CN112823352B - 碱基识别方法、系统和测序系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种碱基识别方法、系统、计算机程序产品和测序系统。碱基识别方法包括将对应测序模板的亮斑集合中的亮斑的坐标对应到待检图像上，确定待检图像的相应坐标位置；确定待检图像的相应坐标位置的强度；以及，比较待检图像的相应坐标位置的强度与预设阈值的大小，基于待检图像上强度大于预设阈值的位置的信息进行该碱基识别。该方法和/或系统通过将对应测序模板的亮斑集合中的亮斑的坐标映射到待检图像上，基于待检图像上相应坐标位置的信息进行碱基识别，能够快速、简便且通量高地识别出碱基，确定核酸序列。

Description

碱基识别方法、系统和测序系统
技术领域
本发明涉及信息处理和识别领域，具体地，涉及核酸序列测定相关数据的处理和分析，更具体地，涉及一种碱基识别方法、一种碱基识别系统、一种测序系统和一种计算机程序产品。
背景技术
在相关技术中，包括在基于成像系统多次对生化反应中的核酸分子(模板)进行图像采集以测定该核酸分子的核苷酸顺序的测序平台中，如何有效、准确以及通量高地获得核酸模板的至少一部分的核苷酸组成和顺序，包括如何对多次不同时间点所采集的图像包括图像上的信息进行识别和处理，是值得关注的问题。
发明内容
本发明实施方式旨在至少解决相关技术中存在的技术问题之一或者至少提供一种可选择的实用方案。为此，本发明提供了一种碱基识别方法、一种碱基识别系统、一种计算机程序产品和一种测序系统。
依据本发明的一个实施方式，提供一种碱基识别方法，该方法包括：将对应测序模板的亮斑集合中的亮斑的坐标对应到待检图像上，以确定待检图像的相应坐标位置；确定所称的待检图像的相应坐标位置的强度；以及比较待检图像的相应坐标位置的强度与预设阈值的大小，基于待检图像上强度大于预设阈值的位置的信息进行碱基识别；所称的对应测序模板的亮斑集合基于多个图像构建获得，所称的图像和待检图像均采集自碱基延伸反应，图像和待检图像对应相同的视野，碱基延伸反应时的该视野中存在多个带有光学可检测标记的核酸分子，至少一部分所称的核酸分子在图像和/或待检图像上表现为亮斑。
依据本发明的一个实施方式，提供一种碱基识别系统，用以实施上述本发明任一实施方式中的碱基识别方法，该系统包括：映射模块，用于将对应测序模板的亮斑集合中的亮斑的坐标对应到待检图像上，以确定待检图像的相应坐标位置；强度确定模块，用于计算来自映射模块的待检图像的相应坐标位置的强度；以及识别模块，用于比较来自强度确定模块的待检图像的相应坐标位置的强度与预设阈值的大小，以及基于待检图像上强度大于预设阈值的位置的信息进行该碱基识别；所称的对应测序模板的亮斑集合基于多个图像构建获得，所称的图像和待检图像均采集自碱基延伸反应，图像和待检图像对应相同的视野，碱基延伸反应时的该视野中存在多个带有光学可检测标记的核酸分子，至少一部分核酸分子在图像和/或待检图像上表现为亮斑。
依据本发明的再一个实施方式，提供一种碱基识别系统，该系统包括：存储器，用于存储数据，包括计算机可执行程序；处理器，用于执行所称的计算机可执行程序，以实施上述本发明任一实施方式中的碱基识别方法。
依据本发明的一个实施方式，提供一种测序系统，该系统包括上述本发明任一实施方式的碱基识别系统。
依据本发明的一个实施方式，提供一种计算机可读存储介质，用于存储供计算机执行的程序，执行程序包括完成上述任一实施方式中的碱基识别方法。计算机可读存储介质包括但不限于只读存储器、随机存储器、磁盘或光盘等。
依据本发明的一个实施方式，提供一种计算机程序产品，包括指令，该指令在计算机执行所称的程序时，使该计算机执行上述本发明任一实施方式中的碱基识别方法。
依据本发明的一个实施方式，提供一种测序系统，包括上述本发明任一实施方式的计算机程序产品。
上述任一实施方式中的碱基识别方法、碱基识别系统、计算机可读存储介质、计算机程序产品和/或测序系统，通过将对应测序模板的亮斑集合中的亮斑的坐标直接对应至待检图像上、依据待检图像上的相应坐标位置的信息进行碱基识别，能够简单、高效且通量高地识别出碱基延伸反应时与模板核酸结合的碱基的类型和顺序，能够实现模板核酸序列的简单、快速和准确的测定。
本发明实施方式的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明实施方式的实践了解到。
附图说明
图1是本发明具体实施方式中的碱基识别方法的流程示意图。
图2是本发明具体实施方式中的碱基识别方法的流程示意图。
图3是本发明具体实施方式中的对图像Repeat1-20中的亮斑进行合并的过程及结果以获得对应测序模板的亮斑集合的示意图。
图4是本发明的具体实施方式中的纠偏过程和纠偏结果的示意图。
图5是本发明具体实施方式中的候选亮斑的对应的矩阵以及连同像素示意图。
图6是本发明具体实施方式中的以像素点矩阵的中心像素点为中心的m1*m2范围的像素值示意图。
图7是本发明具体实施方式中的依据第二亮斑检测阈值进行判定之前和之后的亮斑检测结果对比示意图。
图8是本发明具体实施方式中的依据像素值升序排列的一个300*300区域的像素点的数目的分布曲线。
图9是本发明具体实施方式中的依据像素值升序排列的一个300*300区域的像素点的数目的分布曲线。
图10是本发明具体实施方式中的碱基识别系统的结构示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施方式，实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本文的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者顺序。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本文的描述中，所称的“亮斑”或“亮点”(spots或者peaks)，指图像上的发光斑或发光点，一个发光斑占有至少一个像素点。
在本文的描述中，所称的测序，也称为序列测定或者基因测序，指核酸序列测定，包括DNA测序和/或RNA测序，包括长片段测序和/或短片段测序，包括对核酸序列的多个连续或非连续的特定位置的碱基的类型的识别和排列顺序的测定；可以利用边合成边测序(SBS)或者边连接边测序(SBL)，包括核苷酸或者核苷酸类似物结合至模板上的过程，即碱基延伸反应。对所称的“亮斑”的检测为对来自延伸碱基或碱基簇的光学信号的检测。
测序可以通过测序平台进行，测序平台可选择但不限于Illumina公司的 Hiseq/Miseq/Nextseq/Novaseq测序平台、Thermo Fisher/Life Technologies公司的IonTorrent 平台、华大基因的BGISEQ和MGISEQ平台以及单分子测序平台；测序方式可以选择单端测序，也可以选择双末端测序；获得的测序结果/数据即测读出来的片段，称为读段(reads)。读段的长度称为读长。
在本文的描述中，采集自测序反应/碱基延伸反应的图像或者基于这些图像转化或构建得的图像，可以是灰度图像，也可以是彩色图像。对于灰度图像，所称的像素值同灰度值；对于16位的灰度图像例如tiff灰度图像，像素值的取值范围为0-65535，对于8位的灰度图像，像素值的取值范围为0-255。对于彩色图像，彩色图像的一个像素点具有三个像素值，可以利用提供的方法和/或系统直接利用该像素值数组进行图像检测/目标信息识别，也可以先将该彩色图像转化为灰度图像，再对转化后的灰度图像进行处理和信息识别，以降低图像检测信号识别过程的计算量和复杂度；将非灰度图像转换成灰度图像的方法，可选择但不限于浮点算法、整数方法、移位方法和平均值法等。
在本文的描述中，除非有其它明确的限定，基于图像信息，所称的“强度”与像素(像素值)可以替换，所称的强度或者像素的大小可以是真实或客观的绝对值，也可以是相对值包括基于真实像素值的各种变形，例如放大的像素值、缩小的像素值、基于像素值的比例或者关系等；一般地，涉及比较多个图像或者亮斑或者位置的强度/像素大小的，该些图像或者亮斑或者位置的强度/像素大小为经过相同处理后的强度/像素大小，比如均为客观像素值或者均为相同变形处理后的像素值；涉及基于一个或者多个图像的特定位置的信息进行比较分析的，确定该些特定位置时，较佳地，使该些图像对齐以及位于同一坐标系中。
在基于光学成像测定核酸序列的平台中，特别是单分子测序平台，由于来自目标分子的信号微弱且信号强度短时间内会变化，采集得图像之后，对于碱基识别，一般地，会先将采集得的图像上的亮斑检测识别出，即检测识别出来自碱基/碱基簇延伸的真实信号，接着将每个该些亮斑与测序模板上的亮斑进行匹配，例如遍历待检图像上的每个亮斑，若待检图像上的某个亮斑与测序模板上的亮斑的距离足够小(与分辨率等有关)，则认为该两个亮斑重合，认为待检图像的该亮斑对应的位置上存在待测核酸分子并且该待测核酸分子发生核苷酸结合反应(碱基延伸反应)，由此识别得该待测核酸分子结合上的核苷酸/碱基的类型。该通常使用的碱基识别方法，通过比较待检图像上的亮斑与测序模板上的亮斑的坐标之间的距离，来确定测序模板上所代表的核酸分子是否在本轮中发生反应(发亮；碱基延伸反应)，若发生反应，则测读得加入的碱基类型或者测读得核酸分子的相应位置的碱基的类型。发明人经过大量数据测试发现，该方法受图像质量、亮点定位算法、点密度分布等的影响比较严重，容易发生错误识别碱基的情况。
由此，请参阅图1，发明人在一个实施方式中提供一种碱基识别方法，包括：S2将对应测序模板的亮斑集合中的亮斑的坐标对应到待检图像上，以确定待检图像的相应坐标位置；S4确定所称的待检图像的相应坐标位置的强度；以及S6比较待检图像的相应坐标位置的强度与预设阈值的大小，基于待检图像上强度大于预设阈值的位置的信息进行碱基识别。所称的对应测序模板的亮斑集合基于多个图像构建获得，所称的图像和待检图像均采集自碱基延伸反应，图像和待检图像来自相同的视野，碱基延伸反应时的该视野中存在多个带有光学可检测标记的核酸分子，至少一部分核酸分子在图像和/或待检图像上表现为亮斑。所称的核酸分子为待测序模板或者为包含模板的核酸复合物，所称的碱基延伸反应包含核苷酸包括核苷酸类似物结合至模板或者核酸复合物上的过程；本领域技术人员知道，在基于光学检测实现序列测定的的测序平台上获得的图像，带有光学可检测标记例如带有荧光分子的核苷酸或核酸分子被激光激发发光，在图像中表现为亮斑，每个亮斑占据几个像素。
该碱基识别(base call)方法，通过将对应测序模板的亮斑集合中的亮斑的坐标直接对应至待检图像上、依据待检图像上的相应坐标位置的信息进行碱基识别，相较于一般的将待检图像上的亮斑检测出、通过判断检测出的亮斑是否能匹配上对应测序模板的亮斑集合中的特定亮斑来进行碱基识别的方法，该方法能够简单、高效且通量高地识别出碱基延伸反应时与模板核酸结合的碱基的类型和顺序，能够实现模板核酸序列的简单、快速和准确的测定。对比测试进一步发现，通过该方法获得的读段包括匹配到参考序列唯一位置的读段的量，较一般的碱基识别方法获得的，高30％或以上。
所称的对应测序模板的亮斑集合可以在进行该碱基识别方法时构建，也可以预先构建。在一个示例中，基于图像预先构建对应测序模板的亮斑集合，保存以备调用。具体地，请参阅图2，基于图像构建对应测序模板的亮斑集合，所称的图像包括分别对应碱基/核苷酸/ 核苷酸类似物A、T/U、G和C四种类型碱基延伸反应时的一个相同视野的第一图像、第二图像、第三图像和第四图像，第一图像包括图像M1和图像M2，第二图像包括图像N1 和图像N2，第三图像包括图像P1和图像P2，第四图像包括图像Q1和图像Q2，定义顺序和/或同时实现一次四种类型碱基延伸反应为一轮测序反应，图像M1和图像M2分别来自两轮测序反应，图像N1和图像N2分别来自两轮测序反应，图像P1和图像P2分别来自两轮测序反应，图像Q1和图像Q2分别来自两轮测序反应，该方法包括：S8合并第一图像、第二图像、第三图像和第四图像上的亮斑，记录相同位置上的亮斑的数目，去除数目为1 的亮斑，以获得对应测序模板的亮斑集合。该方法通过对图像上的亮斑直接进行合并处理，能够快速简便地构建出对应核酸分子(测序模板)的亮斑集合。构建得的亮斑集合能有效、准确且全面的反映测序模板的信息，利于后续的碱基的准确识别，获得准确的核酸序列。
