CN108369735B - 用于确定数字图像中多个对象的位置的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过区别多个对象的真阳性位置与多个对象的假阳性候选位置来确定数字图像中多个对象的位置的方法和系统。具体地，本发明涉及一种通过区别多个对象的真阳性位置与多个对象的假阳性候选位置来确定数字图像中多个对象的位置的方法，所述多个对象被配置为接收包含遗传信息的分子。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于确定数字图像中多个对象的位置的方法和系统。本发明特别涉及一种通过区别多个对象的真阳性位置与假阳性候选位置来确定数字图像中多个对象的位置的方法和系统。
背景技术
生物技术、医学和相关技术领域基于对分子的分析。电子器件可以以高的精度和特异性分析分子。特别是在过去的几年中，已经开发自动电子器件以用于通过常规方法分析大量样品。例如，使用现代DNA测序装置来常规分析大量DNA探针。蛋白质样品可以通过高通量筛选和相关方法来分析。通常，这些电子器件检测从样品探针发射的荧光信号。当分子如核酸或蛋白质已经用荧光化合物如染料标记时，这是可能的。
市售测序装置能够对用荧光染料标记的大量样品进行并行测序。最近开发的称为“下一代测序”(NGS)的方法已经彻底改变了测序。NGS允许对在流动池中或通过产生油水乳液在空间上分离的克隆扩增的或单个DNA分子进行大规模并行测序。NGS允许数千或甚至数百万至数十亿个测序反应同时进行。
在NGS中，测序通过聚合酶介导的核苷酸延伸的重复循环来进行，或在一种形式中通过寡核苷酸连接的迭代循环来进行。作为一种大规模并行过程，视平台而定，NGS在单次仪器运行中产生数百兆碱基至数千兆碱基的核苷酸序列输出。与常规方法相比，廉价地产生大量序列数据是主要优势。
用于NGS技术的NGS平台和常见应用/领域例如在Voelkerding等人,ClinicalChemistry 55:4 641-658,2009和Metzker,Nature Reviews/Genetics第11卷,2010年1月,第31-46页中进行了综述。
在NGS中，各种目标寡核苷酸共价连接到载体上。接着，用DNA聚合酶将用荧光染料标记的核苷酸连接到生长的寡核苷酸链上。当用不同的荧光染料标记四种核苷酸时，可以检测从探针发射的荧光信号，并且可以鉴定与寡核苷酸连接的核苷酸的类型。检测后，将荧光染料切割掉，并且进行下一个合成循环，其中新的标记的核苷酸被连接到生长的链上。通过进行多个循环，可以以逐步方式确定生长的寡核苷酸链的序列。工作步骤在自动化测序装置中进行。
US 2010/0323350 A1和WO 2009/117119 A1涉及使用例如通过合成方法从测序获得的数据来确定核苷酸序列中的核酸身份的方法和组合物。
WO 2008/097455 A1涉及一种用于激发和测量包含荧光材料如荧光标记、染料或颜料的样品上或样品中的荧光的成像系统，特别是涉及检测核酸上的荧光标记。此外，公开了一种器件，其被配置为使得可同时检测多种不同DNA模板中的荧光标记。
WO 2014/020137 A1涉及一种用于从测序文库富集目标序列来提供目标富集的测序文库的方法，其中该测序文库适合于大规模并行测序并且包含多个双链核酸分子。
从具有标记分子的样品探针发射的荧光信号很弱，但信号必须以高的精度和特异性检测。因此，这些方法需要精确的光学设备，特别是相机和扫描技术。
此外，为了例如在FASTQ中获得精确且可靠的测序结果，需要对测序装置的光学成像系统所捕获的数字图像进行广泛评估。
测序装置的流动池的一部分的典型白光图像包含代表背景或珠粒的像素。对于测序装置中的测序任务，重要的是读出并且分析珠粒的测量强度。因此，必须确定目标像素，这是指珠粒位置。
珠粒检测过程的准确性必须尽可能稳定并且尽可能可靠，以确保基因测序中后续处理步骤的正确进行，例如，判定珠粒是否接收遗传信息。
