KR20210094969A

KR20210094969A - 암세포 특이적 아데노바이러스

Info

Publication number: KR20210094969A
Application number: KR1020200008900A
Authority: KR
Inventors: 박종만
Original assignee: 주식회사 코어파마
Priority date: 2020-01-22
Filing date: 2020-01-22
Publication date: 2021-07-30

Abstract

본 발명은 암세포를 특이적으로 감염시켜 형광을 나타내고, 암세포를 사멸시키지 않아 암세포의 분리 및 배양이 가능한 아데노 바이러스에 관한 것으로, 본 발명의 아데노 바이러스는 E1을 결실시켜도 침투를 잘하고, 혈액 내에서 암세포만 특이적으로 감염시켜 형광 발현하며, 종래의 암 특이적 아데노 바이러스가 암세포를 사멸하는 것과 달리, 순환종양세포를 사멸시키지 않고, 분리 후에도 배양이 가능한 효과가 있으므로, 이를 이용하여 암세포 검출, 순환종양세포의 분리 및 배양하고 원발성 암을 진단하며 개인별 특이적으로 효과적인 항암제를 선정할 수 있는 효과가 있다.

Description

암세포 특이적 아데노바이러스{CANCER CELL SPECIFIC ADENOVIRUS}

본 발명은 암세포를 특이적으로 감염시켜 형광을 나타내고, 암세포를 사멸시키지 않아 암세포의 분리 및 배양이 가능한 아데노 바이러스에 관한 것이다.

아데노바이러스 게놈은 약 36 kb 크기의 선형 이중가닥 DNA이며, 특히 각 말단은 역 반복 서열 (ITR)를 포함하며, 캡시드화 서열 (psi : Ψ), 초기 유전자 및 말기 유전자로 구성되어 있다. 초기 유전자는 E1, E2, E3 및 E4 영역에 포함되어 있으며, 특히 아데노바이러스의 E1 유전자는 표적 세포에 감염 후, 가장 먼저 발현되는 유전자로서 두 개의 전사단위, 즉 E1A 및 E1B로 구성되어 있다. E1A 유전자에 의해 발현되는 단백질은 감염된 세포 내에서 세포 주기를 활발히 진행시키며 E1B 유전자 및 다른 초기 유전자들의 전사를 촉진시켜 바이러스의 복제 및 생장을 조절한다. 그러나, 아데노바이러스에 의해 감염된 세포 내에서는 이를 저지시키기 위한 방어 기작으로 세포 주기의 과도 진행을 억제시키거나 세포 고사를 유발시킨다 (Shenk, T. Adenviridae: the viruses and their replication 3rd ed. New York: Lippincott-Raven 2111-2148(1996) 및 Shenk, T. et al. Adv Cancer Res 57:47-85(1991)). 한편, E1B 유전자는 E1B 19 kDa 단백질 및 E1B 55 kDa 단백질을 코딩한다. 이들 중 E1B 19 kDa 단백질은 E1A 단백질에 의해 유도되는 세포 고사를 억제하는 역할을 하며, Bcl-2와 염기 서열 및 그 기능이 유사하다 (Imazu, T. et al. Oncogene 18:4523-4529(1999)). 그리고, E1B 55 kDa 단백질은 p53 단백질과 결합하여 p53 단백질에 의해 유발되는 세포 고사 및 여러 기작을 억제하며, 아데노바이러스의 mRNA들을 세포질로 이동시켜 단백질 합성을 촉진하는 기능을 한다 (Babiss, L. et al. Mol Cell Biol 5:2552-2558(1985) 및 Leppard, K. et al. EMBO J 8:2329-2336(1989)).

