CN104561014A - 早期胃腺癌原代细胞单链dna适配子及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子及制备方法。本发明的早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子的基因序列分别为：SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4和SEQIDNo.5。本发明的早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子可在早期胃腺癌检查中的应用，也可在制备早期胃腺癌检测试剂中的应用，还可以在制备治疗胃腺癌药物中的应用。

Description

早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子及制备方法

技术领域

本发明涉及一种病源组织适配子及其制备方法。确切讲本发明是涉及一种早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子及制备方法。

背景技术

胃癌在世界范围内和我国均是最常见的恶性肿瘤之一，根据世界卫生组织公布的全球统计报告^[1]，全球新发胃癌98,9000例，发病率为17.6/10万人，仅次于肺癌居第二位。早期胃癌是病灶局限于胃黏膜和黏膜下层，不考虑是否有淋巴结转移，因无明显症状和局部体征，常不足以引起患者和医师的足够重视而发生误诊或漏诊。

目前，制备肿瘤细胞单链DNA适配子的方法主要涉及到随机单链DNA文库和引物的构建、聚合酶链式反应扩增、cell—SELEX筛选、生物素—链酶亲和素磁珠分离制备次级文库、人正常胃粘膜上皮细胞反筛、蓝白筛选、一级二级结构的分析、适配子亲和力特异性的测定。

其中，生物素—链酶亲和素磁珠方法制备的单链DNA文库纯度高，且成本低，产量高，是实现胃腺癌原代细胞单链DNA适配子制备的最佳途径，参见：“SELEX 法体外筛选胃癌细胞适配子方法的建立”，作者：李真真 发刊时间：2009年3月 杂志名称：生物技术 文章编号：1004 ～311X (2009)03—0042 —05  页码：42—46  ；“应用SELEX技术筛选沙门氏菌抗原的适配子”，作者：郎春燕 发刊时间：2011年  杂志名称：食品科学 文章编号：1002-6630(2011)13-0194-04 ）页码：194—197 。

现阶段研究表明CEA,CA19 -9,CA72 -4对胃癌诊断的敏感度较低，分别为20.7% ,42.7% ,52.4%。而CEA, CA19一9,CA72 -4联合检测的准确度、敏感性提高，3项肿瘤标志物联合检测对胃癌诊断敏感性、准确度均较单项检测提高，差异有统计学意义(P<0.01)，3项肿瘤标志物联合检测对胃癌诊断的特异性单项检测的特异性相比有所下降，但差异无统计学意义(P >0.05)，而适配子的检测方法特异性和亲和力都相对较高。此外循环肿瘤细胞(circulating tumorcells } CTC)被定义为从肿瘤原发病灶或转移病灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。但是目前为止，CTC的检测尚缺乏统一的标准，并不能代替常规的影像学检查，且检测费用高昂。因为各种方法均有不利因素，临床关于生化分子方面的检测手段并没有在实际中应用，所以迫切需要新检测手段研发。参见：“三种肿瘤标志物联合检测胃癌的互补诊断价值”，作者：唐丽，发刊时间：2012年4月，杂志名称：内蒙古医学院学报，文章编号：1001—2113（2012）02—0209—02  页码：209—210 ；“胃癌早期筛查血清学方法新进展”，作者：丁昭珩，发刊时间：2010年12月，杂志名称：医学综述，文章编号：1006—2084（2010）24—3727—03  页码：3727—3729 ；“肿瘤标志物检测技术的研究进展”，作者：时瑛，发刊时间：2011年，杂志名称：新疆医学，文章编号：新疆医学2011年第41卷 页码：38—46。由此可见，现阶段制备公开与披露的胃腺癌原代细胞单链DNA适配子均不适于筛查早期胃腺癌。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足，能与早期胃腺癌细胞结合的早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子，本发明同时提供这种早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子的制备方法及可能的应用。

本发明的一种早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子基因序列为SEQ ID No.1；本发明的另外几种早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子的基因序列分别为SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ ID No.5。

本发明的早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子制备方法是：提取多例早期胃腺癌原代细胞，经纯化后等体积混合，得到消除个体差异性的混合细胞液，再通过生物素-链酶亲和素磁珠分离单链DNA方法得到早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子。

本发明的早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子可在早期胃腺癌检查中的应用，也可在制备早期胃腺癌检测试剂中的应用，还可以在制备治疗胃腺癌药物中的应用。

本发明的早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子可与早期胃腺癌原代细胞特异性结合；本发明采用新的化学技术cell-SELEX技术进行早期胃腺癌原代细胞的单链DNA适配子的筛选，确保筛选出的单链DNA适配子可特异性结合到早期胃腺癌原代细胞膜上，从而通过链酶亲和素磁珠的方法提取到早期胃腺癌原代细胞膜上的肿瘤标志物。为检测早期胃腺癌提供了新的方法，可以为临床胃腺癌的早期诊断、早期治疗提供新的解决途径。这一适配子可在早期胃腺癌检查中的应用也可在制备早期胃腺癌检测试剂中的应用。