因此，有必要只考虑真阳性珠粒位置，并且忽略假阳性位置。由于检测过程的准确性很大程度上取决于白光图像中是否存在噪声和/或伪影，因此用于区别真阳性珠粒位置与假阳性珠粒位置的相应方法必须特别能够处理这些对象。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于确定数字图像中多个对象的位置的方法和系统，特别是通过区别多个对象的真阳性位置与假阳性候选位置来确定数字图像中多个对象的位置的方法和系统。根据本发明的方法是用计算机实施的。然而，技术人员应了解，还存在实施根据本发明方法的其它方式。
这个目的通过根据独立权利要求的方法和系统实现。从属专利权利要求指的是优选实施方式。
本发明涉及一种通过区别多个对象的真阳性候选位置与多个对象的假阳性位置来确定数字图像中多个对象的位置的方法。多个对象被配置为接收包含遗传信息的分子。所述方法包含确定数字图像中的多个像素的步骤，每个像素相对于相应像素的多个相邻像素的强度值具有局部最大强度值。所述方法还包含以下步骤：确定具有局部最大强度值的每个像素的强度值相对于具有局部最大强度值的相应像素的强度值和多个相应相邻像素中的每一个的强度值的方差。所述方法还包含以下步骤：将具有局部最大强度值的多个像素中的每一个的强度值用强度值的相应确定的方差进行加权。所述方法还包含产生直方图的步骤，所述直方图包含各自具有局部最大强度值的多个像素中每个像素的相应加权强度。所述方法还包含确定直方图的多个局部最小值和全局最大值的步骤。所述方法还包含以下步骤：选择多个局部最小值中的一个作为用于区别多个对象的真阳性位置与多个对象的假候选阳性位置的阈值，其中这一个局部最小值是在考虑直方图的所选局部最小值的位置相对于全局最大值的位置的情况下选择的。所述方法还包含使用阈值来区别多个对象的真阳性位置与多个对象的假阳性候选位置的步骤。
优选地，根据本发明的方法还包含确定多个对象中每个对象的子像素位置的步骤。换言之，在确定了对应于多个对象的真阳性位置的像素之后，在子像素标度上确定多个对象的真阳性位置。优选地，通过确定的像素以及对应于多个对象的真阳性位置的对应相邻像素的抛物线拟合来确定多个对象的真阳性位置。抛物线符合的一个实例可以见于参考文献[1]。
优选地，按照如上所呈现的顺序执行根据本发明的方法的上述步骤。
优选地，多个相邻像素由相应像素的直接相邻像素组成，所述相应像素相对于多个相邻像素的强度值具有局部最大值。
优选地，多个相邻像素包含相应像素的直接相邻像素，所述相应像素相对于多个相邻像素的强度值具有局部最大值。
优选地，根据本发明的方法在将具有局部最大强度值的多个像素中的每一个的强度值进行加权的步骤和产生包含各自具有局部最大强度值的多个像素中每个像素的相应加权强度的直方图的步骤之间还包含下述步骤：去除或定位(clamp)加权强度值高于第一阈值t_w1或低于第二阈值t_w2的加权像素。
优选地，根据本发明的方法在将具有局部最大强度值的多个像素中的每一个的强度值进行加权的步骤和产生包含各自具有局部最大强度值的多个像素中每个像素的相应加权强度的直方图的步骤之间并且更优选在去除或定位加权像素后还包含以下步骤：将加权像素用对数标度进行缩放。
优选地，至少一个对象是优选被配置为接收DNA和/或RNA的珠粒。
优选地，根据本发明的方法在确定数字图像中的多个像素，每个像素相对于相应像素的多个相邻像素的强度值具有局部最大强度值的步骤之前还包含以下步骤：去除和/或定位数字图像中强度低于第一阈值t_e1或高于第二阈值t_e2的至少一个像素。
优选地，根据本发明的方法包含去除数字图像中的不均匀照明的步骤。优选地，去除数字图像中的不均匀照明的步骤在确定数字图像中的多个像素，每个像素相对于相应像素的多个相邻像素的强度值具有局部最大强度值的步骤之前进行，并且更优选在去除和/或定位数字图像中强度低于第一阈值t_e1或高于第二阈值t_e2的至少一个像素的步骤之后进行。
