CN108474778A - 利用集成方法来进行基于逆转录聚合酶链式反应（rt-pcr）和/或dna/蛋白质阵列的分析的装置 - Google Patents

利用集成方法来进行基于逆转录聚合酶链式反应（rt-pcr）和/或dna/蛋白质阵列的分析的装置 Download PDF

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Abstract

一种装置，其利用集成方法用于进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT‑PCR）和/或阵列的分析，所述分析涉及信号产生剂（金纳米簇），包括选择性地用DNA和蛋白质作为模板进行基于加热和冷却循环的合成。本发明进一步涉及一种适于基于共用检测剂进行基于RT‑PCR和阵列的基因和蛋白质表达分析的便携式装置，所述分析涉及原位合成金纳米簇的发光，所述装置用于用户友好地适应图形用户界面（GUI）以控制、可视化和分析数据。

Description

利用集成方法来进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR） 和/或DNA/蛋白质阵列的分析的装置
技术领域
本发明涉及一种装置，所述装置利用集成方法来进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和/或DNA/蛋白质阵列的分析，并且更具体地涉及一种简单且方便使用的便携式装置，所述装置包括热循环仪兼可视化单元，从而能够在有效可视化逆转录聚合酶链式反应终产物或基于阵列的膜下在单个装置中进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、终产物PCR定量、基于阵列的DNA和蛋白质表达分析。有利地，便携式装置将会进一步有助于以稳健而简单的方式进行关于基因组学和蛋白质组学的研究，而无需使用任何已知的致癌物质、昂贵的化学物质和合成繁琐的探测分子。
背景技术
指导活细胞应答的细胞信号传导和相关事件序列受到高度复杂且受调控的基因表达模式的控制，所述基因表达可以在mRNA或蛋白质水平实现。各种技术进步促成了基因组学和重要的蛋白质组学的发展，从而革命性地改变了细胞过程的研究。例如，聚合酶链式反应（PCR）[H. D. Van Guilder等人, BioTechniques 2008, 44, 619；美国专利号4683195]和微阵列（A. L. Beaudet, Annu. Rev. Med. 2008, 59, 113；D. S. Wilson等人 Angew, Chem. Int. Ed. Engl. 2003, 42, 494）广泛地大规模地用于基因表达研究。
已知不稳定的mRNA通常通过逆转录酶转化为cDNA。然后，通过使用cDNA作为模板来扩增感兴趣的基因，以通过PCR估计特定靶标或将特定靶标与参考基因（管家基因）进行比较。这种方法的变型有很多种。在一种类型的测定中，通过琼脂糖凝胶基质然后溴化乙锭染色分析参考基因和靶基因的末端扩增产物。另一项革命性技术，即创造性实时PCR，不仅扩增了目标序列和参考序列，还允许在扩增过程中同时进行检测和定量。通常，在进行扩增之前将荧光探针添加到PCR反应混合物，所述混合物的发射强度随着扩增子的量成比例地增加。在扩增过程中，用适当波长的光激发样品，并且以不同的时间间隔测量样品的荧光输出。常规的PCR技术一次只能测量少量基因，这使得难以分析生物体的全基因组。
微阵列技术有助于科学家同时研究数以千计的基因。对于mRNA、DNA的测序、药物发现、途径研究和基因分型，主要使用了微阵列技术。基于DNA微阵列的技术主要是基于探针和靶DNA的杂交（A. A. Gibriel, Brief Funct Genomics 2012，11，311）。蛋白质微阵列是一种用于研究多种蛋白质的基于高通量阵列的方法。然而，蛋白质微阵列技术并不简单，这主要是由于源自翻译后修饰的蛋白质（3D）的结构多样性。此外，未知的结合相互作用、受限且多样的浓度、样品降解、特异性、药物和疾病扰动引起这个技术的主要障碍（M . F.Templin等人 Trends Biotechnol. 2002, 20, 160；V. Espina等人 J. Immunol.Methods 2004, 290, 121）。广义而言，蛋白质微阵列用非常少量的已知特定分子（均质或非均质）进行图案化。这些已知分子（可以是抗体、细胞或噬菌体裂解物、肽、药物、核酸等）必须是纯的、相当浓缩的并且应当是其天然形式。通常，探针或任何未知生物样品被固定到阵列中的特定已知的分子上。探针分子含有信号产生剂，其信号被捕获和分析。
虽然PCR和微阵列技术为基因组学和蛋白质组学研究带来了革命性的变化，但这些技术存在一定的短处，因为它们涉及复杂的步骤、高级的仪器、受过训练的个体和高成本因素。微阵列常常与PCR技术结合以获得足够量的探针和靶cDNA。而且，在其他情况下，PCR通常用于补充微阵列的结果以将研究集中于特定基因序列（H. Cho等人 Chem. Commun.2012, 48, 7601）。所采用的资源昂贵且通常不是环境友好型的；已知用于鉴定PCR中的终产物的染料如溴化乙锭具有致癌性，并且需要特别注意其使用和排放。在实时PCR和微阵列中，采用的探针是昂贵的，并且有时需要设计制备染料-探针缀合物所必需的序列特异性寡核苷酸染料缀合物以实现稳定相互作用，产生最佳信号（J. B. Randolph等人 NucleicAcids Res. 1997, 25, 2923）。这些分子荧光团甚至表现出光漂白、光闪烁，从而降低了信号检测的效率。常规的荧光团通常需要额外的修饰，以使其变成水溶性的或增加溶解度（B.G . Moreira. Biophys. Chem. 2015, 198, 36；M. E. Sanborn J. Phys. Chem. B2007, 111, 11064）。
迄今采用的大多数传统技术都需要在与其靶标分析物相互作用之前标记探针，这可能影响探针的稳定性，从而降低相互作用的效力。在其他方法中，采用可能导致有害的核废料累积的放射性标记（V. Espina等人 J. Immunol. Methods 2004, 290, 121）。常规的微阵列技术采用若干种预处理和后处理方法。常常地，感兴趣的情况是不检查完整基因组，而是仅检查一些感兴趣的基因（L. Quijada等人, Exp. Parasitol. 2005, il l , 64）。但他们仍然需要采用用于整个芯片的复杂制造程序。这使得在先进设施不可用的地理位置难以进行分析。
已知纳米材料提高了热效率、相互作用的特异性、催化特性并且具有将生物分子吸附在其表面上的能力。基于这些特性，纳米材料在基因组学和蛋白质组学领域中的应用（M. R. Mohamadi等人 Nano Today 2006, 1, 38；US 2012/0244075 Al）出现在若干种方法中，以增强现有技术在基于PCR和微阵列的技术中的效力。纳米粒子、量子点、碳纳米管、碳纳米粉末、石墨烯等都是一些显示出改善PCR过程效力的材料（X. Lou等人 Mater.Interfaces 2013, 5, 6276；F. Sang等人, J Biomed. Sci. Eng. 2012, 05, 295）。用于定量PCR产物的尝试已经通过利用纳米材料的等离激元特性来进行（M . A. Cai等人 NanoResearch 2010, 3, 557）。金纳米粒子的等离激元特性已用于微阵列中对生物标志物样品的比色检测中（D. Kim.等人. Anal. Chem. 2009, 81 , 9183）。由于与常规有机染料/探针相比的若干个优点，量子点已在涉及基因和蛋白质表达研究的分析中用作荧光探针（R.Q. Liang Nucleic Acids" Res. 2005, 33, el7）。
一类称为纳米团簇的纳米材料是作为用于探测基因和蛋白质表达的荧光团的潜在选择。这些纳米簇（特别是贵金属纳米簇）超小并且由很少原子组成、具有高度光稳定性、低光闪烁性、无毒性、生物友好性和非致癌性，这使得它们的优势超过等离激元纳米粒子、常规有机荧光团和量子点（X. Yuan. ACS Nano 2011, 5, 8800）。纳米团簇处于最低维度（量子域），与生物分子诸如DNA/蛋白质的结构单元相互作用。最近的一篇报道展示了与抗体缀合的BSA稳定的金纳米簇用于免疫感测的用途（H. Liu等人 J. Phys. Chem. C 2012,116, 2548）。
