CN101497928A - 鉴定ggⅰ组诺如病毒和ggⅱ组诺如病毒的方法及专用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定GGI组诺如病毒和GII类诺如病毒的方法及其专用试剂盒。该试剂盒包括链霉亲和素包被的磁珠和鉴定GGI组诺如病毒和GTT类诺如病毒的基因芯片；该基因芯片，包括芯片基片以及固定与其上的检测GGI组诺如病毒的探针和检测GG II组诺如病毒的探针；检测GGI组诺如病毒基因片段的探针为序列1所示的片段；检测GG II组诺如病毒基因片段的探针为序列2所示的DNA片段和序列3所示的DNA片段。该方法是待测样品RNA反转录后用生物素标记，然后用上述试剂盒检测。本发明的试剂盒可筛查诺如病毒，并将其分类直接鉴定为GGI组诺如病毒或GG II组诺如病毒，真阳性率达到100％，真阴性率达到100％，鉴别GGI组诺如病毒或GG II组诺如病毒的准确率达到100％。

Description

鉴定GGⅠ组诺如病毒和GGⅡ组诺如病毒的方法及专用试剂盒

技术领域

本发明涉及一种鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的方法及其专用试剂合。

背景技术

诺如病毒属于杯状病毒科(Caliciviridae)，根据其聚合酶(RDRP)或衣壳蛋白编码区核苷酸和氨基酸序列特征，可被进一步细分为5个基因组(genogroup，GGI～GGV)，进一步根据血清分型又分为基因型(genotype)，其中基因组I(GGI)包括8个基因型，基因组II(GGII)包括17个基因型，它们是引起人类感染的主要病原。目前GGII-4基因型为全球流行的优势株，常在医院、餐馆、学校、托儿所、孤老院、军队、家庭及其他人群中引起暴发。在早期的研究中，电镜是唯一的诊断手段，之后又应用酶联免疫方法进行该病毒的检测。近年来，随着部分诺如病毒毒株的全基因序列的测定与分析，以及大量毒株序列的获得，许多新的分子生物学技术被广泛应用于诺如病毒的诊断和研究。目前广泛应用的主要是RT-PCR方法，该方法具有操作简便、快捷；敏感性高；特异性强；对起始材料质量要求低的特点，但存在假阳性高的缺点，基于TaqMan探针的荧光定量PCR方法解决了这一问题，但仍然存在通量低的缺点。

生物芯片是指能对生物成分或生物分析进行快速处理和分析的固体薄型器件，将微阵列技术与生物微机电技术相结合，通过微加工技术和微电子技术在固体基片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片能同时检测样本中的多个生物大分子，检测原理是利用分子间的相互作用，如核酸杂交、抗原-抗体特异性结合、蛋白-蛋白间特异性结合等，将待测样品标记后与生物芯片反应，样品种的标记分子与芯片上的探针“对号入座”，标记的待测样品与之结合，通过激光共聚焦荧光扫描仪等检测手段获取信息，由于芯片上可以固定成千上万的探针，因此可以同时检测成千上万的生物大分子，而传统的检测方法一次只能检测一个或几个生物大分子，因此一次芯片实验就成了成千上万个传统实验，即一次生物芯片实验室多次传统实验的集成。生物芯片和传统仪器相比具有体积小、重量轻、便于携带、无污染、分析过程自动化、分析速度快、所需样品和试剂少等诸多优点。生物芯片的出现正在给生命科学研究、疾病诊断、新药开发、司法鉴定以及食品卫生监督等领域带来一场革命。

生物芯片技术平台一般包括5个部分：芯片的机制材料、把探针分配到芯片上的机械手、核酸杂交需要的控制系统、独取杂交信号的光学扫描系统以及读取和分析数据的计算机软件工具，由于不同的文献对探针(probe)和靶标(target)有不同的定义，这里我们的定义是固定在基质载体上的DNA被称为探针，而来自生物样品的核酸被称为靶标。

自芯片技术诞生以来，许多标记检测方法应运而生，如同位素、酶类、半抗原、荧光素、纳米金等。当前，荧光标记具有种类多、灵敏度高等优点，是最为常用的标记检测手段。但是，这种标记方法依赖于昂贵的检测仪器，检测成本较高，且检测结果不能长期保存。除此之外，纳米颗粒，如金纳米颗粒作为非荧光类的标记物，也已广泛应用于微阵列信号的检测。然而，基于金纳米颗粒的检测方法通常需要额外的银染步骤，操作较为繁琐且时间冗长。磁珠在生物学领域又称生物磁粒，多数具有超顺磁性，在磁力下易于操作，已在免疫分析、基因工程、导向药物以及细胞分离等领域获得了广泛的应用。磁珠作为核酸杂交检测的标记物也有报道，但他们多数依赖于微加工技术，加工成本较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的方法及其专用试剂盒。

本发明提供的鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒，包括检测GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的基因芯片；该基因芯片包括芯片基片、固定与所述芯片基片上的用于检测GGI组诺如病毒的探针和固定与所述芯片基片上的用于检测GG II组诺如病毒的探针；所述用于检测GGI组诺如病毒基因片段的探针具有序列表中序列1的核苷酸序列；所述用于检测GGII组诺如病毒基因片段的探针为具有序列表中序列2核苷酸序列的DNA片段和具有序列表中序列3核苷酸序列的DNA片段。

上述用于固定DNA探针的芯片基片包括尼龙膜、纤维素膜、玻片、金属片、硅片、陶瓷片、各种有机高分子制作的薄膜等，优选为玻片。玻片的优点在于：来源方便；其表面经过化学处理后，能够共价结合DNA；玻片能耐受高温及高离子溶液环境；玻片表面光滑，对液体来说是非浸透性的，故杂交体系的体积可以很小，有利于探针和靶标的结合；玻片的背景荧光低，不会给检测带来较大的噪音。