优选地，去除数字图像中的不均匀照明的步骤包含以下步骤中的至少一个，优选按以下顺序：
-将低通滤波器施加于数字图像的拷贝；
-通过数字图像的经过低通过滤的拷贝将数字图像进行划分；
-将数字图像划分成N多个区块(tile)；
-为N多个区块中的每个区块确定第一阈强度值tlo_n和第二阈强度值thi_n，其中1≤n≤N，其中thi_n>tlo_n；
-产生包含N个区块的第一阈强度值tlo_n的第一矩阵m_1并且产生包含N个区块的第二阈强度值thi_n的第二矩阵m_2；
-将中值滤波器施加于第一矩阵m_1并且将中值滤波器施加于第二矩阵m_2；
-将第一矩阵m_1放大到矩阵m_1'并且将第二矩阵m_2放大到矩阵m_2'，矩阵m_1'和m_2'两者都具有数字图像的原始尺寸；以及-在考虑第一矩阵m_1'的对应值和第二矩阵m_2'的对应值的情况下将数字图像的每个像素的每个强度值归一化。
优选地，施加于数字图像的拷贝的低通滤波器是高斯滤波器。优选地，N个区块中的每个区块在第一方向上具有相同长度l_1，并且在垂直于第一方向的第二方向上具有相同长度l_2。优选地，l_1＝l_2。优选地，l_1＝l_2＝64像素。优选地，第一矩阵m_1和第二矩阵m_2的尺寸是52×39。优选地，数字图像的尺寸是3296×2472。优选地，使用双三次内插来执行将第一矩阵m_1放大到矩阵m_1'并且将第二矩阵m_2放大到矩阵m_2'的步骤。
优选地，根据本发明的方法在将第一矩阵m_1放大到矩阵m_1'并且将第二矩阵m_2放大到矩阵m_2'的步骤之后并且在将数字图像的每个像素的每个强度值归一化的步骤之前还包含以下步骤：将低通滤波器施加于第一矩阵m_1并且将低通滤波器施加于第二矩阵m_2。优选地，所述低通滤波器是高斯滤波器。
优选地，通过线性变换来执行将数字图像的每个像素的每个强度值归一化的步骤。
优选地，所述线性变换可以如下计算：
其中
是数字图像中相应像素的归一化强度值，v(x，y)是数字图像中未归一化像素的强度值，m_1'(x,y)是放大的第一矩阵m_1'的对应值并且m_2'(x,y)是放大的第二矩阵m_2'的对应值。
本发明还涉及一种计算机程序产品，其包含一个或多个计算机可读介质，所述计算机可读介质具有用于执行上述方法中的一种方法的步骤的计算机可执行指令。
本发明还涉及一种通过区别多个对象的真阳性位置与多个对象的假阳性位置来确定数字图像中多个对象的位置的系统。
优选地，所述多个对象被配置为接收包含遗传信息的分子。
优选地，所述系统被配置成执行根据前述权利要求任一项所述的方法中的任一种的步骤。
根据本发明的系统包含第一单元，所述第一单元被配置成确定数字图像中的多个像素，每个像素相对于相应像素的多个相邻像素的强度值具有局部最大强度值。
根据本发明的系统还包含第二单元，所述第二单元被配置成确定具有局部最大强度值的每个像素的强度值相对于具有局部最大强度值的相应像素的强度值和多个相应相邻像素中的每一个的强度值的方差。
所述系统还包含第三单元，所述第三单元被配置成将具有局部最大强度值的多个像素中的每一个的强度值用所述强度值的相应确定的方差进行加权。
所述系统还包含第四单元，所述第四单元被配置成产生直方图，所述直方图包含各自具有局部最大强度值的多个像素中每个像素的相应加权强度。
所述系统还包含第五单元，所述第五单元被配置成确定直方图的多个局部最小值和全局最大值。
所述系统还包含第六单元，所述第六单元被配置成选择局部最小值中的一个作为用于区别多个对象的真阳性位置与多个对象的假阳性位置的阈值，其中这一个局部最小值是在考虑直方图的所选局部最小值的位置相对于全局最大值的位置的情况下选择的。
所述系统还包含第八单元，所述第八单元被配置成将所述阈值用于区别多个对象的真阳性位置与多个对象的假阳性候选位置。
优选地，所述系统包含被配置成去除不均匀照明的单元。
优选地，被配置成去除不均匀照明的单元包含以下各项中的至少一项：
-被配置成将低通滤波器施加于数字图像的拷贝的单元；