所称的一轮测序反应，顺序和/或同时实现一次四种类型碱基延伸反应，可以是四种类型碱基反应底物(例如核苷酸类似物/碱基类似物)同时于一个碱基延伸反应体系中实现一轮测序反应，可以是两种类型碱基类似物于一个碱基延伸反应体系中、另外两种类型反应底物于下一个碱基延伸反应体系以实现一轮测序反应，也可以是一种类型碱基类似物于一个碱基延伸反应体系中、依次在四个连续的碱基延伸反应体系中加入该四种类型碱基类似物以实现一轮测序反应。可知，第一图像、第二图像、第三图像和第四图像可以采集自两次碱基延伸反应或者更多次的碱基延伸反应。另外，一个碱基延伸反应可能包含一次图像采集，也可能包含多次图像采集。
在一个示例中，一轮测序反应包括多次碱基延伸反应，例如单色测序，利用的四种类型碱基对应的反应底物(核苷酸类似物)均带有同一种荧光染料，一轮测序反应包括四次碱基延伸反应(4repeats)，对于一个视野来说，一次碱基延伸反应包含一次图像采集，图像M1、图像N1、图像P1和图像Q1分别为来自一轮测序反应的四次碱基延伸反应的同一视野。
在另一个示例中，一轮测序反应包括两次碱基延伸反应，例如双色测序，利用的四种类型碱基对应的反应底物(核苷酸类似物)中的两种带有一种荧光染料、另两种带有另一种不同激发波长的荧光染料，一轮测序反应包括两次碱基延伸反应，带有不同染料的两种类型碱基反应底物于一次碱基延伸反应中进行核苷酸结合/延伸反应，对于一个视野，一次碱基延伸反应包括两次于不同激发波长下的图像采集，图像M1、图像N1、图像P1和图像 Q1分别来自一轮测序反应的两次碱基延伸反应的两种激发波长下的同一视野。
在再一个示例中，一轮测序反应包括一次碱基延伸反应，例如二代测序平台的双色测序反应，四种类型碱基反应底物(例如核苷酸类似物)分别带有染料a、带有染料b、带有染料a和染料b以及不带任何染料，染料a和染料b的激发波长不一样；四种类型反应底物于同一次碱基延伸反应中实现一轮测序反应，一次碱基延伸反应包括两次于不同激发波长下的图像采集，第一图像同第三图像、第二图像同第四图像，图像M1和图像N1分别来自不同轮测序反应或者同一轮测序反应中的不同激发波长下的同一视野。
在又一个示例中，一轮测序反应包括一次碱基延伸反应，例如四色测序反应，四种类型碱基反应底物(例如核苷酸类似物)分别带有染料a、带有染料b、带有染料c和染料d，染料a、染料b、染料c和染料d的激发波长均不一样；四种类型反应底物于同一次碱基延伸反应中实现一轮测序反应，一次碱基延伸反应包括四次于不同激发波长下的图像采集，图像M1、图像N1、图像P1和图像Q1分别来自不同轮测序反应或者同一轮测序反应中的不同激发波长下的同一视野。
发明人设计测序模板(template)的构建算法发现，在部分模板构建算法中，由于部分亮斑在构建模板过程中被丢弃，且一般地，采集自第一轮测序反应的图像信息对template 构建的影响远大于采集自后续反应该视野的图像，容易损失对应测序模板的亮斑。在某些具体实施方式中，S8包括：(a)合并图像N1上的亮斑至图像M1中，获得一次合并图像 M1，对于一次合并图像M1中的重合亮斑依据重合亮斑包含的亮斑的数目进行计数标记，对于非重合亮斑记为1，在一次合并图像M1中的距离小于第一预定像素的多个亮斑为一个重合亮斑；(b)以图像P1、图像Q1、图像M2、图像N2、图像P2或图像Q2替代图像N1，以一次合并图像M1替代图像M1，多次进行(a)直至完成所有图像上的亮斑的合并，获得原始亮斑集合；(c)去除原始亮斑集合中的标记为1的亮斑，以获得对应测序模板的亮斑集合。如此，能够平衡不同轮测序反应的图像的权重，获得更多更准确的模板亮斑，能够快速简便且准确地获取对应测序模板的亮斑集，利于准确识别碱基获得读段。
在一个示例中，所使用的成像系统，电子传感器的尺寸为6.5μm，显微镜放大倍率60 倍，能看到的最小尺寸就是0.1μm。对应核酸分子的亮斑的大小一般为小于10*10像素。所称的第一预定像素，在一个示例中，设置为1.05像素。如此，能够准确的进行重合亮斑的判断，利于测序模板(亮斑集合)的准确构建。
在一个示例中，设置一个模板向量(TemplateVec)承载第1-20Repeats相同视野的图像上的亮斑(Peaks)的合并结果，每次合并都对合并成功的亮斑进行计数，所有合并完成后，去掉计数为1的点。具体地，将图像Repeat1的peaks合并至TemplateVec时，由于初始时TemplateVec上没有任何亮斑，所以TemplateVec中亮斑总数等于图像Repeat1上的亮斑数，且所有亮斑计数为1；将图像Repeat2上的亮斑合并至TemplateVec时，先判断每个 Repeat2的亮斑在TemplateVec中是否有距离小于1.05像素的亮斑，若有则合并在一起得重合亮斑，取这两个亮斑中的任一个的位置作为该重合亮斑的位置或者取这两个亮斑的平均位置作为该重合亮斑的位置，并对该重合亮斑计数加1；若不存在距离小于1.05像素的亮斑，则把该亮斑追加至TemplateVec中，计数为1；重复上述步骤直至完成图像Repeat20 上的亮斑合并至TemplateVec；最后，对TemplateVec中的亮斑进行筛选，去除计数为1的亮斑。
由于不同的加入顺序的原因，某些早期距离较远的亮斑，在合并后，会成为近距离亮斑，在一个示例中，进一步对TemplateVec内距离小于1.05像素的亮斑进行再一次合并。如此，利于获得更准确的测序模板。图3示意上述测序模板构建过程，图中的圆圈示意亮斑。
对于涉及多个亮斑合并成一个亮斑的情形，合并后的亮斑的位置/坐标，在一些示例中，可以通过合并前的多个亮斑的重心坐标来确定，例如取多个亮斑的重心坐标的任一个或者平均值作为合并后的亮斑的坐标，或者依据合并前的多个亮斑的坐标，设置权重，来确定合并后的亮斑的坐标，例如，依据合并前的各亮斑包含的亮斑数目和/或合并前的各亮斑来自第几轮测序反应，设置不同的贡献值，即对合并前的各亮斑坐标设置不同的权重来确定合并后的亮斑的坐标，如此，有利于获得较准确的反映真实情况(对应测序模板)的亮斑的信息。在一个示例中，合并前的一个亮斑包含多个亮斑的，设置相对高的权重，和/或合并前的亮斑来自第一轮测序反应图像，设置相对高的权重，如此，能够使合并后的亮斑的信息客观、准确地反映出合并前的信息，利于构建出准确的对应测序模板的亮斑集合，利于碱基的准确识别。在某些具体实施方式中，图像为经过配准的图像。如此，利于准确地获取对应与测序模板的亮斑集合，利于准确的碱基识别。
对实现图像配准即进行图像纠偏的方式不作限制。在一些示例中，利用如下方法进行图像配准，包括：基于参考图像对待配准图像进行第一配准，参考图像和待配准图像对应相同对象，参考图像和待配准图像均包含多个亮斑，包括确定待配准图像上的预定区域和参考图像上的相应预定区域的第一偏移量，基于第一偏移量移动待配准图像上的所有亮斑，获得第一配准后的待配准图像；基于参考图像对第一配准后的待配准图像进行第二配准，包括合并第一配准后的待配准图像和参考图像，获得合并图像，计算合并图像上的预定区域的所有重合亮斑的偏移量，以确定第二偏移量，距离小于预定像素的两个或多个亮斑为一个重合亮斑，基于该第二偏移量移动第一配准后的待配准图像上的所有亮斑，以实现对待配准图像的配准。该图像配准方法通过两次关联配准，可相对称为粗配准和细配准，包括利用图像上的亮斑进行细配准，能够基于少量数据信息快速地实现图像的高精度纠偏，特别适于高精度图像纠偏要求的场景。例如，单分子级别的图像检测，比如来自第三代测序平台的测序反应的图像。所称单分子级别指分辨率为单个或少数几个分子的大小，例如不多于10个、8个、5个、4个或3个分子。
在某些具体实施方式中，所称的“亮斑”对应延伸碱基或碱基簇的光学信号或者其它发亮物质的干扰信号。所称的图像上的预定区域，可以是整个图像，也可以是图像的一部分。在一个示例中，图像上的预定区域为图像的一部分，例如为图像中心的512*512区域。所称的图像中心，为该视野的中心，成像系统的光轴与成像平面的交点可称为图像中心点，以该中心点为中心的区域可视为图像中心区域。
在某些具体实施方式中，待配准图像来自核酸测序平台。具体地，来自利用光学成像原理进行序列测定的测序平台，该平台包括成像系统和核酸样本承载系统，带有光学检测标记的待测核酸分子固定于反应器中，该反应器也称为芯片，芯片装载在一个可移动台子上，通过该可移动台子带动芯片运动来实现对位于芯片不同位置(不同视野)的待测核酸分子进行图像采集。一般地，光学系统和/或可移动台子的运动存在精度限制，例如，指令指定运动至某个位置和该机械结构实际运动达到的位置存在偏差，特别是在对精度高要求的应用情景，由此，在依据指令移动硬件以对不同时间点的同一位置(视野)进行多次图像采集的过程中，不同时间点采集的同一视野的多个图像难以完全对齐，对该些图像进行纠偏对齐，有利于基于该多个时间点采集的多个图像中的信息的变化来准确确定核酸分子核苷酸顺序。
在某些具体实施方式中，所称的参考图像是通过构建获得的，参考图像可以在对待配准图像进行配准时构建，也可以预先构建保存需要时调用。
在一些示例中，构建参考图像包括：获取第五图像和第六图像，第五图像和第六图像与待配准图像对应相同视野/对象；基于第五图像对第六图像进行粗配准，包括确定第六图像和第五图像的偏移量，基于该偏移量移动第六图像，获得粗配准后的第六图像；合并第五图像和粗配准后的第六图像，以获得参考图像，第五图像和第六图像均包含多个亮斑。如此，利用构建获得包含更多或相对更完整的信息的参考图像，利用该图像作为纠偏的基准，利于实现更准确的图像配准。对于核酸序列测定得到的图像，利用多个图像进行参考图像构建，利于使得该参考图像获得完整的对应核酸分子的亮斑信息，利于基于亮斑的图像纠偏，进而利于对应测序模板的亮斑集合的获取以及碱基识别。
在一些实施例中，第五图像、第六图像分别来自核酸序列测定反应(测序反应)的不同时刻的同一个视野。在一个示例中，一轮测序反应包括多次碱基延伸反应，例如单色测序，利用的四种类型碱基对应的反应底物(核苷酸类似物)均带有同一种荧光染料，一轮测序反应包括四次碱基延伸反应(4repeats)，对于一个视野来说，一次碱基延伸反应包含一次图像采集，第五图像和第六图像分别来自不同次的碱基延伸反应的同一视野。如此，通过处理以及集合第五图像和第六图像的信息获得的参考图像作为纠偏的基准，利于进行更准确的图像纠偏。
在另一个示例中，进行单分子双色测序反应，利用的四种类型碱基对应的反应底物(核苷酸类似物)中的两种带有一种荧光染料、另两种带有另一种不同激发波长和发射波长的荧光染料，一轮测序反应包括两次碱基延伸反应，带有不同染料的两种类型碱基反应底物于一次碱基延伸反应中进行结合反应，对于一个视野，一次碱基延伸反应包括两次于不同激发波长下的图像采集，第五图像和第六图像分别来自不同次的碱基延伸反应或者同一次碱基延伸反应中的不同激发波长下的同一视野。如此，通过处理以及集合第五图像和第六图像的信息获得的参考图像作为纠偏的基准，利于进行更准确的图像纠偏。
在又一个示例中，一轮测序反应包括一次碱基延伸反应，例如二代测序平台的双色测序反应，四种类型碱基反应底物(例如核苷酸类似物)分别带有染料a、带有染料b、带有染料a和染料b以及不带任何染料，染料a和染料b被激发后的发射波长不一样；或者，例如四色测序，四种类型碱基反应底物(例如核苷酸类似物)分别带有染料a、染料b、染料c和染料d，染料a、b、c和d被激发后的发射波长不一样；四种类型反应底物于同一次碱基延伸反应中实现一轮测序反应，第五图像和第六图像分别来自不同轮测序反应或者同一轮测序反应中的不同激发波长下的同一视野。如此，通过处理以及集合第五图像和第六图像的信息获得的参考图像作为纠偏的基准，利于进行更准确的图像纠偏。