所述用于检测GGI组诺如病毒基因片段的探针或用于检测GG II组诺如病毒基因片段的探针的5′端连接有聚T的长链和一个伯氨基；优选为连接有含15个T的聚T长链和一个伯氨基。

本发明所提供的鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的专用试剂盒，包括上述基因芯片。

所述试剂盒还包括GGI组诺如病毒基因片段的扩增引物和GG II组诺如病毒基因片段的扩增引物；所述GGI组诺如病毒基因片段的扩增引物由兼并引物1和兼并引物2组成，所述兼并引物1的核苷酸序列是序列表中序列4，所述兼并引物2的核苷酸序列是序列表中序列5；所述GG II组诺如病毒基因片段的扩增引物由兼并引物3和兼并引物4组成，所述兼并引物3的核苷酸序列是序列表中序列6，所述兼并引物4的核苷酸序列是序列表中序列7。

所述GGI组诺如病毒基因片段的扩增引物或GG II组诺如病毒基因片段的扩增引物至少在引物对中的一个引物上标记了生物素；所述生物素优选标记于所述GGI组诺如病毒基因片段的扩增引物和GG II组诺如病毒基因片段的扩增引物的上游引物。

所述试剂盒还包括链霉亲和素修饰(包被)的信号分子物质；所述的信号分子物质可为磁珠颗粒、纳米金颗粒、荧光颗粒、化学发光颗粒或化学显色颗粒等。所述链霉亲和素修饰的信号分子物质优选为链霉亲和素包被的磁珠颗粒。

所述试剂盒还包括杂交阳性对照；所述基因芯片的芯片基片上还固定有杂交阳性质控探针和杂交阴性质控探针；所述的杂交阳性对照为来源于苦瓜的一段基因片段，和人、动物以及微生物无交叉杂交反应的DNA片段；核苷酸序列为自GENBANK号为AF498100的5′端第342—511位核苷酸序列，所述杂交阳性质控探针是可以与所述杂交阳性对照杂交的片段，所述杂交阴性质控探针是与人、动物以及微生物无交叉杂交反应，且不与所述杂交阳性对照杂交的DNA片段，具体可为由阳性质控探针单碱基改变而形成，和人、动物以及微生物无交叉杂交反应的DNA片段。

所述基因芯片的芯片基片上还固定有磁标，即5′端修饰有一个伯氨基的生物素标记的DNA片段。

所述试剂盒还包括杂交液、芯片清洗液和信号反应缓冲液；

所述杂交液为含有3×SSC，0.2％(质量百分含量)SDS，25％(质量百分含量)甲酰胺，5×Denhardt′s的溶液；所述芯片清洗液为洗液I和洗液II；所述洗液I为含2×SSC和0.2％(质量百分含量)SDS的水溶液；所述洗液II为0.2×SSC的水溶液；所述信号反应缓冲液为羊血清，2×TEN和1％(质量百分含量)BSA-PBS按照4：10：1的体积比混合得到的溶液；所述SSC为含有0.15M氯化钠以及0.015M柠檬酸钠的缓冲液；所述Denhardt′s溶液为含有0.02％(质量百分含量)聚蔗糖、0.02％(质量百分含量)聚乙烯吡咯烷酮以及0.02％(质量百分含量)BSA的溶液液。TEN缓冲液为含有10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA以及2.0M NaCl的混合溶液。所述的1％(质量百分含量)BSA-PBS为添加有1g/L BSA，pH 7.4的PBS缓冲液。所述的PBS缓冲液(pH7.4)的配方为在1000ml水中分别加入8.5g NaCl、2.2g Na₂HPO₄以及0.2g NaH₂PO₄，用HCl或NaOH调PH为7.4得到的缓冲液。

本发明所提供的鉴定GGI组诺如病毒和/或GGII组诺如病毒的方法，是用上述鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒检测，具体方法如下所述：

1)将提取待测样品的RNA，并反转录得到cDNA样品，将该cDNA样品通过PCR扩增得到生物素标记的基因片段样品；

2)将步骤1)得到的生物素标记的基因片段样品与上述鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒的基因芯片杂交；

3)将步骤2)杂交后的基因芯片用链霉亲和素包被的磁珠标记，检测结果；如果所述基因芯片固定用于检测GGI组诺如病毒的探针的部位被链霉亲和素包被的磁珠标记，则该待测样品中含有GGI组诺如病毒；如果所述基因芯片固定用于检测GGII组诺如病毒的探针的部位被链霉亲和素包被的磁珠标记，则该待测样品中含有GGII组诺如病毒。

所述步骤1)中，将所述反转录得到cDNA样品用所述鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒中GGI组诺如病毒基因片段的扩增引物和GG II组诺如病毒基因片段的扩增引物进行PCR扩增得到所述生物素标记的基因片段样品。

本发明的鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒在芯片上采用生物素标记的核酸为样品进行核酸杂交，再通过链霉亲和素与生物素的亲和作用，对芯片上的杂交结果进行标记反应，最终使得杂交结果肉眼可见，或可通过普通显微镜观测，所得结果可长期保存，且定性检测成本低。特异性等同于荧光检测，灵敏度可达到50ng(PCR模板量)。实验所的结果经进一步的图像采集，可进行定量分析。

