CN107389635A

CN107389635A - 基于牛血清白蛋白的功能化纳米金簇的合成方法及应用

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Publication number: CN107389635A
Application number: CN201710550230.9A
Authority: CN
Inventors: 蔡会武; 王行行
Original assignee: Xian University of Science and Technology
Current assignee: Xian University of Science and Technology
Priority date: 2017-07-07
Filing date: 2017-07-07
Publication date: 2017-11-24

Abstract

本发明涉及一种基于牛血清白蛋白的功能化纳米金簇的合成方法及应用，其是以HAuCl₄为Au原子的前驱体，以BSA作为还原剂和保护剂，用“一锅合成法”合成了BSA‑AuNCs，合成方法简单，反应条件温和，所合成的荧光纳米金簇具有良好的生物相容性和光稳定性，荧光特性好，量子产率高，水溶性好，无毒性，受外界干扰小等优点，而且本发明所合成的BSA‑AuNCs对Cu²⁺离子具有较高的选择性，可应用于Cu²⁺的定量检测分析，检测方法简单快速，灵敏度高，无毒害性,能够实现Cu²⁺的实时定性定量检测。

Description

基于牛血清白蛋白的功能化纳米金簇的合成方法及应用

技术领域

本发明属于功能材料研究技术领域，特别涉及一种用牛血清白蛋白修饰的荧光纳米金簇的合成方法以及以所合成的功能化纳米金簇为荧光探针检测Cu²⁺的方法。

背景技术

随着冶炼、化工、采矿、电镀、医药等各个行业的迅速崛起发展，我国面临的重金属污染问题越来越严重。铜在机械加工、开采冶炼和电子电气等行业的应用方面越来越广泛。铜虽然是人体健康不可或缺的微量营养元素，在血液、神经中枢和免疫系统中发挥着及其重要的作用。但是，人体内过多的摄入铜也会引发恶心、呕吐和急性溶血等一系列的中毒现象等。

目前，对于铜离子的检测方法虽然有很多，但是，这些方法一般都是需要大型昂贵的分析仪器，操作并不方便，而且这些方法还存在着分析测试的周期长，原料预处理复杂，分析步骤繁琐并且不能对水域进行实时实地检测等缺点。因此，一些简单实用检测铜离子的方法更加值得研究探索。如今，纳米技术的发展引起了各学科研究者们的关注，而荧光法则是结合纳米技术与光谱技术，制备出具有荧光特性的纳米簇，因其具有较高的选择性、准确性和灵敏度，能够进行快速、实时检测、定量检测等优点，因此，它可以作为检测金属粒子如铜离子的一种手段。

由于金属纳米粒子的直径一般小于2nm，尺寸接近于电子的费米波长，它的级谱带变为不连续结构，而后分裂成类似于分子的离散能级结构，因此金纳米簇可以通过电子在能级间的跃迁来实现与光的相互作用，并呈现出较强的荧光性能，并且金纳米簇的荧光量子产率比块状金属高7～9个数量级。金纳米簇的荧光性质还与纳米簇的大小有关，即是粒径尺寸依赖的荧光性质，因为随着粒径大小的变化，其荧光发射波长可以从紫外到近红外光区范围内变化。除了粒径大小即“尺寸效应”直接影响的荧光性质外，影响的因素还包括包被剂及模板分子的种类，即表面的包被剂和模板分子与金属核的相互作用会影响到的荧光性质；合成方法也会影响的荧光性质。

因此，开发一种荧光性质好、稳定性好的金纳米簇并使其能够作为荧光探针实现快速、简单及准确的检测分析方法是具有非常重要的现实意义。

发明内容

为了克服现有技术所存在的不足，本发明的目的之一是提供一种以HAuCl₄为Au原子的前驱体，以BSA作为还原剂和保护剂的功能化纳米金簇的合成方法，所合成纳米金簇具有良好的生物相容性和稳定性，量子产率高，水溶性好且对Cu²⁺具有良好的选择性。