第五图像和/或第六图像，可以是一个图像也可以是多个图像。在一个示例中，第五图像为第一图像，第六图像为第二图像。进一步地，在一些具体实施方式中，还包括利用第七图像和第八图像构建所称的参考图像，待配准图像、第五图像、第六图像、第七图像和第八图像来自测序反应的相同视野，第五图像、第六图像、第七图像和第八图像分别对应A、T/U、G和C四种类型碱基延伸反应时的视野，构建参考图像还包括：基于第五图像对第七图像进行粗配准，包括确定第七图像相对于第五图像的偏移量，基于该偏移量移动第七图像，获得粗配准后的第七图像；基于第五图像对第八图像进行粗配准，包括确定第八图像相对于第五图像的偏移量，基于该偏移量移动第八图像，获得粗配准后的第八图像；合并第五图像和粗配准后的第六图像、粗配准后的第七图像以及粗配准后的第八图像，以获得参考图像。
对第一配准的实现方式不作限制，例如可利用傅里叶变换，使用频域配准，确定第一偏移量。具体地，例如可参考Kenji TAKITAet al,IEICE TRANS.FUNDAMENTALS,VOL.E86-A,NO.8AUGUST 2003.中的纯相位相关函数(Phase-Only Correlation Function)中的二维离散傅里叶变换确定第一偏移量、第六图像和第五图像的偏移量、第七图像和第五图像的偏移量和/或第八图像和第五图像的偏移量。第一配准/粗配准可达到1像素(1pixel)的精度。如此，可快速准确地确定第一偏移量和/或构建利于精确纠偏的参考图像。
在某些具体实施方式中，参考图像和待配准图像为二值化图像。如此，利于减少运算量快速纠偏。
在一个示例中，待纠偏图像和参考图像均为二值化图像，即图像中的各个像素非a即b，例如a为1，b为0，像素标记为1的较像素标记为0的亮，或者说强度大；参考图像是利用一轮测序反应的四次碱基延伸反应的图像repeat1、repeat2、repeat3和repeat4构建的，第五图像、第六图像选自图像repeat1-4中的任一个、两个或三个。
在一个示例中，第五图像为图像repeat1，图像repeat2、repeat3和repeat4为第六图像，基于图像repeat1依次对图像repeat2-4进行粗配准，分别获得粗配准后的图像repeat2-4；合并图像repeat1和粗配准后的图像repeat2-4，获得参考图像。所称的合并图像为合并图像中的重合亮斑。基于对应核酸分子的亮斑的大小和成像系统分辨率，在一个示例中，设定两个图像上距离不大于1.5个像素的两个亮斑为重合亮斑。这里，采用4个repeat的合成的图像中心区域作为参考图像，一来利于使得参考图像具有足够量的亮斑，利于后续配准，二来检测及定位出的图像中心区域中的亮斑，亮斑信息是相对更准确的，利于准确配准。
在一个示例中，进行如下步骤对图像进行纠偏：1)对采集自另一轮测序反应的一次碱基延伸反应的某个视野的图像repeat5进行粗纠偏，repeat5为二值化后的图像，取该图像中心例如512*512区域，与repeat1-4合成的中心图像(相应参考图像的中心512*512区域)，进行二维离散傅里叶变换，使用频域配准，得到偏移量offset(x0,y0)，即实现图像粗配准， x0、y0能达到1pixel的精度；2)将上述粗配准后的图像和参考图像基于图像上的亮斑进行合并(merge)，包括计算repeat5图像的中心区域内与参考图像相应区域内的重合亮斑的偏移量offset(x1,y1)＝待纠偏图像的该亮斑的坐标位置-参考图像上的相应亮斑的坐标位置，可表示为offset(x1,y1)＝curRepeatPoints-basePoints；求取所有重合亮斑的平均偏移量，从而得到[0,0]到[1,1]范围内的细偏移量。在一个示例中，设定两个图像上距离不大于1.5个像素的两个亮斑为重合亮斑；3)综上，得到一个视野图像(fov)不同cycle的偏移量 (x0,y0)-(x1,y1)，对于一个亮斑(peak)可表示为：curRepeatPoints+(x0,y0)-(x1,y1)， curRepeatPoints表示该亮斑原始坐标，即在纠偏前的图像中的坐标。上述图像纠偏获得的纠偏结果具有较高的准确性，且纠偏精度小于或等于0.1像素。图4示意纠偏过程及结果，图4中，基于图像A对图像C进行纠偏，图像A和图像C中的圆圈表示亮斑、相同数字标记的亮斑为重合亮斑，图像C->A表示纠偏结果，即图像C对齐至图像A的结果。
对图像上亮斑的识别检测方式不作限定。在某些具体实施方式中，检测识别图像上的亮斑，即检测出图像上来自于延伸碱基/碱基簇的信号，包括利用k1*k2矩阵对图像进行亮斑检测，判定矩阵的中心像素值不小于矩阵非中心任一像素值的矩阵对应一个候选亮斑，以及确定候选亮斑是否为亮斑，k1和k2均为大于1的奇数，k1*k2矩阵包含k1*k2个像素点。所称的图像例如为待配准图像、构建参考图像中的图像等。利用该方式检测图像上的亮斑，能够快速有效地实现图像上的亮斑(spots或peaks)的检测，特别是对采集自核酸序列测定反应的图像。该方法对待检测图像即原始输入数据没有特别的限制，适用于任何利用光学检测原理进行核酸序列测定的平台所产生的图像的处理分析，包括但不限于二代和三代测序，具有高准确性和高效的特点，能从图像中获取更多的代表序列的信息。特别是对于随机图像及高准确度要求的信号识别，尤其具有优势。
在一些实施例中，图像来自核酸序列测定反应，核酸分子上带有光学可检测标记，利如荧光标记，荧光分子在特定波长激光照射下能够被激发发出荧光，通过成像系统采集图像。采集到的图像包括可能与荧光分子所在位置相对应的光斑/亮斑。可以理解地，当处于焦面位置时，所采集到的图像中的与荧光分子所在位置相对应的亮斑的尺寸较小且亮度较高；当位于非焦面位置时，所采集到的图像中的与荧光分子所在位置相对应的亮斑的尺寸较大且亮度较低。另外，视野中的可能存在其它非目标或者后续难以利用的物质/信息，比如杂质等；进一步地，在对单分子视野进行拍照中，大量分子聚集(簇)等也会干扰目标单分子信息采集。所称的单分子为一个少数几个分子，例如分子数目不大于10、8、6、5 或者3，例如为一个、两个、三个、四个、五个、六个或者八个。
在一些示例中，矩阵的中心像素值大于第一预设值，矩阵非中心任一像素值大于第二预设值，第一预设值和第二预设值与图像的平均像素值相关。
在一些实施例中，可以利用k1*k2矩阵对图像进行遍历检测，所称的第一预设值和/或第二预设值的设置与该图像的平均像素值相关。对于灰度图像，像素值同灰度值。k1*k2 矩阵，k1、k2可以相等也可以不相等。在一个示例中，成像系统相关参数为：物镜60倍，电子传感器的尺寸为6.5μm，经过显微镜成的像再经过电子传感器，能看到的最小尺寸为 0.1μm，获得的图像或者输入的图像可为512*512、1024*1024或2048*2048的16位的灰度或彩色图像，k1和k2的取值范围均为大于1且小于10。在一个示例中，k1＝k2＝3；在另一个示例中，k1＝k2＝5。
在一个示例中，发明人经过大量图像处理统计，取第一预设值为该图像的平均像素的 1.4倍，取第二预设值为该图像的平均像素值的1.1倍，能够排除干扰、获得来自于光学检测标记的亮斑检测结果。
可利用大小、与理想亮斑的相似程度和/或强度来对候选亮斑进一步进行筛选判断。在某些具体实施方式中，利用候选亮斑对应的连通域的大小来定量反映比较图像上候选亮斑的大小，以此来筛选判断候选亮斑是否为要的亮斑。
在一个示例中，确定候选亮斑是否为亮斑包括：计算一个候选亮斑对应的连通域的大小Area＝A*B，判定对应的连通域的大小大于第三预设值的候选亮斑为一个亮斑，A表示以该候选亮斑对应的矩阵的中心的所在行的相连像素/连通像素的大小，B表示以该候选亮斑对应的矩阵的中心的所在列的相连像素/连通像素的大小，定义一个k1*k2矩阵中大于平均像素值的相连像素为一个所称的候选亮斑对应的连通域。如此，能够有效获得对应标记分子且符合后续序列识别的亮斑，获得核酸序列信息。
在一个例子中，以该图像的平均像素值作为基准，相邻的不小于平均像素值的两个或多个像素为所称的相连像素/连通像素(pixel connectivity)，如图5所示，加粗加大的表示候选亮斑对应的矩阵的中心，粗线框表示候选亮斑对应的3*3矩阵，标记为1的像素为不小于该图像的平均像素值的像素点，标记为0的像素为小于平均像素值的像素点，可看出 A＝3，B＝6，该候选亮斑对应的连通域的大小为A*B＝3*6。
所称的第三预设值可依据该图像上所有候选亮斑对应的连通域的大小这一信息来确定。例如通过计算该图上各候选亮斑对应的连通域的大小，取亮斑的连通域大小的平均值代表该图像一个特性，作为第三预设值；又例如，可将该图像上各个候选亮斑对应的连通域大小按从小到大排序，取第50、第60、第70、第80或第90百分位数连通域大小作为该第三预设值。如此，可有效获得亮斑信息，利于后续识别核酸序列。
在某些示例中，通过统计设置参数来定量反映比较候选亮斑的强度特征，以此来筛选候选亮斑。在一个示例中，确定候选亮斑是否为亮斑包括：计算一个候选亮斑的分值Score＝((k1*k2-1)CV-EV)/((CV+EV)/(k1*k2))，判定分值大于第四预设值的候选亮斑为一个亮斑，CV表示候选亮斑对应的矩阵的中心像素值，EV表示亮斑对应的矩阵的非中心像素值的总和。如此，能够有效获得对应标记分子且符合后续序列识别的亮斑，获得核酸序列信息。
所称的第四预设值可依据该图像上所有候选亮斑的分值的大小这一信息来确定。例如，当该图像上的候选亮斑的数量大于一定数目符合统计上对量的要求，例如该图像上候选亮斑的数目大于30，可计算且将该图像的所有候选亮斑的Score值按升序排序，第四预设值可设置为第50、第60、第70、第80或90分位数Score值，如此，可排除掉小于第50、第60、第70、第80或第90分位数Score值的候选亮斑，利于有效获得目标亮斑，利于后续碱基序列准确识别。进行该处理或者说该筛选设置的依据是，一般地，认为中心与边缘强度/像素值差异大且汇聚的亮斑为与待检分子所在位置相对应的亮斑。一般情况下，图像上的候选亮斑的数量大于50、大于100或大于1000。
在某些示例中，结合形态和强度/亮度对候选亮斑进行筛选。在一个示例中，确定候选亮斑是否为亮斑包括：计算一个候选亮斑对应的连通域的大小Area＝A*B，以及计算一个候选亮斑的分值Score＝((k1*k2-1)CV-EV)/((CV+EV)/(k1*k2))，A表示以该候选亮斑对应的矩阵的中心的所在行的相连像素/连通像素的大小，B表示以该候选亮斑对应的矩阵的中心的所在列的相连像素/连通像素的大小，定义一个k1*k2矩阵中大于平均像素值的相连像素为一个所称的候选亮斑对应的连通域，CV表示候选亮斑对应的矩阵的中心像素值，EV表示亮斑对应的矩阵的非中心像素值的总和；判定对应的连通域的大小大于第三预设值且分值大于第四预设值的候选亮斑为一个亮斑。如此，能够有效地获得对应核酸分子且利于后续序列识别的亮斑信息。对于所称的第三预设值和/或第四预设值，可以参照前面具体实施方式进行考虑和设置。
