CN108872438B - 一种外泌体中肺癌标志物gk5快速检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种外泌体中肺癌标志物GK5快速检测试剂盒，属于试剂盒技术领域。该试剂盒含有外泌体原位捕获孔板，所述的外泌体原位捕获孔板中每孔含有荧光素标记的分子信标，所述的分子信标为靶向肿瘤标志物GK5 mRNA的特异性DNA探针。本发明的试剂盒运用了外泌体原位捕获孔板技术，检测肺癌患者体液样品中外泌体所包含的，肿瘤标志物GK5 mRNA，可用于医学临床肺部肿瘤的早期诊断。该技术是基于外泌体检测的第三代液体活检技术，具有无创或微创、超高灵敏度、快速且特异等优点，适用于医学临床肺部肿瘤的分子诊断和流行病学调查。
Description
技术领域
本发明属于试剂盒技术领域，具体涉及一种外泌体中肺癌标志物GK5快速检测试剂盒。
背景技术
液体活检可通过无创或微创的取样方式获得疾病信息，是“精准医疗”代表性的诊断技术，其检测对象主要为外周血中的循环肿瘤细胞(CTC)、循环游离DNA(cfDNA)和外泌体(exosome)。本质上，液体活检是分子诊断在样本来源上的延伸，是分子诊断市场容量的扩容，是实现为患者做出更好诊断服务的切入点。外泌体因其含量丰富，内含物来源特异、稳定等特性，逐渐成为液体活检领域的新宠，成为分子诊断学应用的重要开发方向。
外泌体(exosome)，是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，直径大约30‐150nm，具有脂质双层膜结构，能很好地保护其包被的物质。这种微小膜泡中含有宿主细胞来源的特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞，是细胞之间通讯的重要媒介，可使受体细胞发生多种生物功能的改变。据报道，这种外逸性介导的细胞间通讯影响了癌症的几个特征，包括调节免疫反应、重编程基质细胞、重建细胞外基质结构，甚至赋予癌细胞耐药特性。不同细胞分泌的外泌体组份和含量不同，选择性地将特定的致癌分子装入外泌体中，通过在肿瘤和远端微环境的不同细胞之间转移生物活性分子参与癌症进展和转移，使外泌体成为潜在的诊断生物标志物和治疗靶点。此外，在临床前和临床试验中基于外源体的药物传递策略已经被证明可以显著地抑制癌症的发展。
外泌体原位捕获孔板技术是一种全新的外泌体原位捕捉与检测技术，尤以检测外泌体中的mRNA和microRNA见长。其以镀金生物膜玻璃为载体，涂附上一层包裹有特异识别疾病相关microRNA或mRNA靶标的分子信标(自行设计)的阳离子脂质纳米颗粒，其与外泌体融合后，分子信标与靶标结合而产生荧光信号，被全内反射荧光显微镜(TIRF)检测，信号强弱和相应靶标含量成正比，从而判断病程或锁定病原体。由于TIRF成像具有超微，对荧光信号超敏感的特性，使得外泌体捕获孔板结合TIRF成像技术，可以实现对外泌体这种纳米级囊泡的直接成像及其内含物的半定量检测。外泌体捕获孔板可制作成24、48、96、384孔多种规格，每孔可包被单一或3种荧光素标记的分子信标，将多个肿瘤标志物基因检测通道集成在一张芯片上，以利于临床高通量筛选，省时省力省成本，这对于临床中常见的肿瘤相关基因快速诊断来说，无疑是个巨大的优势。
