CN103320445A - 特异性识别胃癌细胞的dna适配子gca-5及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体是一种特异性识别胃癌细胞的DNA适配子GCA-5及其应用，DNA适配子GCA-5的核苷酸序列为SEQIDNO.1，经荧光类物质或酶类物质修饰后的GCA-5在识别胃癌细胞方面的应用，包括用于临床胃癌组织标本的辅助诊断、胃癌分子靶向诊断、胃癌生物导向治疗，基础研究中胃癌细胞的分离、纯化和鉴定，以及胃癌肿瘤标志物的识别和鉴定。

Description

特异性识别胃癌细胞的DNA适配子GCA-5及其应用

技术领域

    本发明涉及基因工程领域,具体是一种特异性识别胃癌细胞的DNA寡核苷酸适配子GCA-5的序列和修饰，以及修饰后的GCA-5在识别胃癌细胞方面的应用，包括用于临床胃癌组织标本的辅助诊断、胃癌分子靶向诊断、胃癌生物导向治疗，基础研究中胃癌细胞的分离、纯化和鉴定，以及胃癌肿瘤标志物的识别和鉴定。

背景技术

已证实，胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，严重威胁人类生命健康。尽管早期胃癌的治疗效果较好，但诊断率低；由于胃癌早期的临床表现缺乏特异性，多数胃癌患者确诊时已属进展期，手术及放化疗效果都不理想。可见，胃癌的预后主要依赖于分期，其诊断和治疗的重点是早期。目前，早期胃癌诊治的主要手段（金标准）仍然是内镜活检和内镜粘膜下切除术（Yada T,et al.Diagn Ther Endosc 2013;2013:241320）。然而，这需要特殊的仪器设备、较高的费用和施术者的经验积累，患者的耐受性和依从性也难以保证，因而仍然面临普及难和不易实现早发现、早诊断的问题。因此，更可靠、更方便、更廉价和更容易普及的胃癌诊治手段亟待发现和制备应用。

近年来，众多的高通量生物技术方法不断涌现，其中细胞-SELEX技术可筛选特异性结合于细胞的核酸适配子，这为肿瘤的早期诊断和治疗提供了新的可能。SELEX是指数富集的配基系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）的英文缩写，利用该技术通过多次反复的扩增和筛选循环，可以从随机单链DNA或RNA库中获取特异性结合于靶物质的核酸序列，称为适体（aptamer）或适配子；适配子具有精确识别、高特异性、高亲和力结合靶标等特性，且容易在体外合成和修饰、理化性质稳定、费用低廉、获取周期短等优势。随着SELEX技术本身的不断发展以及靶标范围的不断拓展，近年出现了以活细胞为靶标进行的SELEX筛选，即细胞-SELEX（cell-SELEX或cell-based SELEX）技术（徐发良,等.第二军医大学学报2012;33:432-435）。通过细胞-SELEX筛选而获得的适配子，可用于肿瘤细胞的富集与检测、肿瘤诊断、靶向治疗和肿瘤标志物研究（Fang X, et al. Acc Chem Res 2010;43:48-57）。我们利用细胞-SELEX的筛选原理和实验方法（Sefah K, et al. Nat Protoc 2010;5:1169-1185），以胃癌细胞株为阳性筛选细胞、以正常胃粘膜细胞为对照细胞，建立了筛选肿瘤细胞DNA适配子的方法；该技术的一个显著优势在于，研究者无须事先明确肿瘤细胞特定的靶分子，就可以筛选出特异性结合于肿瘤细胞的适配子。借助蛋白质组学的技术，可对适配子结合的靶标进行分离、鉴定，进而成为潜在的肿瘤标志物。

 

发明内容

本发明的目的是提出特异性识别胃癌细胞的DNA适配子GCA-5, 以及修饰后的GCA-5在识别胃癌细胞方面的应用，包括用于临床胃癌组织标本的辅助诊断、胃癌靶向诊断、基础研究中胃癌细胞的分离、纯化、鉴定和胃癌的生物导向治疗。