本发明的试剂盒可检测诺如病毒，并对GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒分类，可以将诺如病毒分类直接鉴定为GGI组诺如病毒或GG II组诺如病毒，基于这种方法进行了诺如病毒分类的实验，取得了较好的效果，真阳性率达100％，真阴性率为100％。鉴别GGI组诺如病毒或GG II组诺如病毒的准确率达到100％。

附图说明

图1为诺如病毒核酸序列保守性分析图。

图2为诺如病毒GGI基因组及其探针P_NV_GI设计位点。

图3为诺如病毒GII的基因组和探针设计位点。

图4为醛基修饰的基因芯片表面固定探针DNA的主要反应过程。

图5为基因芯片的四个点阵(微阵列)的排布图。

图6为本发明的鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒的基因芯片的各点阵的探针排布图。

图7为本发明的鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒的检测原理图

图8为诺如病毒GGI组杂交结果。

图9为诺如病毒GG II组杂交结果。

图10为GGI组诺如病毒杂交特异性。

图11为GG II组诺如型病毒杂交特异性。

图12为鉴定GGI组类诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒的稳定性验证荧光扫描图。

图13为鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒的稳定性验证普通相机照片。

图14为鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒的灵敏度检测荧光扫描图。

图15为鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒的灵敏度检测普通相机照片。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒的制备

本发明的鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒由下述试剂组成：

1)标记有用于检测GGI组诺如病毒基因片段的探针和用于检测GG II组诺如病毒的探针的基因芯片；

2)生物素标记的GGI组诺如病毒基因片段扩增引物、生物素标记的GGII组诺如病毒基因片段扩增引物；

3)链霉亲和素包被的磁珠：购自北京思尔成生物(112-06D)。用2倍体积的2×TEN清洗待用链霉亲和素包被的磁珠2次后，在磁力架作用下倒去液体，吸留磁珠待用。

4)杂交液：含有3×SSC，0.2％(质量百分含量)SDS，25％(质量百分含量)甲酰胺，5×Denhardt′s的溶液。SSC为含有0.15M氯化钠以及0.015M柠檬酸钠的缓冲液；Denhardt′s溶液为含有0.02％(质量百分含量)聚蔗糖、0.02％(质量百分含量)聚乙烯吡咯烷酮以及0.02％(质量百分含量)BSA的混合溶液；

5)杂交阳性对照：所述杂交阳性对照为来源于苦瓜的242bp的DNA片段(自GENBANK号为AF498100的5′端第342—511位核苷酸序列)，人工合成该DNA片段(5’端生物素修饰)，用去离子水调定浓度为1ug/ul。

6)芯片清洗液：洗液I：含2×SSC，0.2％(质量百分含量)SDS的水溶液；洗液II：0.2×SSC的水溶液。

7)信号反应缓冲液：羊血清，2×TEN和1％(质量百分含量)BSA-PBS按照4∶10∶1的体积比混合的溶液。TEN缓冲液为含10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA以及2.0M NaCl的混合溶液。1％(质量百分含量)BSA-PBS为含1g/L BSA，pH 7.4的1×PBS缓冲液。PBS缓冲液(pH7.4)的配方为在1000ml水中分别加入8.5g NaCl、2.2g Na₂HPO₄以及0.2g NaH₂PO₄，用HCl或NaOH调PH为7.4得到的溶液。

一、标记有用于检测GGI组诺如病毒基因片段的探针和用于检测GG II组诺如病毒的探针的基因芯片的制备方法如下所述：

1、芯片的基片准备

1)醛基化的玻片片基：购自博奥生物有限公司(货号420022)

2)基片背景检测

将购买的醛基基片经晶

LuxScan^TM 10K微阵列芯片扫描仪在PMT/Power＝90/900的扫描参数下扫描，其Cy3通道荧光背景≤1000；Cy5通道荧光背景≤300为荧光背景合格基片，结果表明上述醛基基片的荧光背景合格。

3)醛基基片固定能力的检测

将醛基基片进行核酸固定能力的检测，主要是通过固定在醛基基片表面的激发波长为532nm的荧光标记Oligo样品和要杂交的Oligo样品分别判断醛基基片的表面化学特性和生物样品固定能力等指标。对于2.5μM激发波长为532nm的荧光标记的Oligo样品，在固定化处理后经晶

LuxScan^TM 10K微阵列芯片扫描仪在PMT/Power＝90/750的扫描参数下，Cy3通道荧光背景≥10000，且杂交后10.0μM的PBH(一种Oligo样品)Cy3通道信号≥15000的基片，其固定能力合格，结果表明选用的醛基基片的固定能力合格，可以用于作为本实验中的探针固定及后续检测。

2、用于检测诺如病毒GGI组和诺如病毒GG II组的探针制备

病毒基因组一般都有高保守而且种特异的区域，比如衣壳蛋白等。从NCBI上下载所需微生物的GenBank文件，并从文件中提取核酸和蛋白序列，通过序列比对，在保守序列上设计通用引物和探针。诺如病毒的分子进化学和RT-PCR检测研究主要集中在衣壳蛋白(capsid protein)和RNA依赖的RNA聚合酶(RNA directed RNApolymerase)两个蛋白上，所以探针设计主要以这两种蛋白序列比对为主。

对诺如病毒的核酸序列保守性进行分析，分析了NCBI数据库中所有编码衣壳蛋白且序列长度大于2k bp的诺如病毒核酸序列，希望通过蛋白序列的保守位点找到对应核酸序列的保守位点从而设计出针对单个组(Genogroup)的探针。结果如图1所示。图1中横轴为基因组位点(诺如病毒(GB accession M87661)的基因组位点)的坐标，纵轴为序列相似度。图1中1为ORF1，编码包括保守的具有RNA多聚酶在内的非结构蛋白；2为ORF2，即Capsid蛋白编码区，3为ORF3，编码一种分子量约为22.5Kda的强碱性微小结构蛋白；4为高度保守区。