肺部肿瘤即生长在肺部的肿瘤，主要分为良性肿瘤和恶性肿瘤，肺癌是起源于上皮细胞的恶性肿瘤。近年，肺癌的发病率呈迅速上升趋势，已成为人类肿瘤致死首位病因。肺癌主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两类，小细胞肺癌约占肺癌的20％，恶性程度高，倍增时间短，转移早而广泛，对化疗、放疗敏感，初治缓解率高，但极易发生继发性耐药，容易复发。非小细胞肺癌则占肺癌总数的80％，是最为常见的肺癌。它主要包括腺癌、鳞状细胞癌即肺鳞癌、大细胞未分化癌三类，其对于传统放化疗敏感性较差。肺癌的早期诊断具有重要意义，只有在病变早期得到诊断、早期治疗，才能获得较好的疗效。肺癌的早期诊断可以通过拍摄胸部X线片来了解肺内的异常情况。此外还可进行血液常规检查以及痰液找病理细胞等相关化验帮助诊断，并进行一系列深入的检查，包括支气管镜、纵隔镜、肺组织活检以及胸腔镜等。然而，这些方法特异性和灵敏度均较低，倘若能在患者的体液样品中检测到肿瘤细胞来源的特异性核酸，那么对于肺癌的早期诊断将起到积极作用。由于外泌体在各种体液样品中大量存在，且其中富含肿瘤细胞来源的特异性核酸，因此可以通过分离外泌体，运用高度灵敏的外泌体捕获孔板检测技术加以鉴定。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种外泌体中肺癌标志物GK5快速检测试剂盒的技术方案。
所述的一种外泌体中肺癌标志物GK5快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有外泌体原位捕获孔板，所述的外泌体原位捕获孔板中每孔含有荧光素标记的分子信标，所述的分子信标为靶向肿瘤标志物GK5mRNA的特异性DNA探针。
所述的一种外泌体中肺癌标志物GK5快速检测试剂盒，其特征在于所述的特异性DNA探针的5’端茎和环与靶基因完全互补，3’端茎与5’端茎部分互补，5’端和3’端分别用荧光基团和淬灭基团修饰，环上部分碱基用锁核酸修饰。
所述的一种外泌体中肺癌标志物GK5快速检测试剂盒，其特征在于所述的特异性DNA探针具有如SEQ ID No.1～23所示核苷酸序列的探针。
所述的一种外泌体中肺癌标志物GK5快速检测试剂盒，其特征在于所述的特异性DNA探针由阳离子脂质复合纳米颗粒包裹。
所述的一种外泌体中肺癌标志物GK5快速检测试剂盒，其特征在于还包括外泌体分离试剂、外泌体纯化试剂、外泌体纯化色谱柱、阴性对照品、阳性对照品、蛋白酶K和1×PBS。
所述的靶向肿瘤标志物GK5mRNA的特异性DNA探针在制备肺部肿瘤筛查用试剂中的应用。
所述的应用，其特征所述的肺部肿瘤包括小细胞肺部肿瘤和非小细胞肺部肿瘤。
所述的应用，其特征在于所述的特异性DNA探针的5’端茎和环与靶基因完全互补，3’端茎与5’端茎部分互补，5’端和3’端分别用荧光基团和淬灭基团修饰，环上部分碱基用锁核酸修饰。
所述的应用，其特征在于所述的特异性DNA探针具有如SEQ ID No.1～23所示核苷酸序列的探针。
本发明的试剂盒运用了外泌体原位捕获孔板技术，检测肺癌患者体液样品中外泌体所包含的，肿瘤标志物GK5mRNA，可用于医学临床肺部肿瘤的早期诊断。该技术是基于外泌体检测的第三代液体活检技术，具有无创或微创、超高灵敏度、快速且特异等优点，适用于医学临床肺部肿瘤的分子诊断和流行病学调查。
附图说明
图1为实施例2中的检测结果图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例1：特异性分子信标设计
设计检测靶基因的特异性分子信标，对于外泌体捕获孔板检测特异性核酸至关重要。为此，结合靶向基因的特征，申请人设计了特殊茎环结构的分子信标，5’端茎和环与靶基因完全互补，3’端茎与5’端茎部分互补，5’端和3’端分别用荧光基团和淬灭基团修饰，环上部分碱基用锁核酸修饰，特异性分子信标具体序列如表1所示。