然而，在设计一种独特的方法以在所需的生物相互作用之后使用生物分子自身作为模板简单且快速地合成这些信号传导剂是一项挑战。所述方法将确保参与生物分子的高效相互作用，因为在特定相互作用发生后在模板上进行合成。这还将消除如在许多其他程序中所采用的在相互作用/扩增之前/之后进行单独合成或表面修饰或加标签所花费的额外人力和时间。就这一点而言，基于纸的方法是非常受关注的，因为它们较便宜、易于处理、灵活、容易处置、广泛可得并且可以容易地在医学诊断领域采用（M. N. Costa等人 Nanot2014, 25, 094006；D. D. Liana等人 Sensors (Basel) 2012, 12, 11505）。尤其地，在基因和蛋白质表达研究中，硝酸纤维素和PVDF（聚偏二氟乙烯）膜由于其带电性质以及与化学物质和生物分子的相容性而被广泛使用。这些具有均匀孔径的稳定膜适用于构建便携式装置，诸如用于现场诊断的传感器。
为了克服现有方法的挑战并促进基因组学和蛋白质组学的研究，因此需要使用更简单仪器将实现准确且灵敏的诊断的低成本、简单、用户和生物友好型技术。
发明目的
因此，本发明的基本目的是提供一种用于在单个单元中进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和/或阵列的分析而不需要多个单独装置、费时又费力程序的装置，所述装置如上文所论述是高度所需的且在相关领域中具有挑战性。
本发明的另一个目的是提供一种用于进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和/或阵列的分析的共用装置，所述分析涉及用于原位合成信号产生发光剂的热循环仪的加热和冷却循环以有效可视化逆转录聚合酶链反应终产物或基于阵列的膜。
本发明的另一目的是提供一种用于基于PCR和阵列的技术的方法，所述方法用于通过可视化进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和/或阵列的分析，所述可视化涉及原位信号产生发光剂。
本发明的另一个目的是提供一种用于可视化方法，所述方法涉及用于基于PCR和阵列的技术的原位信号产生发光剂，涉及作为信号产生剂的金纳米簇的发光强度，所述发光强度随着dsDNA浓度或蛋白数量而单调增加。
本发明的另一个目的是提供一种用于基于PCR和阵列的技术的方法，所述方法是生物友好型的、非致癌的且涉及最小前体浓度并且选择性地涉及金纳米簇，所述金纳米簇为高度光稳定的并且在液相中和固相中表现出发光发射。
本发明的另一个目的是提供一种包括基于阵列的技术以一次研究多种基因/蛋白质的相对表达的方法。
本发明的又另一个目的是提供一种用于基于PCR和阵列的技术的方法，所述方法摆脱了对信号产生剂（簇）的任何必需的单独合成、表面修饰和对特异性探测分子的需求。
发明内容
因此，根据本发明的基本方面，提供了一种用于进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和/或阵列的分析的装置，所述装置包括：
选择性地用于保持PCR管的样品载架和用于支撑用于基于阵列的检测的膜的载台；
用于支撑在任何所述样品载架上的样品的加热和冷却循环的装置；用于可视化逆转录聚合酶链反应的终产物或基于阵列的膜以用于基于信号产生发光剂的分析的装置；
所述用于可视化的装置包括光源和成像。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和/或阵列的分析的装置，所述装置包括：
选择性地用于保持PCR管的样品载架和用于支撑用于基于阵列的检测的膜的载台；
用于支撑在任何所述样品载架上的样品的加热和冷却循环、以及用于原位合成有效可视化逆转录聚合酶链式反应的终产物或基于阵列的膜所必需的信号产生发光剂的装置；
可视化装置，其包括光源和成像。
根据另一方面，本发明提供了一种装置，所述装置包括：
i）热循环仪单元，其包括：
所述选择性地用于保持PCR管的样品载架和用于支撑用于基于阵列的检测的膜的载台；
所述用于支撑在任何所述样品载架上的样品的加热和冷却循环的装置；
所述用于样品的加热和冷却循环的装置，所述装置提供了原位合成信号产生发光剂以有效地可视化逆转录聚合酶链式反应的终产物或基于阵列的膜；以及
ii）可视化单元，其包括：
用于提供照射源的UV光源；和
用于捕获图像的相机。
所述热循环仪单元和所述可视化单元优选地通过程序上开发的GUI与计算机装置连接。
在另一个方面，本发明提供了一种装置，其中，所述样品载架包括：（a）具有至少7个孔以保持PCR管和温度传感器的PCR管载架块和（b）用于支撑用于所述基于阵列的分析的膜的载台；所述用于所述样品的加热和冷却循环的装置包括（a）加热/冷却元件，其具有风扇和散热器以加热/冷却PCR管、载架块以及盖子，所述盖子具有加热元件、用于监测载架块的温度和PCR管的顶部加热的温度传感器，和（b）用于加热和冷却所述用于支撑膜的载台的装置；
所述可视化装置包括UV光源以给予照射源和网络相机以捕获图像。
本发明的又另一方面提供了一种装置，其中所述具有所述加热装置的所述样品载架适于达到在15℃至95℃范围内的温度，所述具有加热元件的盖子适于达到在室温与120℃之间的温度。
本发明的另一个方面提供了一种装置，所述装置包括对热循环仪的输入参数的基于GUI的控制，所述输入参数包括过程（PCR/基于阵列的分析/自定义实验）、操作阶段、温度参数、盖子控制（ON/OFF）、盖子温度、启动/停止过程以及生成样品块和盖子的当前状态和温度；
用于所述可视化单元的另外的GUI，其使得能够获取、分析和生成报告；所述获取使得能够获取图像、控制图像的模式并控制相机设置；
所述获取使得用户能够向图像应用阈值、选择和观看感兴趣区域（ROI）、可视化图像的3D视图、获取直方图数据、执行区域和线分布分析；以及
所述报告使得能够生成所有选择的ROI的概述、输出数据、执行拟合分析并且使用线性回归技术来帮助估计样品的量。
在另一方面，本发明提供了一种用于提供通过可视化进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和/或阵列的分析的方法，所述方法涉及所述装置，所述方法包括：
在所述热循环仪中，在受控的加热和冷却循环下进行以下项中的任一项：（i）将基因在所述PCR管保持器中用所需引物扩增为PCR产物（dsDNA）和（ii）与用于基于阵列的基因表达研究的互补ssDNA进行基于膜的杂交或与用于基于阵列的蛋白质表达研究的抗原/抗体一起温育；
在所述（a）如此获得的PCR产物（b）上述步骤（ii）的膜上的杂交产物或温育蛋白质（相互作用的抗原-抗体）产物中的任何一者上进行原位合成所述信号产生发光剂；
在所述可视化单元中对所述发光剂标签的（a）PCR产物（b）膜上的杂交产物或温育蛋白质（相互作用的抗原-抗体）产物中的任何一者或多者进行迅速可视化，从而推断基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和/或阵列的分析的结果。
在又另一方面，本发明提供了一种方法，其中所述将基因在所述PCR管保持器中用所需引物扩增为PCR产物的步骤包括以下步骤：
在热循环仪中通过逆转录酶、通过在42℃下加热40 min然后在95℃下后续加热2 min将分离的mRNA转化成cDNA；
在热循环仪中在受控的加热和冷却循环下使用所需引物和2X PCR主混合物扩增特定cDNA；
进行所述信号产生发光剂的原位合成包括在如此获得的PCR产物上与扩增成比例地合成金纳米簇。
本发明的另一方面提供了一种方法，所述方法包括：
提供所述杂交产物包括以下步骤：（i）提供具有ssDNA的膜；和（ii）使所述膜与互补的靶ssDNA杂交，
所述进行所述信号产生发光剂的原位合成的步骤包括在所述杂交产物上合成金纳米簇；
所述在所述可视化单元中迅速可视化的步骤包括对所述杂交产物上的金纳米簇进行可视化并捕获图像和定量基因表达。
本发明的另一方面提供了一种方法，所述方法包括使所述膜与互补靶ssDNA杂交，其中所述互补靶ssDNA通过以下方式获得：（i）如果可获得足够浓度的话，则将mRNA转化为cDNA，或（ii）如果不能获得足够浓度的话，则将mRNA转化为cDNA，然后通过PCR通过基因特异性引物扩增所需基因并且涉及将所述PCR扩增产物用于所述杂交。
在另一个方面，本发明提供了一种方法，所述方法包括通过可视化进行用于基于阵列的蛋白质表达研究的基于阵列的分析，其包括：提供膜；
将一抗/抗原印迹在膜上；
将膜与抗原/抗体一起温育；
进行所述信号产生发光剂的原位合成，其包括在所述膜上合成金纳米簇，从而与抗原/抗体一起温育；
在所述可视化单元中的快速可视化，其包括对所述膜上的金纳米簇进行可视化，从而与抗原/抗体一起温育并捕获图像并定量蛋白质表达。
在又另一方面，本发明提供了一种方法，其中所述金纳米簇的合成涉及HAuC溶液和3-巯基丙酸。
本发明的另一个方面提供了一种生物友好型的、非致癌的且需要最小前体浓度的方法，并且其中所述金纳米簇具有高度光稳定性并且当在λex=254 nm（254 nm光用于装置中的激发，300 nm用于光谱研究）激发时表现出发光发射（λem=580 nm），金簇的发光强度随着dsDNA的浓度或蛋白质的量单调增加。