本发明制备的DNA适配子为小分子核酸，其分子结构不同于任何使用的检测物质，且只高亲和力结合早期胃腺癌原代细胞，对其他细胞并无危害；该DNA适配子也有别于传统的抗体，其分子量小，可快速渗入，经修饰后可作为治疗药物携带体，因其无抗原性，因此不引起副作用。

附图说明

图1 细胞免疫组化图，早期胃腺癌原代细胞。

图2 细胞免疫组化图，正常胃粘膜上皮细胞。

图3 聚合酶链式反应扩增结果；M代表50bp DNA Marker；箭头指示为目的条带。

图4 荧光素标记的单链DNA与早期胃腺癌原代细胞结合结合率测定。

图5  1-12轮筛选的单链DNA次级文库PCR产物电泳图；M代表50bp DNA Marker；箭头指示为目的条带。

图6  感受态E.coli DH5α转化率结果（将转化反应用培养液按1:10的比例稀释，取其中100μL的稀释液来涂布(0.01ng DNA/100μL)。

图7  重组体转入E.coli DH 5α感受态细胞后蓝白筛选结果A:目的片段与载体的摩尔比3:1。

图8  重组体转入E.coli DH 5α感受态细胞后蓝白筛选结果B：目的片段与载体的摩尔比6:1。

图9  重组体转入E.coli DH 5α感受态细胞后蓝白筛选结果C: 目的片段与载体的摩尔比10:1。

图10  重组体测序图（通过对含有目的片段的重组体进行双向测序，得到含有目的片段测序图）。

图11  适配子二级结构预测结果（将22个适配子序列，根据DNA稳定的自由能最低能量值，利用DNAMAN 7.0软件进行二级结构预测 ），其中：A：C1号适配子   B：C22号适配子   C:  C11号适配子。

图12  适配子特异性分析结果（利用荧光素标记的ssDNA分子，分别与早期胃腺癌原代细胞、正常胃腺癌原代细胞结合，测定荧光强度）。

具体实施方式

本发明以下结合实施例解说。

本发明所涉及的早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子制备方法是通过对临床病人的筛查得到早期胃腺癌原代细胞及正常胃粘膜上皮细胞，再相应的克隆处理、测序等处理，再对所得到的各适配子进行特异性测定和亲和力分析。最终对所得到的适配子进行筛选，得到所需的适配子。

本发明由武威市人民医院、兰州大学第二医院从多名早期胃癌根治手术的患者组织分离得到得到早期胃腺癌原代细胞及正常胃粘膜上皮细胞；本发明中所用的大肠杆菌DH5α及克隆载体pGEM-T通过商业购置。以下是本发明的适配子的具体制备方法。

、早期胃腺癌原代细胞的分离

选择早期胃腺癌根治手术治疗的患者，经病人同意并签定知情同意书，分别取早期胃腺癌胃粘膜上皮组织及远离病灶5厘米处取正常胃粘膜上皮组织约5~10克，分别放入含青链霉素的磷酸盐缓冲液中，4℃保存运回实验室，反复冲洗，应用含0.1%胶原酶Ⅳ型的溶液进行分离。

(1) 将装有组织的一次性聚丙烯材料的容器用含75%酒精棉球擦拭，放入经紫外灭菌的超净工作台中，点燃酒精灯；

(2) 用眼科镊仔细剥离组织的粘膜层和固有层，将剥离得到的粘膜层放入110毫升一次性聚丙烯材料的容器中，用磷酸盐缓冲液反复冲洗，洗去粘液；

(3) 加入配制好的0.1%胶原酶Ⅳ型的溶液20~30毫升，用灭菌的手术剪将粘膜层剪碎至每块1~3立方毫米，补加胶原酶液，使酶量和组织的量达到1毫升/块；

(4) 将溶液放入恒温摇床中，以大于摇床最低转速，37℃酶解2~3小时，使溶液变粘稠；

(5) 取出容器，用75%的酒精棉球擦拭，放入超净工作台中，加入胎牛血清，终止反应，用吸管反复吹打；将溶液过150目不锈钢滤网，取滤液离心，1000转每分钟，离心5分钟；

(6) 倒出上清液，沉淀加入磷酸盐缓冲液洗涤2遍，加入磷酸盐缓冲液悬浮，细胞计数，台盼蓝染色观察细胞存活率，用上皮细胞角蛋白8抗体和上皮细胞角蛋白18抗体进行免疫组化鉴定细胞纯度；

