CN113155816A - 一种基于金纳米簇-二氧化锰纳米片的甲基对氧磷荧光-比色分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于金纳米簇‑二氧化锰纳米片的甲基对氧磷荧光‑比色方法，通过简单方法合成了AuNCs‑MnO2复合材料，MnO2NSs可有效猝灭AuNCs的荧光。硫代乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶的催化下生成硫代胆碱，硫代胆碱可将MnO2还原生成Mn2+，从而失去荧光猝灭能力，AuNCs荧光得以恢复，再通过甲基对氧磷对乙酰胆碱酯酶的不可逆抑制，使体系中AuNCs再次猝灭，从而根据荧光强度的变化构建甲基对氧磷的分析方法。在甲基对氧磷浓度为0.0005～10ng mL‑1范围时，甲基对氧磷浓度的对数与抑制效率(IE％)有良好的线性关系(R2＝0.992)，检测限(LOD)为0.00037ng mL‑1。本发明灵敏度高、选择性较好、抗干扰能力较强，为农药检测建立新方法，在环境检测、食品分析等方面有着巨大应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于金纳米簇(AuNCs)锚定二氧化锰纳米片(MnO2 NSs)复合材料的制备方法，并建立了乙酰胆碱酯酶(AChE)介导的甲基对氧磷荧光-比色检测分析方法。
背景技术
有机磷农药因其具有施药简单、药效时间长和杀灭隐藏害虫等优点，被广泛应用于现代农产品种植过程中。甲基对硫磷为有机磷农药的一种，是杀虫谱广的高毒杀虫剂。在空气中，甲基对硫磷在太阳照射下可氧化成为毒性更强的甲基对氧磷(Methyl-paraoxon，MP)。MP可抑制人体乙酰胆碱酯酶(Acetyl cholinesterase，AChE)的活性，导致乙酰胆碱(Acetylcholine，Ach)积聚，从而增加患神经系统疾病的风险。目前，对毒性更强、潜在危害更大的MP关注较少。因此，对甲基对硫磷代谢产物甲基对氧磷的残留检测至关重要。传统检测有机磷农药的方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱联用技术、液相色谱法、液相色谱-质谱联用技术、胶束电动色谱等，虽然这些方法有检出限低、准确度高、选择性好等优点，但也有前处理操作复杂、耗时长、成本高、对检测人员要求高等缺点，因此很难实现短时大批量检测。荧光分析方法所具有简捷、灵敏、快速等独特优势，可解决传统检测方法存在的缺点，也是有机磷农药检测领域的研究热点。羧基荧光素、罗丹明衍生物等荧光小分子探针和量子点、碳点等荧光纳米材料都已应用到有机磷农药的检测中，但这些荧光物质存在一些缺点如水溶性差、合成条件苛刻，直接利用这些荧光物质构建的检测有机磷农药方法存在选择性低、灵敏度低等问题。为解决上述问题，利用合成简单的纳米材料构建农药快速检测方法成为有效途径，其原理为利用纳米材料猝灭探针荧光，结合材料与有机磷农药间的作用使荧光恢复，进而实现有机磷农药检测。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术存在的操作复杂、灵敏度低等问题，提供了一种金纳米簇(AuNCs)锚定二氧化锰纳米片(MnO2 NSs)复合材料的简单合成方法，将其利用于甲基对氧磷的荧光检测方法中，并建立荧光-比色双信号输出模式，结合AChE的特异响应和甲基对氧磷对AChE的抑制作用引起复合材料的荧光变化，同时伴随体系颜色发生明显变化，实现了对甲基对氧磷的快速可视化监测和高效灵敏检测，为这类传感器在农药中的应用提供新方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种基于金纳米簇-二氧化锰纳米片的甲基对氧磷荧光-比色方法，其步骤如下：
A、牛血清白蛋白功能化的金纳米簇AuNCs的制备：