在某些具体实施方式中，识别检测亮斑包括：预处理图像，获得预处理后的图像，所称的图像选自第一图像、第二图像、第三图像、第四图像、第五图像、第六图像、第七图像和第八图像中的至少一个；确定临界值以简化预处理后的图像，包括对小于临界值的预处理后的图像上的像素点的像素值赋值为第一预设值，对不小于临界值的预处理后的图像上的像素点的像素值赋值为第二预设值，以获得简化图像；基于预处理后的图像确定第一亮斑检测阈值c1；基于预处理后的图像和简化图像识别图像上的候选亮斑，包括判定满足以下i)-ii)中至少两个条件的像素点矩阵为一个候选亮斑，i)在预处理后的图像中，像素点矩阵的中心像素点的像素值为最大，像素点矩阵可表示为r1*r2，r1和r2均为大于1的奇数，r1*r2像素点矩阵包含r1*r2个像素点，ii)在简化图像中，像素点矩阵的中心像素点的像素值为第二预设值并且像素点矩阵的连通像素大于*r1*r2，以及iii)在预处理后的图像中的像素点矩阵的中心像素点的像素值大于第三预设值，并且满足g1*g2>c1，g1为以像素点矩阵的中心像素点为中心的m1*m2范围的二维高斯分布的相关系数，g2为该m1*m2 范围的像素，m1和m2均为大于1的奇数，m1*m2范围包含m1*m2个像素点；以及确定候选亮斑是否为亮斑。利用该方式检测图像上的亮斑，包括利用发明人通过大量数据训练确定的判断条件或判断条件的组合，能够快速有效地实现图像上的亮斑的检测，特别是对采集自核酸序列测定反应的图像。该方法对待检测图像即原始输入数据没有特别的限制，适用于任何利用光学检测原理进行核酸序列测定的平台所产生的图像的处理分析，包括但不限于二代和三代测序，具有高准确性和高效的特点，能从图像中获取更多的代表序列的信息。特别是对于随机图像及高准确度要求的信号识别，尤其具有优势。
对于灰度图像，像素值同灰度值。若图像是彩色图像，彩色图像的一个像素点具有三个像素值，可以将彩色图像转化为灰度图像，再进行亮斑检测，以降低图像检测过程的计算量和复杂度。可选择但不限于利用浮点算法、整数方法、移位方法或平均值法等将非灰度图像转换成灰度图像。
在一些实施例中，预处理图像包括：利用开运算确定图像的背景；基于背景，利用顶帽运算将图像转化为第一图像；对第一图像进行高斯模糊处理，获得第二图像；对第二图像进行锐化，以获得所称的预处理后的图像。如此，能对图像进行有效的降噪或者说提高图像的信噪比，利于亮斑的准确检测。
可参照CN107945150A基因测序的图像处理方法及系统披露的方法进行预处理；具体地，开运算是一种形态学处理，即先膨胀后腐蚀的过程，腐蚀操作会使得前景(感兴趣的部分)变小，而膨胀会使得前景变大；开运算可以用来消除小物体，在纤细点处分离物体，并且在平滑较大物体的边界的同时不明显改变其面积。该实施方式对图像做开运算的结构元p1*p2(用来处理图像的基本模板)的大小不作特别限制，p1和p2为奇数。在一个示例中，结构元p1*p2可以为15*15、31*31等，最终都能够获得利于后续处理分析的预处理后的图像。
顶帽运算往往用来分离比临近点(亮点/亮斑)亮一些的斑块，在一幅图像具有大幅的背景，而微小物品比较有规律的情况下，可以使用顶帽运算进行背景提取。在一个示例中，对图像进行顶帽变换包括先对图像做开运算，进而利用原图像减去开运算结果，获得第一图像即顶帽变换后的图像。顶帽变换的数学表达式为dst＝tophat(src,element)＝src-open(src,element)。发明人认为，开运算的结果放大了裂缝或者局部低亮度的区域，因此从原图中减去开运算后的图，得到的图像突出了比原图轮廓周围的区域更明亮的区域，这一操作与选择的核的大小相关，可以认为与亮点/亮斑的预期大小相关，若亮点不是预期大小，处理后的效果会使得整张图产生许多小凸起，具体可以参考虚焦图片，即亮点/亮斑晕染成一团。在一个示例中，亮点的预期大小即选择的核的大小为3*3，得到的顶帽变换后的图像利于后续进一步去噪处理。
高斯模糊(GaussianBlur)也称为高斯滤波，是一种线性平滑滤波，适用于消除高斯噪声，广泛应用于图像处理的减噪过程。通俗的讲，高斯滤波就是对整幅图像进行加权平均的过程，每一个像素点的值，都由其本身和邻域内的其他像素值经过加权平均后得到。高斯滤波的具体操作是：用一个模板(或称卷积、掩模)扫描图像中的每一个像素，用模板确定的邻域内像素的加权平均灰度值去替代模板中心像素点的值。在一个示例中，对第一图像进行高斯模糊处理，在OpenCV中使用高斯滤波GaussianBlur函数进行，高斯分布参数Sigma取0.9，所使用的二维滤波器矩阵(卷积核)是3*3，从图像角度看经过该高斯模糊处理后，第一图像上的小突起被抹平，图像边缘光滑。进一步地，对第二图像即高斯过滤后的图像进行锐化，例如进行二维拉普拉斯锐化，从图像角度看经过处理后，边缘被锐化，高斯模糊后的图像得以恢复。
在一些实施例中，简化预处理后的图像包括：基于背景和预处理后的图像，确定临界值；比较预处理后的图像上的像素点的像素值与临界值，对小于临界值的预处理后的图像上的像素点的像素值赋值为第一预设值，对不小于临界值的预处理后的图像上的像素点的像素值赋值为第二预设值，获得简化图像。如此，根据发明人大量测试数据总结的确定临界值的方式以及确定的临界值，据此将预处理后的图像简化，例如二值化，利于后续亮斑准确检测，利于后续碱基准确识别、获得高质量数据等。
具体地，在一些示例中，获得简化图像包括：将预处理后获得的锐化后的结果除以开运算结果，获得和图像像素点对应的一组数值；通过该组数值，确定二值化预处理后的图像的临界值。例如，可将该组数值按大小升序排列，取该组数值中第20、30或40百分位数对应的数值作为二值化临界值/阈值。如此，获得的二值化图像利于后续亮斑的准确检测识别。
在一个示例中，图像预处理时的开运算的结构元为p1*p2，所称的将预处理后的图像 (锐化后的结果)除以开运算结果，获得一组和结构元一样大小的数组/矩阵p1*p2，在每个数组中，将该数组包含的p1*p2个数值按大小升序排列，取该数组中第三十百分位数对应的数值作为该区域(数值矩阵)的二值化临界值/阈值，如此，分别确定阈值对图像上的各个区域进行二值化，最终获得的二值化结果在去噪的同时更加突出所需信息，利于后续亮斑的准确检测。
在一些示例中，利用大津法进行第一亮斑检测阈值的确定。大津法(OTSU算法)也可称为最大类间方差法，大津法利用类间方差最大来分割图像，意味着错分概率小，准确性高。假设预处理后的图像的前景和背景的分割阈值为T(c1)，属于前景的像素点数占整幅图像的比例为w0，其平均灰度为μ0；属于背景的像素点数占整幅图像的比例为w1，其平均灰度为μ1。待处理图像的总平均灰度记为μ，类间方差记为var，则有：μ＝ω0*μ0+ω1*μ1； var＝ω0(μ0-μ)2+ω1(μ1-μ)2，将后者代入前者，得到等价公式：var＝ω0ω1(μ1-μ0)2。采用遍历的方法得到使类间方差最大的分割阈值T，即为所求的第一亮斑检测阈值c1。
在一些实施例中，基于预处理后的图像和简化图像识别图像上的候选亮斑，包括判断同时满足i)-iii)三个条件的像素点矩阵为一个候选亮斑。如此，能有效地提高后续基于亮斑信息确定核酸序列的准确性和下机数据的质量。
具体地，在一个示例中，候选亮斑的判定需要满足的条件包括i)，r1和r2可以相等也可以不相等。在一个示例中，成像系统相关参数为：物镜60倍，电子传感器的尺寸为6.5μm，经过显微镜成的像再经过电子传感器，能看到的最小尺寸为0.1μm，获得的图像或者输入的图像可为512*512、1024*1024或2048*2048的16位的灰度或彩色图像，r1和r2的取值范围均为大于1且小于10。在一个示例中，在一个预处理后的图像中，依据亮斑的预期大小设置r1＝r2＝3；在另一个示例中，设置r1＝r2＝5。
在一个示例中，候选亮斑的判定需要满足的条件包括ii)，在简化图像中，像素点矩阵的中心像素点的像素值为第二预设值，并且该像素点矩阵的连通像素大于(2/3)*r1*r2，即中心像素点的像素值大于临界值且连通像素大于矩阵的三分之二。这里，相邻的像素值都为第二预设值的两个或多个像素为所称的相连像素/连通像素(pixelconnectivity)，例如，简化图像为二值化图像，第一预设值为0，第二预设值为1，如图5所示，加粗加大的表示所称的像素点矩阵的中心，粗线框表示像素点矩阵3*3，即r1＝r2＝3，该矩阵的中心像素点的像素值为1，连通像素为4，小于(2/3)*r1*r2＝6，该像素点矩阵不满足条件b)，非候选亮斑。
在一个示例中，候选亮斑的判定需要满足的条件包括iii)，在预处理图像中，g2为修正后的m1*m2范围的像素，即为修正后的m1*m2范围像素总和。在一个例子中，依据简化图像相应m1*m2范围中像素值为第二预设值的像素点所占的比例进行修正，例如，如图 6所示，m1＝m2＝5，所称的简化图像相应m1*m2范围中像素值为第二预设值的像素点所占的比例为13/25(13个“1”)，修正后的g2为原来的13/25。如此，利于更准确的检测识别亮斑，利于后续亮斑信息的分析读取。
在一些示例中，所称的判定候选亮斑是否为亮斑还包括：基于预处理后的图像确定第二亮斑检测阈值，以及判定像素值不小于第二亮斑检测阈值的候选亮斑为亮斑。在具体示例中，以候选亮斑的坐标所在的位置的像素值作为该候选亮斑的像素值。通过利用基于预处理后的图像确定的第二亮斑检测阈值对候选亮斑的进一步筛选，能够排除掉至少一部分更可能是图像背景或者干扰但亮度(强度)和/或形状表现为“斑”的亮斑，利于后续基于亮斑的序列的准确识别，提高下机数据的质量。
在一个示例中，可利用重心法获取候选亮斑的坐标，包括亚像素级坐标。利用双线性插值法计算候选亮斑的坐标位置的像素值/灰度值。
在某些具体示例中，判定候选亮斑是否为亮斑包括：将预处理后的图像划分为预定大小的一组区域(block)，对该区域中的像素点的像素值进行排序，以确定该区域对应的第二亮斑检测阈值；对于位于区域的候选亮斑，判定像素值不小于该区域对应的第二亮斑检测阈值的候选亮斑为亮斑。如此，区分图像的不同区域的差异比如光强的整体落差，分开进行亮斑的进一步检测识别，利于准确识别亮斑并且获得更多的亮斑。
所称的将预处理后的图像划分为预定大小的一组区域(block)，block之间可以有重叠也可以没有重叠。在一个示例中，block之间没有重叠。在一些实施例中，预处理后的图像的大小不小于512*512，例如为512*512、1024*1024、1800*1800或者2056*2056等，所称预定大小的区域可以设为200*200。如此，利于快速计算判断识别亮斑。
在一些实施例中，确定该区域对应的第二亮斑检测阈值时，对每个block中的像素点的像素值按大小进行升序排列，取p10+(p10-p1)*4.1作为该block对应的第二亮斑检测阈值，即该block的背景，p1表示第百分之一分位的像素值，p10表示第百分之十分位的像素值。该阈值是发明人通过大量数据训练测试得出的较为稳定的阈值，能够适应多种图像采集时的光学环境包括不同的激光功率和/或各种亮点密度的图像的检测，通过该阈值对候选亮斑进行筛选能够消除掉大量非目标亮斑，利于后续快速分析和获得准确的结果。可以理解地，当由于系统设置包括光学系统的较大调整，图像整体像素分布发生明显改变时，此阈值可能需要适当调整。图7为进行该处理之前和之后的亮斑检测结果对比示意图，即排除掉区域背景前后的亮斑检测结果示意图，图7的上半部分为作该处理后的亮斑检测结果、下半部分为不作该处理的亮斑检测结果，十字标记的为候选亮斑或亮斑。
在某些具体实施方式中，在S2中，基于相同的坐标体系，将对应测序模板的亮斑集合中的亮斑的坐标对应到待检图像上，比如将对应测序模板的亮斑集合和待检图像均置于第一轮测序反应获得的图像的坐标系中，将对应测序模板的亮斑集合中的各个亮斑的坐标标记到待检图像上，各亮斑的坐标可以通过重心法等确定，如此，可快速且准确确定待检图像上的相应位置的坐标。
对图像上的某个位置的强度的确定方式不作限定，例如可以利用双线性插值法、二次函数插值法和二次样条插值法等计算该位置的亚像素值/灰度值作为该位置的强度。在一些具体实施方式中，S4中的待检图像的相应坐标位置的强度可以为绝对强度，例如为该位置的像素值，也可以为相对强度，例如为基于该位置的像素值的相关关系值，例如为对待检图像进行降噪、去背景和/或利用相邻像素点的像素做差之后的相关值。
在某些具体实施方式中，预设阈值与待检图像相对应，一个所称的预设阈值对应一个或多个待检图像，即利用该碱基识别方法对一个或多个待检图像进行检测时，可共用一个预设阈值。在该种情形下，所称的待检图像的相应坐标位置的背景强度为相对强度，例如，所称的相对强度为通过该相应坐标位置的绝对强度和该相应坐标位置所在区域的背景强度来确定。所称的该相应坐标位置所在区域为包含该位置的区域，较佳地，为不需严格地以该位置为中心的包含x1*y1像素点的区域，x1和y1均为自然数，x1*y1不小于100，较佳地，x1*y1不小于1000。如此，利于快速且准确地进行碱基识别。