本发明的另一个方面提供了一种用于基于发光强度进行相对DNA/蛋白质定量的方法，其没有常规荧光团（染料/探针）。
本发明的又另一方面提供了一种方法，所述方法摆脱了对信号产生剂（簇）的任何必需的初始单独合成、表面修饰和对特异性寡核苷酸的需求，并且其中Au NC的合成可以直接在DNA自身上进行。
在另一方面，本发明提供了一种方法，所述方法包括用于基因表达研究的基于纸的阵列技术，其涉及在具有金纳米簇作为信号产生剂的硝化纤维素膜上的杂交，有效地涉及与dsDNA相比时ssDNA中的金簇的较低发光强度。
在另一个方面，本发明提供了一种方法，所述方法摆脱了对信号产生剂的任何必需的初始加标签（荧光团、光学探针、放射性标记等）、探测分子的单独合成。
在又另一方面，本发明提供了一种方法，所述方法包括基于阵列的技术以一次研究多种基因的相对表达。
本发明的另一方面提供了一种方法，其中所述基于阵列的方法包括通过研究三种基因即Caspase 3、BCL 2、BAX相对于作为对照的β-肌动蛋白的表达来分析细胞的凋亡途径。
本发明的另一个方面提供了一种方法，所述方法用于基于发光强度而不使用常规荧光团（染料/探针）并且不存在对簇的初始单独合成、表面修饰来进行相对蛋白质定量。
本发明的另一方面提供了一种方法，所述方法包括用于蛋白质表达研究的基于纸的阵列技术，其涉及具有金纳米簇作为信号产生剂的PVDF膜上的抗体-抗原相互作用，涉及下述观察结果：在固相中，当与相互作用的抗原-抗体相比时抗原或抗体中的来自所形成簇的发射强度更小，这与存在的蛋白数量相关联。
在另一方面，本发明提供了一种方法，所述方法摆脱了对信号产生剂的任何初始加标签（荧光团、光学探针、放射性标记、酶标记等）或探测分子的单独合成。
在另一方面，本发明提供了一种方法，其中基于阵列的方法包括直接标记方法，并且不需要用于检测的二抗。
在另一个方面，本发明提供了一种方法，其中基于阵列的方法有助于一次研究多种蛋白质的表达。
本发明的另一方面提供了一种方法，所述方法包括基于阵列的方法，其中GST（谷胱甘肽S-转移酶）抗体被固定并且使对应的GST标签的抗原相互作用，并且其中GST标签的抗原的量可以由合成的金纳米簇的发光强度相对地定量。
本发明的另一个方面提供了一种方法，所述方法用于在用254 nm光激发时在固相中具有低强度水平的情况下增强金纳米簇的发光强度，涉及用于信号放大的锌离子。
在又另一方面，本发明提供了一种稳健、便携式且易于操作的装置。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PC）和/或阵列的分析的方法，产生信号产生剂（簇）的步骤包括选择性地用DNA和蛋白质作为模板进行基于加热和冷却循环的合成。
根据上述方法的优选方面，所述基于加热和冷却循环的合成涉及PCR加热和冷却循环。根据上述方法的又另一方面，所述基于加热和冷却循环的合成包括合成金纳米簇。
附图说明
图1示出了用于0.2 mL PCR管的样品保持器的结构细节。在SI处安装温度传感器，并且HI至H6分配用于保持PCR管。
图2示出了用于0.2 mL PCR管的盖子的结构。在HE1处放置加热元件并将温度传感器放置在S2中。
图3显示了膜保持板的结构。此处S3表示温度传感器的安装。膜将滑动（放置）在板的表面（Ml）上。
图4表示配备有UV源（UV）的可视化单元的结构的框图，所述UV源由可互换的管（即，用于短波长、中波长和长波长UV源）组成。它还包括相机源（CS），其用于捕获放置在图中指示的样品座（SM）上的感兴趣样品。
图5表示装置的不同功能单元的框图。
图6表示使用金纳米簇的基于阵列的基因表达研究所采用的程序流程图。
图7表示使用金纳米簇的基于阵列的蛋白质表达研究所采用的程序流程图。
图8示出了从本发明装置获得的PCR终产物相对于使用商业装置获得的PCR终产物的对比。此处，泳道L1、L2分别对应于来自所提出的装置和商业装置的PCR扩增子。A）在UV照射下对凝胶的可视化。B）来自两台机器的PCR扩增子的相对发光强度。
图9描述了在液相中用金纳米簇对不同循环的PCR扩增子（β-肌动蛋白）的相对定量。A）在UV照射下对凝胶的可视化。B）对不同循环的PCR扩增子的相对发光强度。
图10表示在固定在硝酸纤维素膜上的ssDNA和dsDNA上合成的金纳米簇的发光强度。
A）UV照射下的灰度图像，其示出了在两行中的递增量（每行中从左至右，如由箭头所指示）的固定（点样）在硝化纤维素膜上的商业获得的ssDNA（β-肌动蛋白）（（i）0.18 μg、（ii）0.37 μg和（iii）0.74 μg）以及在第二行中杂化的不同量的互补靶ssDNA（商业获得）（（i）0.18 μg、（ii）0.37 μg和（iii）0.74 μg），在它们上合成有金纳米簇。B）针对ssDNA和dsDNA的递增量的金纳米簇的相对发光强度。
图11表示在固定在硝化纤维素膜上的商业获得的基因序列中合成的金纳米簇的发光强度。
A）UV照射下的膜中阵列的灰度图像，其示出了递增量（每行中从左至右，如由箭头所指示）的分别固定在硝酸纤维素膜上每行中的商业获得的-肌动蛋白、BCL 2、BAX和Caspase 3的ssDNA序列（（i）0.18 μg、（ii）0.37 μg、（iii）0.74 μg和（iv）1.1 g）以及递增量的互补靶ssDNA被杂交（（ⅰ）0.18 μg、（ⅱ）0.37 μg、（ⅲ）0.74 μg和（iv）1.1 μg），在它们上合成有金纳米簇 B）针对各种基因金纳米簇随着杂交DNA量的增加的相对发光强度。
图12示出了A）和B）UV照射下的对照和处理Hela细胞（分别地）的基因表达水平的灰度图像，通过基于阵列的技术进行分析，使用金纳米簇作为信号产生剂。将递增量（每行中从左至右，如通过箭头所指示）的ssDNA的固定在硝酸纤维素膜上以进行分析（i）0.18 μg、（ii）0.37 μg和（iii）0.74 μg）。使递增量的来自对照和处理细胞的PCR产物进行杂交（（ⅰ）0.18 μg、（ⅱ）0.37 μg和（ⅲ）0.74 μg）。然后在膜的斑点上合成金纳米簇。C）如从膜分析的对照和处理HeLa细胞中各种基因的相对发光强度。D）利用EtBr染色的标准凝胶电泳。LI和L2泳道对应于对照和处理样品。
图13示出了在液相中用蛋白质BSA（牛血清白蛋白）作为模板合成金纳米簇。
图14示出了在液相中使用不同蛋白质合成金纳米簇。
图15示出了用液相中的金纳米簇的发光强度探测抗原-抗体相互作用。
图16示出了用合成在PVDF膜上的金纳米簇的发光强度探测抗原-抗体相互作用。
A）在两行中以递增量（从左至右，如通过箭头所指示）固定在PVDF膜上的抗谷胱甘肽-S-转移酶（抗体）在UV照射下的灰度和RGB图像（（i）0.1 μg、（ii）0.2 μg和（iii）0.4 μg）。然后，仅在一行中以递增量温育GST（抗原）（（i）0.1 μg、（ii）0.2 μg和（iii）0.4 μg）。然后在所有斑点上合成金纳米簇。B）如从膜分析的各种量的抗原和抗原-抗体的相对强度，反过来也可以在GST抗原最初固定在膜上，然后如C和D所示那样温育抗GST的情况下进行。
图17示出了使用金纳米簇的蛋白质表达水平研究。
A）UV照射下PVDF膜的灰度图像，抗GST抗体（（i）0.1 μg、（ii）0.2 μg和（iii）0.4 μg）固定在PVDF膜上并且与GST标签的hGMCSF (（i）0.08 μg、（ii）0.16 μg和（iii）0.32 μg)和纯GST (（i）0.1 μg、（ii）0.2 μg和（iii）0.4 μg)相互作用。将递增量的仅仅GST标签的hGMCSF、纯GST和Ab（抗GST）固定在PVDF膜上以用于比较和分析。B）蛋白质表达的相对发光强度分析，C）纯GST和GST标签的hGMCSF的SDS PAGE结果。
图18表示在固相中用锌离子进行的荧光增强 A、B）在dsDNA/蛋白质上的金纳米簇合成后在不添加和添加锌的情况下UV照射下的硝化纤维素/PVDF膜的灰度图像。C、D）在不添加和添加锌的情况下的相对发光强度分析。
具体实施方式
因此，本发明提供了一种便携式、易于操作的装置以及一种用于进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和/或阵列的分析的方法，使用了原位产生的出现在液相和固相中的信号产生发光剂（液相-mRNA的逆转录、DNA的扩增、信号产生剂的合成；固相-信号产生剂的合成、进行相关基因和蛋白质表达水平研究）。所述装置基于模块化方法，因此其不同的部件是独立地触及的。
所述装置包括：
1.热循环器单元，其有助于实现15℃与95℃之间的温度以加热/冷却样品，所述热循环器单元包括：
a.用于冷却的风扇
b.用于加热和冷却保持器的珀尔帖