本发明是结合了国内外的研究进展以及发明人自身的工作积累，以胃癌细胞株为靶标、以正常胃粘膜为消减靶标，通过成功建立细胞-SELEX技术筛选到一个适配子GCA-5（gastric cancer aptamer）。经鉴定，GCA-5能特异性识别并结合胃癌细胞株，而不与正常胃粘膜细胞及结肠癌细胞株结合；尤其重要的是，GCA-5也能特异性识别并结合来自临床胃癌手术标本的癌细胞；而对照核酸序列与上述细胞均无结合。这对于胃癌的临床辅助诊断、分子靶向诊断和生物导向治疗中所需试剂盒和药物的制备具有重要意义。由于经过FITC或TAMRA标记的GCA-5可以直接用于荧光方法检测肿瘤细胞，其操作比传统的免疫学方法更简单。另外，GCA-5可能通过特定的靶标分子结合于胃癌细胞，从而在胃癌细胞的分离、纯化和鉴定，以及胃癌肿瘤标志物的鉴定方面得到应用。因此，本发明可以在临床医学和基础医学中得到广泛应用。

为实现本发明目的而采用的技术方案是这样的，一种特异性识别胃癌细胞的DNA适配子GCA-5的核苷酸序列为:SEQ  ID  NO.1。

进一步可以再在所述核苷酸序列SEQ ID NO.1的5’端标记荧光素（如FITC、TAMRA等）或酶类物质(生物素和地高辛)等，并通过荧光检测设备、链亲和素标记的辣根过氧化物酶检测系统和抗地高辛抗体标记的碱性磷酸酶检测系统，对胃癌细胞进行示踪、定位和检测。

上述核苷酸在制备靶向定位胃癌细胞的试剂盒中的应用。

上述核苷酸在制备靶向杀灭胃癌细胞的药物中的应用。

上述核苷酸在制备胃癌细胞体外识别、分离和鉴定的试剂盒中的应用。

上述核苷酸在制备分离或鉴定胃癌生物标记物的试剂盒中的应用。

本发明能够获得的有益技术效果包括：1）与功能类似的蛋白类抗体相比，单链DNA理化性质更加稳点；适配子体外合成的成本比抗体制备的成本低、周期短；适配子可直接在体外合成、修饰标记、批量生产，操作更简便、迅速。

2）GCA-5能特异性识别胃癌细胞株和胃癌手术标本的细胞，因此在胃癌的临床辅助诊断、分子靶向诊断和生物导向治疗药物的制备方面具有重要价值。

3）本发明证实GCA-5能特异性识别并结合胃癌细胞株和胃癌手术标本，从而在胃癌细胞的分离、纯化和鉴定，以及胃癌肿瘤标志物的鉴定方面具有广泛的应用价值和广阔的市场前景。

附图说明

图1为适配子GCA-5高亲和力结合胃癌细胞株和手术标本结果图；

图2 为激光共聚焦分析FITC-GCA-5特异性识别胃癌细胞结果图，图中A表示正常人胃粘膜GES-1株，B表示人结肠癌细胞株Lovo，C表示人胃癌细胞株SGC-7901，D临床胃癌标本细胞悬液。 

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明范围内。

1. 以胃癌细胞株为靶标、以正常胃粘膜为消减靶标，通过细胞-SELEX技术筛选到一个适配子GCA-5。采用精确比对法，在NCBI网站提供的Blastn程序比对人、小鼠的编码核酸数据库和其他非编码数据库，均未发现与GCA-5相似的核酸序列。

2.人工合成GCA-5及其对照序列RCA，均在5'端标记FITC（用于流式细胞检测）或TAMRA（用于激光共聚焦），由上海生功公司完成：

FITC-GCA-5或TAMRA-GCA-5：

SEQ ID NO.1：5'- ataccagctt attcaattgc acccataaca aggcacacgt ggaaggtctt ttgtacttct tttcaaatgg  agatagtaag  tgcaatct-3'

3.胃癌标本单细胞悬液的制作：

1)    取胃癌新鲜手术标本，用无菌PBS冲洗；

2)    用无菌剪刀剪成糊状；

3)    200目铜网过滤，1000r/min离心5min以沉淀细胞，弃上清后用Hanks液漂洗；

4)    用台盼蓝染色法计数活细胞比例大于90%；

5)    用含10%FBS的培养基重悬细胞；

6)    调整细胞浓度为2×10⁵/ml。

4.细胞样品制备、FCM检测：

1)  FITC标记的GCA-5或RCA与2×10⁵的正常胃粘膜细胞GES-1、结肠癌细胞Lovo、胃癌细胞SGC-7901、临床胃癌标本细胞悬液共孵育于200ul含20%FBS的结合液；