本发明还提供了该功能化纳米金簇在Cu²⁺定性定量化检测方面的应用。

本发明还提供了用上述方法所合成的功能化纳米金簇作为荧光探针检测Cu²⁺的方法。

本发明实现上述目的所采用的技术方案是：

该基于牛血清白蛋白修饰的功能化纳米金簇的合成方法，其包括以下步骤：

(1)将浓度为50mg/mL的牛血清蛋白溶液和浓度为10mmol/L的氯金酸溶液按照体积比1:1混合，磁力搅拌混匀；

(2)向步骤(1)的混合溶液中加入1mol/L的NaOH溶液，将混合液置于37～75℃水浴中连续磁力搅拌反应4～12h，得到功能化纳米金簇。

上述步骤(2)是向步骤(1)的混合溶液中加入1mol/L的NaOH溶液，将混合液置于60℃水浴中连续磁力搅拌反应6h。

上述合成的功能化纳米金簇在Cu²⁺定性定量化检测方面的用途。

上述合成的功能化纳米金簇作为荧光探针对浓度为2.0～1000μmol/L的Cu²⁺的荧光法检测方面的应用。

一种用上述方法合成的功能化纳米金簇作为荧光探针检测Cu²⁺的方法，其包括以下步骤：

(1)用pH为6.0的缓冲液配制浓度为10mmol/L的Cu²⁺溶液，之后将其稀释成不同浓度的系列Cu²⁺标准溶液；

(2)在室温条件下，取等量权利要求1合成的功能化纳米金簇置于不同离心管内，并分别加入等量步骤(1)所配制的不同浓度的系列Cu²⁺标准溶液，待反应5～15min，在激发波长为350nm～450nm，发射波长为400～700nm，狭缝为10nm的条件下用荧光法检测不同浓度的系列Cu²⁺标准溶液所对应的荧光强度值I_i，以系列Cu²⁺标准溶液的浓度为横坐标，相对荧光强度F₀-F为纵坐标，绘制浓度-荧光强度工作曲线，拟合线性回归方程；

(3)室温下，取权利要求1合成的功能化纳米金簇置于离心管内，加入与步骤(2)Cu²⁺标准溶液等量的待测Cu²⁺溶液，待反应5～15min，在激发波长为440nm，发射波长为400～700nm的条件下用荧光法检测其荧光强度值I_x，将其带入步骤(2)的线性回归方程中，得到待测Cu²⁺溶液的浓度。

上述步骤(1)的缓冲液是硼砂-盐酸配制pH＝6.0的缓冲溶液。

上述步骤(2)的线性回归方程为：△F＝6.42+1.31c_i；c_i为不同浓度的Cu²⁺标准溶液所对应的Cu²⁺浓度。

上述线性回归方程的线性相关系数R²＝0.96。

上述功能化纳米金簇与对应Cu²⁺标准溶液的体积比为1:1。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明以HAuCl₄为Au原子的前驱体，以BSA作为还原剂和保护剂，用“一锅合成法”合成了BSA-AuNCs，合成方法简单，反应条件温和，所合成的荧光纳米金簇具有良好的生物相容性和光稳定性，荧光特性好，量子产率高，水溶性好，无毒性，受外界干扰小等优点，因此本发明的功能化纳米金簇可在生物成像和分析检测领域具有广阔的应用前景。

2、本发明所合成的BSA-AuNCs对Cu²⁺离子具有较高的选择性，利用牛血清白蛋白上的巯基可捕获金原子形成稳定的Au-S键，而其所含的特殊官能团氨基和羧基则对铜离子有特异性响应，当向体系中加入铜离子后，铜离子可引起金纳米簇的团簇，使得BSA-AuNCs的荧光发生明显的猝灭现象，因此将BSA-AuNCs应用于Cu²⁺的定量检测分析，检测方法简单快速，灵敏度高，无毒害性,能够实现Cu²⁺的实时定性定量检测。

3、本发明合成的BSA-AuNCs的荧光强度与Cu²⁺的浓度呈良好的线性关系，以BSA-AuNCs作为荧光探针用于定量检测分析Cu²⁺，对Cu²⁺的最低检出限可达2μmol/L，而且Cu²⁺的检测浓度范围广，对于水样中Cu²⁺离子的定量检测分析，在工业用水和生活用水的检测中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为BSA-AuNCs在日光灯I和紫外灯II下的照片。

图2为BSA与BSA-AuNCs紫外吸收图谱。

图3为BSA-AuNCs的荧光光谱图。

图4为BSA和BSA-AuNcs的红外共谱图

图5为BSA-AuNCs的稳定性变化曲线图。

图6为BSA-AuNCs的Cu²⁺选择性对比图。

图7为BSA-AuNCs加入Cu²⁺(1mmol·L^-1)后不同反应时间的荧光强度变化曲线。

图8为BSA-AuNCs加入不同浓度Cu²⁺时的荧光光谱图。

图9为BSA-AuNCs的荧光强度随Cu²⁺浓度的回归曲线。

图10为未加Cu²⁺时BSA-AuNCs的HRTEM图。

图11为添加Cu²⁺时BSA-AuNCs的HRTEM图。

具体实施方式

现结合附图和实施例对本发明的技术方案进行进一步说明。

一、用牛血清白蛋白修饰合成功能化纳米金簇

取浓度为50mg/mL的牛血清蛋白溶液2mL与浓度为10mmol/L的氯金酸溶液2mL，依次加入50mL圆底烧瓶中，用集热式恒温加热磁力搅拌器搅拌混匀，2min之后，加入0.2mL的1mol/L NaOH溶液，将混合液置于60℃水浴中分别连续磁力搅拌6h，反应结束后，得到棕色的功能化纳米金簇，可将其置于冰箱(4℃)避光储存备用。

