CN115889757A - 一种菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及金锌纳米簇合成技术领域，尤其涉及一种菠萝蛋白酶‑金锌纳米簇的制备方法及应用，具体步骤如下：以菠萝蛋白酶为模板，在特定的pH条件下制备菠萝蛋白酶‑金锌纳米簇原液。在375nm激发波长下，金锌纳米簇呈现红色荧光，在475nm和655nm处有最大发射峰；金锌纳米簇作为一种有效的环境友好型荧光探针可用于检测溶液中的S2‑。本发明制备的荧光金锌纳米簇光学性质稳定、制备简单、生物相容性好，检测S2‑方法简单便捷、检测灵敏度高，受环境影响小，是应用于生物和医学领域的理想荧光纳米材料。

Description

一种菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及金锌纳米簇合成技术领域，尤其涉及一种菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的制备方法及应用。
背景技术
菠萝蛋白酶又称菠萝酶，为浅黄色无定形粉末，是由菠萝汁、菠萝皮等提取的巯基蛋白酶，是一种植物源性蛋白质，在体外和体内表现出各种纤溶、抗水肿、抗血栓和抗炎活性，具有一定的药用价值。菠萝茎中的菠萝蛋白酶含量很高，提取菠萝蛋白酶不需要从可食用的菠萝果实中提取，因此菠萝蛋白酶价格低廉，生物相容性较好，环境友好，是制备金属纳米簇的理想模板。
小尺寸的金属纳米团簇是由几个到几百个原子组成的纳米材料，在有适当配体保护时会表现出较强的荧光，与单金属纳米团簇相比，双金属纳米团簇呈现出更好的稳定性，且具有一些不同于单金属纳米簇的物理和化学性质。当以蛋白为配体时，金属纳米团簇一般不会显著改变蛋白的二级结构和生物功能，具有独特的光物理特性、尺寸小、低毒性和优异的生物相容性等优点，是应用于生物和医学领域的理想荧光材料。
二价硫离子(S2-)作为一种常见的有毒离子，广泛存在于火山喷发的火山中或者石油中，或者来自于有污染源的水或者排泄物中。当S2-的浓度增加到一定程度，就会导致严重的问题，如刺激粘膜、导致意识丧失和呼吸麻痹。此外，S2-的水平异常与许多疾病的风险增加相关，因此检测S2-浓度对工业、环境以及生物学研究来说十分必要。传统检测方法存在样品处理复杂、操作人员要求高、设备昂贵等缺点，因此，亟需开发一种有效的低成本、高选择性、方便快捷的方法来检测S2-。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的制备方法及应用，以菠萝蛋白酶为模板，采用一步合成法制备菠萝蛋白酶-金锌纳米簇，产物表现出独特的光物理特性、几乎无毒且具有优异的生物相容性，检测S2-方法快速简单、检测灵敏度好、检测限低。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的制备方法，具体步骤如下：
S1、称量一定量的菠萝蛋白酶固体，加入400μL水溶解，将氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入氯化锌溶液，室温下混合均匀，得到溶液A；
S2、将适量浓度为1M的氢氧化钠溶液加入至步骤S1得到的溶液A中，混合均匀，溶液水浴条件下加热0.5-4小时，得到溶液B；
S3、将步骤S2得到的溶液B，用分子截留量为12-14kDa的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，以去除未反应的反应物，使蛋白尽可能的恢复到天然状态，产物保存在4℃条件下，得到菠萝蛋白酶-金锌纳米簇。
优选地，在步骤S1中，菠萝蛋白酶浓度为40mg ml-1。
优选地，在步骤S1中，氯金酸和氯化锌的浓度比为5:1。
优选地，在步骤S2中，反应时间为2小时，反应温度为45℃。
本发明还提供了一种采用上述的制备方法制得的菠萝蛋白酶-金锌纳米簇在S2-检测中的应用，将不同浓度的S2-溶液加入至菠萝蛋白酶-金锌纳米簇中，并在室温下孵育，从而实现检测S2-的目的；激发波长条件下，随着S2-浓度的增加，菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的荧光强度逐渐减弱，实现检测。
优选地，在室温条件下孵育20分钟，在375nm激发波长条件下，实现荧光检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明以菠萝蛋白酶为模板，采用一步合成法制备菠萝蛋白酶-金锌纳米簇，产物表现出独特的光物理特性、毒性低、稳定性良好和优异的生物相容性。
2、本发明制备的菠萝蛋白酶-金锌纳米簇，检测S2-方法简单便捷、检测灵敏度好，检测限低，是应用于生物和医学领域的理想荧光纳米材料。
附图说明
图1为本发明制备的菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的激发光谱和发射光谱图；
图2为本发明不同比例的氯金酸和氯化锌合成菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的荧光光谱图；
图3为本发明不同反应时间合成菠萝蛋白酶-金锌纳米簇荧光光谱图；
图4为本发明不同温度合成菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的荧光光谱图；
图5为本发明不同浓度菠萝蛋白酶合成菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的荧光光谱图；
图6本发明加入不同浓度的S2-后，菠萝蛋白酶-金锌纳米簇溶液的荧光发射光谱图；
图7本发明S2-浓度与菠萝蛋白酶-金锌纳米簇荧光强度之间的线性关系图。
具体实施方式
下面结合附图将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
提高产物的发光性能，包括以下步骤：
称量一定量的菠萝蛋白酶固体，加入400μL水溶解，将90μL浓度为10mM的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入30μL浓度为10mM的氯化锌溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1M的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液pH；混合溶液水浴加热，得到产物。利用荧光光谱仪检测产物的激发光谱和发射光谱。改变氯化锌体积以改变氯金酸和氯化锌的浓度比，检测荧光光谱，当氯金酸和氯化锌的浓度比为5:1时，荧光强度达到最强；因此选择氯金酸和氯化锌的浓度比为5:1作为制备菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的最佳反应比例。
称量一定量的菠萝蛋白酶固体，加入400μL水溶解，将90μL浓度为10mM的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入18μL浓度为10mM的氯化锌溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1M的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液pH；混合溶液水浴加热0.5小时，得到产物，并利用荧光光谱仪检测产物的发射光谱。增加反应时间，检测荧光光谱，随着反应时间增加，荧光强度逐渐增强，当反应时间为2小时，荧光强度最佳。因此选择2小时作为制备菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的最佳时间。
