CN115290613A - 一种二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于荧光传感检测技术领域，具体涉及一种二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点‑Amplex Red比率型荧光体系及应用。本发明基于二氧化锰纳米片与生物质碳量子点之间的内滤效应和具有类过氧化酶活性的二氧化锰纳米片会氧化Amplex Red为有红色荧光的试卤灵。还原性的胆碱会使二氧化锰纳米片还原成锰离子，引起生物质碳量子点的荧光恢复，而试卤灵的红色荧光降低。有机磷农药会抑制乙酰胆碱脂酶催化硫代乙酰胆碱产生胆碱，引起生物质碳量子点和试卤灵的红色荧光强度变化，因此可将该比率型荧光体系用于构建有机磷农药的荧光检测法。该检测方法具有操作简单、选择性好、线性范围宽的特点。
Description
技术领域
本发明属于荧光传感检测技术领域，具体涉及一种二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系及应用。
背景技术
农药是农业上用于防治病虫危害及调节植物生长的化学药剂，广泛用于农林牧业生产、环境和家庭卫生除害防疫、工业品防霉与防蛀等。有机磷农药是目前市场中所占比重最高的一类农药，具有应用范围广、易于施用、残留期短、易分解、药效高等特点。但有机磷农药的毒性较强，大量使用后也不可避免地造成了环境污染。另外，残留在玉米和大豆等农作物中的有机磷农药会通过食物链富集在生物体内，对人类造成神经损伤、肝脏病变，诱发突变及致癌等。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系及应用。
本发明所采取的技术方案如下：一种二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系，其制备过程包括以下步骤：
（1）生物质碳量子点的制备：取生物质碳源于高压反应釜中，加入去离子水，于120～200°C反应7～15小时，然后用0.22 μm的滤膜，取滤液，滤液中包含生物质碳量子点；
（2）二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系的构建：将生物质碳量子点、Amplex Red溶液、二氧化锰纳米片加入到Tris-HCl缓冲溶液中得到二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系。
步骤（1）中，所述的生物质碳源为秋葵、杨梅、卷心菜、菠菜中的一种或多种。
所述的二氧化锰纳米片的制备过程包括以下步骤：于离心管中加入KMnO4溶液，超声，离心，去上清液，得到二氧化锰纳米片。
所述的KMnO4溶液的浓度为0.3～0.75 mM。
所述的Tris-HCl缓冲溶液pH 为3.4～8.4。
一种有机磷农药的检测方法，包括以下步骤：将乙酰胆碱脂酶与待测溶液混合，于10～40°C下孵育20～45分钟得到一次反应液；将硫代乙酰胆碱加入到一次反应液中，混匀，于10～40°C下孵育20～45分钟得到二次反应液；将二次反应液与权利要求1-5任一项所述的二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系混合，孵育5～15min。
所述有机磷农药为敌敌畏、乐果、对硫磷、马拉硫磷中的一种或多种。
所述乙酰胆碱酯酶的浓度为10～100 U·L-1。
所述硫代乙酰胆碱的浓度为0.1～1.0 mM。
三次反应液分别于激发波长为330 nm和560 nm条件下，测试体系的荧光发射峰，记录400 nm处的峰值I400和585 nm处的荧光I585；I585/I400的值与有机磷农药的浓度呈线性相关。
本发明的有益效果如下：本发明以生物质碳量子点为荧光探针，毒性小、生物相容性好、光稳定性好、制备简便，基于二氧化锰纳米片与生物质碳量子点之间的内滤效应和具有类过氧化酶活性的二氧化锰纳米片会氧化Amplex Red为有红色荧光的试卤灵。还原性的胆碱会使二氧化锰纳米片还原成锰离子，引起生物质碳量子点的荧光恢复，而试卤灵的红色荧光降低的现象。有机磷农药会抑制乙酰胆碱脂酶催化硫代乙酰胆碱产生胆碱，引起生物质碳量子点和试卤灵的荧光强度变化，因此可将生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系用于构建有机磷农药的荧光检测法。该检测方法具有操作简单、选择性好、线性范围宽的特点，为有机磷农药的灵敏检测提供了一种新方法，且可实现有机磷农药的可视化检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1、不同反应温度（A）和反应时间（B）下水热处理后生物质碳量子点的荧光强度；
图2、生物质碳量子点的透射电子显微镜图；
图3、生物质碳量子点的X光电子能谱；
图4、生物质碳量子点的荧光图；
图5、不同浓度KMnO4下Amplex Red（585 nm）和 生物质碳量子点（400 nm）的荧光强度图（A）和荧光强度比值图（B）；