-被配置成通过数字图像的经过低通过滤的拷贝将数字图像进行划分的单元；
-被配置成将数字图像划分成N多个区块的单元；
-被配置成为N多个区块中的每个区块确定第一阈强度值tlo_n和第二阈强度值thi_n的单元，其中1≤n≤N，其中thi_n>tlo_n；
-被配置成产生包含N个区块的第一阈强度值t tlo_n的第一矩阵m_1以及产生包含N个区块的第二阈强度值thi_n的第二矩阵m_2的单元；
-被配置成将中值滤波器施加于第一矩阵m_1并且将中值滤波器施加于第二矩阵m_2的单元；
-被配置成将第一矩阵m_1放大到矩阵m_1'并且将第二矩阵m_2放大到矩阵m_2'的单元，矩阵m_1'和m_2'两者都具有数字图像的原始尺寸；以及
-被配置成在考虑第一矩阵m_1'的对应值和第二矩阵m_2'的对应值的情况下将数字图像的每个像素的每个强度值归一化的单元。
优选地，被配置成去除不均匀照明的单元还包含如下单元，所述单元被配置成将低通滤波器施加于第一矩阵m_1并且将低通滤波器施加于第二矩阵m_2。更优选地，被配置成去除不均匀照明的单元还包含如下单元，所述单元被配置成在将中值滤波器施加于第一矩阵m_1并且将中值滤波器施加于第二矩阵m_2之后将低通滤波器施加于第一矩阵m_1并且将低通滤波器施加于第二矩阵m_2。
附图说明
下文将参考优选示例性实施方式并且参考附图更详细地解释本发明，其中：
图1显示示例性白光图像、其放大部分以及根据本发明的实施方式确定相对于直接相邻像素的强度值具有局部最大强度值的像素；
图2显示根据本发明的优选实施方式的示例性直方图；
图3显示具有由渐晕效应引起的不均匀照明的白光图像的示例性草图；
图4显示根据本发明的实施方式将具有不均匀照明的白光图像划分成多个区块的示例性草图；
图5显示根据本发明的优选实施方式的示例性系统；
图6显示根据本发明的另一个优选实施方式的示例性系统；并且
图7显示根据本发明的优选实施方式的被配置成去除不均匀照明的单元。
具体实施方式
图1在左侧显示代表所谓白光图像的示例性数字图像，即在反射式白光照明期间使用光学成像系统获得的数字图像。出于说明性目的，示例性数字图像为反色。白光图像包含珠粒，即被配置为在表面上接收DNA或RNA的对象。这些珠粒可例如以商标Dynabeads购自例如Thermo Fisher Scientific Inc.，参见参考文献[2]。图1左侧的白光图像还包含伪影，所述伪影必须与真实珠粒以及真实珠粒位置相区别。图1的右侧显示图1左侧的示例性白光图像的示例性放大部分。根据本发明，选择白光图像的像素，并且判定这个像素是否相对于其相邻像素的强度值具有局部最大强度值。根据这个优选实施方式，仅考虑直接相邻的像素。然而，技术人员应理解，还可以考虑更多的相邻像素，例如，不仅直接相邻像素，即最近的相邻像素，而且例如其次最近的相邻像素。在图1右侧的放大部分中显示相对于相邻像素的强度值具有局部最大强度值的示例性像素。具有局部最大强度值的像素在3×3图案的正方形中用“X”标记，并且其相邻像素与图案中的所述像素直接接触。
分析白光图像的每个像素，并且判定相应像素是否相对于其相邻像素的强度值具有局部最大强度值。用这种方式确定多个像素，每个像素相对于其相应的相邻像素具有局部最大强度值。
具有局部最大强度值的这些像素是可能的珠粒位置的候选者。
在下一步骤中，确定具有局部最大强度值的每个像素的强度值相对于具有局部最大强度值的相应像素的强度值和多个相应相邻像素中的每一个的强度值的方差。例如，在图1右侧的放大部分中，确定具有局部最大强度值的强度值相对于3×3图案中的每个像素的强度值的方差。对于具有局部最大强度值的每个像素重复进行这种具有局部最大强度值的像素的强度值的方差的确定。
计算具有局部最大强度值的像素的强度值的方差以及其相邻像素的强度值的方差的优点之一是珠粒像素，即真实珠粒位置的方差高于“空区”如指的是假阳性位置的图像区域中的局部峰值的方差。