称量一定量的菠萝蛋白酶固体，加入400μL水溶解，将90μL浓度为10mM的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入18μL浓度为10mM的氯化锌溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1M的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液pH；混合溶液25℃条件下水浴加热2小时，得到产物，并利用荧光光谱仪检测产物的发射光谱。增加反应温度，检测荧光光谱，随着反应温度增加，荧光强度逐渐增强，当反应温度为45℃时，荧光强度最佳。因此选择45℃作为制备菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的最佳温度。
称量8mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μL水溶解，将90μL浓度为10mM的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入18μL浓度为10mM的氯化锌溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1M的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液pH；混合溶液45℃条件下水浴加热2小时，得到产物，并利用荧光光谱仪检测产物的发射光谱。增加菠萝蛋白酶浓度，检测荧光光谱，随着菠萝蛋白酶浓度的增加，荧光强度逐渐增强，当使用40mg ml-1的菠萝蛋白酶时，荧光强度最佳；因此选择40mg ml-1菠萝蛋白酶作为制备菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的最佳浓度。
以菠萝蛋白酶-金锌纳米簇为荧光探针检测S2-：
将不同浓度的S2-溶液加入至菠萝蛋白酶-金锌纳米簇溶液中，并在室温条件下孵育。在375nm激发波长条件下，随着S2-浓度的增加，菠萝蛋白酶-金锌纳米簇在655nm处的荧光强度逐渐减弱，而475nm处的荧光强度保持不变。
(一)菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的制备及优化
实施例一：称量16mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μL水溶解，将90μL浓度为10mM的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入18μL浓度为10mM的氯化锌溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1M的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液pH；混合溶液在45℃条件下水浴加热2小时，用分子截留量为12-14kDa的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金锌纳米簇。如图1所示，在375nm激发波长下，在475nm和655nm处分别有两个荧光发射峰。
实施例二：称量16mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μL水溶解，将90μL浓度为10mM的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入30μL浓度为10mM的氯化锌溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1M的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液pH；混合溶液在45℃条件下水浴加热2小时，用分子截留量为12-14kDa的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金锌纳米簇。
实施例三：称量16mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μL水溶解，将90μL浓度为10mM的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入15μL浓度为10mM的氯化锌溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1M的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液pH；混合溶液在45℃条件下水浴加热2小时，用分子截留量为12-14kDa的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金锌纳米簇。
实施例四：实施例一、实施例二、实施例三得到的菠萝蛋白酶-金锌纳米簇，如图2所示，在375nm激发波长下，通过比较其荧光强度，确定当氯金酸与氯化锌的比例为5:1时，菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的荧光发射强度最强。
实施例五：称量16mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μL水溶解，将90μL浓度为10mM的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入18μL浓度为10mM的氯化锌溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1M的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液pH；混合溶液在45℃条件下水浴加热1小时，用分子截留量为12-14kDa的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金锌纳米簇。
实施例六：称量16mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μL水溶解，将90μL浓度为10mM的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入18μL浓度为10mM的氯化锌溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1M的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液pH；混合溶液在45℃条件下水浴加热3小时，用分子截留量为12-14kDa的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金锌纳米簇。