图6、生物质碳量子点和Amplex Red在二氧化锰纳米片（MnO2 NSs）存在和不存在时的荧光光谱；
图7、Amplex Red （585 nm）和 生物质碳量子点（400 nm）在不同 pH 下的荧光强度；
图8、在不同浓度的硫代乙酰胆碱（ATCh）(A)、乙酰胆碱酯酶（AChE）(B)、反应时间(C)、反应温度(D)条件下，（585 nm）和 生物质碳量子点（400 nm）的比值变化；
图9、不同浓度敌敌畏（DDVP）存在下反应溶液的荧光光谱图；
图10、二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系用于敌敌畏检测的线性范围；
图11、二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系在敌敌畏或其他类型农药存在下的荧光响应。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
生物质碳量子点的制备：称取5.5 g卷心菜于100 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，然后将27 mL去离子水加入到上述高压反应釜中，于120°C条件下，反应10小时。最后，将所得的溶液用0.22 μm的滤膜抽滤，滤液置于4°C冰箱保存，备用。
实施例2
生物质碳量子点的制备：称取5.5 g秋葵于100 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，然后将27 mL去离子水加入到上述高压反应釜中，于120～200°C条件下，反应7～15小时。最后，将所得的溶液用0.22 μm的滤膜抽滤，滤液置于4°C冰箱保存，备用。
图1为不同反应温度（A）和反应时间（B）下热处理后过滤的粗产物的荧光强度，可见，所制备的生物质碳量子点在 200 ºC 的水热温度下达到最大值，而反应时间对其影响不大。综上所述，最佳合成条件为：秋葵 5.5 g，水27 mL，反应温度 200 ℃，反应时间 7 h。
如图2所示，最佳合成条件下所制备的生物质碳量子点的粒径在 1.3-2.8 nm 范围内，且分散性良好。如图3所示，X光电子能谱中于 285.05 eV、532.02 eV 和 399.88 eV处出现了三个主要的峰，它们为 C 1s (73.40 %)、O 1s(17.44 %) 和 N 1s (4.52 %)的峰，表明所制备的生物质碳量子点中富含C、O、N元素。另外，谱图中还有Na 1s峰，表明所制备的生物质碳量子点中还含有少量的Na元素。如图4所示，最佳合成条件下所制备的生物质碳量子点的最大激发波长和发射波长分别为330 nm和400 nm。
实施例3
二氧化锰纳米片的制备：将1.5 mL MES溶液加入到15 mL离心管中，然后向离心管中加入0～7.5 mM KMnO4溶液（500 μL），用去离子水补至5 mL，涡旋混匀，然后超声20分钟。最后，将所得的二氧化锰纳米片溶液离心，弃去上清液，用去离子水重新分散纳米片，储存于4°C冰箱，备用。所制备二氧化锰纳米材料为片状结构，厚度约为1.0-2.0 nm。其紫外-可见吸收光谱在 300～500 nm 范围内呈现宽频带，特征峰位于 400 nm 处。当KMnO4溶液的浓度从0增加到7.5 mM时，如图5所示，荧光强度的比值 Amplex Red (585 nm)/生物质碳量子点 (400 nm) 随着 KMnO4 浓度的增加而增加。当 KMnO4 的浓度为 6.5 mM 时，该比率达到最大，因此6.5 mM KMnO4制备的二氧化锰纳米片为最优。
实施例4
二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系的构建：将50 μL实施例2中合成条件下所制备的生物质碳量子点、50 μL Amplex Red（32 μM）溶液、500 μL实施例3中6.5 mM KMnO4制备的制备二氧化锰纳米片加入到500 μL Tris-HCl缓冲溶液（pH 3.4、4.4、5.4、6.4、7.4、8.4）中。由于内滤效应，生物质碳量子点在二氧化锰纳米片存在下会发生荧光猝灭，导致荧光强度降低。同时，二氧化锰纳米片具有类过氧化酶的性质，可催化荧光染料Amplex Red 生成红色荧光强的试卤灵。如图6所示，由生物质碳量子点、二氧化锰纳米片和Amplex Red构建的荧光探针在 400 nm 和 585 nm 处显示出双重荧光。测试了反应体系对 pH 的敏感性，如图7所示，在缓冲液的pH 为8.4时，荧光强度达到最高，为最优实施方案。
实施例5：
配制 0～1.0 mM的硫代乙酰胆碱溶液，同时将 20000 U·L-1 的乙酰胆碱酯酶原液稀释至0～100 U·L-1。各取 500 μL，在 2 mL 离心管中充分混合，放入回旋恒温摇床35℃反应25 min使乙酰胆碱酯酶充分催化 硫代乙酰胆碱分解产生胆碱。反应结束后取混合液 100 uL 加入上述体系，混匀并用荧光分光计分别测量生物质碳量子点（400 nm）与Amplex Red（585 nm）的荧光强度。图 8A 显示，在硫代乙酰胆碱浓度为 0.45 mM之前，该比率随着硫代乙酰胆碱浓度的增加而下降，然后趋势逐渐趋于平缓。实验选择0.7 mM 硫代乙酰胆碱 进行后续实验。使用相同的方法，选择60 U·L-1 乙酰胆碱酯酶作为实验浓度（图8B）。此外，反应时间25 min和反应温度为35°C，使乙酰胆碱酯酶和硫代乙酰胆碱反应尽可能完全（图 8C、D）。