将HAuCl4(10mmol L-1)和BSA(50mg mL-1)放于37℃温育10min，按体积比1:1混合，剧烈搅拌2-5min；将NaOH(1mol L-1)相比于上述混合溶液1:20加入到上述溶液中，于37℃下剧烈搅拌反应12小时，即可获得黄色AuNCs溶液，通过透析(1kDa)进行纯化，冷冻抽干获得黄色AuNCs粉末，超纯水溶解稀释至0.20mg mL-1备用。
B、AuNCs-MnO2纳米片复合材料的制备：
将步骤A的AuNCs溶液与超纯水按照体积比20:77混合，缓慢搅拌5min；然后将MnCl2·4H2O(50mmol L-1)相比于上述混合溶液2:97加入到上述溶液中，缓慢搅拌1小时；随后将NaOH(1mol L-1)相比于上述混合溶液1:99加入到上述溶液中，缓慢搅拌反应4小时，得到棕黄色AuNCs-MnO2复合材料溶液，通过透析(1kDa)进行纯化，放置于4℃备用。
C、甲基对氧磷的荧光-比色分析：
在多个1.5mL离心管中分别加入25μL不同浓度的甲基对氧磷、25μL乙酰胆碱酯酶(AChE，80mU mL-1)混匀，在37℃下300rpm反应40min；然后加入25μL硫代乙酰胆碱(ATch，2mmol L-1)、25μL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0，100mmol L-1)混匀，在37℃下300rpm反应25min；随后加入50μL步骤B的AuNCs-MnO2、25μL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0，100mmol L-1)、300μL超纯水混匀，在37℃下300rpm反应15min；最后用荧光分光光度计、紫外分光光度计进行检测并记录，进行颜色拍照。
本发明机理如下：
AuNCs-MnO2复合材料中，MnO2纳米片可有效猝灭AuNCs的荧光。硫代乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶的催化下生成硫代胆碱，硫代胆碱可将MnO2还原生成Mn2+，使AuNCs荧光恢复，再通过甲基对氧磷对乙酰胆碱酯酶的不可逆抑制，构建甲基对氧磷荧光分析方法。本荧光分析方法利用简单方法合成了水溶性好、发光稳定的AuNCs-MnO2，借助酶的特异性，使本方法有灵敏度高、选择性较好的特点。
本发明提供的这种酶介导的荧光检测方法，为农药检测建立新方法，为现场快检提供新思路，在环境检测、食品分析方面展现出巨大的应用前景。
附图说明
图1：实施例4所述，为基于AuNCs-MnO2复合材料检测甲基对氧磷的原理示意图。
图2：实施例4所述，为本方法的可行性验证，AuNCs-MnO2、AuNCs-MnO2+ATch、AuNCs-MnO2+AChE、AuNCs-MnO2+ATch+AChE和AuNCs-MnO2+ATch+AChE+Methyl-paraoxon的荧光光谱。
图3：实施例3所述，基于AuNCs-MnO2 NPs复合材料实现AChE的有效检测。为在AuCNs-MnO2+ATch体系在加入不同浓度AChE(0、1、2、5、10、20、40和80mU mL-1)的荧光光谱。
图4：实施例3所述，为(F–F0)/F0与AChE浓度的线性关系图。
图5：实施例3所述，为在AuNCs-MnO2+ATch体系在加入不同浓度AChE(0、1、2、5、10、20、40和80mU mL-1)的吸收光谱。
图6：实施例3所述，为AuNCs-MnO2+ATch体系在加入不同浓度AChE(0、1、2、10、40、80、100、200、400和600mU mL-1)在自然光下照片。
图7：实施例4所述，基于AuNCs-MnO2 NPs复合材料传感平台实现甲基对氧磷的荧光-比色分析，为在AuNCs-MnO2+ATch+AChE体系中加入不同浓度甲基对氧磷标准液(0、0.01、1.0、20、50、500、2000和4000ng mL-1)对应的荧光光谱。
图8：实施例4所述，为IE(％)与甲基对氧磷浓度对数的线性关系图。
图9：实施例4所述，为在AuNCs-MnO2+ATch+AChE体系在加入不同浓度甲基对氧磷标准液(0、0.01、0.5、1.0、20、50、500、2000和4000ng mL-1)的吸收光谱。