序列比对结果表明：

1)对诺如病毒的RNA directed RNA polymerase蛋白序列比对，比对结果表明不同组Genogroup)的RNA directed RNA polymerase蛋白序列相对比较保守。

2)经分析表明，虽然同组内蛋白序列比较保守，但是核酸序列差异很大，因此无法利用此段RNA directed RNA polymerase的序列设计出针对同一组(Genogroup)的探针。

3)对常用的RT-PCR检测的序列区域进行序列分析，结果表明capsid protein的核酸序列差异也很大，因此无法利用常规的编码蛋白的核酸序列设计探针。

4)通过诺如病毒核酸序列比对和序列保守性分析发现位于RNA directed RNApolymerase和capsid protein的结合位点附近的核酸序列最为保守，可以用于设计针对诺如病毒不同组(Genogroup)的探针。

根据上述序列分析结果，设计检测诺如病毒GGI组的探针序列为P_NV_GI：TTAGACGCCATCATCATTTAC(序列表中序列1)，经过对已有的58株诺如病毒GGI组进行序列分析，表明探针序列覆盖了NCBI诺如病毒GGI组中96％(56/58)左右的包含此序列区域的病毒株。如图2所示为诺如病毒基因组及其探针P_NV_GI设计位点，方框标记的核酸序列为探针识别位点。图中注释和序列信息来自NorwalkVirus(GB accession M87661)。图2中orf1为编码包括保守的具有RNA多聚酶在内的非结构蛋白；orf2为Capsid蛋白编码区，orf3为编码一种分子量约为22.5Kda的强碱性微小结构蛋白。

设计了检测诺如病毒GG II组的探针序列为P_NV_GII_1：

TCGACGCCATCTTCATTCAC(序列表中序列2)和P_NV_GII_2：

AGCCAGATTGCGATCGCCCT(序列表中序列3)。P_NV_GII_1位于RNA directedRNA polymerase和capsid protein的结合位点，经过对已有的239株诺如病毒GG II组进行序列分析，表明探针序列覆盖了NCBI诺如GII中93.7％(224/239)左右的包含此序列区域的病毒株。P_NV_GII_2是专门针对GII的探针，此探针在RNA directedRNA polymerase靠近3’端区域，经过对已有的71株诺如病毒GG II组进行序列分析，结果表明P_NV_GII_2覆盖率略高于P_NV_GII_1，为94.4％(67/71)。对这些毒株进行进化分析，从进化树上来看，产生非特异杂交的GG II组病毒株很有可能是属于GGI组的，因此不会对芯片杂交实验产生太大影响。因此P_NV_GII_1的实际覆盖率应该为96％左右。诺如病毒GII的基因组和探针识别位点如图3所示，图中序列和注释信息来自于Norovirus Hu/GII/Carlow/2002/Ire(GB accesion DQ415279)。图3中orf1为编码包括保守的具有RNA多聚酶在内的非结构蛋白；orf2为Capsid蛋白编码区，orf3为编码一种分子量约为22.5Kda的强碱性微小结构蛋白。

探针设计完毕后使用NCBI BLAST中的nr数据库进行特异性的检验，并使用Primer premier5检测是否有发夹结构或者二聚体形成，结果表明设计探针满足特异性要求，且不会形成发夹结构或者二聚体。

3、探针的合成和标记

1)探针的合成

醛基化芯片寡聚核苷酸探针固定原理是将合成的寡聚核苷酸探针使用5′连接氨基直接连接在醛基化表面上。醛基玻片固定DNA存在两个反应，共价结合反应和还原反应。共价结合反应是DNA碱基上的氨基和醛基进行共价结合，发生于连接氨基上的非键电子对亲和进攻醛基基团上电正性的碳原子时。随后的脱水步骤在多数芯片点样过程(如，湿度<40％时)均会发生，使得在氨基化DNA分子和芯片表面间形成共价键。反应结果是形成了一个取代亚胺，通常被称为希夫碱(Schiffbase)。然后通过还原反应得到可用于杂交的标记探针的醛基修饰基因芯片，主要反应原理如图4所示。

因此要在醛基化表面固定的DNA分子(探针)必须具有一个伯氨基，即5’-氨基，又称为连接氨基，具有通过6-12个碳原子间隔臂连接在5’核苷酸的磷酸基团上的一个伯氨基。而为了使探针分子在芯片上伸展开来，利于靶标探针的杂交，在5’端加上15个T。合成探针P_NV_GI：TTAGACGCCATCATCATTTAC(序列表中序列1)、P_NV_GII_1：TCGACGCCATCTTCATTCAC(序列表中序列2)P_NV_GII_2：AGCCAGATTGCGATCGCCCT(序列表中序列3)，并在合成时在每个探针的5’端加上15个T后再加上一个伯氨基即得到用于检测诺如病毒GI型和诺如病毒GII型的探针。按照上述要求，将探针在英俊生物技术有限公司合成。

2)点样前的探针准备

步骤1合成好的检测诺如病毒GGI组的探针(P_NV_GI)或检测诺如病毒GG II组的探针(P_NV_GII_1和P_NV_GII_2)分别先溶解在双蒸水中，得到P_NV_GI终浓度为40μM的探针核酸溶液(检测诺如病毒GGI组的探针溶液)或P_NV_GII_1和P_NV_GII_2终浓度均为40μM的探针核酸溶液(检测诺如病毒GG II组的探针溶液)，分别转5μL上述检测诺如病毒GGI组的探针溶液或检测诺如病毒GG II组的探针溶液到384孔板或96孔板中，分别加入5μL2×晶