对所合成的功能化纳米金簇(简称BSA-AuNC)通过以下实验对其形貌以及性能进行表征。

1、对所合成的功能化纳米金簇(简称BSA-AuNC)在可见光下的颜色和形态以及365nm紫外灯照射下观察其颜色和形态。结果如图1所示。

由图1所示，在可见光下，BSA-AuNCs为深棕色透明液体(I)，在365nm紫外光下BSA-AuNCs呈现出肉眼可见的较强的红色荧光(II)，表明所制备的BSA-AuNC溶液具有良好的光致发光性。这种现象是由于金纳米簇对可见光具有吸收作用所导致的。

2、移取2mL合成的BSA-AuNCs溶液，以2mL超纯水作为实验的空白对照，用紫外分光光度计分别对超纯水、BSA溶液和BSA-AuNCs溶液进行扫描，检测它们的紫外吸收光谱，如图2所示。

图2为BSA溶液与BSA-AuNCs溶液的紫外吸收光谱图。从图中很明显可以看出，紫外吸收光谱的检测范围为300nm至700nm，并且在光谱扫描的范围内BSA溶液和BSA-AuNCs溶液两者都没有出现明显的紫外吸收峰，这就可以说明本实验所合成的金纳米簇粒径小于3nm，并且表现出与蛋白质分子相似的性质。

3、将合成的BSA-AuNCs溶液进行荧光光谱扫描，以350nm为激发波长，狭缝为10nm，测得其荧光图谱，如图3所示，图3为BSA-AuNCs的荧光激发(左)和荧光发射图谱(右)。

从图3中可以看出，BSA-AuNCs的最大激发在450nm左右，在640nm左右有最大发射光谱，其荧光发射峰峰型左右对称，荧光激发波长范围宽，制备的BSA-AuNCs具有良好的荧光性能。

4、对BSA和BSA-AuNCs分别进行了红外光谱分析。

BSA修饰的金纳米簇样品红外测定结果如图4所示，BSA-AuNCs与其对应修饰剂BSA的红外光谱非常的相似。1600cm^-1～1700cm^-1处是蛋白质的酰胺Ⅰ谱带，其中1640cm^-1处是蛋白质中α螺旋部分的特征峰，即为-NH的面内弯曲振动，而3440cm^-1处出现的峰为-NH的伸缩振动。在1380cm^-1和2360cm^-1处出现的峰分别为-OH的面内弯曲振动和伸缩振动，1560cm^-1左右处的-SH的特征吸收峰在金纳米簇中明显的消失了，这说明了蛋白质的巯基与Au形成了共价键。以上这些结果表明，BSA已经成功修饰到了金纳米簇的表面，本课题所设计合成的具有荧光特性的金纳米簇初步合成成功。

6、BSA-AuNCs的稳定性

每相隔5天就对BSA-AuNCs溶液进行一次荧光扫描，测定它的荧光强度变化，如图5所示。

从图5可以看出，在制备好BSA-AuNCs溶液后的二十天之内，BSA-AuNCs的荧光强度变化较小，但当其存放时间超过二十天之后，它的荧光强度却会出现明显的减弱现象。以上结果表明，本实验所合成的BSA-AuNCs溶液的荧光稳定性比较良好，但是不能进行太长时间的保存。

二、用上述方法合成的功能化纳米金簇作为荧光探针检测Cu²⁺的方法，由以下步骤实现：

(2)在室温条件下，取权利要求1合成的功能化纳米金簇置于离心管内，并分别加入等量步骤(1)所配制的不同浓度的系列Cu²⁺标准溶液，待反应5～15min，在激发波长为440nm，发射波长为400～700nm的条件下(请确认！)用荧光法检测不同浓度的系列Cu²⁺标准溶液所对应的荧光强度值I_i，以Cu²⁺标准溶液的浓度为横坐标，相对荧光强度F₀-F为纵坐标，绘制浓度-荧光强度工作曲线，拟合线性回归方程；

用上述检测方法分别对自来水和两个不同地方的湖水中的Cu²⁺进行检测，具体为：

将不同来源水样(自来水、湖水)，分别进行煮沸，过滤等前处理。再对水样分别进行加标，按照上述Cu²⁺的检测方法在荧光分光光度计上进行检测分析。将数据根据线性回归方程进行计算，可得到回收率，具体数据列于表1。