本发明设计的特异性分子信标最大程度地提高了分子信标与靶基因结合的特异性，同时降低了反应的背景荧光强度。分子信标合成后，为了验证其与相应靶基因结合的特异性和最佳工作温度，我们设计了如下表2，根据最高信噪比选取最佳分子信标及其工作温度。
表1
表2
*采用荧光读板机读取其荧光强度。**采用TIRF显微镜检测其荧光强度。
实施例2：检测试验
一、外泌体分离
1、取200ul血清样品，室温12000×g离心30min，去除细胞和碎片；
2、转移上清至一新的EP管中，加入100ul外泌体沉淀试剂；
3、混匀，4℃孵育30min；
4、室温10,000×g离心10min；
5、吸弃上清，取100ul 1×PBS重悬富含外泌体的沉淀物，4℃静置备用。
二、外泌体色谱柱纯化
1、平衡色谱柱：加100ul平衡液，9000×g离心1min；
2、上样：将100ul重悬液上柱，9000×g离心1min；
3、洗脱：加50ul洗脱液，9000×g离心3min。
三、外泌体捕获孔板检测
1、取出孔板(该孔板中每孔可包被1‐3种荧光素标记的表1所示的分子信标，该分子信标由阳离子脂质复合纳米颗粒包裹)，将纯化后的外泌体洗脱液加入样品孔中；
2、将试剂盒中的阴、阳性对照品(阴、阳性对照品是用阴离子纳米颗粒分别包裹的线虫基因片段和靶基因片段)加入后续样品孔中；
3、孵育1小时；
4、室温平衡5min后，用TIRF显微镜采集荧光图片；
5、用DXimageV1软件分析图片，自动设置cut‐off值，自动判读待测样品结果。
四、检测结果
如图1所示，试验中，外泌体捕获孔板在TIRF显微镜下成像后，肺癌组荧光亮点数量和总的荧光强度都明显高于健康对照组，说明具有代表性的两例非小细胞肺癌患者的血浆外泌体中GK5mRNA的表达量，显著高于健康组。因此，肺癌患者体液样品中外泌体所包含的肿瘤标志物GK5mRNA特异性核酸片段，可用于医学临床肺部肿瘤的早期诊断。
序列表
<110> 杭州迪相实业有限公司
<120> 一种外泌体中肺癌标志物GK5快速检测试剂盒
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Claims (4)
1.一种外泌体中肺癌标志物GK5快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有外泌体原位捕获孔板，所述的外泌体原位捕获孔板中每孔含有荧光素标记的分子信标，所述的分子信标为靶向肿瘤标志物GK5 mRNA的特异性DNA探针，所述的特异性DNA探针的5’端茎和环与靶基因完全互补，3’端茎与5’端茎部分互补，5’端和3’端分别用荧光基团和淬灭基团修饰，环上部分碱基用锁核酸修饰，所述的特异性DNA探针具有如SEQ ID No.1～23所示核苷酸序列的探针。
2.如权利要求1所述的一种外泌体中肺癌标志物GK5快速检测试剂盒，其特征在于所述的特异性DNA探针由阳离子脂质复合纳米颗粒包裹。
3.如权利要求1所述的一种外泌体中肺癌标志物GK5快速检测试剂盒，其特征在于还包括外泌体分离试剂、外泌体纯化试剂、外泌体纯化色谱柱、阴性对照品、阳性对照品、蛋白酶K和1 × PBS。
4.血浆外泌体中靶向肿瘤标志物GK5 mRNA的特异性DNA探针在制备非小细胞肺癌筛查用试剂中的应用，所述的特异性DNA探针的5’端茎和环与靶基因完全互补，3’端茎与5’端茎部分互补，5’端和3’端分别用荧光基团和淬灭基团修饰，环上部分碱基用锁核酸修饰，所述的特异性DNA探针具有如SEQ ID No.1～23所示核苷酸序列的探针。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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