c.可切换保持器，其中保持器适用于基于PCR过程和阵列的分析、配备有温度传感器
d.盖子，其具有加热元件（筒型加热元件）和温度传感器
2.可视化单元，其允许在适当激发下捕获图像并进一步进行分析，所述可视化单元包括：
a.UV照射源，其具有可切换灯（长波长、短波长和中波长；电池供电）
b.相机，其具有来自GUI的可控属性
3.计算机/膝上型电脑，其用于运行GUI（针对热循环仪和可视化单元的图形用户界面。）
4.电子电路，其由Arduino Uno接口板组成以执行各种操作和附加电路。
5.电源单元。
热循环仪所需的附加电路被设计并安装在Arduino Uno板上。但是，微控制器单元是通过图形用户界面控制的。整个单元可以使用能够供应12 V和10 A的电源运行。针对热循环仪单元和可视化单元的图形用户界面（GUI）是使用LabVIEW平台开发的。
因此，本发明涉及一种用于研究相关基因和蛋白质表达的有效方法，所述方法使用共用的原位产生的信号产生发光剂，而不使用昂贵的设备、致癌材料和特定探测分子的合成。
本发明的共用的信号产生发光剂优选为金纳米簇，其具有高度光稳定性，并且直接在装置中的PCR产物/杂交斑点/蛋白质上合成。用于合成金纳米簇的方法容易嵌入到PCR的传统温度循环过程（也在温度限制内）中，因此不如使用传统染料/其他纳米材料作为信号产生剂的情况那样需要具有单独实验条件的外部制备。涉及合成金纳米簇的条件不仅进行合成，而且进一步帮助杂交。因为信号产生剂对于RT-PCR或DNA/蛋白质阵列而言是相同的，所以单一UV激发是足够的。这些均匀的纳米簇不需要进一步的表面修饰。
当在液相中以254 nm激发（在装置中使用254 nm光作为获得发射的光源，使用300nm 光用于光谱学研究）时金纳米簇发射580 nm下的光。据观察，随着dsDNA/蛋白质浓度的增加，金簇的发光强度单调增加。因此，这将能够区分DNA/蛋白质的浓度与簇的强度。
重要的是，这种发光行为被用于研究蛋白质表达，其中在特异性抗原-抗体相互作用的情况下，相对发光改变，从而表示相互作用的程度。所述发光行为也有用于凋亡介导的细胞死亡的基因表达，其中在体外研究三种凋亡途径调控基因BCL-2（B细胞淋巴瘤2）、BAX（BCL2相关X蛋白）和Caspase 3的表达。
金纳米簇的发光强度可以通过锌离子的相互作用而增强。在基于阵列的技术涉及DNA和蛋白质的情况下，如果低于可检测极限，则添加最佳量的锌离子导致信号强度增加而不改变结果。
下面通过举例的方式论述每个部分和功能属性的详细描述。
实施例1：装置的功能特征
i）热循环仪单元：
热循环仪的硬件由以下项构成：用于0.2 mL PCR管的可切换样品保持器和用于放置膜的载台、具有筒型加热器作为加热元件的盖子、两个温度传感器、具有风扇的散热器、用于加热和冷却的珀耳帖元件、基于Arduino Uno的微控制器单元、A/B型USB电缆和电子电路。热循环仪由用G语言（LabVIEW）编码的图形用户界面（GUI）控制。
样品保持器由铝制成，如图1所示。它由7个孔组成，HI至H6用于保持样品，并且SI用于温度传感器。样品保持器的侧面用隔热材料屏蔽。保持器的底部暴露于加热并冷却样品保持器的珀耳帖单元。珀耳帖单元连接到散热器，而散热器又连接到风扇。整个组件被保持在四个支撑体上。样品保持器可以实现在15℃至95℃范围内的温度。
维持PCR管顶部的高温以避免管内冷凝。这通过如图2所示的位于PCR管帽上方的铝盖提供。盖子由周边上的两个孔组成，HE1用于加热元件以加热盖子，并且S2用于温度传感器。盖子被筒型加热元件加热并定位于PCR管帽的上方，并且可实现从室温至120℃的温度。
可安装温度传感器的另一个板用于加热和冷却用于基于阵列的研究的基于纸张的膜（最大尺寸为40 mm×40 mm），如图3所示。该板设置有延伸部S3以安装温度传感器。膜将滑动（放置）在板的表面（Ml）上。
可切换的保持器有助于同时进行基于RT-PCR和阵列的技术。基于Arduino Uno的微控制器单元用于执行各种操作。热循环仪所需的附加电路被设计并安装在Arduino Uno板上。但是，微控制器单元是通过图形用户界面（GUI 1）控制的。
热循环仪单元的GUI 1大致分为三个部分-输入设置、控制和指示器。
输入设置-在这个部分中，可以选择特定的过程，即PCR或基于阵列的分析。在PCR模式下，可以设置初始变性（开/关）及变性时间、最终延伸（开/关）及延伸时间。可以给定PCR的循环次数。此外，盖子（开/关）可以被控制成具有设置在室温至120℃之间的任何处的温度。还包括附加选项以提供预期启动过程的最大超时（以秒计）。如果在这段时间内没有启动过程，则机器将自动关闭。另外，可以设置自定义温度和时间段。
控制器-控制器涉及诸如启动过程、停止过程和退出应用的操作。
指示器-存在温度指示器，其连续地指示样品保持器/板和盖子的温度。超时计数器指示特定过程触发后的时间。还存在显示特定阶段是否超时的指示器。如果在预设时间内没有发生特定操作，则超时指示器会指示它并且机器会自动关闭。此外，还存在指示循环中的当前阶段和已完成的循环次数的指示器。还指示了特定阶段的运行时间。
i i）可视化单元
图4可视化单元由样品座（SM）组成，在所述样品座上放置待检查的特定样品。具有可互换管（用于短波长、中波长、长波长）的UV源（UV，6W，电池驱动）以倾斜角度安装以适当地照射样品区域。具有可调参数（通过GUI）的相机源（CS）用于捕获图像以供进一步分析。它也通过在LabVIEW中编程的GUI进行控制。GUI 2分为三个面板-获取、分析和生成报告。
获取-获取允许用户选择相机源并开始可视化样品。相机可以在自动模式或手动模式下操作。在自动模式下，相机尝试使用预设参数进行聚焦。但是，在手动模式下，用户可以改变参数以获取更好的结果。一旦实现所需图像，就允许用户捕获图像以供存储和进一步分析。
分析-分析面板允许用户以8位灰度模式获取图像。存在选项以向图像应用阈值。允许用户对感兴趣的区域或沿线进行分析。可以选择呈不同几何形状（诸如矩形、正方形、多边形、圆锥形或任何其他自由手绘形状）的感兴趣区域（ROI）用于分析。可以获得直方图数据，即区域、线分布上感兴趣线上的X, Y平均像素分布并且将其导出。此外，还并入了用可变参数对图像进行3D可视化的选项。每个ROI都可以用与其相关的数据单独进行可视化。
报告-此面板允许用户导出分析中获得的所有信息，快速绘制信息。另外，用户可以用线性回归技术来拟合点，并且可以根据拟合估计未知点。
i i i）功能相关性
参数的输入通过图形法完成，所述图形法可以完全控制机器并容易地实现对运行状态和结果的可视化。将PCR、基于阵列的技术和合成信号发生剂所需的条件并入在GUI中。另外，GUI被编码用于信号发生剂的可视化，并且甚至用于对获取的图像进行分析。将结果绘制在GUI中并导出。上述各种过程的组合使GUI具有在共用平台中带来多种过程的有用特征，成为可能这是一个有用的功能，这在商业机器中是不可获得的。
机器的不同部分以模块化方式构造。可切换样品保持器有助于PCR与基于阵列的分析之间的容易切换。
图5解释了整个装置的不同功能单元的相关性。
实施例2：用于基因表达研究的基于阵列的技术
对于基因表达研究，初始将靶基因（待观察的）的互补ssDNA固定在硝酸纤维素膜上。从感兴趣的细胞中分离RNA。通过逆转录从mRNA产生cDNA。如果cDNA具有足够的量，则将其与初始固定在膜上的基因特异性互补ssDNA杂交，并且进行金纳米簇的合成。如果获得的量较少，则通过PCR过程扩增以获得最佳量的靶基因。PCR产物被加热然后突然冷却（快速冷却）。然后将该产物杂交在膜的斑点上。然后在这些杂交斑点上制备金纳米簇，然后在UV照射下可视化。捕获图像并进一步分析基因表达的量化。这些步骤的布局（图6）将在下面的章节中详细论述。
步骤1：从靶细胞中分离RNA
将1×106个细胞（HeLa细胞）接种在两个60 mm培养板上，并且在37°C下在5% CO2下温育24 h。将接种细胞的一个板用抗癌药物（多柔比星）处理24 h。使用标准RNA分离方案从两个板（对照和处理细胞）分离RNA。
步骤2：将总mRNA转化为cDNA
使用逆转录酶、使用Verso cDNA试剂盒将来自步骤1的分离mRNA在构建的台式热循环仪中转化成cDNA（42℃持续40 min，95℃持续2 min）。
步骤3：使用特异性引物扩增感兴趣的基因
如果来自步骤2的cDNA量不足以用于检测，则该步骤是必需的。在热循环仪中使用引物（得自Integrated DNA Technologies，IDT）和2X PCR主混合物扩增感兴趣的特定基因，直到所需循环。
步骤4：将寡核苷酸（ssDNA）以阵列模式固定在硝酸纤维素膜上
通过以下程序将商业获得的寡核苷酸固定在硝酸纤维素膜上。
切割出合适大小（具有最大尺寸40 mm×40 mm）的膜（标称孔隙率为0.45 μm）并且将其在1X SSC缓冲液中活化并使其风干。将商业寡核苷酸以阵列形式点样出并使用标准程序进行UV交联。