在下一步骤中，将具有局部最大强度值的每个像素的强度值用相应像素的强度值的相应确定的方差进行加权。换言之，方差-图像被解释为高通滤波器，其中高频元素如珠粒通过并且低频结构被抑制。因此，每个像素只有一个标量值即加权强度值需要进一步考虑。
在下一步骤中，将加权强度值低于第一阈值t_w1或高于第二阈值t_w2的加权像素定位。通过去除下限和上限来限制动态范围产生更拉伸的双模态直方图，这将在下文进行描述，因为这确保了异常值不会不必要地将相关数据点压缩到下文提及的直方图的过少的柱中。这种拉伸支持即将进行的阈值确定过程的稳健性和可靠性。
在下一步骤中，将加权像素用对数标度进行缩放。对数缩放进一步支持下述双模态直方图中两种类型的拉伸。
在下一步骤中，产生直方图，所述直方图包含各自具有局部最大强度值的多个像素中每个像素的相应加权强度。因此，每个像素只有一个标量值即加权强度值被置于直方图中。
在下一步骤中，确定直方图的多个局部最小值和全局最大值。
在下一步骤中，选择局部最小值中的一个作为用于区别多个对象的真阳性位置与多个对象的假阳性位置的阈值。局部最小值是在考虑直方图的所选局部最小值的位置相对于全局最大值的位置的情况下选择的。换言之，选择全局最大值旁边的右侧或左侧最小值。如果全局最大值位于直方图的右侧部分，则搜索左侧最小值。如果全局最大值位于直方图的左侧部分，则搜索右侧最小值。考虑双模态直方图的优点之一是可以预期两个峰值位置，所述位置大致代表两个潜在类别，即珠粒的真阳性位置和假阳性位置。基于峰的最大值，确定施加最接近的最小值的搜索的方向。例如，当最大峰值对应于真阳性值时，则在左侧搜索局部最小值，并且在最大峰值对应于假阳性值的情况下，在右侧搜索局部最小值。对最大值属于假或真阳性类别的辨别是基于直方图的中心位置，因为假阳性值即低区别值通常位于直方图的左侧部分，并且真阳性值即高区别值位于直方图的右侧部分。
在下一步骤中，确定对应于多个对象的真阳性位置的像素。这使用用于区别多个对象的真阳性位置与多个对象的假阳性候选位置的阈值来执行。换言之，将确定的最小值用作阈值来区别真阳性珠粒位置与假阳性珠粒位置。
此外，可以在子像素标度上例如通过抛物线拟合来计算珠粒位置。抛物线拟合的一个实例在参考文献[1]中给出。
图2示例性显示根据本发明的优选实施方式的双模态直方图。在直方图中，全局最大值对应于真阳性值，并且在所述全局最大值的左侧搜索局部最小值。
在捕获白光图像期间发生不均匀照明的情况下，优选在上文提及的用于区别真阳性位置与假阳性位置的方法之前进行预处理步骤。
图3显示由所谓渐晕效应引起的不均匀照明的示例性草图。渐晕效应是指与图像中心相比，周边的图像亮度或饱和度降低。在图3中，亮度降低的区域以阴影区显示。
根据本发明的一个优选实施方式，执行以下步骤来去除白光图像中的不均匀照明：
在第一步骤中，将高斯滤波器施加于数字图像的拷贝。高斯滤波器优选具有非常高的σ。接着，将数字图像通过其模糊化即经过高斯过滤的版本进行划分。高斯滤波器具有低通滤波器的特性，因此保留了图像的低频元素。因此，这是照明函数的可行近似，特别是当滤波器使用非常高的σ时。
在下一步骤中，将数字图像划分成N多个区块。换言之，将所得图像细分成数个区块。具有不均匀照明的数字图像的这种划分如图4中示例性显示。这种区块法的优点之一是可以更稳健地确定不同图像区域的低百分位值和高百分位值。在下述步骤中需要这些值来将图像的对比度归一化。
在下一步骤中，为N多个区块中的每个区块确定第一阈强度值tlo_n和第二阈强度值thi_n，其中1≤n≤N，并且其中thi_n>tlo_n。换言之，在局部图像区域中确定低百分位值和高百分位值。
在下一步骤中，产生包含N个区块的第一阈强度值tlo_n的第一矩阵m_1，并且产生包含N个区块的第二阈强度值thi_n的第二矩阵m_2。
在下一步骤中，将中值滤波器施加于第一矩阵m_1，并且将中值滤波器施加于第二矩阵m_2。施加中值滤波器的一个优点是抑制异常值。