(7) 将所提取的细胞冻存，根据医院病理科的病理切片结果，确定为早期胃腺癌患者的标本才可用于后续实验。

、胃腺癌细胞纯度的鉴定

细胞涂片

(1)新的载玻片泡酸，用酒精棉球擦洗干净，75％的酒精中浸泡30分钟；

(2)出用双蒸水洗涤几次，烘干，再用多聚赖氨酸溶液涂片，涂抹均匀，烘干，紫外消毒30分钟；

(3)胞离心后吸取100微升直接均匀涂在多聚赖氨酸包被的载玻片上，待自然干燥后开始实验。

细胞组化过程

同步设置早期胃腺癌细胞组和正常胃粘膜细胞组，采用免疫组织化学法即用型三步法：

(1)分别对两组细胞用磷酸缓冲盐溶液洗三次，每次3分钟；预冷的4%多聚甲醛溶液固定30分钟，磷酸盐缓冲液洗三次，每次3分钟；

(2)加入3%去离子水溶液室温孵育15分钟，磷酸盐缓冲液洗三次，每次3分钟；用0.3% TritonX-100溶液透化15分钟，磷酸盐缓冲液洗三次，每次3分钟；

(3)滴加封闭用的正常山羊血清工作液，37℃孵育15分钟，轻轻甩去血清，加入一抗上皮细胞角蛋白8抗体和上皮细胞角蛋白18抗体，4℃过夜；取出，室温下放置30分钟，磷酸盐缓冲液洗三次，每次3分钟；

(4)滴加生物素标记的二抗溶液，37℃孵育15分钟，磷酸盐缓冲液洗三次每次3分钟；

(5)滴加试剂盒中辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液，37℃孵育15分钟，滴加新鲜配制的二氨基联苯胺显色剂，显微镜下观察；

(6)自来水冲洗，苏木素复染，0.5%盐酸酒精分化，返蓝液返蓝；梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。

结果判定标准：上皮细胞角蛋白8抗体和上皮细胞角蛋白18抗体主要标记单层腺上皮，细胞膜、细胞质标记成棕黄色，早期胃腺癌细胞组的细胞核变大，正常胃粘膜细胞组细胞核较小，分别计数一个视野中的阳性细胞数，结果见附图1与图2。

3、细胞冻存

(1)冻存液的配制：DMEM高糖培养液7毫升，甘油 1毫升，小牛血清2毫升，配制成10毫升细胞冻存液；

(2)加入一定量配制好的冻存液，用吸管轻轻吹打混匀，用血细胞计数板计数，使细胞终浓度为5×10⁵每毫升~1×10⁷每毫升；

(3)分装：用移液管将其分装入无菌冻存管中，1.5毫升/管；

(4)封口：拧紧瓶口，封膜，标明细胞名称，冻存日期，冻存者姓名，装入冻存盒中，用棉花包裹；

(5)冻存步骤：4℃，30分钟；-20℃，2小时；最后移入-80℃超低温冰箱保存。

4、随机单链DNA文库的设计与合成

设计全长为90个核苷酸，中间为54个核苷酸随机序列，两端各为18个核苷酸的单链DNA文库，库容量大约为10¹⁶，序列如下：5’-TAGATTGCACTTACTATC-54N-ATTGAATAAGCTGGTATA-3’。N代表A或T或G或C，委托生工生物工程（上海）有限公司合成，合成量为2OD₂₆₀，合成后储存于-20℃备用。

5、上下游引物的设计与合成

参考文献合成以下4种引物，无任何二级结构形成，与核酸序列中已有的核酸序列无同源性。引物序列：

SEQ ID No.6  P1

5’-TAGATTGCACTTACTATC-3’ ；

P2       

5’-FAM-TAGATTGCACTTACTATC-3’；

P3       

5’- Bio-ATTGAATAAGCTGGTATA-3’；

SEQ ID No.7   P4

5’-ATTGAATAAGCTGGTATA-3’；

上序列中FAM：   巯基荧光素，Bio：    生物素。

以上4种引物合成量均为2OD₂₆₀，每OD₂₆₀加570微升的三蒸水配制成10微摩尔每升贮存液-20℃储存备用。

6、早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子的筛选——Cell-SELEX筛选过程

Cell-SELEX筛选过程是单链DNA文库与早期胃腺癌原代细胞孵育，经洗涤，沸水浴加热结合的单链DNA脱离靶细胞，然后与正常胃黏膜细胞结合做反筛，离心，取上清收集单链DNA次级文库。经聚合酶链式反应扩增，借助链霉亲和素磁珠分离单链DNA，用于下一轮筛选。