图10：实施例4所述，为AuNCs-MnO2+ATch+AChE体系在加入不同浓度甲基对氧磷标准液(0、0.1、1.0、5.0、20、100、500、1000、2000和4000ng mL-1)在自然光下照片。
图11：实施例4所述，为本分析方法检测甲基对氧磷(4μg mL-1)的特异性(其它农药浓度为10μg mL-1)。
图12：实施例4所述，为其他物质(10μg mL-1)对本分析方法检测甲基对氧磷(4μgmL-1)的干扰反应。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步地说明。
实施例1：牛血清白蛋白功能化的金纳米簇AuNCs的制备
将5mL的HAuCl4(10mmol L-1)和5mL的BSA(50mg mL-1)放于37℃温育10min，将两者混合，剧烈搅拌5min。将0.5mL的NaOH(1mol L-1)加入到上述溶液中，于37℃下剧烈搅拌反应12小时，即可获得黄色AuNCs溶液，通过透析(1kDa)进行纯化，冷冻抽干获得黄色AuNCs粉末，超纯水溶解稀释至0.20mg mL-1备用。
实施例2：AuNCs-MnO2纳米片复合材料的制备
取实施例1的2mL AuNCs溶液加入到7.7mL超纯水中，缓慢搅拌5min。然后，将0.2mLMnCl2·4H2O(50mmol L-1)加入到上述溶液中，缓慢搅拌1小时；随后加入0.2mL NaOH(1molL-1)，缓慢搅拌反应4小时，得到棕黄色AuNCs-MnO2复合材料溶液，通过透析(1kDa)进行纯化，放置于4℃备用。
实施例3：乙酰胆碱酯酶的荧光-比色传感设计
检测AuNCs-MnO2复合荧光体系对AChE的敏感性，将2mmol L-1的ATch与不同浓度的AChE(0～1000mU mL-1)混匀，在37℃下混合反应25min，随后加入50μL实施例2的AuNCs-MnO2混匀，在37℃下混合反应15min。随着AChE的浓度增加，AuNCs-MnO2的荧光强度逐渐增加(图3)，吸收光逐渐降低(图5)，体系颜色逐渐变浅(图6)。荧光恢复率((F–F0)/F0，其中F和F0表示AChE存在和不存在时的荧光强度)与AChE的浓度在1～80mU mL-1范围内有良好的线性关系(R2＝0.999)(图4)。
实施例4：甲基对氧磷的荧光-比色分析
基于酶的特异性识别调控的AuNCs-MnO2荧光-比色传感平台，构建甲基对氧磷检测体系(图1)。在多个1.5mL离心管中分别加入25μL不同浓度的甲基对氧磷、25μL乙酰胆碱酯酶(AChE，80mU mL-1)混匀，在37℃下300rpm反应40min。然后加入25μL硫代乙酰胆碱(ATch，2mmol L-1)、25μL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0，100mmol L-1)混匀，在37℃下300rpm反应25min。由于加入的甲基对氧磷浓度不同，生成的硫代胆碱量不同。将上述反应液与50μL实施例2的AuNCs-MnO2、25μL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0，100mmol L-1)、300μL超纯水混匀，在37℃下300rpm反应15min，最后用荧光分光光度计、紫外分光光度计进行检测并记录，进行颜色拍照。本方法原理可行(图2)，甲基对氧磷浓度与AuNCs-MnO2荧光强度成反比关系，荧光强度随着甲基对氧磷的浓度增加而降低(图7)，吸收光逐渐升高(图9)，体系颜色逐渐变深(图10)。在甲基对氧磷浓度为0.005～10ng mL-1范围内，甲基对氧磷浓度的对数与抑制效率(IE％)有良好的线性关系(R2＝0.992)(图8)，检测限(LOD)为0.000892ng mL-1，可满足甲基对氧磷的检测。而且，本发明构建的方法对新烟碱类农药(氯噻啉、烯啶虫胺)、氨基甲酸酯类农药(西维因)、氯化烟碱类农药(啶虫脒、吡虫啉)均没有相应，对有机磷农药(水胺硫磷、毒死蜱、马拉硫磷)相应很弱，只有甲基对氧磷(4μg mL-1)可引起显著的变化(图11)，表明该方法对甲基对氧磷具有较高选择性。如图12所示，样品中常见阳离子(Na+、K+、Mg2+)、氨基酸(精氨酸、甘氨酸、苏氨酸)、蛋白质(BSA)等不会显著影响检测体系的荧光强度变化，表明该方法具有良好的抗干扰能力。