在一些示例中，通过以下确定所称的相应坐标位置所在区域的背景强度：依据像素值对所称的相应坐标位置所在的x1*y1区域的像素点进行排序，以获得该x1*y1区域中的像素点的数目的分布曲线；基于分布曲线确定所称的相应坐标位置所在区域的背景强度。所称的排序可以是升序排序也可以是降序排序，以下以升序排序结果作为示例，本领域技术人员通过该示例能够获得通过降序排序的曲线以及根据该曲线确定得相关参数或条件，同样也可以计算出所称的区域的强度。
在一些示例中，待检图像的大小为1800*1800，取x1＝y1＝300，图8和图9显示依据像素值大小升序排列的300*300区域即9万个像素点的分布曲线(直方图)，横坐标为像素(像素值)，纵坐标为像素点的数目，图9和图10分别取自同一图像上的视野边缘和视野中心的300*300区域(方框显示)。可以看出，图像上的背景的像素点数随像素值的变化呈对称分布，服从正态分布或者近似服从正态分布，如图8所示；而背景与亮斑的叠加，使得该曲线有分布拉宽、波峰相对左移且右侧的下降趋势变缓即右边呈拖尾状的趋势，如图9所示。另外，该区域存在其它干扰亮斑比如强度异常或者亮斑分布疏密差异较大等，也是得该曲线趋于不对称分布，包括在波峰或右侧波谷或者靠近波峰或波谷处存在异常凸起或凹陷等(不遵循原变化趋势)。
在一个示例中，以该分布曲线的最高频像素值即波峰作为所称的相应坐标位置所在区域的背景强度，以相对稳定的所称的最高频像素值代表相应区域的背景强度，有利于后续快速简便且准确地的识别出碱基。本实施方式区域的背景强度的估算或确定方法不作限定，例如可以用OpenCV的开运算等。
在另一些具体实施方式中，发明人基于大量图像数据进行归纳、测试和验证，拟出可用于确定该类分布曲线的波峰像素值即所称的相应坐标位置所在区域的背景强度Iblock的公式，Iblock＝Ij1+(Ij2-Ij3)×t1，其中，Ij1、Ij2、Ij3分别为该分布曲线上第j1百分位数、第j2 百分位数和第j3百分位数对应的像素值，j1、j2和j3均为小于50且不小于1的整数，j2>8+j3，t1为第一修正系数，t1取值通过j1、j2和j3确定。该公式估算得的波峰像素值较可靠，适用于各种测序平台产生的图像，特别适用于单分子测序平台产生的图像。
在一些示例中，较佳地，j1选自[1,40]，j2选自[6,40]，j3选自[1,30]，40<j1+(j2-j3)×t1< 50；如此，能较准确地估得利于准确碱基识别的波峰像素值。
进一步地，所称的相应坐标位置所在区域的背景强度通过上述公式确定，而待检图像的相应坐标位置的强度为该相应坐标位置的绝对强度和该相应坐标位置所在区域的背景强度的比值，预设阈值选自[0.85,0.95]，以进行S6比较待检图像的相应坐标位置的强度与预设阈值的大小，进而基于待检图像上强度大于预设阈值的位置的信息进行碱基识别，如此，能够较少丢失有效信息且准确地识别出碱基。在一个具体示例中，j1＝j2＝10，j3＝1，t1＝4.1，预设阈值为0.9，能较好的适用于基于单分子测序平台产生的图像的碱基识别。
在另一些具体实施方式中，预设阈值和待检图像的相应坐标位置是对应的，即预设阈值随着位置的不同一般会随着变化，一个预设阈值对应一个所称的待检图像的相应坐标位置。在该些情形下，所称的待检图像的相应坐标位置的强度为绝对强度，例如为该位置的像素值。
各位置对应的预设阈值可以在进行S6时确定，也可以预先确定保存。在一些示例中，预设阈值的确定与所称的该相应坐标位置所在区域的背景强度有关，所称的该相应坐标位置所在区域为待检图像上包含该位置的区域，为不严格地以该位置为中心的包含x2*y2像素点的区域，x2和y2均为自然数，x2*y2不小于100，较佳地，x2*y2不小于1000。如此，利于快速有效地确定预设阈值，利于准确地识别出碱基。
具体地，在一些示例中，确定预设阈值包括：依据像素值对所称的相应坐标位置所在的x2*y2区域的像素点进行排序，以获得该x2*y2区域的像素点的数目的分布曲线；以及基于所称的分布曲线确定预设阈值。所称的排序可以是升序排序也可以是降序排序，以下以升序排序结果作为示例，本领域技术人员通过该示例能够获得通过降序排序的曲线以及根据该曲线确定得相关参数或条件，同样也可以计算确定得预设阈值。
参见图8和图9，以分布曲线的右侧波谷像素值作为预设阈值，以期望确定得的预设阈值能使得识别出的碱基的准确性的可信度达90％、95％或者99％以上，有利于后续准确地的识别碱基。
对曲线的波谷像素值的确定方法不作限制。在另一些具体实施方式中，发明人经过大量图像数据归纳测试和验证，拟出可用于确定该类分布曲线的右侧波谷像素值即预设阈值 Threshold的公式，Threshold＝Ij4+(Ij5-Ij6)×t2，其中，Ij4、Ij5、Ij6分别为第j4百分位数、第j5百分位数和第j6百分位数对应的像素值，j4、j5和j6均为小于50且不小于1的整数，j5> 8+j6，t2为第二修正系数，t2的取值通过j4、j5和j6确定。利用该公式估算得的右侧波谷像素值较可靠，适用于各种测序平台产生的图像，包括亮斑分布均匀或者不均匀的图像，特别适用于单分子测序平台产生的图像。
较佳地，j4选自[1,40]，j5选自[6,40]，j6选自[1,30]，85<j4+(j5-j6)×t2<100；如此，利于获得较准确的估算得右侧波谷像素值，利于准确的碱基识别。在一个具体示例中，j4＝ j5＝10，j6＝1，t2＝3.7，基于大于该预设阈值确定出的位置进行碱基识别，能较好的适用于基于单分子测序平台产生的图像。
在一些示例中，除了与预设阈值进行比较，还可进一步地结合待检图像的相应位置(的亮斑)的形态等对该位置进行筛选判定，以使确定出的位置的信息能够客观反映出该位置是否真实地发生碱基延伸反应，以利于准确地碱基识别。
上述在流程图中表示或在此以其他方式描述的逻辑和/或步骤，例如，可以被认为是用于实现逻辑功能的可执行指令的序列表，可以具体实现在任何计算机可读存储介质中，以供指令执行系统、装置或设备(如基于计算机的系统、包括处理器的系统或其他可以从指令执行系统、装置或设备取指令并执行指令的系统)使用，或结合这些指令执行系统、装置或设备而使用。
在一个实施方式中，提供一种计算机可读存储介质，用于存储供计算机执行的程序，执行所称的程序包括完成上述任一实施方式中的碱基识别方法。计算机可读存储介质包括但不限于只读存储器、随机存储器、磁盘或光盘等。计算机可读存储介质可以是任何可以包含、存储、通信、传播或传输程序以供指令执行系统、装置或设备或结合这些指令执行系统、装置或设备而使用的装置。计算机可读存储介质的更具体的示例(非穷尽性列表) 包括以下：具有一个或多个布线的电连接部(电子装置)，便携式计算机盘盒(磁装置)，随机存取存储器(RAM)，只读存储器(ROM)，可擦除可编辑只读存储器(EPROM或闪速存储器)，光纤装置，以及便携式光盘只读存储器(CDROM)。另外，计算机可读存储介质甚至可以是可在其上打印程序的纸或其他合适的介质，因为可以例如通过对纸或其他介质进行光学扫描，接着进行编辑、解译或必要时以其他合适方式进行处理来以电子方式获得程序，然后将其存储在计算机存储器中。上述对任一实施方式中的碱基识别方法的技术特征和优点的描述，同样适用于该计算机可读存储介质，在此不再赘述。
在一个实施方式中，参见图10，还提供一种碱基识别系统100，用以实施上述本发明任一实施方式中的碱基识别方法，该系统包括：映射模块10，用于将对应测序模板的亮斑集合中的亮斑的坐标对应到待检图像上，以确定待检图像的相应坐标位置；强度确定模块20，用于计算来自映射模块10的待检图像的相应坐标位置的强度；以及识别模块30，用于比较来自强度确定模块20的待检图像的相应坐标位置的强度与预设阈值的大小，以及基于待检图像上强度大于预设阈值的位置的信息进行该碱基识别；所称的对应测序模板的亮斑集合基于多个图像构建获得，所称的图像和待检图像均采集自碱基延伸反应，图像和待检图像对应相同的视野，碱基延伸反应时的该视野中存在多个带有光学可检测标记的核酸分子，至少一部分核酸分子在图像和/或待检图像上表现为亮斑。
上述对任一实施方式中的碱基识别方法的技术特征和优点的描述，同样适用本发明这一实施方式中的碱基识别系统，在此不再赘述。例如，在一些示例中，还包括模板构建模块12，与映射模块10连接，用于基于多个图像构建对应测序模板的亮斑集合，所称的图像包括分别对应A、T/U、G和C四种类型碱基延伸反应时的一个相同视野的第一图像、第二图像、第三图像和第四图像，第一图像包括图像M1和图像M2，第二图像包括图像N1和图像N2，第三图像包括图像P1和图像P2，第四图像包括图像Q1和图像Q2，定义顺序和/或同时实现一次四种类型碱基延伸反应为一轮测序反应，图像M1和图像M2分别来自两轮测序反应，图像N1和图像N2分别来自两轮测序反应，图像P1和图像P2分别来自两轮测序反应，图像Q1和图像Q2分别来自两轮测序反应，在模板构建模块12中进行以下：合并第一图像、第二图像、第三图像和第四图像上的亮斑，记录相同位置上的亮斑的数目，去除数目为1的位置上的亮斑，以获得所称的对应测序模板的亮斑集合。
具体地，在模板构建模块12中，合并第一图像、第二图像、第三图像和第四图像上的亮斑，包括：(a)合并图像N1上的亮斑至图像M1中，获得一次合并图像M1，标记一次合并图像M1中的重合亮斑为A，标记非重合亮斑为B，在一次合并图像M1中的距离小于第一预定像素的多个亮斑为一个所述重合亮斑；(b)以图像P1、图像Q1、图像M2、图像 N2、图像P2或图像Q2替代图像N1，以一次合并图像M1替代图像M1，多次进行(a) 直至完成所有图像上的亮斑的合并，获得原始亮斑集合；以及(c)去除原始亮斑集合中的标记为B的亮斑，以获得对应测序模板的亮斑集合。
在一些示例中，所称的图像为经过配准的图像。该系统100还包括配准模块14，与模板构建模块12相连，用于实施以下以实现图像的配准：基于参考图像对待配准图像进行第一配准，参考图像和待配准图像对应相同视野，包括：确定待配准图像上的预定区域和参考图像上的相应预定区域的第一偏移量，基于第一偏移量移动待配准图像上的所有亮斑，获得第一配准后的待配准图像；基于参考图像对第一配准后的待配准图像进行第二配准，包括：合并第一配准后的待配准图像和参考图像，获得合并图像，计算合并图像上的预定区域的所有第二重合亮斑的偏移量，以确定第二偏移量，在合并图像上的距离小于第二预定像素的多个亮斑为一个第二重合亮斑，基于该第二偏移量移动第一配准后的待配准图像上的所有亮斑，以实现对待配准图像的配准。
在一些示例中，配准模块14包括参考图像构建单元142，用于进行以下以实现参考图像的构建：获取第五图像和第六图像，第五图像和第六图像与待配准图像对应相同视野；基于第五图像对第六图像进行粗配准，包括确定第六图像相对于第五图像的偏移量，基于该偏移量移动所述第六图像，获得粗配准后的第六图像；合并第五图像和粗配准后的第六图像，以获得所称的参考图像。
进一步地，在参考图像构建单元142中，构建参考图像还包括利用第七图像和第八图像，第五图像、第六图像、第七图像和第八图像对应相同视野，第五图像、第六图像、第七图像和第八图像分别对应A、T/U、G和C四种类型碱基延伸反应时的视野，构建参考图像还包括：基于第五图像对第七图像进行粗配准，包括确定第七图像相对于第五图像的偏移量，基于该偏移量移动第七图像，获得粗配准后的第七图像；基于第五图像对第八图像进行粗配准，包括确定第八图像相对于第五图像的偏移量，基于该偏移量移动第八图像，获得粗配准后的第八图像；合并第五图像和粗配准后的第六图像、粗配准后的第七图像以及粗配准后的第八图像，以获得所称的参考图像。
在一些示例中，所称的参考图像和待配准图像均为二值化图像。
在一些示例中，利用二维离散傅里叶变换确定所称的第一偏移量、第六图像相对于第五图像的偏移量、第七图像相对于第五图像的偏移量和/或第八图像相对于第五图像的偏移量。