步骤5：cDNA/加热和快速冷却的PCR产物与固定在硝酸纤维素膜上的互补寡核苷酸（即ssDNA）的相互作用
将步骤2中获得的cDNA（如果其具有足够量的话）或PCR产物（在经受加热和突然冷却之后）通过以下过程与其相应的固定的互补核苷酸杂交。
使用封闭溶液将膜封闭15 min以避免非特异性结合。将杂交在60℃下在5X SSC缓冲液、10%聚乙二醇（PEG）6000中进行半小时。然后用1X SSC（盐-柠檬酸钠）缓冲液洗涤膜。
步骤6：在杂交膜上合成金纳米簇
在杂交后使用以下程序在斑点上合成金纳米簇。将1.5 uL的0.7mM HAuCU和0.5 uL的0.01M 3-巯基丙酸（MPA）添加在膜的每个斑点上。然后将膜置于板（具有温度传感器）上，然后在95℃下加热2 min，然后立即冷却至15℃。
步骤7：基于杂交膜上的差异斑点强度对基因表达的分析
然后在机器的可视化单元中观察膜。将膜放置在可视化单元的在样品座（SM）上并且在UV照射下激发并获取发光图像。将照片调整到所需的像素范围。然后，选择感兴趣区域（ROI）。获得选择的ROI的直方图数据。获取了ROI的X和Y平均强度分布，即垂直和水平地沿每条线的像素值的平均值。通过线分布图获得沿选择线的像素值。ROI的相对强度水平的比较揭示了杂交DNA的量和杂交的性质。这有助于通过基因的各种量的组合获得相对基因表达水平。
实施例3：用于蛋白质表达研究的基于阵列的技术
利用基于谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合标签的系统进行蛋白质表达研究。因为GST在翻译后迅速折叠成稳定且高度可溶的蛋白质，所以与不含标签的表达相比，包含GST标签促进重组蛋白的较大表达和溶解性。可以基于GST以高亲和力和特异性结合其底物谷胱甘肽的能力来纯化或检测GST标签的蛋白质。
为了检测GST标签的蛋白质，采用纯GST和GST标签的hGMCSF（人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子），并且使GST特异性的一抗与GST和GST标签的hGMCSF相互作用。然后在相互作用的产物上合成金簇，并且基于形成的金纳米簇的发射强度，鉴定表达的蛋白质的量。
基于阵列的蛋白质表达研究在PVDF膜上进行。在甲醇处理PVDF膜后，将抗体印迹在其上。之后，使抗原在抗体印迹膜上相互作用。然后在膜上合成金纳米簇并在UV照射下可视化。捕获图像并进一步分析以便定量蛋白质表达。基于阵列的蛋白质表达研究的详细步骤如图7所示，并且在下面详细描述出。
步骤1：以阵列模式将一抗固定在PVDF膜上
通过以下程序将一抗固定在PVDF膜上。切割出适合大小（具有最大尺寸40 mm×40 mm）的膜并且将其在甲醇中活化。将不同稀释度的一抗点样在膜上。在点样过程中，膜不应当干燥。将液滴置于膜上并使其风干15-20 min。
步骤2：抗原与PVDF膜上抗体的相互作用
使用封闭溶液将膜封闭30 min以避免非特异性结合。然后将膜与相应的抗原温育30min，并用PBST（磷酸盐缓冲盐水与吐温20）缓冲液洗涤。
步骤3：在PVDF膜上合成金纳米簇
在使抗原-抗体相互作用发生后，使用以下程序在斑点上用蛋白质作为模板合成金纳米簇。将1.5 uL的0.7mM HAuCI4和0.5 uL的0.01 M 3-巯基丙酸（MPA）添加在每个斑点上，并且将膜在95℃下加热2 min，然后冷却至15℃。
步骤4：基于PVDF膜上的差异斑点强度分析相对于抗体存在的抗原量
然后在机器的可视化单元中观察膜。在UV照射下激发膜并且获取发光图像。将照片调整到所需的像素范围。然后，选择感兴趣区域（ROI）。获得选择的ROI的直方图数据。获得了ROI的X和Y平均强度分布，即垂直和水平地沿每条线的像素值的平均值。通过线分布图获得沿选择线的像素值。ROI的相对强度水平的比较揭示了关于抗原-抗体相互作用的信息。这有助于通过抗原和抗体的各种量的组合获得相对蛋白质表达水平。
实施例4：PCR扩增与商业机器的比较
为了比较PCR产物的扩增，在所提出的机器以及常规PCR机器（Palm循环仪）中使用特异性引物扩增β-肌动蛋白基因35个循环，在两种情况下保持扩增条件相同。两种情况中使用的参数如下：在95℃下初始变性3 min，然后重复95℃，持续30秒，55℃持续30秒，72℃持续1min，各自35个循环，伴随有在72℃下最后延伸10 min。使用利用溴化乙锭（EtBr）染色的标准凝胶电泳分析来自两台机器的PCR扩增子。在UV照射下得到的产物如图8所示。所实现的扩增为相比于常规PCR机器的95.85%。
实施例5：在液相中使用金纳米簇检测扩增产物
为了使用金纳米簇检测扩增产物，使用实施例4中所述的相同参数，在所提出的机器中使用特异性引物扩增β-肌动蛋白基因不同的循环（20、25、30、35个）。不同循环的扩增产物是通过琼脂糖凝胶电泳的标准方法进行验证，并用EtBr进行染色以便可视化。同时，取另一组扩增产物并且在其上进行金纳米簇的合成。对于合成，将1.0 mM HAuCI4和0.01 M 3-巯基丙酸（MPA）以3:1（v/v）比例添加到终点PCR产物（在PCR管自身内部），并且在机器中在95℃下加热2 min，然后冷却至15℃（使用PCR管保持器），从而在扩增的DNA上与扩增成比例地形成金纳米簇。纳米簇的发光强度用于将不同循环的扩增产物可视化。将含有PCR混合物但不含有cDNA的PCR管作为对照。将具有扩增的PCR产物和合成的金纳米簇的PCR管平放在可视化单元的样品座（SM）上。然后在UV照射（254 nm）下使这些PCR管可视化，并且用照相机单元捕获图像。如图9所示，成功地鉴定出针对不同循环的扩增的PCR产物。簇的发光强度随着PCR扩增子量的增加而单调增加。对于比较，传统的凝胶电泳（用EtBr染色）显示出与使用金纳米簇获得的结果非常一致。
实施例6：在固相中比较ssDNA和dsDNA上合成的AuNC的发光强度的比较。
将硝酸纤维素膜（尺寸为约25 mm×15 mm）在1X SSC缓冲液中活化并使其风干。如图10中所指示，将商业上获得的单链寡核苷酸（β-肌动蛋白）以增加的量0.18 μg、0.37 μg和0.74 μg点样在阵列的两行中，并且进行UV交联（2 min）以进行固定。然后使用封闭溶液处理将膜封闭15 min以避免非特异性结合。如实施例2中所述那样，将0.18 μg、0.37 μg和0.74 μg的递增量的互补靶链杂交到第二行中的斑点上。根据实施例2中描述的方法合成金纳米簇。然后用1X SSC缓冲液洗涤膜，然后在可视化单元中可视化膜的发光。据观察，当与对照斑点（即，第1行中的单链寡核苷酸）相比时，Au NC的发光强度在杂交的dsDNA斑点中增加。
实施例7：通过Au NC检测商业基因序列的杂交
通过使用与实施例6中所述相同的程序将商业获得的凋亡基因（BCL-2、BAX、Caspase-3）的单链DNA和内源对照β-肌动蛋白固定化。然后使用与实施例6中相同的程序将互补的靶序列进行与其单链对应部分相对应的杂交。放置于每个斑点上的DNA的总量（探针+靶标）分别是0.37 μg、0.74 μg、1.47 μg和2.20 μg。然后用与前面实施例中所述相同的方法合成AuNC，并对其进行可视化。如图11所指示，杂交DNA的发光强度随着每种基因的量的增加而增加。
实施例8：对照和处理HeLa细胞中相对基因表达的研究
通过使用与实施例2中所述相同的程序将商业获得的凋亡标志物基因（BCL-2、BAX、Caspase-3）的单链DNA和内源对照β-肌动蛋白固定化（对于对照阵列以及处理阵列）。用于每种基因的单链寡核苷酸的量分别为0.18 μg、0.37 μg和0.74 μg。总RNA得自对照和多柔比星处理的HeLa细胞。通过逆转录由总RNA获得cDNA。使用基因特异性引物扩增凋亡基因和β-肌动蛋白。将获得的扩增PCR产物加热并突然冷却（快速冷却），然后使用与实施例2中相同的程序，以递增量将它们置于每个斑点上以进行与其单链对应部分相对应的杂交。然后合成AuNC（如实施例2所述的程序）并且进行可视化。同时，通过标准琼脂糖凝胶电泳（使用溴化乙锭染色）验证所有基因的一组扩增PCR产物。
如图12所示，对于对照和处理细胞，研究了不同量的每种基因的相对基因表达。分析显示凋亡基因BAX、Caspase-3上调，并且BCL-2下调，这表示了与对照细胞相比多柔比星处理的HeLa细胞情况下的凋亡。结果符合标准琼脂糖凝胶电泳分析，如图12D所指示。
实施例9：在液相中以蛋白质（BSA）为模板合成Au NC
使用液相中前体HAuCI4和MPA、以递增浓度（0.05 mg/mL-1,0 mg/mL）的牛血清白蛋白作为模板进行Au NC的合成。