6.1早期胃腺癌原代细胞的复苏

(1) 从液氮罐中取出冻存管，迅速放入盛有37℃水的搪瓷罐中，轻轻摇动，使其在30秒~1分钟内完全融化；

(2) 取出冻存管，用75%酒精擦消毒后，移入无菌操作台内。用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加5~10 毫升磷酸盐缓冲液，吹打使细胞悬浮；

(3) 低速离心800~1000 转每分钟，5 分钟，弃上清后，收集细胞。

上述操作中操作人员应戴防护口罩及手套，防止冷冻管可能的爆裂而造成伤害。

6.2 早期胃腺癌原代细胞与单链DNA文库的结合

(1) 取1.5毫升离心管 ，加入400微升1×结合缓冲液，取10微升单链DNA文库储存液加入到结合缓冲液中，沸水浴变性5分钟，迅速放置于冰上10分钟； 加入13.5微升3%的牛血清白蛋白以降低非特异性吸附；

(2) 根据病人的个体差异，将确定为早期的胃腺癌原代细胞，按相同的量混合，取量为2×10^6个早期胃腺癌细胞与上述溶液混合，混匀，放置于37℃水浴锅中，30分钟；

(3) 将离心管中的溶液转移到另一1.5毫升离心管，以去除与离心管结合的单链DNA； 1000转每分钟，离心5分钟，弃上清液，沉淀中加入400微升洗涤缓冲液重悬细胞，再离心，重复此步骤4次，洗去未与细胞结合的单链DNA；

(4) 向上述沉淀中加入100微升洗脱缓冲液，混匀，洗脱结合到细胞上的单链DNA，1000转每分钟，离心5分钟，取上清于一离心管中； 取与上述上清等体积的酚：氯仿：异戊醇混合液加入到离心管中，颠倒混匀，10000转每分钟，4℃离心5分钟，取上层溶液于一离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇，混匀，10000转每分钟。4℃离心5分钟，取上层溶液于离心管中；

(5) 加入2倍体积的无水乙醇并加入1/10体积的3摩尔每升的醋酸钠溶液，混匀，放置于-20℃冰箱中30分钟；

(6) 取出离心管，14000转每分钟，4℃离心15分钟，弃上清液，加入70%的乙醇500~1000微升洗涤沉淀2次，将沉淀放置于超净工作台中，吹干，加入20微升 Tris-EDTA缓冲液，使单链DNA溶解，应用微量核酸蛋白分析仪测定浓度，储存于-20℃冰箱中，备用。

6.3 PCR扩增

(1) PCR反应体系

以上一步得到的单链DNA为模板，上游引物P1和下游生物素修饰的引物P3进行聚合酶链式反应扩增，得到一端带有生物素的双链DNA。扩增反应所用试剂参见表1.

   

 用漩涡振荡器混合均匀，离心样品，放于聚合酶链式反应仪中。

(2) 反应条件

根据聚合酶链式反应扩增条件优化结果，确定以单链DNA为模板时，最佳的循环次数为15次，退火温度为46℃，所以在细胞筛选的过程中，每一轮可以应用此条件进行聚合酶链式反应扩增。

聚合酶链式反应条件见表2：

(3)聚合酶链式反应扩增结束后，取8微升聚合酶链式反应用于3%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件是100伏，45分钟，电泳结束后，应用凝胶成像系统观察并拍照保存，结果见附图3。

6.4 SanPrep柱式聚合酶链式反应产物纯化试剂盒纯化PCR扩增产物

从琼脂糖凝胶电泳结果中可以看出，目的片段为90个碱基对的双链DNA条带较单一，可进行产物回收。使用SanPrep柱式聚合酶链式反应产物纯化试剂盒进行聚合酶链式反应产物回收。

6.5 生物素-链霉亲和素磁珠分离制备单链DNA次级文库

(1) 取一支磁珠，颠倒混匀， 取100微升磁珠悬浮液于1.5毫升离心管中；上磁力架约1~2分钟，待液体变的澄清，吸弃上清；取下离心管，加入200微升 0.5×SSC洗涤缓冲液，摇匀，洗涤磁珠；上磁力架1~2分钟，吸弃上清液；

(2) 取下离心管，加入200微升 1×结合缓冲液重悬磁珠，将生物素化的双链DNA加入到离心管中，混匀，37℃水浴锅中孵育30分钟；经孵育后，双链DNA标记的生物素与链霉亲和素磁珠结合，上磁力架1~2分钟，吸弃上清液，得到双链DNA-生物素-链霉亲和素磁珠复合物；

(3) 取下离心管，加入1×洗涤缓冲液，重悬沉淀洗涤；上磁力架1~2分钟，吸弃上清液；

加入150毫摩尔每升的氢氧化50微升，混匀，37℃水浴锅中反应20分钟，不断摇动，以使单链DNA能够从复合物中分离出来；

(4) 上磁力架1~2min，不带生物素的一条单链DNA链存在于上清液中，小心吸出上清液于1.5毫升的离心管中；加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3摩尔每升的错酸钠溶液，混匀，-20℃冰箱放置30分钟；4℃，14000转每分钟离心15分钟，吸弃上清；