在下一步骤中，将高斯滤波器施加于第一矩阵m_1，并且将高斯滤波器施加于第二矩阵m_2。换言之，使两个矩阵的表面平滑。使两个矩阵的表面平滑的优点之一是在放大矩阵的后续步骤中，防止或抑制放大的矩阵中的不连续性。
在下一步骤中，将第一矩阵m_1放大到矩阵m_1'，并且将第二矩阵m_2放大到矩阵m_2'。放大后，矩阵m_1'和m_2'两者都具有数字图像的原始尺寸。放大两个矩阵的优点之一是对于每个珠粒位置或每个可能的珠粒位置存在对应的百分位值。
在下一步骤中，通过使用下式线性变换将每个像素的每个强度值v(x，y)归一化：
其中
是数字图像中相应像素的归一化强度值，v(x，y)是数字图像中未归一化像素的强度值，m_1'(x,y)是放大的第一矩阵m_1'的对应值并且m_2'(x,y)是放大的第二矩阵m_2'的对应值。这个归一化步骤将强度变换成在0至1范围内的中间值，即[0,1]。
图5显示根据本发明的优选实施方式的示例性系统100。
通常，系统100被配置成执行上述方法步骤。
系统100包含第一单元101，所述第一单元101确定数字图像中的多个像素，每个像素相对于相应像素的多个相邻像素的强度值具有局部最大强度值。
在第一单元101确定所述多个像素之后，系统100的第二单元102确定具有局部最大强度值的每个像素的强度值相对于具有局部最大强度值的相应像素的强度值和多个相应相邻像素中的每一个的强度值的方差。
在第二单元102确定具有局部最大强度值的每个像素的强度值的方差之后，第三单元103将具有局部最大强度值的多个像素中的每一个的强度值用强度值的相应确定的方差进行加权。
在第三单元103将强度值加权之后，系统100的第四单元104产生直方图，所述直方图包含各自具有局部最大强度值的多个像素中每个像素的相应加权强度。
之后，第五单元105确定直方图的局部最小值和全局最大值。
在确定直方图的局部最小值和全局最大值之后，第六单元106选择局部最小值中的一个作为用于区别多个对象的真阳性位置与多个对象的假阳性位置的阈值，其中这一个局部最小值是在考虑直方图的所选局部最小值的位置相对于全局最大值的位置的情况下选择的。
之后，第七单元107通过将阈值施加于直方图来确定对应于多个对象的真阳性位置的像素。
图6显示根据本发明的另一优选实施方式的示例性系统100。
系统100包含与参考图5的根据优选实施方式的系统100相同的单元。此外，系统100还包含被配置成去除不均匀照明的单元108。
图7显示根据本发明的一个优选实施方式的被配置成去除不均匀照明的单元108。
通常，单元108被配置成执行上述去除不均匀照明的方法步骤。
单元108包含第一单元108-1，所述第一单元108-1将低通滤波器施加于数字图像的拷贝。在施加低通滤波器之后，系统100的第二单元108-2通过数字图像的经过低通过滤的拷贝将数字图像进行划分。之后，系统100的第三单元108-3将数字图像划分成N多个区块。在划分成多个区块之后，系统100的第四单元108-4为N多个区块中的每个区块确定第一阈强度值tlo_n和第二阈强度值thi_n，其中1≤n≤N，其中thi_n>tlo_n。之后，系统100的第五单元108-5产生包含N个区块的第一阈强度值tlo_n的第一矩阵m_1，并且产生包含N个区块的第二阈强度值thi_n的第二矩阵m_2。产生矩阵之后，第六单元108-6将中值滤波器施加于第一矩阵m_1并且将中值滤波器施加于第二矩阵m_2。中值过滤之后，第七单元108-7将高斯滤波器施加于第一矩阵m_1并且将高斯滤波器施加于第二矩阵m_2。
经过高斯过滤之后，第八单元108-8将第一矩阵m_1放大到矩阵m_1'，并且将第二矩阵m_2放大至矩阵m_2'，矩阵m_1'和m_2'两者都具有数字图像的原始尺寸。放大之后，第九单元108-9在考虑第一矩阵m_1'的对应值和第二矩阵m_2'的对应值的情况下将数字图像中每个像素的每个强度值归一化。