对于合成，将0.4 μL的10 mM HAuCI4和0.16 μL的0.11 M 3-巯基丙酸（MPA）添加到20 μL蛋白质溶液中，并且在热循环仪中在95℃下加热2 min，然后冷却至15℃。然后使用分光荧光计（λex=300 nm，λem=580 nm）记录由此形成的Au NC的发光光谱。Au NC的发光强度随着BSA浓度的增加而增加，如图13所指示。据观察，随着蛋白质浓度的增加，簇的发光强度增加。
实施例10：在液相中以不同蛋白质为模板合成Au NC
使用与实施例9中所指出的相同程序在不同蛋白质（人血清白蛋白、α淀粉酶和溶菌酶）上进行合成。据观察，Au NC在所有蛋白质上形成，不管其类别如何，其中当在300 nm处激发时光发射最大值在580 nm，如图14所示。
实施例11：在液相中通过合成Au NC检测抗原-抗体相互作用
通过与实施例9中所述相同的方法，在作为抗原的GST（谷胱甘肽S转移酶）、作为抗体的一抗GST和不同浓度的GST-抗GST（相互作用后）（Ag-Ab）上合成Au NC。与单独的GST（Ag）和抗GST（Ab）相比，发光强度随着在一起的GST-抗GST（Ag-Ab）浓度的增加而增加，如图15所示。据观察，与仅在抗体或抗原存在下合成的簇的强度相比，抗体-抗原样品中的金纳米簇的发光强度更大。
实施例12：在固相中通过Au NC检测抗原-抗体相互作用
将抗GST抗体以递增量的0.1 μg、0.2 μg和0.4 μg分两行固定在PVDF膜上。使用封闭溶液将膜封闭30 min以避免非特异性结合。然后仅在一行（三个点）中将膜与0.1 μg、0.2 μg和0.4 μg的GST抗原一起温育30 min。然后用PBST缓冲液洗涤膜以除去未反应的产物。
然后在膜的每个斑点上合成Au NC。对于Au NC合成，将1.5 μL的0.7 mM HAuCI和0.5 μL的0.01 M 3-巯基丙酸（MPA）添加到每个斑点上，并且将膜在热循环仪中在95℃下加热2 min，然后冷却至15℃。如图16A、B所示，与单独的抗GST抗体相比，具有GST-抗GST抗体的斑点的发光强度更高。据观察，与仅在抗体上的簇的强度相比，抗体-抗原样品中的金纳米簇的发光强度更大。
然而，代替固定抗GST抗体，也可以在初始将GST抗原固定在膜上，然后以上述类似方式温育抗GST的情况下来反向进行。结果如图16C、D所示。
实施例13：使用Au NC研究蛋白质表达
将GST标签的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（hGMCSF）克隆并与作为对照纯GST一起表达。将抗GST抗体固定在PVDF膜上并且以与实施例12中所述类似的方法与GST标签的hGMCSF和GST相互作用。也固定了递增量的仅仅GST标签的hGMCSF和仅仅GST、仅仅抗GST抗体以用于比较。GST标签的hGMCSF的最终量为0.08 μg、0.16 μg和0.32 μg；GST标签的hGMCSF-抗GST的最终量为0.18 μg、0.36 μg和0.72μg；GST的最终量为0.1μg、0.2μg和0.4 μg；GST-抗GST的最终量为0.2 μg、0.4 μg和0.8μg；抗GST的最终量为0.1 μg、0.2 μg和0.4 μg。
Au NC通过与实施例12中所述相同的方法合成，并且在UV照射下可视化。与GST标签的hGMCSF相比，GST情况下的相对发光强度更高。由此我们可以推断GST标签在GST标签的hGMCSF的情况下是完整的，借助于此推断，其表达可以用纯GST作为对照来研究。结果符合标准SDS PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）结果，如图17C所示。
实施例14：在固相中用锌离子进行发光增强
将递增量的DNA（（i）0.37 μg、（ii）0.74 μg）/抗体（（ⅰ）0.1 μg、（ⅱ）0.74μg）分组点样在硝化纤维素/PVDF膜上。使互补DNA（（ⅰ）0.37 μg、（ⅱ）1.1 μg）/抗原（（ⅰ）0.1 μg、（ⅱ）0.4μg）相互作用并且如早期实验中所述那样在所有斑点上合成Au NC。在一行中，在合成过程中添加锌离子（5 μg/μL）。如图18所示，在添加锌离子的情况下，发光强度增加。因此，该技术可用于在信号强度较低的情况下增强膜中的发光。
因此，本发明提供了一种用户友好型装置，所述装置利用集成方法以进行基于RT-PCR和阵列的技术以及对产物的检测和可视化以及随后的结果分析。通过在装置自身中直接在作为模板的生物分子上快速合成金纳米簇、在UV照射下对其进行可视化并用相机捕获图像来实现检测。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种用于进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和/或阵列的分析的装置，所述装置包括：
选择性地用于保持PCR管的样品载架和用于支撑用于基于阵列的检测的膜的载台；
用于支撑在任何所述样品载架上的样品的加热和冷却循环的装置，所述装置提供了在逆转录聚合酶链式反应的样品或基于阵列的膜上原位合成作为纳米簇的信号产生发光剂；
用于基于所述逆转录聚合酶链式反应的样品或基于阵列的膜上产生的作为纳米簇的发光剂将逆转录聚合酶链式反应的终产物或基于阵列的膜可视化以用于基于信号产生发光剂的分析的装置；
所述用于可视化的装置包括光源和成像。
2.如权利要求1所述的装置，所述装置包括：
所述用于支撑在任何所述样品载架上的样品的加热和冷却循环的装置，所述装置提供了基于逆转录聚合酶链式反应的样品或基于阵列的膜成比例地原位合成所述作为纳米簇的信号产生发光剂。
3.如权利要求1或2中任一项所述的装置，所述装置包括：
i）热循环仪单元，其包括：
所述选择性地用于保持PCR管的样品载架和用于支撑用于基于阵列的检测的膜的载台；
所述用于支撑在任何所述样品载架上的样品的加热和冷却循环的装置；
所述用于样品的加热和冷却循环的装置，所述装置包括所述原位合成信号产生发光剂以有效地将逆转录聚合酶链式反应的样品或基于阵列的膜可视化；以及
ii）可视化单元，其包括：
用于提供照射源的UV光源；以及
用于捕获图像的相机。
所述热循环仪单元和所述可视化单元优选地通过程序上开发的GUI与计算机（PC）连接。
4.如权利要求1-3中任一项所述的装置，其中
所述样品载架包括（a）具有至少7个孔以保持PCR管和温度传感器的PCR管载架块和（b）用于支撑用于所述基于阵列的分析的膜的载台；
所述用于所述样品的加热和冷却循环的装置包括（a）加热/冷却元件，其具有风扇和散热器以加热/冷却所述PCR管载架块以及盖子，所述盖子具有加热元件、用于监测所述载架块的温度和PCR管的顶部加热的温度传感器，以及（b）用于加热和冷却所述用于支撑膜的载台的装置；
所述可视化装置包括UV光源以给予照射源和网络相机以捕获图像。
5.如权利要求1至4中任一项所述的装置，其中所述具有所述加热装置的所述样品载架适于达到在15℃至95℃范围内的温度，所述具有加热元件的盖子适于达到在室温与120℃之间的温度。
6.如权利要求1至5中任一项所述的装置，所述装置包括对热循环仪的输入参数的基于GUI的控制，所述输入参数包括过程（PCR/基于阵列的分析/自定义实验）、操作阶段、温度参数、盖子控制（ON/OFF）、盖子温度、启动/停止所述过程以及生成所述样品块和所述盖子的当前状态和温度；
用于所述可视化单元的另外的GUI，其使得能够获取、分析和生成报告；
所述获取使得能够获取所述图像、控制图像的模式并控制相机设置；
所述获取使得用户能够向图像应用阈值、选择和观看感兴趣区域（ROI）、可视化图像的3D视图、获取直方图数据、执行区域和线分布分析；以及
所述报告使得能够生成所有所述选择的ROI的概述、输出数据、执行拟合分析并且使用线性回归技术来帮助估计所述样品的浓度量。
7.一种用于通过可视化进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和/或阵列的分析的方法，所述方法涉及如权利要求1至5中任一项所述的装置，所述方法包括：
在所述热循环仪中，在受控的加热和冷却循环下进行以下项中的任一项：（i）将基因在所述PCR管保持器中用所需引物扩增为PCR产物（dsDNA）和（ii）与用于基于阵列的基因表达研究的互补ssDNA进行基于膜的杂交或与用于基于阵列的蛋白质表达研究的抗原/抗体一起温育；
在所述热循环仪中并且在所述（a）如此获得的PCR产物（b）上述步骤（ii）的膜上的杂交产物或温育蛋白质（相互作用的抗原-抗体）中的任何一者上进行原位合成所述信号产生发光剂；
在所述可视化单元中对加标签于（a）PCR产物（b）膜上的杂交产物或温育蛋白质（相互作用的抗原-抗体）中的任何一者或多者上的所述如此原位产生的发光剂进行迅速可视化，从而推断基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和/或阵列的分析的结果。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述将所述基因在所述PCR管保持器中用所需引物扩增为PCR产物的步骤包括以下步骤：