在一些示例中，该系统100还包括亮斑检测模块16，与映射模块10、模板构建模块12和/或配准模块14相连，用于进行以下以实现图像上的亮斑的检测：预处理图像，获得预处理后的图像；确定临界值以简化预处理后的图像，包括对小于临界值的预处理后的图像上的像素点的像素值赋值为第一预设值，对不小于临界值的预处理后的图像上的像素点的像素值赋值为第二预设值，以获得二值化图像；基于预处理后的图像确定第一亮斑检测阈值c1；基于预处理后的图像和二值化图像进行所述图像上的亮斑的识别，包括判定满足以下i)-iii)中至少两个条件的像素点矩阵为一个候选亮斑，i)在所述预处理后的图像中，像素点矩阵的中心像素点的像素值为最大，像素点矩阵可表示为k1*k2，k1和k2均为大于 1的奇数，k1*k2像素点矩阵包含k1*k2个像素点，ii)在所述二值化图像中，像素点矩阵的中心像素点的像素值为第二预设值并且像素点矩阵的连通像素大于(2/3)*k1*k2，以及 iii)在所述预处理后的图像中的像素点矩阵的中心像素点的像素值大于第三预设值，并且满足g1*g2>c1，g1为以像素点矩阵的中心像素点为中心的m1*m2范围的二维高斯分布的相关系数，g2为该m1*m2范围的像素，m1和m2均为大于1的奇数，m1*m2范围包含 m1*m2个像素点。
进一步地，亮斑检测模块16中，还包括进行以下以判定候选亮斑是否为亮斑：基于预处理后的图像确定第二亮斑检测阈值，以及比较候选亮斑的像素值和第二亮斑检测阈值的大小，判定像素值不小于第二亮斑检测阈值的候选亮斑为亮斑，以该候选亮斑的坐标所在的位置的像素值作为该候选亮斑的像素值。
具体地，在一些示例中，在亮斑检测模块16中，判定候选亮斑是否为亮斑包括：将预处理后的图像划分为预定大小的一组区域，对该区域中的像素点的像素值进行排序，以确定该区域对应的第二亮斑检测阈值，比较该区域的候选亮斑的像素值和第二亮斑检测阈值的大小，判定像素值不小于该区域对应的第二亮斑检测阈值的候选亮斑为亮斑。
在一些示例中，所称的预处理图像，包括：利用开运算确定图像的背景，基于背景，利用顶帽运算转化图像，对转化后的图像进行高斯模糊处理，对高斯模糊处理后的图像进行锐化，获得所称的预处理后的图像。
在一些示例中，确定临界值以简化预处理后的图像，获得二值化图像，包括：基于背景和预处理后的图像，确定所述临界值，比较预处理后的图像上的像素点的像素值与该临界值，以获得二值化图像。
在一些示例中，g2为修正后的m1*m2范围的像素，依据二值化图像相应m1*m2范围中像素值为第二预设值的像素点所占的比例进行修正以获得修正后的m1*m2范围的像素。
在一些示例中，一个所称的预设阈值对应一个或多个待检图像。在该种情况下，待检图像的相应坐标位置的强度为相对强度，例如通过该相应坐标位置的绝对强度和该相应坐标位置所在区域的背景强度来确定。
在一些示例中，强度确定模块20中，确定相应坐标位置所在区域的背景强度，包括：依据像素值对相应坐标位置所在的x1*y1区域的像素点进行排序，以获得该x1*y1区域的像素点的数目的分布曲线，x1和y1均为自然数，x1*y1不小于100；以及基于所称的分布曲线确定该相应坐标位置所在区域的背景强度。
具体地，所称的排序为升序排序，以所称的分布曲线的波峰像素值作为相应坐标位置所在区域的背景强度，利用公式Iblock＝Ij1+(Ij2-Ij3)×t1估算所述分布曲线的波峰像素值，其中，Ij1、Ij2、Ij3分别为第j1百分位数、第j2百分位数和第j3百分位数对应的像素值，j1、 j2和j3均为小于50且不小于1的整数，j2>8+j3，t1为第一修正系数，t1取值通过j1、j2和j3确定。
进一步地，j1选自[1,40]，j2选自[6,40]，j3选自[1,30]，40<j1+(j2-j3)×t1<50。相应地，预设阈值选自[0.85,0.95]中的任意数值。
在另一些示例中，一个所称的预设阈值对应一个待检图像的相应坐标位置。在该种情形下，待检图像的相应坐标位置的强度为绝对强度。
在一些示例中，系统100还包括阈值确定模块40，与识别模块30相连，用以进行以下以确定预设阈值：依据像素值对所称的相应坐标位置所在的x2*y2区域的像素点进行排序，以获得该x2*y2区域的像素点的数目的分布曲线，x2和y2均为自然数，x2*y2不小于100；基于该分布曲线确定预设阈值。
具体地，所称的排序为升序排序，以该分布曲线的右侧波谷像素值作为预设阈值，利用公式Threshold＝Ij4+(Ij5-Ij6)×t2估算所述右侧波谷像素值，其中，Ij4、Ij5、Ij6分别为第j4 百分位数、第j5百分位数和第j6百分位数对应的像素值，j4、j5和j6均为小于50且不小于1的整数，j5>8+j6，t2为第二修正系数，t2的取值通过j4、j5和j6确定。
进一步地，j4选自[1,40]，j5选自[6,40]，j6选自[1,30]，85<j4+(j5-j6)×t2<100。
在另一个实施方式中，提供一种碱基识别系统，该系统包括：存储器，用于存储数据，包括计算机可执行程序；以及处理器，用于执行所称的计算机可执行程序，以实施上述本发明任一实施方式中的碱基识别方法。该系统用于实施上述任一具体实施方式中的碱基识别方法，上述对任一实施方式中的碱基识别方法的技术特征和优点的描述，同样适用于该碱基识别系统，在此不再赘述。
在一个实施方式中，提供一种测序系统，该测序系统包括上述任一实施方式中的碱基识别系统。
在一个实施方式中，提供一种计算机程序产品，包括指令，该指令在计算机执行所称的程序时，使该计算机执行上述本发明任一实施方式中的碱基识别方法。上述对任一实施方式中的碱基识别方法的技术特征和优点的描述，同样适用于该计算机程序产品，在此不再赘述。
在一个实施方式中，提供一种测序系统，包括上述本发明任一实施方式的计算机程序产品。上述对任一实施方式中的碱基识别方法和/或计算机程序产品的技术特征和优点的描述，同样适用于该测序系统，在此不再赘述。
本领域技术人员知晓，除了以纯计算机可读程序代码方式实现控制器/处理器外，完全可以通过将方法步骤进行逻辑变成来使得控制器以逻辑门、开关、专用集成电路、可编辑逻辑控制器和嵌入微控制器等的形式来实现相同的功能。因此，这种控制器/处理器可以被认为是一种硬件部件，而对其内包括的用于实现各种功能的装置也可以视为硬件部件内的结构。或者甚至，可以将用于实现各种功能的装置视为既可以是实现方法的的软件模块又可以是硬件部件内的结构。
在本说明书的描述中，一个实施方式、一些实施方式、一个或一些具体实施方式、一个或一些实施例、示例等的描述意指结合该实施方式或示例描述的具体特征、结构或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。
在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构等特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同限定。

Claims (68)

1.一种碱基识别方法，其特征在于，包括：
将对应测序模板的亮斑集合中的亮斑的坐标对应到待检图像上，以确定所述待检图像的相应坐标位置；
确定所述待检图像的相应坐标位置的强度；
比较所述待检图像的相应坐标位置的强度与预设阈值的大小，基于所述待检图像上强度大于预设阈值的位置的信息进行所述碱基识别；
所述对应测序模板的亮斑集合基于多个图像构建获得，所述图像和所述待检图像均采集自碱基延伸反应，所述图像和所述待检图像对应相同的视野，碱基延伸反应时的该视野中存在多个带有光学可检测标记的核酸分子，至少一部分所述核酸分子在所述图像和/或所述待检图像上表现为亮斑。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，一个所述预设阈值对应一个或多个所述待检图像。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述待检图像的相应坐标位置的强度为相对强度，依据该相应坐标位置的绝对强度和该相应坐标位置所在区域的背景强度确定所述相对强度。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，确定所述相应坐标位置所在区域的背景强度，包括：
依据像素值对所述相应坐标位置所在的x1*y1区域的像素点进行排序，以获得该x1*y1区域的像素点的数目的分布曲线，x1和y1均为自然数，x1*y1不小于100；
基于所述分布曲线确定所述相应坐标位置所在区域的背景强度。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述排序为升序排序，以所述分布曲线的波峰像素值作为所述相应坐标位置所在区域的背景强度，利用公式Iblock＝Ij1+(Ij2-Ij3)×t1估算所述分布曲线的波峰像素值，其中，
Ij1、Ij2、Ij3分别为第j1百分位数、第j2百分位数和第j3百分位数对应的像素值，j1、j2和j3均为小于50且不小于1的整数，j2>8+j3，t1为第一修正系数，t1取值通过j1、j2和j3确定。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，j1选自[1,40]，j2选自[6,40]，j3选自[1,30]，40<j1+(j2-j3)×t1<50。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述预设阈值选自[0.85,0.95]。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，一个所述预设阈值对应一个所述待检图像的相应坐标位置。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待检图像的相应坐标位置的强度为绝对强度。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，确定所述预设阈值，包括：
依据像素值对所述相应坐标位置所在的x2*y2区域的像素点进行排序，以获得该x2*y2区域的像素点的数目的分布曲线，x2和y2均为自然数，x2*y2不小于100；
基于所述分布曲线确定所述预设阈值。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述排序为升序排序，以所述分布曲线的右侧波谷像素值作为所述预设阈值，利用公式Threshold＝Ij4+(Ij5-Ij6)×t2估算所述右侧波谷像素值，其中，
Ij4、Ij5、Ij6分别为第j4百分位数、第j5百分位数和第j6百分位数对应的像素值，j4、j5和j6均为小于50且不小于1的整数，j5>8+j6，t2为第二修正系数，t2的取值通过j4、j5和j6确定。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，j4选自[1,40]，j5选自[6,40]，j6选自[1,30]，85<j4+(j5-j6)×t2<100。
13.根据权利要求1-12任一所述的方法，其特征在于，所述图像包括分别对应A、T/U、G和C四种类型碱基延伸反应时的一个相同视野的第一图像、第二图像、第三图像和第四图像，所述第一图像包括图像M1和图像M2，所述第二图像包括图像N1和图像N2，所述第三图像包括图像P1和图像P2，所述第四图像包括图像Q1和图像Q2，定义顺序和/或同时实现一次四种类型碱基延伸反应为一轮测序反应，
图像M1和图像M2分别来自两轮测序反应，图像N1和图像N2分别来自两轮测序反应，图像P1和图像P2分别来自两轮测序反应，图像Q1和图像Q2分别来自两轮测序反应，
所述基于多个图像构建所述对应测序模板的亮斑集合，包括：