基因芯片点样液(博奥生物，产品目录号：440010)，并用移液器充分混合后，即可用于基因芯片点样。

3)芯片设计和探针固定

A、芯片设计和探针固定

探针和对照样品以点阵(微阵列)的形式分布在芯片上。每个芯片上有四个点阵。四个点阵的设计完全相同，其排列和间距如图6所示；

每个点阵各有检测诺如病毒GGI组的探针和检测诺如病毒GG II组的探针，同时设置杂交阳性质控(PC)、杂交阴性质控(NC)和磁标。

磁标为一段生物素(Biotin)标记的序列(序列为15个T的聚T长链，其3′端用生物素标记，5′端修饰有一个伯氨基)，直接点到芯片上，作用主要有两个：一是监控链霉亲和素杂交过程，二是以此为基准分辩杂交结果。

杂交阳性质控(PC)探针，其序列来源于苦瓜的一段基因片段，和人以及微生物无交叉杂交反应，可与上述杂交阳性对照杂交，其序列为：

GCCGAACCTACCATACATTGAG(序列表中序列8)。

杂交阴性质控(NC)探针为由阳性质控探针单碱基改变而形成，和人以及微生物无交叉杂交反应；其序列为：GCCGAACCTAGCATACATTGAG(序列表中序列9)。

杂交阳性质控(PC)探针和杂交阴性质控(NC)探针在合成时在每个探针的5’端加上15个T后再加上一个伯氨基即得到杂交阳性质控(PC)探针和杂交阴性质控(NC)探针。按照上述要求，将探针在英俊生物技术有限公司合成。

杂交阳性质控(PC)探针和杂交阴性质控(NC)探针和磁标按照步骤2)所述的方法先分别溶解在双蒸水中至终浓度均为40μM，用于基因芯片点样。

将上述检测诺如病毒GGI组的探针和检测诺如病毒GG II组的探针，同时设置杂交阳性质控(PC)探针、杂交阴性质控(NC)探针和磁标(Biotin)由博奥生物有限公司生产的晶

SmartArrayer^TM 48微阵列芯片点样系统按点样步骤点样到醛基片基上。点好样的芯片37℃水合过夜，去离子水清洗2遍，将芯片放入硼酸盐溶液中(1.0g NaBH₄+300ml PBS+100ml无水乙醇)孵育5分钟，去离子水清洗2遍，空气中干燥后，即得到检测诺如病毒GGI组的探针和检测诺如病毒GG II组的探针的基因芯片。各点阵的探针排布图如图6所示。图6中GI为检测诺如病毒GGI组的探针，GII为检测诺如病毒GG II组的探针，PC为杂交阳性质控探针，NC为杂交阴性质控探针，Biotin为磁标。

B、芯片的质量控制

制备完成后的芯片经晶

LuxScan^TM 10K微阵列芯片扫描仪在PMT/Power＝90/900的扫描参数下扫描，在同一张芯片内，同一根针点样，点直径偏差小于20％。点阵整齐，无明显连点现象，即证明芯片是合格的。结果表明步骤A制备的基因芯片合格。

二、GGI组诺如病毒基因片段扩增引物和GG II组诺如病毒基因片段扩增引物的制备

实验中预期采用的方法为提取RNA后首先用随机引物进行反转录。但是也设计了特异的引物备用。在正向引物的5′端都加上了PstI的酶识别位点(CTGCAG)，反向引物的5′端加上了SacI酶识别位点(GAGCTC)，并都在酶切位点5′端加上了保护碱基。加上酶切位点和保护碱基可以提高PCR反应扩增效率。引物包括GGI组类诺如病毒基因片段扩增引物、GGII组诺如病毒基因片段扩增引物，它们的序列如下所述：

设计调取诺如病毒GGI组基因序列的引物序列为：GI_SKF：

TGCACTGCAGCTGCCCGAATTYGTAAATGA(兼并引物，其中，Y是兼并碱基符号，Y表示T或C；序列表中序列4)；GI_SKR：

AGCTGAGCTCCCAACCCARCCATTRTACA(兼并引物，其中，R是兼并碱基符号，R表示G或A，序列表中序列5)。该引物对可以GGI组诺如病毒基因组DNA为模板扩增得到350bp的片段，该片段可与探针P_NV_GI杂交。

设计调取诺如病毒GG II组基因序列的引物序列为：GII_SKF：TGCACTGCAGCARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG(兼并引物，其中，R、B、Y是兼并碱基符号，R表示G或A，B表示G或C或T，Y表示T或C；序列表中序列6)；GII_SKR：AGCTGAGCTCCCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT(兼并引物，序列表中序列7，其中，R、N和H是兼并碱基符号，R表示G或A，N表示A、G、C或T，H表示A或C或T)。该引物对可以GG II组诺如病毒基因组DNA为模板扩增得到387bp的片段，该片段可与探针P_NV_GII_1和P_NV_GII_2杂交。