在所述热循环仪中通过逆转录酶、通过在42℃下加热40 min然后在95℃下后续加热2min将分离的mRNA转化成cDNA；在所述热循环仪中在受控的加热和冷却循环下使用所需引物和2X PCR主混合物扩增特定cDNA；
进行所述信号产生发光剂的原位合成包括在如此获得的PCR产物上与扩增成比例地合成金纳米簇。
9.如权利要求7或8中任一项所述的方法，所述方法包括：
提供所述杂交产物包括以下步骤：（i）提供具有ssDNA的膜；和（ii）使所述膜与互补的靶ssDNA杂交；
所述进行所述信号产生发光剂的原位合成的步骤包括在所述杂交产物上合成金纳米簇；
所述在所述可视化单元中迅速可视化的步骤包括对所述杂交产物上的金纳米簇进行可视化并捕获图像和定量基因表达。
10.如权利要求7至9中任一项所述的方法，所述方法包括使所述膜与互补靶ssDNA杂交，其中所述互补靶ssDNA通过以下方式获得：（i）如果可获得足够量的话，则通过基因特异性引物将mRNA转化为cDNA，或（ii）如果不能获得足够浓度的话，则将mRNA转化为cDNA，然后通过PCR通过基因特异性引物扩增所需基因并且涉及将所述PCR扩增产物用于所述杂交。
11.如权利要求7所述的方法，所述方法包括通过可视化进行用于蛋白表达研究的基于阵列的分析，其包括：提供所述膜；
将一抗/抗原印迹在所述膜上；
将所述膜与抗原/抗体一起温育；
进行所述信号产生发光剂的原位合成，其包括在所述膜上合成金纳米簇，从而与抗原/抗体一起温育；
在所述可视化单元中的快速可视化，其包括对所述膜上的金纳米簇进行可视化，从而与抗原/抗体一起温育并捕获图像并定量蛋白质表达。
12.如权利要求7至11中任一项所述的方法，其中所述合成金纳米簇涉及HAuCl4溶液和3-巯基丙酸。
13.如权利要求12所述的方法，所述方法是生物友好型的、非致癌的且需要最小前体浓度，并且其中所述金纳米簇具有高度光稳定性并且当在λex=254 nm（254 nm光用于所述装置中的激发，300 nm光用于光谱研究）激发时表现出发光发射（Xem = 580 nm），所述金簇的发光强度随着dsDNA的浓度或蛋白质的量单调增加。
14.如权利要求8至13中任一项所述的方法，所述方法用于基于发光强度进行相对DNA/蛋白质定量，没有常规荧光团（染料/探针）。
15.如权利要求8至14中任一项所述的方法，所述方法摆脱了对信号产生剂（簇）的任何必需的初始单独合成、表面修饰和对特异性寡核苷酸的需求，并且其中Au NC的合成可以直接在DNA自身上进行。
16.如权利要求8至15中任一项所述的方法，所述方法包括用于基因表达研究的基于纸的阵列技术，其涉及在具有金纳米簇作为信号产生剂的硝化纤维素膜上的杂交，
有效地涉及与ssDNA相比时dsDNA中的金簇的较高发光强度。
17.如权利要求8至16中任一项所述的方法，所述方法摆脱了对信号产生剂的任何必需的初始加标签（荧光团、光学探针、放射性标记等）、探测分子的单独合成。
18.如权利要求8至17中任一项所述的方法，所述方法包括基于阵列的技术以一次研究多种基因的相对表达。
19.如权利要求8至18中任一项所述的方法，其中所述基于阵列的方法包括通过研究三种基因即Caspase 3、BCL 2、BAX相对于作为对照的β-肌动蛋白的表达来分析细胞的凋亡途径。
20.如权利要求7至19中任一项所述的方法，所述方法用于基于发光强度而不使用常规荧光团（染料/探针）并且不存在对簇的初始单独合成、表面修饰来进行相对蛋白质定量。
21.如权利要求7至20中任一项所述的方法，所述方法包括用于蛋白质表达研究的基于纸的阵列技术，其涉及具有金纳米簇作为信号产生剂的PVDF膜上的抗体-抗原相互作用，涉及下述观察结果：在固相中，当与相互作用的抗原-抗体相比时抗原或抗体中的所形成簇的发射强度更小，这与存在的蛋白质量相关联。
22.如权利要求7至21中任一项所述的方法，所述方法摆脱了对信号产生剂的任何初始加标签（荧光团、光学探针、放射性标记、酶标记等）或探测分子的单独合成。
23.如权利要求7至22中任一项所述的方法，其中所述基于阵列的方法包括直接标记方法，并且不需要用于检测的二抗。
24.如权利要求7至23中任一项所述的方法，其中所述基于阵列的方法有助于一次研究多种蛋白质的表达。
25.如权利要求7至24中任一项所述的方法，所述方法包括基于阵列的方法，其中GST（谷胱甘肽S-转移酶）抗体被固定并且使对应的GST标签的抗原相互作用，并且其中GST标签的抗原的量可以由所述合成的金纳米簇的发光强度相对地定量。
26.如权利要求7至25中任一项所述的方法，所述方法包括在用254 nm光激发时在固相中具有低强度水平的情况下增强所述金纳米簇的发光强度，所述增强涉及用于信号放大的锌离子。
27.如权利要求7至26中任一项所述的用于进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和/或阵列的分析的方法，所述产生信号产生剂（簇）的步骤包括选择性地用DNA和蛋白质作为模板进行基于加热和冷却循环的合成。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述基于加热和冷却循环的合成涉及PCR加热和冷却循环。
29.如权利要求27或28中任一项所述的方法，其中所述基于加热和冷却循环的合成涉及金纳米簇的合成。
说明或声明(按照条约第19条的修改)
修订权利要求书涉及阐明和限定本发明的发明方面，属于开发用于进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和/或阵列的分析的集成装置和方法，所述集成装置和方法在单个平台上同时涉及选择性地用于保持PCR管的可切换支持器/样品载架和用于支撑用于基于阵列的检测的膜的载台。有利地，进步是不需要在杂交之前标记靶多核苷酸分子，并且反而通过本发明装置和方法能够首次在用于样品载架中的加热和冷却循环的装置中实现对信号产生发光剂的原位产生，此举有助于杂交之后的样品标记并且还能够基于逆转录聚合酶链式反应的样品或基于阵列的膜上的所述相同的所述作为纳米簇的原位产生发光剂可视化逆转录聚合酶链式反应的终产物或基于阵列的膜以用于基于信号产生发光剂的分析。
在用于支撑在所述样品载架中的任一个上的加热和冷却循环下的所述装置集成了在杂交/抗原-抗体反应后提供在逆转录PCR样品上或基于阵列的膜上原位合成作为纳米簇的信号发生发光剂。采用发光纳米簇作为共用的信号产生剂，所述装置和方法由此有效地可视化多种基因/蛋白质的逆转录聚合酶链式反应的终产物或基于阵列的膜分析，
同时由此避免了使用致癌性的昂贵化学物质和合成繁琐的探测分子。
重要的是，所述修订也限定了首次提供下述系统和方法的进步的方面，在所述系统和方法中，将信号产生发光剂诸如金纳米簇合成集成到PCR的温度循环过程（也在温度限制内）并且因此不需要在单独实验条件下的外部制备因为信号产生剂对于RT-PCR或DNA/蛋白质阵列是相同的，所述单一UV激发是足够的。
所述修订还指明：根据进步的优选方面，荧光纳米簇的强度正比于样品中存在的双链DNA或蛋白质的量，这进而有助于在扩增之后在固相中或在杂交/抗原-抗体反应之后快速定量荧光信号。
本进步的上述独特方面已清楚且充分地指明在修订权利要求书中。

Claims (29)

1.一种用于进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和/或阵列的分析的装置，所述装置包括：
选择性地用于保持PCR管的样品载架和用于支撑用于基于阵列的检测的膜的载台；
用于对支撑在任何所述样品载架上的样品进行加热和冷却循环的装置；
用于将逆转录聚合酶链反应的终产物或基于阵列的膜可视化以用于基于信号产生发光剂的分析的装置；
所述用于可视化的装置包括光源和成像。
2.如权利要求1所述的用于进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和/或阵列的分析的装置，所述装置包括：
选择性地用于保持PCR管的样品载架和用于支撑用于基于阵列的检测的膜的载台；
用于对支撑在任何所述样品载架上的样品的加热和冷却循环、以及用于原位合成能够有效地将逆转录聚合酶链式反应的终产物或基于阵列的膜可视化的信号产生发光剂的装置；
可视化装置，其包括光源和成像。
3.如权利要求1或2中任一项所述的装置，所述装置包括：
i）热循环仪单元，其包括：
所述选择性地用于保持PCR管的样品载架和用于支撑用于基于阵列的检测的膜的载台；
所述用于支撑在任何所述样品载架上的样品的加热和冷却循环的装置；
