混合物中，并在黑暗环境中反应30分钟。在室温下记录荧光光谱。实验结果图5显示了定量检测 DDVP的荧光强度变化图。在各种浓度的DDVP存在下SC(A)和AR(B)的荧光光谱。(a)0，(b)5pg/mL，(c)50pg/mL(d)500pg/mL，(e)5ng/mL，(f)50ng /mL，(g)500ng/mL，(h)750ng/mL。(插图：照片对应不同终浓度的DDVP)

如图6所示，两种荧光探针荧光强度的比值与DDVP浓度对数值的拟合曲线；在5.0pg/mL～500ng/mL范围内，荧光强度的比值与有机磷农药的对数浓度呈现良好的线性关系，检测限是1.6pg/mL。

实施例6

为了进一步研究此方法在实际样品中的应用性，将来自九龙湖的湖水取1、2、3、4、5个样品以13000rpm离心30分钟，以除去不溶物。随后，使用0.22微米硝酸纤维素膜过滤器过滤。然后，将5个水样分别加入已知浓度的OPs(终浓度分别为0.005ng mL^-1、 0.05ng mL^-1、0.5ng mL^-1、5ng mL^-1、250ng mL^-1)用于进一步的测定实验。将含有40 μL AChE(0.25U/mL)分别和10uL含OPs的水样混合后在37℃温育30分钟。接下来，将20μL ATCh溶液(5mM)和30μL PBS缓冲溶液在37℃下再加入上述溶液中30分钟。然后，加入30μL实施例1制备的MnO₂ NS溶液(0.5mg/mL)和54μL PB缓冲溶液，并在室温下温育30分钟。最后，将6μL SC(50μM)和10μL AR(50μM)加入上述混合物中，并在黑暗环境中反应30分钟，在室温下记录荧光光谱。利用荧光光谱最大荧光强度处的荧光强度值，并将检测结果与标准曲线对比，得到湖水中DDVP的残留量。实验结果如表 1所示，这些结果表明可接受的回收率和相对标准偏差，表明制备的方法具有良好的性能，可用于检测实际水样中的OPs。

表1

上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。

Claims

1.基于二氧化锰纳米片响应的比率型荧光传感器检测有机磷农药的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括以下步骤：将有机磷农药与乙酰胆碱酯酶混合反应得到混合溶液，然后在混合溶液中加入氯化乙酰胆碱溶液和PBS缓冲溶液反应得到溶液，在溶液中加入二氧化锰纳米片溶液和PB缓冲溶液室温下反应得到混合物，最后将Scopoletin和Amplex Red加入上述混合物中在黑暗环境中反应，记录溶液荧光光谱，通过荧光强度得出有机磷农药的浓度。

2.根据权利要求1所述基于二氧化锰纳米片响应的比率型荧光传感器检测有机磷农药的分析方法，其特征在于，所述机磷农药与乙酰胆碱酯酶的体积比0.2~0.25。

3.根据权利要求1所述基于二氧化锰纳米片响应的比率型荧光传感器检测有机磷农药的分析方法，其特征在于，所述乙酰胆碱酯酶的浓度为12.5 mU/mL~0.75U/mL，所述氯化乙酰胆碱的浓度为1 mM -10 mM。

4.根据权利要求1所述的基于二氧化锰纳米片响应的比率型荧光传感器检测有机磷农药的分析方法，其特征在于，所述PBS缓冲溶液为：137 mM NaCl、10 mM NaH₂PO₄、2.7 mMKCl、2 mM KH₂PO₄，pH 6～9。

5.根据权利要求1所述基于二氧化锰纳米片响应的比率型荧光传感器检测有机磷农药的分析方法，其特征在于，所述二氧化锰纳米片溶液的合成步骤如下：

1）过氧化氢与四甲基氢氧化铵溶液混合后在15秒~30秒内快速加入MnCl₂溶液，悬浊液在室温下剧烈搅拌，将得到的溶液在离心机离心，然后用水洗和醇洗，干燥，得到块状二氧化锰； 2）称取块状二氧化锰溶于超纯水中并超声，使二氧化锰完全分散，将分散液在离心机离心，保留上清液。

6.根据权利要求5所述的基于二氧化锰纳米片响应的比率型荧光传感器检测有机磷农药的分析方法，其特征在于，所述过氧化氢浓度为2 wt %~3 wt %，四甲基氢氧化铵浓度为1.1 M ~1.2 M，氯化锰浓度为0.2 M~ 0.3 M。

7.根据权利要求1所述的基于二氧化锰纳米片响应的比率型荧光传感器检测有机磷农药的分析方法，其特征在于，所述二氧化锰纳米片溶液的浓度为0.1 mg/mL-1.5 mg/mL。

8.根据权利要求1所述的基于二氧化锰纳米片响应的比率型荧光传感器检测有机磷农药的分析方法，其特征在于，所述PB缓冲溶液为25 mM NaH₂PO₄，pH 5~5.5。

9.根据权利要求1所述的基于二氧化锰纳米片响应的比率型荧光传感器检测有机磷农药的分析方法，其特征在于，所述分析方法具体包括以下步骤：将含有乙酰胆碱酯酶和有机磷农药溶液混合后在37℃温育20~30分钟；接下来，将氯化乙酰胆碱溶液和PBS缓冲溶液再加入上述溶液中在35 ℃~ 40 ℃下反应25~30分钟；然后，加入MnO₂纳米片溶液和PB缓冲溶液，并在室温下温育30分钟；最后，将Scopoletin和Amplex Red加入上述混合物中，并在黑暗环境中反应30~40分钟，在室温下记录荧光光谱，通过荧光强度得出有机磷农药的浓度。

10.根据权利要求7所述的基于二氧化锰纳米片响应的比率型荧光传感器检测有机磷农药的分析方法，其特征在于，所述Scopoletin浓度为 45~50 uM；所述Amplex Red浓度为45~50 uM。