尽管已经在附图和前面的描述中详细说明和描述了本发明，但是所述说明和描述应被认为是说明性的或示例性的并且是非限制性的；因此本发明不限于所公开的实施方式。根据对附图、公开内容和权利要求书的研究，本领域技术人员可以通过实践要求保护的本发明来了解且实现所公开的实施方式的变化。在权利要求书中，词语“包含”不排除其它要素或步骤，并且不带具体数量的指称不排除多个并且可以表示“至少一个”。
参考文献：
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[2]-https://www.thermofisher.com/de/de/home/brands/product-brand/dynal.html
Claims (15)
1.一种通过区别多个对象的真阳性位置与所述多个对象的假阳性候选位置来确定数字图像中多个对象的位置的方法，所述多个对象被配置为接收包含遗传信息的分子，所述方法包含以下步骤，优选按以下顺序：
a)确定所述数字图像中的多个像素，每个像素相对于相应像素的多个相邻像素的强度值具有局部最大强度值；
b)确定具有局部最大强度值的每个像素的强度值相对于具有局部最大强度值的相应像素的强度值和多个相应相邻像素中的每一个的强度值的方差；
c)将具有局部最大强度值的所述多个像素中的每一个的强度值用所述强度值的相应确定的方差进行加权；
d)产生直方图，所述直方图包含各自具有局部最大强度值的所述多个像素中每个像素的相应加权强度；并且
e)确定所述直方图的多个局部最小值和全局最大值；
f)选择所述多个局部最小值中的一个作为用于区别所述多个对象的真阳性位置与所述多个对象的假阳性位置的阈值，其中这一个局部最小值是在考虑所述直方图的所选局部最小值的位置相对于所述全局最大值的位置的情况下选择的；以及
g)使用所述阈值来区别所述多个对象的真阳性位置与所述多个对象的假阳性候选位置。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包含确定每个对象的子像素位置的步骤，优选通过所确定的像素的抛物线拟合来进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法在步骤d)与e)之间还包含以下步骤：去除或定位加权强度值低于第一阈值t_w1或高于第二阈值t_w2的加权像素。
4.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法在步骤d)与e)之间还包含以下步骤：将加权像素用对数标度进行缩放。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个对象是珠粒，所述珠粒优选被配置为接收DNA和/或RNA。
6.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法在步骤a)之前还包含如下步骤：去除或定位所述数字图像中强度低于第一阈值t_e1或高于第二阈值t_e2的至少一个像素。
7.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包含去除所述数字图像中的不均匀照明的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中去除不均匀照明包含以下步骤中的至少一个，优选按以下顺序：
a1)将低通滤波器施加于所述数字图像的拷贝；
a2)通过所述数字图像的经过低通过滤的拷贝将所述数字图像进行划分；
a3)将所述数字图像划分成N多个区块；
a4)为所述N多个区块中的每个区块确定第一阈强度值tlo_n和第二阈强度值thi_n，其中1≤n≤N，其中thi_n>tl_n；
a5)产生包含N个区块的第一阈强度值tlo_n的第一矩阵m_1以及产生包含N个区块的第二阈强度值thi_n的第二矩阵m_2；
a6)将中值滤波器施加于所述第一矩阵m_1并且将中值滤波器施加于第二矩阵m_2；