实施例6
有机磷农药的检测：以敌敌畏（DDVP）为有机磷农药的代表，首先将乙酰胆碱酯酶（60 U·L-1）与500 μL不同浓度的DDVP于室温孵育30分钟。然后将500 μL 硫代乙酰胆碱（0.7 mM）加入到上述反应液中，涡旋混匀，35°C孵育25分钟。最后取150 μL反应液加入到步骤（3）所制备的二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系中，涡旋混匀，孵育10分钟后，分别于激发波长为330 nm和560 nm条件下，测试体系的荧光发射峰。如图9所示，随着敌敌畏的浓度升高，生物质碳量子点的荧光峰降低，而位于585 nm处氧化Amplex Red的荧光峰增强。如图10，线性范围为4-120 μg L-1，具有良好的相关系数 (R2)为 0.9970，最低检测限为5 ng mL-1。
实施例7
选择目前大量使用的七种非有机磷农药替换实施例6中的敌敌畏（DDVP）来测试上述方法的选择性，如图11所示，当体系中存在敌敌畏时，Amplex Red （585 nm）的荧光强度与生物质碳量子点（400 nm）的荧光强度之间的比率远小于干扰物质的值，表明该方法具有高的选择性。
应用例1
为了评估基于二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系的实际应用能力，以市售的果汁（苹果汁、橙汁、葡萄汁、番茄汁和黑加仑汁）为实际样品，采用标准加入法进行验证。结果分析为回收率在95.74% ~ 109.65%之间。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (10)
1. 一种二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系，其特征在于其制备过程包括以下步骤：
（1）生物质碳量子点的制备：取生物质碳源于高压反应釜中，加入去离子水，于120～200°C反应7～15小时，然后用0.22 μm的滤膜，取滤液，滤液中包含生物质碳量子点；
（2）二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系的构建：将生物质碳量子点、Amplex Red溶液、二氧化锰纳米片加入到Tris-HCl缓冲溶液中得到二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系。
2. 根据权利要求1所述的二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系，其特征在于：步骤（1）中，所述的生物质碳源为秋葵、杨梅、卷心菜、菠菜中的一种或多种。
3. 根据权利要求1所述的二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系，其特征在于：所述的二氧化锰纳米片的制备过程包括以下步骤：于离心管中加入KMnO4溶液，超声，离心，去上清液，得到二氧化锰纳米片。
4. 根据权利要求3所述的二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系，其特征在于：所述的KMnO4溶液的浓度为0.3～0.75 mM。
5. 根据权利要求1所述的二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系，其特征在于：所述的Tris-HCl缓冲溶液pH 为3.4～8.4。
6. 一种有机磷农药的检测方法，其特征在于包括以下步骤：将乙酰胆碱脂酶与待测溶液混合，于10～40°C下孵育20～45分钟得到一次反应液；将硫代乙酰胆碱加入到一次反应液中，混匀，于10～40°C下孵育20～45分钟得到二次反应液；将二次反应液与权利要求1-5任一项所述的二氧化锰纳米片辅助的生物质碳量子点-Amplex Red比率型荧光体系混合，孵育5～15min得到三次反应液。
7.根据权利要求6所述的有机磷农药的检测方法，其特征在于：所述有机磷农药为敌敌畏、乐果、对硫磷、马拉硫磷中的一种或多种。
8. 根据权利要求6所述的有机磷农药的检测方法，其特征在于：所述乙酰胆碱酯酶的浓度为10～100 U·L-1。
9. 根据权利要求6所述的有机磷农药的检测方法，其特征在于：所述硫代乙酰胆碱的浓度为0.1～1.0 mM。
10. 根据权利要求9所述的有机磷农药的检测方法，其特征在于：三次反应液分别于激发波长为330 nm和560 nm条件下，测试体系的荧光发射峰，记录400 nm处的峰值I400和585nm处的荧光I585，I585/I400的值与有机磷农药的浓度呈线性相关。
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