上述引物在英俊生物技术有限公司合成，其中上游引物(GI_SKF、GII_SKF)5’端用生物素(Biotin)标记。

实施例2、鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒的效果检测

实施例1制备的鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒的检测原理如图7所示，具体过程是用生物素标记的GGI组诺如病毒基因片段扩增引物和生物素标记的GG II组诺如病毒基因片段扩增引物对样品进行扩增，如果该样品中含有GGI组诺如病毒或GG II组诺如病毒，则其相应的引物可扩增得到生物素标记的GGI组诺如病毒或GG II组诺如病毒基因片段，将扩增得到的产物与实施例1的步骤一制备的标记有用于检测GGI组诺如病毒基因片段的探针和用于检测GG II组诺如病毒的探针的基因芯片杂交，然后用链霉亲和素包被的磁珠进行标记，如果探针跟扩增产物可以杂交结合，则结合上的生物素标记的扩增产物可被链霉亲和素包被的磁珠标记，反应结果可以直接裸眼观察，或采用普通光学照相装置照相成像观察结果，也可以用晶芯LuxScan10K/A微阵列芯片扫描仪在Power/PMT＝90/800下进行扫描图像。如果在相应的位置有成像反应点则可确定该样品中含有该探针检测的诺如病毒类型；反之，则没有。以下述检测具体样品的实验为例，说明实施例1制备的鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒的具体使用方法和效果。

一、实施例1制备的鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒的检测诺如病毒效果

1、病毒RNA提取及PCR扩增目标基因

1)病毒总RNA提取

分别取10份GGI组诺如病毒阳性样本(经鉴定(方法参见：孙亚萍，程民，宋士利，等.牡蛎和粪便中G I、G II型诺如病毒实时聚合酶链反应检测方法的建立.中华流行病学杂志，2008；29(6)，594-597)感染GGI组诺如病毒而未感染GGII组诺如病毒的人的粪便标本，广东省疾病预防控制中心)和10份GG II组诺如病毒阳性样本(经鉴定(方法参见：孙亚萍，程民，宋士利，等.牡蛎和粪便中G I、G II型诺如病毒实时聚合酶链反应检测方法的建立.中华流行病学杂志，2008；29(6)，594-597)感染GGI组诺如病毒而未感染GGI组诺如病毒的人的粪便标本，广东省疾病预防控制中心)，每份分别取100ul，加入200ul TRIzol试剂，剧烈振荡60秒，加入100ul氯仿，剧烈振荡15秒，室温防治5分钟，然后于12000g离心15分钟，将水相转移到新离心管内，加入500ul异丙醇，4℃，12000g离心10分钟，弃上清，用70％乙醇洗涤RNA沉淀，然后12000g离心2分钟，干燥10分钟，将沉淀溶于DEPC水中。

2)反转录

采用0mniscript RT kit试剂盒(北京华美生科生物技术有限公司，货号Qiagen-205111)进行反转录，具体方法为将随机引物2μL，dNTP Mix(10mM)(各2.5mM)1μL，样品总RNA(1ng至5μg)6μL混匀，65℃加热变性5分钟，冰浴5分钟；然后加入10×First-Strand Buffer₂μL，MgCL₂(25mM)4μL，DTT(0.1M)2μL，RNaout 1μL，混匀，25℃加热2min，然后加入SuperScript^TM II反转录酶(5U/uL)1μL，混匀，25℃ 10min，42℃ 50min，70℃ 15min，得到反转录的cDNA。

3)PCR扩增GGI组诺如病毒基因片段和GG II组诺如病毒基因片段

以上述步骤2)得到的GGI组诺如病毒或GG II组诺如病毒阳性样本反转录得到的cDNA为模板，用GGI组诺如病毒基因片段扩增引物和GG II组诺如病毒基因片段扩增引物进行PCR扩增反应。

PCR反应体系为：10×PCR Buffer 2μL，25mM MgCL₂ 2μL，2.5mM dNTP mix1.6μL，GGI组诺如病毒基因片段扩增引物和GGII组诺如病毒基因片段扩增引物的下游引物(GII_SKR和GI_SKR，未标记，5μM)0.5μL，GGI组诺如病毒基因片段扩增引物和GGII组诺如病毒基因片段扩增引物的上游引物(GII_SKF和GI_SKF生物素标记40μM)0.5μL，GGI组诺如病毒或GG II组诺如病毒阳性样本反转录得到的cDNA2μL，LA-TagE(5U/ML)0.2μL，H₂O 11.2μL。

PCR扩增程序为：先94℃ 10min；然后94℃ 30sec，51℃ 30sec，72℃ 30sec，40个循环；最后72℃ 5min。

2、PCR产物芯片杂交

根据碱基互补配对的原则，在适当的反应条件下，带有生物素标记的PCR产物与芯片上的互补探针结合形成稳定的双链，再与链霉亲和素包被的磁珠反应，通过链霉亲和素与生物素的亲和作用，对芯片上的杂交结果进行磁珠标记后，得到检测分析结果。

具体方法如下所述：

1)芯片杂交

将实施例1的步骤一制备的标记有用于检测GGI组诺如病毒基因片段的探针和用于检测GGII组诺如病毒的探针的基因芯片放到杂交盒(博奥生物有限公司，货号430010)中，取7.8ul杂交液(含有3×SSC，0.2％(质量百分含量)SDS，25％(质量百分含量)甲酰胺和5×Denhardt′s的溶液)，0.2ul杂交阳性对照，分别和7ul步骤2得到GGI组诺如病毒或GG II组诺如病毒阳性样本PCR产物混合，用移液器混匀后3000rpm离心30s，95℃热变性3min(在PCR仪中)。冰浴骤冷1min。然后用移液器通过杂交盒的盖片上的小孔注到基因芯片的点阵上，使其覆盖芯片上的点阵。确认杂交液覆盖芯片上的点阵后，盖紧杂交盒盖，放入42℃恒温水浴锅中，杂交2小时，使样品与探针充分反应。注：杂交细菌PCR产物时，需两体系PCR产物混合后杂交。每个点阵15μL。一张芯片共4个点阵，可杂交四份样本。