合并所述第一图像、第二图像、第三图像和第四图像上的亮斑，记录相同位置上的亮斑的数目，去除数目为1的位置上的亮斑，以获得所述对应所述测序模板的亮斑集合。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，合并所述第一图像、第二图像、第三图像和第四图像上的亮斑，包括：
(a)合并图像N1上的亮斑至图像M1中，获得一次合并图像M1’，标记一次合并图像M1’中的重合亮斑为A，标记非重合亮斑为B，在所述一次合并图像M1’中的距离小于第一预定像素的多个亮斑为一个所述重合亮斑；
(b)以图像P1、图像Q1、图像M2、图像N2、图像P2或图像Q2替代所述图像N1，以一次合并图像M1’替代所述图像M1，多次进行(a)直至完成所有图像上的亮斑的合并，获得原始亮斑集合；
(c)去除所述原始亮斑集合中的标记为B的亮斑，以获得所述对应测序模板的亮斑集合。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述图像为经过配准的图像。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，配准所述图像，包括：
基于参考图像对待配准图像进行第一配准，所述参考图像和所述待配准图像对应相同视野，包括，
确定所述待配准图像上的预定区域和所述参考图像上的相应预定区域的第一偏移量，基于所述第一偏移量移动所述待配准图像上的所有亮斑，获得第一配准后的待配准图像；
基于所述参考图像对第一配准后的待配准图像进行第二配准，包括，
合并所述第一配准后的待配准图像和所述参考图像，获得合并图像，
计算所述合并图像上的预定区域的所有第二重合亮斑的偏移量，以确定第二偏移量，在所述合并图像上的距离小于第二预定像素的多个亮斑为一个所述第二重合亮斑，
基于该第二偏移量移动所述第一配准后的待配准图像上的所有亮斑，以实现对所述待配准图像的配准。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述参考图像通过构建获得，构建所述参考图像包括：
获取第五图像和第六图像，所述第五图像和所述第六图像与所述待配准图像对应相同视野；
基于第五图像对第六图像进行粗配准，包括确定所述第六图像相对于所述第五图像的偏移量，基于该偏移量移动所述第六图像，获得粗配准后的第六图像；
合并所述第五图像和粗配准后的第六图像，以获得所述参考图像。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，构建所述参考图像还包括利用第七图像和第八图像，所述第五图像、第六图像、第七图像和第八图像对应相同视野，所述第五图像、第六图像、第七图像和第八图像分别对应A、T/U、G和C四种类型碱基延伸反应时的所述视野，构建所述参考图像还包括：
基于第五图像对第七图像进行粗配准，包括确定所述第七图像相对于所述第五图像的偏移量，基于该偏移量移动所述第七图像，获得粗配准后的第七图像；
基于第五图像对第八图像进行粗配准，包括确定所述第八图像相对于所述第五图像的偏移量，基于该偏移量移动所述第八图像，获得粗配准后的第八图像；
合并所述第五图像和粗配准后的第六图像、粗配准后的第七图像以及粗配准后的第八图像，以获得所述参考图像。
19.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述参考图像和所述待配准图像为二值化图像。
20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，利用二维离散傅里叶变换确定所述第一偏移量、所述第六图像相对于所述第五图像的偏移量、所述第七图像相对于所述第五图像的偏移量和/或所述第八图像相对于所述第五图像的偏移量。
21.根据权利要求14-20任一所述的方法，其特征在于，检测所述图像上的亮斑，包括：
预处理图像，获得预处理后的图像；
确定临界值以简化预处理后的图像，包括对小于临界值的预处理后的图像上的像素点的像素值赋值为第一预设值，对不小于临界值的预处理后的图像上的像素点的像素值赋值为第二预设值，以获得二值化图像；
基于预处理后的图像确定第一亮斑检测阈值c1；
基于预处理后的图像和二值化图像进行所述图像上的亮斑的识别，包括判定满足以下i)-iii)中至少两个条件的像素点矩阵为一个候选亮斑，
i)在所述预处理后的图像中，像素点矩阵的中心像素点的像素值为最大，像素点矩阵可表示为r1*r2，r1和r2均为大于1的奇数，r1*r2像素点矩阵包含r1*r2个像素点，
ii)在所述二值化图像中，像素点矩阵的中心像素点的像素值为第二预设值并且像素点矩阵的连通像素大于(2/3)*r1*r2，以及
iii)在所述预处理后的图像中的像素点矩阵的中心像素点的像素值大于第三预设值，并且满足g1*g2>c1，g1为以像素点矩阵的中心像素点为中心的m1*m2范围的二维高斯分布的相关系数，g2为该m1*m2范围的像素，m1和m2均为大于1的奇数，m1*m2范围包含m1*m2个像素点。
22.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，检测所述图像上的亮斑，包括：
预处理图像，获得预处理后的图像；
确定临界值以简化预处理后的图像，包括对小于临界值的预处理后的图像上的像素点的像素值赋值为第一预设值，对不小于临界值的预处理后的图像上的像素点的像素值赋值为第二预设值，以获得二值化图像；
基于预处理后的图像确定第一亮斑检测阈值c1；
基于预处理后的图像和二值化图像进行所述图像上的亮斑的识别，包括判定满足以下i)-iii)中至少两个条件的像素点矩阵为一个候选亮斑，
i)在所述预处理后的图像中，像素点矩阵的中心像素点的像素值为最大，像素点矩阵可表示为r1*r2，r1和r2均为大于1的奇数，r1*r2像素点矩阵包含r1*r2个像素点，
ii)在所述二值化图像中，像素点矩阵的中心像素点的像素值为第二预设值并且像素点矩阵的连通像素大于(2/3)*r1*r2，以及
iii)在所述预处理后的图像中的像素点矩阵的中心像素点的像素值大于第三预设值，并且满足g1*g2>c1，g1为以像素点矩阵的中心像素点为中心的m1*m2范围的二维高斯分布的相关系数，g2为该m1*m2范围的像素，m1和m2均为大于1的奇数，m1*m2范围包含m1*m2个像素点。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，还包括判定候选亮斑是否为亮斑，包括：
基于所述预处理后的图像确定第二亮斑检测阈值，以及
比较所述候选亮斑的像素值和所述第二亮斑检测阈值的大小，判定像素值不小于所述第二亮斑检测阈值的候选亮斑为亮斑，以该候选亮斑的坐标所在的像素点的像素值作为所述候选亮斑的像素值。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，判定候选亮斑是否为亮斑包括：
将所述预处理后的图像划分为预定大小的一组区域，
对该区域中的像素点的像素值进行排序，以确定该区域对应的第二亮斑检测阈值，
比较该区域的候选亮斑的像素值和所述第二亮斑检测阈值的大小，判定像素值不小于该区域对应的第二亮斑检测阈值的候选亮斑为亮斑。
25.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述预处理图像，包括：
利用开运算确定所述图像的背景，
基于背景，利用顶帽运算转化所述图像，
对转化后的图像进行高斯模糊处理，
对高斯模糊处理后的图像进行锐化，获得所述预处理后的图像。
26.根据权利要求22-24任一所述的方法，其特征在于，所述预处理图像，包括：
利用开运算确定所述图像的背景，
基于背景，利用顶帽运算转化所述图像，
对转化后的图像进行高斯模糊处理，
对高斯模糊处理后的图像进行锐化，获得所述预处理后的图像。
27.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，确定临界值以简化预处理后的图像，获得二值化图像，包括：
基于背景和所述预处理后的图像，确定所述临界值，
比较所述预处理后的图像上的像素点的像素值与所述临界值，以获得所述二值化图像。
28.根据权利要求22-25任一所述的方法，其特征在于，确定临界值以简化预处理后的图像，获得二值化图像，包括：
基于背景和所述预处理后的图像，确定所述临界值，
比较所述预处理后的图像上的像素点的像素值与所述临界值，以获得所述二值化图像。
29.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，确定临界值以简化预处理后的图像，获得二值化图像，包括：
基于背景和所述预处理后的图像，确定所述临界值，
比较所述预处理后的图像上的像素点的像素值与所述临界值，以获得所述二值化图像。
30.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，g2为修正后的m1*m2范围的像素，依据二值化图像相应m1*m2范围中像素值为第二预设值的像素点所占的比例进行修正以获得所述修正后的m1*m2范围的像素。
31.根据权利要求22-25、27、29、30任一所述的方法，其特征在于，g2为修正后的m1*m2范围的像素，依据二值化图像相应m1*m2范围中像素值为第二预设值的像素点所占的比例进行修正以获得所述修正后的m1*m2范围的像素。
32.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，g2为修正后的m1*m2范围的像素，依据二值化图像相应m1*m2范围中像素值为第二预设值的像素点所占的比例进行修正以获得所述修正后的m1*m2范围的像素。
33.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，g2为修正后的m1*m2范围的像素，依据二值化图像相应m1*m2范围中像素值为第二预设值的像素点所占的比例进行修正以获得所述修正后的m1*m2范围的像素。
34.一种碱基识别系统，其特征在于，包括：
存储器，用于存储数据，包括计算机可执行程序；
处理器，用于执行所述计算机可执行程序，以实施权利要求1-33任一所述方法。
35.一种测序系统，其特征在于，包括权利要求34所述的碱基识别系统。
36.一种碱基识别系统，其特征在于，包括：
映射模块，用于将对应测序模板的亮斑集合中的亮斑的坐标对应到待检图像上，以确定所述待检图像的相应坐标位置；
强度确定模块，用于计算所述待检图像的相应坐标位置的强度；以及
识别模块，用于比较来自所述强度确定模块的待检图像的相应坐标位置的强度与预设阈值的大小，以及基于所述待检图像上强度大于所述预设阈值的位置的信息进行所述碱基识别；
所述对应测序模板的亮斑集合基于多个图像构建获得，所述图像和所述待检图像均采集自碱基延伸反应，所述图像和所述待检图像对应相同的视野，碱基延伸反应时的该视野中存在多个带有光学可检测标记的核酸分子，至少一部分所述核酸分子在所述图像和/或所述待检图像上表现为亮斑。
37.根据权利要求36所述的系统，其特征在于，一个所述预设阈值对应一个或多个所述待检图像。
38.根据权利要求37所述的系统，其特征在于，所述待检图像的相应坐标位置的强度为相对强度，依据该相应坐标位置的绝对强度和该相应坐标位置所在区域的背景强度确定所述相对强度。
39.根据权利要求36所述的系统，其特征在于，所述强度确定模块中，确定所述相应坐标位置所在区域的背景强度，包括：
依据像素值对所述相应坐标位置所在的x1*y1区域的像素点进行排序，以获得该x1*y1区域的像素点的数目的分布曲线，x1和y1均为自然数，x1*y1不小于100；
基于所述分布曲线确定所述相应坐标位置所在区域的背景强度。
40.根据权利要求39所述的系统，其特征在于，所述排序为升序排序，以所述分布曲线的波峰像素值作为所述相应坐标位置所在区域的背景强度，利用公式Iblock＝Ij1+(Ij2-Ij3)×t1估算所述分布曲线的波峰像素值，其中，