(5) 加入500~1000微升 70%的乙醇洗涤沉淀，4℃ 14000转每分钟离心5分钟，吸弃上清，重复一次； 将离心管放置于超净工作台中，干燥沉淀，加入Tris-EDTA缓冲液20微升溶解沉淀，应用微量核酸蛋白分析仪测定溶液中次级单链DNA文库的量，以用于后续试验；

6.6 正常胃粘膜细胞进行反筛选

每进行一次以早期胃腺癌原代细胞为靶细胞的正筛选，就要进行以正常胃粘膜细胞为对照细胞的反筛选，以去除与正常胃粘膜原代细胞结合的单链DNA，从而去除非特异性的单链DNA。

(1) 取上一步得到的单链DNA次级文库与400微升结合缓冲液于1.5毫升离心管中混匀，沸水浴变性5分钟，立即放于冰上10分钟；

(2) 取1×10⁶个早期胃腺癌原代细胞，经磷酸盐缓冲液洗涤后，离心，去上清，沉淀与上述溶液混合孵育，37℃结合30分钟；

(3) 取出离心管，1000转每分钟，离心5分钟，取上清于一灭菌的离心管中，经乙醇沉淀，Tris-EDTA缓冲液溶解，用微量核酸蛋白分析仪测定浓度，用于下一轮筛选。

7 、检测每轮筛选得到的单链DNA文库与早期胃腺癌上皮细胞结合的荧光强度值及结合率

在cell-SELEX筛选的过程中，需要检测与早期胃腺癌细胞结合的单链DNA富集情况，利用荧光素标记单链DNA文库与早期胃腺癌原代细胞混合孵育，进而测定荧光强度，计算结合率，从而判断筛选的进度。

7.1 制备荧光素和生物素标记的双链DNA

以每轮筛选得到的单链DNA次级文库为模板，以上游荧光素标记的引物P2和下游生物素标记引物P3进行聚合酶链式反应扩增，从而得到目标链标记有荧光素，另一条链标记生物素的双链DNA。

(1) PCR反应体系见表3

 

漩涡震荡混匀后，离心，放入聚合酶链式反应扩增仪中。

(2) 聚合酶链式反应条件见表4：

(3) 聚合酶链式反应结束后，取聚合酶链式反应扩增产物8微升进行3%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统观察并拍照。

7.2 回收荧光素和生物素标记的双链DNA

聚合酶链式反应扩增结束后，利用酚：氯仿：异戊醇法进行回收：

(1) 将反应产物转移至1.5毫升离心管中，取与上述等体积的酚：氯仿：异戊醇混合液加入到离心管中，迅速反复颠倒混匀，10000转每分钟，4℃离心5分钟；

(2) 取上层溶液，加入等体积的氯仿：异戊醇，迅速反复颠倒混匀，10000转每分钟，4℃离心5分钟，取上层溶液；

(3) 向离心管加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3摩尔每升的醋酸钠溶液，混合均匀，放置于-20℃冰箱中30分钟；

(4) 取出离心管，14000转每分钟，4℃离心15分钟，弃上清液，加入70%的乙醇500~1000微升洗涤沉淀2次，将沉淀放置于超净工作台中，吹干，加入30~50微升 Tris-EDTA缓冲液，使双链DNA溶解，用微量核酸蛋白分析仪测定浓度备用。

7.3 链霉亲和素磁珠分离荧光素修饰的单链DNA

    如上6.5的分离步骤

7.4 荧光素标记的单链DNA与早期胃腺癌原代细胞结合结合率测定

(1) 取200皮摩尔荧光素修饰的单链DNA于一灭菌的1.5毫升离心管中，加入400微升结合缓冲液，利用荧光分光光度计测定总荧光强度。沸水浴变性5分钟，立即放置冰上10分钟，同时以不加细胞的结合缓冲液为对照组进行实验；

(2) 取1×10⁶个早期胃腺癌原代细胞与上述溶液混匀，37℃结合30分钟；

(3) 将上述溶液1000转每分钟离心5分钟，用洗涤缓冲液洗涤3次，加入pH 9.0的结合缓冲液，在495纳米波长处激发荧光，521纳米波长处发射荧光，测定各管的荧光强度，测3次，取平均值。

(4) 每一轮单链DNA库的结合率=管中荧光强度平均值/总荧光强度×100%，结果见附图4；

以上步骤为cell-SELEX的一轮筛选，重复此步骤，进行多轮筛选，将各轮荧光素标记的单链DNA与早期胃腺癌结合的荧光强度值及结合率以柱状图的形式表示出来，以确定筛选的次数。