2)芯片清洗

芯片清洗使用不同离子强度的溶液依次漂洗芯片，以除去游离的及非特异性结合的样品。芯片清洗液：洗液I：含2×SSC，0.2％(质量百分含量)SDS的水溶液；洗液II：0.2×SSC的水溶液。

将步骤2)杂交结束后的芯片，快速从杂交盒中拿出(盖片可以重复利用)，将芯片转移到盛放预热至42℃的洗液I(含2×SSC，0.2％(质量百分含量)SDS的水溶液)的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上清洗4min，以洗去没有与探针特异结合的样品。

在洗液I中清洗结束后，迅速用镊子将芯片转移到盛放预热至42℃的洗液II(0.2×SSC的水溶液)的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上清洗4min。然后，将芯片放在50mL锥形离心管中1500rpm离心1分钟。

3、信号反应

1)将步骤4经杂交后的芯片每个点阵点12μL羊血清，37℃孵育30分钟，然后用1×PBS(pH 7.4)(配方为在1000ml水中分别加入8.5g NaCl、2.2g Na₂HPO₄以及0.2g NaH₂PO₄，用HCl或NaOH调PH为7.4)清洗2次，1500rpm离心1分钟。

2)信号反应

链霉亲和素标记：取清洗后的链霉亲和素包被的磁珠与链霉亲和素杂交缓冲液以1：3的体积比混合，然后点到步骤1)处理过的芯片上，点样量为12ul/点阵，37℃杂交10分钟。然后用1×PBS(1000ml水中分别加入8.5g NaCl、2.2g Na₂HPO₄以及0.2g NaH₂PO₄，用HCI或NaOH调PH为7.4得到的溶液)清洗2次，1500rpm离心1分钟，即得到全部反应完毕的芯片。

4、结果分析

1)杂交图片：

芯片杂交结果可以用肉眼直接辨别，达到了直观可视化检测要求。结果也可以采用直接光学成像设备照相显示，如图9和图10中的CCD照片、普通相机照片结果。因磁珠可被激发普适荧光，所以结果也可用扫描仪进行分析，如图9和图10中的荧光扫描图即使用晶芯LuxScan 10K/A微阵列芯片扫描仪在Power/PMT＝90/800下进行扫描的图像结果。结果表明，10份GGI组诺如病毒阳性样本的结果均检测表明为GGI组诺如病毒阳性；10份GG II组诺如病毒阳性样本的检测结果均为GG II组诺如病毒阳性；其中，部分GGI组诺如病毒阳性样本的检测结果(理论杂交图、荧光扫描图、、CCD照片、普通相机照片)如图8所示，部分GGII组诺如病毒阳性样本的检测结果(理论杂交图、荧光扫描图、CCD照片、普通相机照片)如图9所示。

2)杂交信号特异性数据分析

将杂交样品的芯片用晶芯LuxScan 10K/A微阵列芯片扫描仪在Power/PMT＝90/800下进行扫描，并提取荧光信号光强度值中位值，结果如图10(GGI组诺如病毒杂交特异性)和图11(GG II组诺如型病毒杂交特异性)所示，杂交阳性样品探针信号与非样品探针信号值进行方差分析，取置信区间95％，结果表明，由数据分析结果p＝0.0000(<0.05)杂交阳性样品点探针信号与其他探针点信号之间存在显著性差异，证明芯片杂交特异性非常好。图10和图11中，PC为阳性质控探针信号，NC为阴性质控探针信号，NV GI为检测GGI组诺如病毒的探针信号，NV GII为检测GG组诺如病毒的探针信号。

二、实施例1制备的鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒的稳定性验证

按照步骤一的方法用实施例1制备的鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒对GGI组诺如病毒阳性样本(经鉴定(方法参见：孙亚萍，程民，宋士利，等.牡蛎和粪便中G I、G II型诺如病毒实时聚合酶链反应检测方法的建立.中华流行病学杂志，2008；29(6)，594-597)感染GGI组诺如病毒而未感染GG II组诺如病毒的人的粪便标本，广东省疾病预防控制中心)，平行四次同时检测，比较四次检测结果，考察芯片检测方法是否稳定，结果如图12(荧光扫描图)和图13(普通相机照片)所示，检测结果都为GGI组诺如病毒阳性GG II组诺如病毒阴性，四次结果之间并无显著性差异，证明芯片检测方法相当稳定。

三、实施例1制备的鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒的灵敏度检测

以DNA模板起始量为基准对该芯片的检测灵敏度进行了初步研究。取GG II组诺如病毒阳性样品(经鉴定(方法参见：孙亚萍，程民，宋士利，等.牡蛎和粪便中G I、G II型诺如病毒实时聚合酶链反应检测方法的建立.中华流行病学杂志，2008；29(6)，594-597)感染GG II组诺如病毒而未感染GGI组诺如病毒的人的粪便标本，广东省疾病预防控制中心)，提取病毒RNA经反转录后，将cDNA依次进行梯度稀释(100ng，50ng，25ng，10ng)，按步骤一的方法用实施例1制备的鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒进行杂交检测。各cDNA量的检测结果如图14(荧光信号扫描图)和图15(普通相机照片)所示，荧光信号检测灵敏度为模板量25ng，本发明的芯片检测当模板量降至25ng时缺失一个位点，检测灵敏度为模板量50ng。结果表明本发明的方法可视化芯片检测灵敏度为cDNA模板量50ng。