2)  冰上放置50min令其结合；

3)  以0.7ml结合液(含0.1%的NaN₃)洗涤两次；

4)  以0.4ml结合液(含0.1%的NaN₃)重悬；

5)  上FCM计数30000个细胞的平均荧光强度；

6)  以FITC标记的RCA作为背景荧光，计算相对亲和力。

5.细胞爬片，孵育、结合、共聚焦流图：

1)    分别培养正常胃粘膜细胞GES-1、结肠癌细胞Lovo、胃癌细胞SGC-7901、临床胃癌标本细胞悬液，调整浓度为2×10⁵/ml，接种于预先放置了盖玻片的6孔板，爬片过夜；甲醛-20℃固定2小时，PBS冲洗。

2)    取50 pmol的TAMRA标记的GCA-5，与靶细胞结合于100ul含20%FBS的结合液；

3)    冰上放置50min令其结合；

4)    以0.7ml结合液(含0.1%的NaN3)洗涤两次；

5)    以0.4ml结合液(含0.1%的NaN3)重悬；

6)    激光共聚焦显微观察与靶细胞结合的情况（在细胞的定位、数量）、留图。

实验结果：

GCA-5特异性结合于胃癌细胞株SGC-7901和临床胃癌细胞的表面，但不与正常胃粘膜细胞GES-1或结肠癌细胞株Lovo结合，从而对胃癌细胞具有选择性识别作用。

由表1和图1可以得到结论：GCA-5与胃癌细胞株SGC-7901或临床胃癌标本的细胞高亲和力结合，但与正常胃粘膜细胞GES-1或结肠癌细胞Lovo的亲和力较低。对照序列RCA和四种细胞结合的亲和力均较低。

由图2可以得到结论：GCA-5特异性结合于胃癌细胞株SGC-7901或临床胃癌标本的细胞表面；但与正常胃粘膜细胞GES-1或结肠癌细胞Lovo几乎无结合，由图中A、B、C和D所示。

序列的功能和应用： 

该序列的基本功能：能高亲和力、特异性结合于胃癌细胞的表面。推定的应用领域主要包括：示踪、研究、靶向诊断；靶向治疗；其他识别和靶向应用领域。

在示踪技术方面，用放射性物质、荧光素或酶类等示踪剂标记该DNA核苷酸，利用其特异性识别功能，通过相应的检测手段即可进行定位甚至定性显示胃癌细胞的存在，从而应用于实验研究、肿瘤靶向诊断、定位诊断或大量筛查。

在制备靶向治疗药物方面，将放射性治疗药物、细胞毒性药物等杀肿瘤的药物与该DNA核苷酸偶联，利用其特异性识别功能，就可以达到靶向杀灭肿瘤细胞的作用。

在其他涉及到肿瘤特异性识别和靶向作用的应用领域，也可采用该DNA寡核苷酸代替相应的抗体，达到更好的特异性识别和靶向作用的效果。

表1平均荧光强度（FITC-GCA-5高亲和力结合胃癌细胞）；*P<0.05

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  重庆市肿瘤研究所

<120>  特异性识别胃癌细胞的DNA适配子GCA-5及其应用

<160>  1    

 

<210>  1

<211>  88

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

 

<400> SEQ ID NO.1

ataccagctt attcaattgc acccataaca aggcacacgt ggaaggtctt ttgtacttct       60

tttcaaatgg agatagtaag tgcaatct                                                88

 

 

Claims (7)

1.一种特异性识别胃癌细胞的DNA适配子GCA-5,其特征在于:所述适配子的核苷酸序列为:SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述的特异性识别胃癌细胞的DNA适配子GCA-5，其特征在于：在所述核苷酸序列SEQ ID NO.1的5’端标记荧光类物质或酶类物质。

3.根据权利要求2所述的特异性识别胃癌细胞的DNA适配子GCA-5，其特征在于：所述荧光类物质为FITC或者TAMRA。

4.权利要求1或2或3所述核苷酸在制备靶向定位胃癌细胞的试剂盒中的应用。

5.权利要求1或2或3所述核苷酸在制备靶向杀灭胃癌细胞的药物中的应用。

6.权利要求1或2或3所述核苷酸在制备胃癌细胞体外识别、分离和鉴定的试剂盒中的应用。

7.权利要求1或2或3所述核苷酸在制备分离或鉴定胃癌生物标记物的试剂盒中的应用。

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