在筛选的前几轮，单链DNA首次加入量不合适的话，可能会使筛选失败，要获得较多可与早期胃腺癌原代细胞结合的单链DNA，就要把单链DNA 的量和细胞的量加大。在后面的实验中，需要减少单链DNA和早期胃腺癌原代细胞的投入量，以使特异性的单链DNA能够被筛选出来，但单链DNA的量与早期胃腺癌原代细胞数的比例要提高，这样可使特异性的单链DNA能竞争结合在细胞膜表面的特异性物质上。同时在筛选的过程中，逐渐减少单链DNA与细胞的结合时间，这样可以使特异性弱的单链DNA被淘汰掉。每轮加入单链DNA的量、早期胃腺癌原代细胞数及结合时间如表5，

。

8、最后一轮筛选产物聚合酶链式反应扩增与纯化

将确定为最后一轮的单链DNA库，用引物P1和引物P4经聚合酶链式反应扩增成双链DNA，,然后利用聚合酶链式反应胶回收试剂盒进行回收。1-12轮筛选结果见附图五。

9、克隆与测序

9.1 目的片段与T载体的连接

最后一轮的单链DNA经过聚合酶链式反应之后，由于用了TaqDNA聚合酶，使得在扩增产物的3’端加上一个腺嘌呤(A)，这种腺嘌呤尾正好与pGEM-T载体末端胸腺嘧啶(T)配对，形成氢键，再用DNA连接酶将缝隙连接，就可以形成重组子。根据公式：插入目的片段量(ng)=目的片段与载体的摩尔比×加入载体的量(ng)×插入片段的大小(kb)/载体的大小(kb)。计算出回收的目的片段在不同的摩尔比例下所需的量，根据Promega公司提供的说明书及其他相关资料的介绍，按目的片段和载体的摩尔比3:1、6:1、10:1的比例在0.2毫升离心管中加入表6成分建立了3个反应体系进行连接反应，同时设立空白对照和阳性对照组，

小心混匀，低速离心，使样品集中，4℃冰箱过夜，次日存于-20℃冰箱备用。

9.2 感受态细胞制备

    (1) 将接种环在火焰上灼烧，冷却后挑选平板上DH5α的单个菌落，在倾斜的含3毫升Luria-Bertani液体培养基的试管中接种，在恒温摇床上37℃摇菌过夜； 取500微升培养的菌液转移到含有50毫升 LB液体培养基的锥形瓶中，37℃摇菌培养2~3小时，使菌液的OD₆₀₀达到0.5左右；

(2) 取50毫升的离心管，将菌液全部转移到离心管中，立即放置冰上10分钟；4℃，4000转每分钟离心10分钟，使细胞沉淀；倒出上清液倒扣在灭菌滤纸上1分钟，尽量流尽培养液；

(3) 加入10毫升 4℃预冷的0.1摩尔每升的CaCl₂溶液使菌体悬浮，立即放置冰上30分钟；4℃，4000转每分钟离心10分钟；倒出上清液，倒扣于灭菌的滤纸上1分钟，尽量流尽液体；加入2毫升 4℃预冷的0.1摩尔每升的CaC1₂溶液悬浮菌体；

(4) 迅速将悬液分装到1.5毫升离心管中，每200微升一管，冰浴过夜，以提高转化率，也可直接存放于-80℃冰箱。

9.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞转化率测定

(l) 取50纳克每微升的pGEM-T载体按1:50的比例稀释，使pGEM-T载体的浓度为1纳克每微升； 将冻存于冰箱中的感受态细胞取出融化，加入1微升稀释的载体，缓慢吹打混匀，冰浴放置30分钟；

(2) 将离心管放置于42℃水浴中热激90秒，迅速放冰上2分钟，此过程操作要轻柔快速； 加入的Luria-Bertani液体培养基，使离心管中培养基的体积为1000微升，37℃摇菌培养l小时；

(3) 将管中的转化反应用培养液按1:10稀释，取其中100微升稀释液加到含有适量氨苄青霉素的Luria-Bertani固体培养基的培养皿中，用火焰上灼烧的玻璃涂布器冷却后将转化菌均匀涂布在琼脂板表面；

(4) 将平板正放于细菌培养箱中30分钟，使培养液被吸收；将平板倒置，37℃培养过夜，用菌落计数器进行计数；

(5) 转化率的计算用细菌菌落的总数除以加入DNA的量，结果见附图6，本实验中用lng完整的DNA载体转化200μL的感受态细胞，向转化反应液中加入培养基至1000μL，则载体的浓度为0.001ng/μL，让细菌恢复一段时间(lh)。将转化反应用培养液按1:10的比例稀释，则载体的浓度为0.0001ng/μL，取其中100μL的稀释液来涂布(0.01ng DNA/100μL)。根据平板菌落计数可知，获得的克隆菌落为200个左右。