四、实际样品的检测

取临床检测样本20例(人粪便样品，由珠海出入境检验检疫局提供)，用实施例1制备的鉴定GGI组诺如病毒和GG II组诺如病毒的试剂盒检测，操作同步骤一，同时用PCR方法进行检测(PCR检测方法参见：孙亚萍，程民，宋士利，等.牡蛎和粪便中G I、G II型诺如病毒实时聚合酶链反应检测方法的建立.中华流行病学杂志，2008；29(6)，594-597)。

结果如下表1所示，结果表明，本发明的检测方法鉴定GGI组诺如病毒和GGII组诺如病毒真阳性率为6/6＝100％，真阴性率为14/14＝100％，鉴别GGI组诺如病毒或GGII组诺如病毒的准确率达到100％。

表1.实际样品的检测结果

 

检测方法	PCR检测	本发明的检测诺如病毒的试剂盒
			GGI组诺如病毒阳性	1	1
GG II组诺如病毒阳性	5	5
			阳性总数	6	6
阴性	14	14

序列表

<160>9

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc-feature

<222>(22)

<223>y＝t或c

<400>4

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc-feature

<222>(18，25)

<223>r＝g或a

<400>5

<210>6

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc-feature

<222>(13，16，27)

<223>r＝g或a

<220>

<221>misc-feature

<222>(25)

<223>y＝t或c

<220>

<221>misc-feature

<222>(19)

<223>n＝a或g或t或c

<400>6

<210>7

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc-feature

<222>(13，21，25，27)

<223>r＝g或a

<220>

<221>misc-feature

<222>(16)

<223>n＝a或g或t或c

<220>

<221>misc-feature

<222>(16)

<223>h＝a或t或c

<400>7

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

Claims (10)

1、用于鉴定GGI组诺如病毒和GGII组诺如病毒的基因芯片，包括芯片基片、固定于所述芯片基片上的用于检测GGI组诺如病毒的探针和固定于所述芯片基片上的用于检测GGII组诺如病毒的探针；所述用于检测GGI组诺如病毒基因片段的探针具有序列表中序列1的核苷酸序列；所述用于检测GGII组诺如病毒基因片段的探针为具有序列表中序列2核苷酸序列的DNA片段和具有序列表中序列3核苷酸序列的DNA片段。

2、根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：所述用于检测GGI组诺如病毒基因片段的探针或用于检测GGII组诺如病毒基因片段的探针的5′端连接有由聚T组成的直链DNA片段和一个伯氨基。

3、根据权利要求2所述的基因芯片，其特征在于：所述由聚T组成的直链DNA片段含15个T。

4、用于鉴定GGI组诺如病毒和GGII组诺如病毒的试剂盒，包括权利要求1或2或3所述的基因芯片。

5、根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括GGI组诺如病毒基因片段的扩增引物和GGII组诺如病毒基因片段的扩增引物；所述GGI组诺如病毒基因片段的扩增引物由兼并引物1和兼并引物2组成，所述兼并引物1的核苷酸序列为序列表中序列4，所述兼并引物2的核苷酸序列是序列表中序列5；所述GGII组诺如病毒基因片段的扩增引物由兼并引物3和兼并引物4组成，所述兼并引物3的核苷酸序列是序列表中序列6，所述兼并引物4的核苷酸序列是序列表中序列7。

6、根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括链霉亲和素修饰的信号分子；所述链霉亲和素修饰的信号分子为磁珠颗粒、纳米金颗粒、荧光颗粒、化学发光颗粒或化学显色颗粒；所述GGI组诺如病毒基因片段的扩增引物和GGII组诺如病毒基因片段的扩增引物至少在引物对中的一个引物上标记了生物素。

7、根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述GGI组诺如病毒基因片段的扩增引物和GGII组诺如病毒基因片段的扩增引物的上游引物上标记了生物素；所述基因芯片的芯片基片上还固定有5′端修饰有一个伯氨基的生物素标记的DNA片段。

8、根据权利要求4-7中任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括杂交阳性对照；所述基因芯片的芯片基片上还固定有杂交阳性质控探针和杂交阴性质控探针，所述的杂交阳性对照核苷酸序列为自GENBANK号为AF498100的5′端第342—511位核苷酸序列，所述杂交阳性质控探针是能与所述杂交阳性对照杂交的片段，所述杂交阴性质控探针是与人、动物以及微生物无交叉杂交反应，且不与所述杂交阳性对照杂交的DNA片段。

9、一种鉴定GGI组诺如病毒和/或GGII组诺如病毒的方法，是用权利要求4-8中任意一项所述鉴定GGI组诺如病毒和GGII组诺如病毒的试剂盒检测；所述检测方法包括下述步骤：

1)将提取待测样品的RNA，并反转录得到cDNA样品，将干cDNA样品用生物素标记得到生物素标记的基因片段样品；

2)将步骤1)得到的生物素标记的基因片段样品与所述鉴定GGI组诺如病毒和GGII组诺如病毒的试剂盒的基因芯片杂交；

3)将步骤2)杂交后的基因芯片用链霉亲和素修饰的信号分子标记，检测结果；如果所述基因芯片固定用于检测GGI组诺如病毒的探针的部位被链霉亲和素修饰的信号分子标记，则该待测样品中含有GGI组诺如病毒；如果所述基因芯片固定用于检测GGII组诺如病毒的探针的部位被链霉亲和素修饰的信号分子标记，则该待测样品中含有GGII组诺如病毒。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，将所述反转录得到cDNA样品用所述鉴定GGI组诺如病毒和GGII组诺如病毒的试剂盒中GGI组诺如病毒基因片段的扩增引物和GGII组诺如病毒基因片段的扩增引物进行扩增得到所述生物素标记的基因片段样品。

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