实施例七：称量16mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μL水溶解，将90μL浓度为10mM的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入18μL浓度为10mM的氯化锌溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1M的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液pH；混合溶液在45℃条件下水浴加热4小时，用分子截留量为12-14kDa的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金锌纳米簇。
实施例八：实施例一、实施例五、实施例六、实施例七得到的菠萝蛋白酶-金锌纳米簇，如图3所示，在375nm激发波长下，通过比较其荧光强度，确定反应时间为2小时，菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的荧光发射强度最强。
实施例九：称量16mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μL水溶解，将90μL浓度为10mM的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入18μL浓度为10mM的氯化锌溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1M的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液pH；混合溶液在25℃条件下水浴加热2小时，用分子截留量为12-14kDa的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金锌纳米簇。
实施例十：称量16mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μL水溶解，将90μL浓度为10mM的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入18μL浓度为10mM的氯化锌溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1M的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液pH；混合溶液在55℃条件下水浴加热2小时，用分子截留量为12-14kDa的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金锌纳米簇。
实施例十一：实施例一、实施例九、实施例十得到的菠萝蛋白酶-金锌纳米簇，如图4所示，在375nm激发波长下，通过比较其各自荧光发射强度，确定当反应温度为45℃时，荧光发射强度最强。
实施例十二：称量8mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μL水溶解，将90μL浓度为10mM的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入18μL浓度为10mM的氯化锌溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1M的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液pH；混合溶液在45℃条件下水浴加热2小时，用分子截留量为12-14kDa的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金锌纳米簇。
实施例十三：称量12mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μL水溶解，将90μL浓度为10mM的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入18μL浓度为10mM的氯化锌溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1M的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液pH；混合溶液在45℃条件下水浴加热2小时，用分子截留量为12-14kDa的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金锌纳米簇。
实施例十四：实施例一、实施例十二、实施例十三得到的菠萝蛋白酶-金锌纳米簇，如图5所示，在375nm激发波长下，通过比较其各自荧光发射强度，确定当菠萝蛋白酶浓度为40mg ml-1时，荧光发射强度最强。
(二)菠萝蛋白酶-金锌纳米簇作为荧光探针检测
实施例十五：将不同浓度的S2-溶液加入到菠萝蛋白酶-金锌纳米簇溶液中，使其终浓度为100～500μM，在室温下孵育20分钟后，用荧光光谱仪检测375nm激发波长下的荧光光谱。
本发明中披露的说明和实践，对于本技术领域的普通技术人员来说，都是易于思考和理解的，且在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1、称量一定量的菠萝蛋白酶固体，加入400μL水溶解，将氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入氯化锌溶液，室温下混合均匀，得到溶液A；
S2、将适量浓度为1M的氢氧化钠溶液加入至步骤S1得到的溶液A中，混合均匀，溶液水浴条件下加热0.5-4小时，得到溶液B；
S3、将步骤S2得到的溶液B，用分子截留量为12-14kDa的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，以去除未反应的反应物，使蛋白尽可能的恢复到天然状态，产物保存在4℃条件下，得到菠萝蛋白酶-金锌纳米簇。
2.根据权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，菠萝蛋白酶浓度为40mg ml-1。
3.根据权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，氯金酸和氯化锌的浓度比为5:1。
4.根据权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，反应时间为2小时，反应温度为45℃。
5.一种采用权利要求1所述的制备方法制得的菠萝蛋白酶-金锌纳米簇在S2-检测中的应用，其特征在于，将不同浓度的S2-溶液加入至菠萝蛋白酶-金锌纳米簇中，并在室温下孵育；激发波长条件下，随着S2-浓度的增加，菠萝蛋白酶-金锌纳米簇的荧光强度逐渐减弱，实现检测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在室温条件下孵育20分钟，在375nm激发波长条件下，实现荧光检测。
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