9.4 重组载体的转化及蓝白筛选

(1) 取3个灭菌的离心管，分别加入不同摩尔比的目的片段和载体的连接反应液5微升；

(2) 将冻存的感受态细胞置于冰浴中融化；取 200微升感受态细胞加入离心管中，缓慢混匀，冰浴30分钟；

(3) 将离心管放置于42℃水浴锅中，热激90秒，取出后冰浴2分钟，操作的过程中要轻柔；向各离心管加入灭菌的Luria-Bertani液体培养基至1000微升，37℃摇菌培养1小时；

    (4) 取100微升上述各管的培养液，分别涂布到含适量异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷/

5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷/氨苄青霉素的平板上；

(5) 先将平板正放于室温30分钟，使液体充分被吸收，再倒置于37℃培养箱中，培养过夜；取出培养皿在4℃放置4小时，使蓝色显现充分，选择白色菌落用于测序观察结果，结果见附图7、图8和图9。

本发明中重组体转化到大肠杆菌感受态细胞中，在含有IPTG/X-gal/Amp的平板上培养，在目的片段与载体的摩尔比为3:1，6:1，10:1的情况下，分别对培养的平板进行菌落计数，白色菌落数分别为：117，123，100 (图7、8、9)。

 重组体转入E.coli DH 5α感受态细胞后蓝白筛选结果(A:目的片段与载体的摩尔比3:1，B: 目的片段与载体的摩尔比6:1，C: 目的片段与载体的摩尔比10:1)。

9.5 测序

(1) 取出培养皿，按目的片段和载体的摩尔比，分别计数各培养皿中白色菌落的数目；

    (2) 选择白色菌落较多的培养皿，随机挑取26个白色菌落，接种于装有3毫升含有氨苄青霉素的Luria-Bertani液体培养基中，标记为C1~C26，37℃摇菌过夜；

(3) 分别吸取l毫升转化菌液加入1.5毫升离心管中，每管再加入30微升灭菌甘油，对应标记为C1~C26，混匀；

(4) 封膜后送生工生物(上海)股份有限公司采用载体的测序引物T7和SP6进行双向测序；

(5) 剩余菌液加入30微升灭菌甘油混匀后置-80℃冰箱冻存备用。测序结果见说明书附图7。

10、适配子一级结构同源性分析及二级结构预测

经过测序之后，选择长度正确，且没有双峰出现的序列测序结果应用于测定特异性和亲和力。例如C1适配子峰图见附图10。

将随机适配子序列，根据DNA稳定的自由能最低能量值，利用DNAMAN 7.0分析软件进行二级结构预测，部分二级结构预测见附图11。

11、 适配子特异性和亲和力分析

将储存在-80℃冰箱中的转化菌，经培养、质粒抽提、PCR扩增、纯化后，制备荧光素标记的单链DNA，测定其与早期胃腺癌细胞结合的特异性和亲和力。

11.1 特异性测定

(1) 取1.5毫升的离心管分别加入200皮摩尔的荧光素标记的22种适配子，加入400微升结合缓冲液，沸水浴5分钟，迅速放置于冰上10分钟；

(2) 分别将早期胃腺癌原代细胞、正常胃腺癌原代细胞、SGC-7901细胞和BGC-803细胞分别加入上述离心管中，混合均匀，37℃孵育20分钟，剩下的一管为空白对照，不加入任何细胞；

(3) 孵育结束后，放入离心机中，1000转每分钟，离心5分钟，去上清，加入洗涤缓冲液，洗涤3次，加入PH 9.0结合缓冲液，测定各管的荧光强度值，3次取平均值。特异性测定结果见表7。

为了得到各个适配子的特异性高低，利用SPSS 16.0软件对适配子配子与各细胞组结合后的荧光强度值进行单因素方差分析分析，得到两两比较的统计学意义P值，因统计结果中P值都小于0.01，可以判定各适配子与早期胃腺癌原代细胞结合的特异性都非常高，如表8，

。

 11.2适配子的亲和力分析

(1) 将各荧光素标记的适配子制备成不同的浓度，各取等体积的适配子加入400微升结合缓冲液，经沸水浴变性5分钟后，立即放于冰上10分钟；

(2) 加入1×10⁶个早期胃腺癌原代细胞，混合均匀，放置于37℃水浴锅中孵育20分钟；

(3) 放入离心机中，1000转每分钟，离心5分钟，去上清，加入洗涤缓冲液，洗涤3次；

(4) 加入PH 9.0结合缓冲液，吹打混匀，利用荧光分光光度测定各管的荧光强度值。按照以上方法做两组平行对照，测定荧光强度；

(5) 根据公式Y=Bmax×X/(Kd+X)，运用SigmaPlot 12.1软件，在非线性分析Regression Wizard公式类型中选择双曲线(Hyperbola)的类型，对数据进行分析，结合SPSS 16.0软件得出各适配子与胃腺癌原代细胞结合的平衡解离常数Kd值，见表9，