表1实际水样中Cu²⁺的检测

从表1的结果显示，回收率从89.5％～108.4％，满足检测要求，因此本课题构建的Cu²⁺检测方法是可行的，并且可用于实际水样中Cu²⁺的定量检测。

进一步为了验证本发明的BSA-AuNCs在荧光法检测Cu²⁺方面的检测效果，发明人做了大量的验证实验，现以下述实验为例进行说明。

1、金属离子的选择性

如图6所示，用F₀–F表示不同的金属离子对BSA-AuNCs的荧光响应程度，F₀–F的数值越大则表明金属离子的响应程度越大。从图上可以看出，一般常见的金属离子对BSA-AuNCs的响应程度并不明显，但当溶液中有Cu²⁺存在时，BSA-AuNCs的荧光响应程度却很大，即当体系中存在Cu²⁺离子时，就会引起BSA-AuNCs体系荧光较为强烈的猝灭，其他金属离子对BSA-AuNCs体系的荧光强度影响则很小，这表明BSA-AuNCs对Cu²⁺离子具有良好的选择性。

2、Cu²⁺的动力学研究

为了验证Cu²⁺与BSA-AuNCs相互作用的时间，对体系进行了动力学研究。将Cu²⁺加入到BSA-AuNCs溶液中，分别选取不同反应时间(5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min)的体系进行荧光测定，结果如图7所示，荧光强度随着反应时间的增加而减弱，但当反应时间超过二十分钟后，其荧光强度不再发生明显变化。实验结果表明，Cu²⁺与BSA-AuNCs的反应是瞬时的，反应稳定所需的时间大约为20min。

3、Cu²⁺的定量检测

由于Cu²⁺对BSA-AuNCs存在特异性响应，因此需要对BSA-AuNCs的荧光强度与Cu²⁺浓度的关系进行深入的研究。本文研究了不同的Cu²⁺浓度(1-1000μmol·L^-1)对BSA-AuNCs荧光强度变化的影响，并得到相应的荧光图谱(图8)。如图8，在640nm处，BSA-AuNCs的荧光强度随Cu²⁺浓度的增加而降低。而当Cu²⁺的浓度范围为1-20μmol·L^-1时，BSA-AuNCs的荧光强度会随浓度的变化呈现良好的线性关系，回归方程为：y＝6.42+1.31x，线性相关系数为R²＝0.96，如图9所示。且用BSA-AuNCs建立的检测Cu²⁺的方法，最低检出限为2.0μmol L^-1.实验结果表明，BSA-AuNCs可对Cu²⁺进行定量检测。

4、TEM检测

为了进一步证明BSA-AuNCs的荧光猝灭是由团簇引起的，还进行了TEM检测，从图10、11对比可以看出，所合成的BSA-AuNCs具有良好的分散性，并且粒径分布均匀，约为2nm。当在溶液中加入Cu²⁺后，观察到明显有团簇出现，这进一步说明了Cu²⁺离子使BSA-AuNCs的猝灭是由团簇引起的。

Claims

1.一种基于牛血清白蛋白修饰的功能化纳米金簇的合成方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于牛血清白蛋白修饰的功能化纳米金簇的合成方法，其特征在于所述步骤(2)是向步骤(1)的混合溶液中加入1mol/L的NaOH溶液，将混合液置于60℃水浴中连续磁力搅拌反应6h。

3.权利要求1所合成的功能化纳米金簇在Cu²⁺定性定量化检测方面的用途。

4.权利要求1所合成的功能化纳米金簇作为荧光探针对浓度为2.0～1000μmol/L的Cu²⁺的荧光法检测方面的应用。

5.一种用权利要求1的方法合成的功能化纳米金簇作为荧光探针检测Cu²⁺的方法，其特征在于包括以下步骤：

(3)室温下，取权利要求1合成的功能化纳米金簇置于离心管内，加入与步骤(2)Cu²⁺标准溶液等量的待测Cu²⁺溶液，待反应5～15min，在激发波长为440nm，发射波长为400～700nm的条件下用荧光法检测其荧光强度值I_x，将其带入步骤(2)的线性回归方程中，得到待测Cu² ⁺溶液的浓度。

6.根据权利要求5所述的检测Cu²⁺的方法，其特征在于所述步骤(1)的缓冲液是硼砂-盐酸配制pH＝6.0的缓冲溶液。

7.根据权利要求5所述的检测Cu²⁺的方法，其特征在于所述步骤(2)的线性回归方程为：△F＝6.42+1.31c_i；c_i为不同浓度的Cu²⁺标准溶液所对应的Cu²⁺浓度。

8.根据权利要求7所述的检测Cu²⁺的方法，其特征在于所述线性回归方程的线性相关系数R²＝0.96。

9.根据权利要求7所述的检测Cu²⁺的方法，其特征在于所述功能化纳米金簇与对应Cu²⁺标准溶液的体积比为1:1。