a7)将所述第一矩阵m_1放大到矩阵m_1'并且将所述第二矩阵m_2放大到矩阵m_2'，矩阵m_1'和m_2'两者都具有所述数字图像的原始尺寸；以及
a8)在考虑所述第一矩阵m_1'的对应值和所述第二矩阵m_2'的对应值的情况下将所述数字图像的每个像素的每个强度值归一化。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法在步骤a6)之后和步骤a7)之前还包含以下步骤：将低通滤波器施加于所述第一矩阵m_1以及将低通滤波器施加于所述第二矩阵m_2。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述放大是使用双三次内插来执行的。
11.根据权利要求8或9所述的方法，其中将所述数字图像的每个像素的每个强度值归一化通过线性变换、优选通过下式来执行：
其中
是所述数字图像的相应像素的归一化强度值，v(x，y)是所述数字图像的未归一化像素的强度值，m_1'(x,y)是放大的第一矩阵m_1'的对应值并且m_2'(x,y)是放大的第二矩阵m_2'的对应值。
12.一种计算机程序产品，其包含一个或多个计算机可读介质，所述计算机可读介质具有用于执行根据前述权利要求任一项所述的方法的步骤的计算机可执行指令。
13.一种通过区别多个对象的真阳性位置与所述多个对象的假阳性候选位置来确定数字图像中多个对象的位置的系统，所述多个对象被配置为接收包含遗传信息的分子，所述系统优选被配置为执行根据权利要求1至9任一项所述的方法的步骤，所述系统包含：
第一单元，其被配置成确定所述数字图像中的多个像素，每个像素相对于相应像素的多个相邻像素的强度值具有局部最大强度值；
第二单元，其被配置成确定具有局部最大强度值的每个像素的强度值相对于具有局部最大强度值的相应像素的强度值和多个相应相邻像素中的每一个的强度值的方差；
第三单元，其被配置成将具有局部最大强度值的所述多个像素中的每一个的强度值用所述强度值的相应确定的方差进行加权；
第四单元，其被配置成产生直方图，所述直方图包含各自具有局部最大强度值的所述多个像素中每个像素的相应加权强度；和
第五单元，其被配置成确定所述直方图的多个局部最小值和全局最大值；
第六单元，其被配置成选择所述局部最小值中的一个作为用于区别所述多个对象的真阳性位置与所述多个对象的假阳性位置的阈值，其中这一个局部最小值是在考虑所述直方图的所选局部最小值的位置相对于所述全局最大值的位置的情况下选择的；以及
第七单元，其被配置成通过将所述阈值施加于所述直方图来确定对应于所述多个对象的真阳性位置的像素。
14.根据权利要求13所述的系统，所述系统还包含被配置成去除不均匀照明的单元。
15.根据权利要求14所述的系统，其中所述被配置成去除不均匀照明的单元包含：
第一单元，其被配置成将低通滤波器施加于所述数字图像的拷贝；
第二单元，其被配置成通过所述数字图像的经过低通过滤的拷贝将所述数字图像进行划分；
第三单元，其被配置成将所述数字图像划分成N多个区块；
第四单元，其被配置成为所述N多个区块中的每个区块确定第一阈强度值tlo_n和第二阈强度值thi_n，其中1≤n≤N，其中thi_n>tlo_n；
第五单元，其被配置成产生包含N个区块的第一阈强度值tlo_n的第一矩阵m_1以及产生包含N个区块的第二阈强度值thi_n的第二矩阵m_2；
第六单元，其被配置成将中值滤波器施加于所述第一矩阵m_1并且将中值滤波器施加于所述第二矩阵m_2；
第七单元，其被配置成将所述第一矩阵m_1放大到矩阵m_1'并且将所述第二矩阵m_2放大到矩阵m_2'，矩阵m_1'和m_2'两者都具有所述数字图像的原始尺寸；以及
第八单元，其被配置成在考虑所述第一矩阵m_1'的对应值和所述第二矩阵m_2'的对应值的情况下将所述数字图像的每个像素的每个强度值归一化。
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