。

从表中可以得知，测定适配子与早期胃腺癌原代细胞结合的荧光强度，拟合各适配子与早期胃腺癌原代细胞的结合曲线，得到解离常数K_d值，此值达到了nmol/L的水平。由于解离常数Kd值越大，亲和力越小的原则可知，C1、C7、C12、C20、C26号适配子的亲和力较高，C25号的亲和力最低。

最终从所得到的适配子中筛选出特异性最佳的五个适配子，它们是：

1）SEQ  ID  No.1，即C1：

TAGATTGCACTTACTATCTCGGGGCCGGGTGTGTGGTTCTGGTTCGTGCCTGTCGTCCGCGTGTGGCTGGTAATTGAATAAGCTGGTATA；

2）          SEQ  ID  No.2，即C7：

TAGATTGCACTTACTATCTCCACCAGCAGTACGAGCGCCGCACCTGACACCACGCACCTCGCCATCCCCGTAATTGAATAAGCTGGTATA

3）          SEQ  ID  No.3，即C12：

TAGATTGCACTTACTATCTACCACACCACACGACACGACCGCACCGCCCGAGCAAGCCTAACACCGCCCGGAATTGAATAAGCTGGTATA；

4）          SEQ  ID  No.4，即C20：

TAGATTGCACTTACTATCTCACCACGCAGGCCAGACGGAGACGACGCAACCATAACACACAGGCCACCCGTAATTGAATAAGCTGGTATA；

5）          SEQ  ID  No.5，即C26：

TAGATTGCACTTACTATCTACGCACCAAACCCACGACCGCGCAGAGACCACCACACCCACGAGGCGCCTGTAATTGAATAAGCTGGTATA。

 

<110>  兰州大学

<120>  早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子及制备方法

<160>  序列表中序列的个数 （如18） （注：CN1至CN8的基因序列与其氨基酸序列）

 

<210>  1

<211>  90

<212>  DNA

<213>  第一种早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子 C1

<400>

tagattgcac ttactatctc ggggccgggt gtgtggttct ggttcgtgcc tgtcgtccgc      60

 

gtgtggctgg taattgaata agctggtata                                90

 

<210>  2

<211>  90

<212>  DNA

<213>  第二种早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子C7

<400>    

tagattgcac ttactatctc caccagcagt acgagcgccg cacctgacac cacgcacctc      60

 

gccatccccg taattgaata agctggtata                                  90

 

<210>  3

<211>  90

<212>  DNA

<213>  第三种早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子C12

<400> 

tagattgcac ttactatcta ccacaccaca cgacacgacc gcaccgcccg agcaagccta      60

 

acaccgcccg gaattgaata agctggtata                                 90

 

<210>  4

<211>  90

<212>  DNA

<213>  第四种早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子C20

<400>

tagattgcac ttactatctc accacgcagg ccagacggag acgacgcaac cataacacac      60

 

aggccacccg taattgaata agctggtata                                  90

 

<210>  5

<211>  90

<212>  DNA

<213>  第五种早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子C26

<400> 

tagattgcac ttactatcta cgcaccaaac ccacgaccgc gcagagacca ccacacccac      60

 

gaggcgcctg taattgaata agctggtata                                  90

 

<210>  6

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列P1

<400> 

tagattgcac ttactatc                                                    18

 

<210>  7

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列P4

<400> 

attgaataag ctggtata                                                    18

Claims (9)

1.一种早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子，其特征在于基因序列为SEQ ID No.1。

2.一种早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子，其特征在于基因序列为SEQ ID No.2。

3.一种早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子，其特征在于基因序列为SEQ ID No.3。

4.一种早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子，其特征在于基因序列为SEQ ID No.4。

5.一种早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子，其特征在于基因序列为SEQ ID No.5。

6.权利要求1至5所述的早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子制备方法，其特征在于提取多例早期胃腺癌原代细胞，经纯化后等体积混合，得到消除个体差异性的混合细胞液，再通过生物素-链酶亲和素磁珠分离单链DNA方法得到早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子。

7.权利要求1至5所述的早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子在早期胃腺癌检查中的应用。

8.权利要求1至5所述的早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子在制备早期胃腺癌检测试剂中的应用。

9.权利要求1至5所述的早期胃腺癌原代细胞单链DNA适配子在制备治疗胃腺癌药物中的应用。