实施例5：实际样品中甲基对氧磷含量的测定
利用本发明，采用标准加入法，对环境和食品样品中的甲基对氧磷进行检测，探讨其实用性。具体样品包括自来水、河水和橙汁，自来水与河水利用0.22μm滤膜过滤后，直接添加甲基对氧磷标准液，终浓度分别为0.1、1和5ng mL-1；橙汁12000rpm离心10min，取上清液稀释25倍添加甲基对氧磷标准液，终浓度分别为0.1、1和5ng mL-1，并利用本发明开发的荧光方法进行检测。如表1所示，实际样品中甲基对氧磷的添加回收率为90.3-116％，相对标准偏差(RSD)小于8.73％，表明该检测方法可应用于实际样品检测中。
表1：应用本发明开发的荧光-比色策略检测实际样品中的甲基对氧磷
Claims (7)
1.一种基于金纳米簇-二氧化锰纳米片的甲基对氧磷荧光-比色分析方法，其特征在于，其步骤如下：
A、牛血清白蛋白功能化的金纳米簇(AuNCs)的制备：
将HAuCl4和BSA放于按体积比1:1混合，剧烈搅拌2-5min；将NaOH相比于上述混合溶液1:20加入到上述溶液中，于37℃下剧烈搅拌反应12小时，即可获得黄色AuNCs溶液，通过透析进行纯化，冷冻抽干获得黄色AuNCs粉末，超纯水溶解稀释至0.20mg mL-1备用；
B、AuNCs-MnO2纳米片复合材料的制备：
将步骤A的AuNCs溶液与超纯水按照体积比20:77混合，缓慢搅拌5min；然后将MnCl2·4H2O相比于上述混合溶液2:97加入到上述溶液中，缓慢搅拌1小时；随后将NaOH相比于上述混合溶液1:99加入到上述溶液中，缓慢搅拌反应4小时，得到棕黄色AuNCs-MnO2荧光复合材料溶液，通过透析进行纯化备用；
C、甲基对氧磷的荧光-比色分析：
在多个1.5mL离心管中分别加入25μL不同浓度的甲基对氧磷、25μL乙酰胆碱酯酶(AChE，80mU mL-1)混匀，在37℃下300rpm反应40min；然后加入25μL硫代乙酰胆碱(ATch，2mmol L-1)、25μL Tris-HCl缓冲液混匀，在37℃下300rpm反应25min；随后加入50μL步骤B的AuNCs-MnO2、25μL Tris-HCl缓冲液、300μL超纯水混匀，在37℃下300rpm反应15min；最后用荧光分光光度计、紫外分光光度计进行检测并记录，进行颜色拍照。
2.如权利要求1所述的一种基于金纳米簇锚定二氧化锰纳米片的甲基对氧磷荧光-比色分析方法，其特征在于，步骤A所述的HAuCl4的浓度为10mmol L-1，BSA的浓度为50mg mL-1，NaOH的浓度为1mol L-1。
3.如权利要求1所述的一种基于金纳米簇-二氧化锰纳米片的甲基对氧磷荧光-比色分析方法，其特征在于HAuCl4及BSA需提前在37℃下温育10min，整个合成过程在37℃下进行。
4.如权利要求1所述的一种基于金纳米簇-二氧化锰纳米片的甲基对氧磷荧光-比色分析方法，其特征在于，步骤B所述的MnCl2·4H2O的浓度为50mmol L-1，NaOH的浓度为1mol L-1。
5.如权利要求1所述的一种基于金纳米簇-二氧化锰纳米片的甲基对氧磷荧光-比色分析方法，其特征在于，步骤C所述的Tris-HCl缓冲液pH为8.0，浓度为100mmol L-1。
6.如权利要求1所述的一种基于金纳米簇-二氧化锰纳米片的甲基对氧磷荧光-比色分析方法，其特征在于，步骤C使用激发波长560nm进行荧光检测，最佳发射波长位于665nm处。
7.如权利要求1所述的一种基于金纳米簇-二氧化锰纳米片的甲基对氧磷荧光-比色分析方法，其特征在于，步骤C进行吸收光谱检测的扫描范围为300-750nm。
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