Ij1、Ij2、Ij3分别为第j1百分位数、第j2百分位数和第j3百分位数对应的像素值，j1、j2和j3均为小于50且不小于1的整数，j2>8+j3，t1为第一修正系数，t1取值通过j1、j2和j3确定。
41.根据权利要求40所述的系统，其特征在于，j1选自[1,40]，j2选自[6,40]，j3选自[1,30]，40<j1+(j2-j3)×t1<50。
42.根据权利要求41所述的系统，其特征在于，所述预设阈值选自[0.85,0.95]。
43.根据权利要求36所述的系统，其特征在于，一个所述预设阈值对应一个所述待检图像的相应坐标位置。
44.根据权利要求43所述的系统，其特征在于，所述待检图像的相应坐标位置的强度为绝对强度。
45.根据权利要求44所述的系统，其特征在于，还包括阈值确定模块，与所述识别模块相连，用以确定所述预设阈值，包括：
依据像素值对所述相应坐标位置所在的x2*y2区域的像素点进行排序，以获得该x2*y2区域的像素点的数目的分布曲线，x2和y2均为自然数，x2*y2不小于100；
基于所述分布曲线确定所述预设阈值。
46.根据权利要求45所述的系统，其特征在于，所述排序为升序排序，以所述分布曲线的右侧波谷像素值作为所述预设阈值，利用公式Threshold＝Ij4+(Ij5-Ij6)×t2估算所述右侧波谷像素值，其中，
Ij4、Ij5、Ij6分别为第j4百分位数、第j5百分位数和第j6百分位数对应的像素值，j4、j5和j6均为小于50且不小于1的整数，j5>8+j6，t2为第二修正系数，t2的取值通过j4、j5和j6确定。
47.根据权利要求46所述的系统，其特征在于，j4选自[1,40]，j5选自[6,40]，j6选自[1,30]，85<j4+(j5-j6)×t2<100。
48.根据权利要求36-47任一所述的系统，其特征在于，所述图像包括分别对应A、T/U、G和C四种类型碱基延伸反应时的一个相同视野的第一图像、第二图像、第三图像和第四图像，所述第一图像包括图像M1和图像M2，所述第二图像包括图像N1和图像N2，所述第三图像包括图像P1和图像P2，所述第四图像包括图像Q1和图像Q2，定义顺序和/或同时实现一次四种类型碱基延伸反应为一轮测序反应，
图像M1和图像M2分别来自两轮测序反应，图像N1和图像N2分别来自两轮测序反应，图像P1和图像P2分别来自两轮测序反应，图像Q1和图像Q2分别来自两轮测序反应，
还包括模板构建模块，与所述映射模块连接，用于实施以下以实现基于多个图像构建所述对应测序模板的亮斑集合：
合并所述第一图像、第二图像、第三图像和第四图像上的亮斑，记录相同位置上的亮斑的数目，去除数目为1的位置上的亮斑，以获得所述对应测序模板的亮斑集合。
49.根据权利要求48所述的系统，其特征在于，在所述模板构建模块中，合并所述第一图像、第二图像、第三图像和第四图像上的亮斑，包括：
(a)合并图像N1上的亮斑至图像M1中，获得一次合并图像M1’，标记一次合并图像M1’中的重合亮斑为A，标记非重合亮斑为B，在所述一次合并图像M1’中的距离小于第一预定像素的多个亮斑为一个所述重合亮斑；
(b)以图像P1、图像Q1、图像M2、图像N2、图像P2或图像Q2替代所述图像N1，以一次合并图像M1’替代所述图像M1，多次进行(a)直至完成所有图像上的亮斑的合并，获得原始亮斑集合；
(c)去除所述原始亮斑集合中的标记为B的亮斑，以获得所述对应测序模板的亮斑集合。
50.根据权利要求48所述的系统，其特征在于，所述图像为经过配准的图像。
51.根据权利要求50所述的系统，其特征在于，还包括配准模块，与所述模板构建模块相连，用于实施以下以实现所述图像的配准：
基于参考图像对待配准图像进行第一配准，所述参考图像和所述待配准图像对应相同视野，包括，
确定所述待配准图像上的预定区域和所述参考图像上的相应预定区域的第一偏移量，基于所述第一偏移量移动所述待配准图像上的所有亮斑，获得第一配准后的待配准图像；
基于所述参考图像对第一配准后的待配准图像进行第二配准，包括，
合并所述第一配准后的待配准图像和所述参考图像，获得合并图像，
计算所述合并图像上的预定区域的所有第二重合亮斑的偏移量，以确定第二偏移量，在所述合并图像上的距离小于第二预定像素的多个亮斑为一个所述第二重合亮斑，
基于该第二偏移量移动所述第一配准后的待配准图像上的所有亮斑，以实现对所述待配准图像的配准。
52.根据权利要求51所述的系统，其特征在于，所述配准模块包括参考图像构建单元，用于实施以下以实现所述参考图像的构建：
获取第五图像和第六图像，所述第五图像和所述第六图像与所述待配准图像对应相同视野；
基于第五图像对第六图像进行粗配准，包括确定所述第六图像相对于所述第五图像的偏移量，基于该偏移量移动所述第六图像，获得粗配准后的第六图像；
合并所述第五图像和粗配准后的第六图像，以获得所述参考图像。
53.根据权利要求52所述的系统，其特征在于，在所述参考图像构建单元中，构建所述参考图像还包括利用第七图像和第八图像，所述第五图像、第六图像、第七图像和第八图像对应相同视野，所述第五图像、第六图像、第七图像和第八图像分别对应A、T/U、G和C四种类型碱基延伸反应时的所述视野，构建所述参考图像还包括：
基于第五图像对第七图像进行粗配准，包括确定所述第七图像相对于所述第五图像的偏移量，基于该偏移量移动所述第七图像，获得粗配准后的第七图像；
基于第五图像对第八图像进行粗配准，包括确定所述第八图像相对于所述第五图像的偏移量，基于该偏移量移动所述第八图像，获得粗配准后的第八图像；
合并所述第五图像和粗配准后的第六图像、粗配准后的第七图像以及粗配准后的第八图像，以获得所述参考图像。
54.根据权利要求51-53任一所述的系统，其特征在于，所述参考图像和所述待配准图像为二值化图像。
55.根据权利要求53所述的系统，其特征在于，利用二维离散傅里叶变换确定所述第一偏移量、所述第六图像相对于所述第五图像的偏移量、所述第七图像相对于所述第五图像的偏移量和/或所述第八图像相对于所述第五图像的偏移量。
56.根据权利要求48所述的系统，其特征在于，还包括亮斑检测模块，与所述映射模块、模板构建模块和/或配准模块相连，用于进行以下以实现所述图像上的亮斑的检测：
预处理图像，获得预处理后的图像；
确定临界值以简化预处理后的图像，包括对小于临界值的预处理后的图像上的像素点的像素值赋值为第一预设值，对不小于临界值的预处理后的图像上的像素点的像素值赋值为第二预设值，以获得二值化图像；
基于预处理后的图像确定第一亮斑检测阈值c1；
基于预处理后的图像和二值化图像进行所述图像上的亮斑的识别，包括判定满足以下i)-iii)中至少两个条件的像素点矩阵为一个候选亮斑，
i)在所述预处理后的图像中，像素点矩阵的中心像素点的像素值为最大，像素点矩阵可表示为r1*r2，r1和r2均为大于1的奇数，r1*r2像素点矩阵包含r1*r2个像素点，
ii)在所述二值化图像中，像素点矩阵的中心像素点的像素值为第二预设值并且像素点矩阵的连通像素大于(2/3)*r1*r2，以及
iii)在所述预处理后的图像中的像素点矩阵的中心像素点的像素值大于第三预设值，并且满足g1*g2>c1，g1为以像素点矩阵的中心像素点为中心的m1*m2范围的二维高斯分布的相关系数，g2为该m1*m2范围的像素，m1和m2均为大于1的奇数，m1*m2范围包含m1*m2个像素点。
57.根据权利要求49-53任一所述的系统，其特征在于，还包括亮斑检测模块，与所述映射模块、模板构建模块和/或配准模块相连，用于进行以下以实现所述图像上的亮斑的检测：
预处理图像，获得预处理后的图像；
确定临界值以简化预处理后的图像，包括对小于临界值的预处理后的图像上的像素点的像素值赋值为第一预设值，对不小于临界值的预处理后的图像上的像素点的像素值赋值为第二预设值，以获得二值化图像；
基于预处理后的图像确定第一亮斑检测阈值c1；
基于预处理后的图像和二值化图像进行所述图像上的亮斑的识别，包括判定满足以下i)-iii)中至少两个条件的像素点矩阵为一个候选亮斑，
i)在所述预处理后的图像中，像素点矩阵的中心像素点的像素值为最大，像素点矩阵可表示为r1*r2，r1和r2均为大于1的奇数，r1*r2像素点矩阵包含r1*r2个像素点，
ii)在所述二值化图像中，像素点矩阵的中心像素点的像素值为第二预设值并且像素点矩阵的连通像素大于(2/3)*r1*r2，以及
iii)在所述预处理后的图像中的像素点矩阵的中心像素点的像素值大于第三预设值，并且满足g1*g2>c1，g1为以像素点矩阵的中心像素点为中心的m1*m2范围的二维高斯分布的相关系数，g2为该m1*m2范围的像素，m1和m2均为大于1的奇数，m1*m2范围包含m1*m2个像素点。
58.根据权利要求57所述的系统，其特征在于，所述亮斑检测模块中，还包括进行以下以判定候选亮斑是否为亮斑：
基于所述预处理后的图像确定第二亮斑检测阈值，以及
比较所述候选亮斑的像素值和所述第二亮斑检测阈值的大小，判定像素值不小于所述第二亮斑检测阈值的候选亮斑为亮斑，以该候选亮斑的坐标所在的像素点的像素值作为所述候选亮斑的像素值。
59.根据权利要求58所述的系统，其特征在于，在所述亮斑检测模块中，判定候选亮斑是否为亮斑包括：
将所述预处理后的图像划分为预定大小的一组区域，
对该区域中的像素点的像素值进行排序，以确定该区域对应的第二亮斑检测阈值，
比较该区域的候选亮斑的像素值和所述第二亮斑检测阈值的大小，判定像素值不小于该区域对应的第二亮斑检测阈值的候选亮斑为亮斑。
60.根据权利要求57所述的系统，其特征在于，所述预处理图像，包括：
利用开运算确定所述图像的背景，
基于背景，利用顶帽运算转化所述图像，
对转化后的图像进行高斯模糊处理，
对高斯模糊处理后的图像进行锐化，获得所述预处理后的图像。
61.根据权利要求58-59任一所述的系统，其特征在于，所述预处理图像，包括：
利用开运算确定所述图像的背景，
基于背景，利用顶帽运算转化所述图像，
对转化后的图像进行高斯模糊处理，
对高斯模糊处理后的图像进行锐化，获得所述预处理后的图像。
62.根据权利要求57所述的系统，其特征在于，确定临界值以简化预处理后的图像，获得二值化图像，包括：
基于背景和所述预处理后的图像，确定所述临界值，
比较所述预处理后的图像上的像素点的像素值与所述临界值，以获得所述二值化图像。
63.根据权利要求58-60任一所述的系统，其特征在于，确定临界值以简化预处理后的图像，获得二值化图像，包括：
基于背景和所述预处理后的图像，确定所述临界值，
比较所述预处理后的图像上的像素点的像素值与所述临界值，以获得所述二值化图像。
64.根据权利要求61所述的系统，其特征在于，确定临界值以简化预处理后的图像，获得二值化图像，包括：
基于背景和所述预处理后的图像，确定所述临界值，
比较所述预处理后的图像上的像素点的像素值与所述临界值，以获得所述二值化图像。
65.根据权利要求57所述的系统，其特征在于，g2为修正后的m1*m2范围的像素，依据二值化图像相应m1*m2范围中像素值为第二预设值的像素点所占的比例进行修正以获得所述修正后的m1*m2范围的像素。
66.根据权利要求58-60、62、64任一所述的系统，其特征在于，g2为修正后的m1*m2范围的像素，依据二值化图像相应m1*m2范围中像素值为第二预设值的像素点所占的比例进行修正以获得所述修正后的m1*m2范围的像素。
67.根据权利要求61所述的系统，其特征在于，g2为修正后的m1*m2范围的像素，依据二值化图像相应m1*m2范围中像素值为第二预设值的像素点所占的比例进行修正以获得所述修正后的m1*m2范围的像素。
68.根据权利要求63所述的系统，其特征在于，g2为修正后的m1*m2范围的像素，依据二值化图像相应m1*m2范围中像素值为第二预设值的像素点所占的比例进行修正以获得所述修正后的m1*m2范围的像素。
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