所述用于样品的加热和冷却循环的装置提供了原位合成信号产生发光剂，所述信号产生发光剂用于有效地将逆转录聚合酶链式反应的样品或基于阵列的膜可视化；以及
ii）可视化单元，其包括：
用于提供照射源的UV光源；和
用于捕获图像的相机，
所述热循环仪单元和所述可视化单元优选地通过程序上开发的GUI与计算机（PC）连接。
4.如权利要求1-3中任一项所述的装置，其中
所述样品载架包括（a）具有至少7个孔以保持PCR管和温度传感器的PCR管载架块和（b）用于支撑用于所述基于阵列的分析的膜的载台；
所述用于所述样品的加热和冷却循环的装置包括（a）加热/冷却元件，其具有风扇和散热器以加热/冷却所述PCR管载架块以及盖子，所述盖子具有加热元件、用于监测所述载架块的温度和PCR管的顶部加热的温度传感器，以及（b）用于加热和冷却所述用于支撑膜的所述载台的装置；
所述可视化装置包括UV光源以给予照射源和网络相机以捕获图像。
5.如权利要求1至4中任一项所述的装置，其中所述具有所述加热装置的所述样品载架适于达到在15℃至95℃范围内的温度，所述具有加热元件的盖子适于达到在室温与120℃之间的温度。
6.如权利要求1至5中任一项所述的装置，所述装置包括对热循环仪的输入参数的基于GUI的控制，所述输入参数包括过程（PCR/基于阵列的分析/自定义实验）、操作阶段、温度参数、盖子控制（ON/OFF）、盖子温度、启动/停止所述过程以及生成所述样品块和所述盖子的当前状态和温度；
用于所述可视化单元的另外的GUI，其使得能够获取、分析和生成报告；所述获取使得能够获取图像、控制图像的模式并控制相机设置；
所述获取使得用户能够向所述图像应用阈值、选择和观看感兴趣区域（ROI）、可视化所述图像的3D视图、获取直方图数据、执行区域和线分布分析；以及
所述报告使得能够生成所有所述选择的ROI的概述、输出数据、执行拟合分析并且使用线性回归技术来帮助估计所述样品的浓度量。
7.一种用于通过可视化进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和/或阵列的分析的方法，所述方法涉及如权利要求1至5中任一项所述的装置，所述方法包括：
在所述热循环仪中，在受控的加热和冷却循环下进行以下项中的任一项：（i）将基因在所述PCR管保持器中用所需引物扩增为PCR产物（dsDNA）和（ii）与用于基于阵列的基因表达研究的互补ssDNA进行基于膜的杂交或与用于基于阵列的蛋白质表达研究的抗原/抗体一起温育；
在所述（a）如此获得的PCR产物（b）上述步骤（ii）的膜上的杂交产物或温育蛋白质（相互作用的抗原-抗体）中的任何一者上进行原位合成所述信号产生发光剂；
在所述可视化单元中对所述发光剂标签的（a）PCR产物（b）膜上的杂交产物或温育蛋白质（相互作用的抗原-抗体）中的任何一者或多者进行迅速可视化，从而推断基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和/或阵列的分析的结果。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述将所述基因在所述PCR管保持器中用所需引物扩增为PCR产物的步骤包括以下步骤：
在所述热循环仪中通过逆转录酶、通过在42℃下加热40 min然后在95℃下后续加热2min将分离的mRNA转化成cDNA；在所述热循环仪中在受控的加热和冷却循环下使用所需引物和2X PCR主混合物扩增特定cDNA；
进行所述信号产生发光剂的原位合成包括在如此获得的PCR产物上与所述扩增成比例地合成金纳米簇。
9.如权利要求7或8中任一项所述的方法，所述方法包括：
提供所述杂交产物包括以下步骤：（i）提供具有ssDNA的膜；和（ii）使所述膜与互补的靶ssDNA杂交；
所述进行所述信号产生发光剂的原位合成的步骤包括在所述杂交产物上合成金纳米簇；
所述在所述可视化单元中迅速可视化的步骤包括对所述杂交产物上的金纳米簇进行可视化并捕获图像和定量基因表达。
10.如权利要求7至9中任一项所述的方法，所述方法包括使所述膜与互补靶ssDNA杂交，其中所述互补靶ssDNA通过以下方式获得：（i）如果可获得足够量的话，则通过基因特异性引物将mRNA转化为cDNA，或（ii）如果不能获得足够浓度的话，则将mRNA转化为cDNA，然后通过PCR通过基因特异性引物扩增所需基因并且涉及将所述PCR扩增产物用于所述杂交。
11.如权利要求7所述的方法，所述方法包括通过可视化进行用于蛋白表达研究的基于阵列的分析，其包括：
提供所述膜；
将一抗/抗原印迹在所述膜上；
将所述膜与抗原/抗体一起温育；
进行所述信号产生发光剂的原位合成，其包括在所述膜上合成金纳米簇，从而与抗原/抗体一起温育；
在所述可视化单元中的快速可视化，其包括对所述膜上的金纳米簇进行可视化，从而与抗原/抗体一起温育并捕获图像并定量蛋白质表达。
12.如权利要求7至11中任一项所述的方法，其中所述合成金纳米簇涉及HAuCl4溶液和3-巯基丙酸。
13.如权利要求12所述的方法，所述方法是生物友好型的、非致癌的且需要最小前体浓度，并且其中所述金纳米簇具有高度光稳定性并且当在λex=254 nm（254 nm光用于所述装置中的激发，300 nm光用于光谱研究）激发时表现出发光发射（λem=580 nm），所述金簇的发光强度随着dsDNA的浓度或蛋白质的量单调增加。
14.如权利要求8至13中任一项所述的方法，所述方法用于基于发光强度进行相对DNA/蛋白质定量，没有常规荧光团（染料/探针）。
15.如权利要求8至14中任一项所述的方法，所述方法摆脱了对信号产生剂（簇）的任何必需的初始单独合成、表面修饰和对特异性寡核苷酸的需求，并且其中Au NC的合成可以直接在DNA自身上进行。
16.如权利要求8至15中任一项所述的方法，所述方法包括用于基因表达研究的基于纸的阵列技术，其涉及在具有金纳米簇作为信号产生剂的硝化纤维素膜上的杂交，有效地涉及与ssDNA相比时dsDNA中的金簇的较高发光强度。
17.如权利要求8至16中任一项所述的方法，所述方法摆脱了对信号产生剂的任何必需的初始加标签（荧光团、光学探针、放射性标记等）、探测分子的单独合成。
18.如权利要求8至17中任一项所述的方法，所述方法包括基于阵列的技术以一次研究多种基因的相对表达。
19.如权利要求8至18中任一项所述的方法，其中所述基于阵列的方法包括通过研究三种基因即Caspase 3、BCL 2、BAX相对于作为对照的β-肌动蛋白的表达来分析细胞的凋亡途径。
20.如权利要求7至19中任一项所述的方法，所述方法用于基于发光强度而不使用常规荧光团（染料/探针）并且不存在对簇的初始单独合成、表面修饰来进行相对蛋白质定量。
21.如权利要求7至20中任一项所述的方法，所述方法包括用于蛋白质表达研究的基于纸的阵列技术，其涉及具有金纳米簇作为信号产生剂的PVDF膜上的抗体-抗原相互作用，涉及下述观察结果：在固相中，当与相互作用的抗原-抗体相比时抗原或抗体中的所形成簇的发射强度更小，这与存在的蛋白质量相关联。
22.如权利要求7至21中任一项所述的方法，所述方法摆脱了对信号产生剂的任何初始加标签（荧光团、光学探针、放射性标记、酶标记等）或探测分子的单独合成。
23.如权利要求7至22中任一项所述的方法，其中所述基于阵列的方法包括直接标记方法，并且不需要用于检测的二抗。
24.如权利要求7至23中任一项所述的方法，其中所述基于阵列的方法有助于一次研究多种蛋白质的表达。
25.如权利要求7至24中任一项所述的方法，所述方法包括基于阵列的方法，其中GST（谷胱甘肽S-转移酶）抗体被固定并且使对应的GST标签的抗原相互作用，并且其中GST标签的抗原的量可以由所述合成的金纳米簇的发光强度相对地定量。
26.如权利要求7至25中任一项所述的方法，所述方法包括在用254 nm光激发时在固相中具有低强度水平的情况下增强所述金纳米簇的发光强度，所述增强涉及用于信号放大的锌离子。
27.如权利要求7至26中任一项所述的用于进行基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PC）和/或阵列的分析的方法，所述产生信号产生剂（簇）的步骤包括选择性地用DNA和蛋白质作为模板进行基于加热和冷却循环的合成。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述基于加热和冷却循环的合成涉及PCR加热和冷却循环。
29.如权利要求27和28中任一项所述的方法, 其中所述基于加热和冷却循环的合成涉及金纳米簇的合成。
CN201680068615.5A 2015-12-09 2016-06-02 利用集成方法来进行基于逆转录聚合酶链式反应和/或dna/蛋白质阵列的分析的装置 Active CN108474778B (zh)

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