개인들을 특정 질병이나 특정 치료에 대한 반응에 관하여 각 환자의 개별적 특성에 맞춘 의료 치료를 제공하는 것을 맞춤의학이라고 한다. 근대의학에서는 같은 질병의 경우 개개인의 유전형질과 무관하게 같은 의약을 확립된 투여용량 범위 내에서 처방하는 획일적 치료를 해왔었다. 하지만 최근 각종 유전체 프로젝트를 통하여 인체의 질환을 유전자 수준에서 이해할 수 있는 기반이 조성되었으며, 이에 따라 유전적 환경이 다른 환자 개개인에 맞추어 보편적 치료가 아닌 개개인의 유전형질과 각각의 약물반응을 비교해보면서 개인 맞춤형 질병 진단, 치료, 예방하는 맞춤 의학의 시대가 도래하고 있다. 다만, 종래에는 신체에 천공(구멍)을 내서 생체조직(특히 암 조직과 같은 질병 조직)을 수집하는 침생검병리조직검사(invasive tissue biopsy)를 이용하여 생체조직 수집할 수밖에 없었다. 이는 고가의 방법임은 물론, 환자 신체 내에 침습 기구가 침습해야 하는 점에서 환자가 채집과정에서 고통스러움은 물론, 암세포의 경우에는 골수 내 암세포를 수집할 필요가 있어서 침습 과정이 환자에게 위험할 수도 있다는 단점이 있었다. 그러나 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)를 수집하는 경우에 단순히 환자의 혈액만 채취하면 되므로 침습 기구가 환자의 신체 내에 침습하지 않아 간편하고, 안전하다. 나아가, 혈액을 채취하는 것은 단시간 내에 가능하므로 시간도 절약되어 항암제 반응의 결과에 기초하여 개개인에게 맞는 항암제 선별하는 전체 과정의 시간이 단축되어 경제적인 측면 또한 존재한다.

최근 분자생물학의 발전으로 유전자 수준에서의 암을 비롯한 여러 가지 난치성 질환들의 원인이 규명되었고, 이를 질병의 치료에 응용한 유전자 치료 (gene therapy)가 새로운 치료 분야로 발전되고 있다. 예를 들어, 1990년, 레트로바이러스 시스템을 이용한 첫 유전자 치료 임상시험이 ADA (adenosine deaminase) 결핍증 환자를 대상으로 시행된 후 유전자 치료에 대한 연구가 활발해 졌으며 아데노바이러스, 아데노부속바이러스 및 리포좀과 같은 유전자 전달체를 이용한 유전자 치료가 새로운 치료분야로 각광받고 있다. 이 중 아데노바이러스는 기존의 다른 전달체 시스템에 비해 고농도로 농축될 수 있고, 유전자 전달 효율이 높으며, 완전 분열된 신경 세포에까지 전달 효과가 있는 등 여러 장점들 때문에 점차 많은 빈도로 이용되고 있다.

본 발명은 아데노 바이러스를 이용하여 순환종양세포를 검출하고, 이를 사멸없이 분리 및 배양하여 원발성 암을 진단하거나 개인 맞춤형 항암제를 선별하는데 이용하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암세포 검출용 아데노 바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 암세포 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 암세포 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 순환종양세포의 분리 및 배양 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 원발성 암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 개인 맞춤형 항암제 선정 방법을 제공한다.

본 발명의 아데노 바이러스는 혈액 내에서 암세포만 특이적으로 감염시켜 형광 발현하며, 종래의 암 특이적 아데노 바이러스가 암세포를 사멸하는 것과 달리, 순환종양세포를 사멸시키지 않고, 분리 후에도 배양이 가능한 효과가 있으므로, 이를 이용하여 암세포 검출, 순환종양세포의 분리 및 배양하고 원발성 암을 진단하며 개인별 특이적으로 효과적인 항암제를 선정할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 아데노 바이러스의 구조를 모식화한 도이다.
도 2는 본 발명의 아데노 바이러스의 엔지니어링 과정을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 아데노 바이러스의 엔지니어링 과정을 나타낸 도이다.
도 4는 종래의 종양분해성 아데노 바이러스가 암세포의 사멸을 야기하는 것을 확인한 도이다.
도 5는 종래의 종양분해성 아데노 바이러스가 암세포의 사멸을 야기하는 것을 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 아데노 바이러스가 암세포의 사멸을 야기하지 않는 것을 확인한 도이다.
도 7은 혈액 내에서 본 발명의 아데노 바이러스가 암세포에서만 특이적으로 형광을 나타내는 것을 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 아데노 바이러스를 이용하여 분리한 암세포의 콜로니 형성능을 확인한 도이다:
Oncolytic virus: 종래의 종양분해성 아데노 바이러스 감염 암세포; 및
E1 deleted 형태: 본 발명의 아데노 바이러스 감염 암세포.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

일 측면에서, 본 발명은 E1 영역 내 핵산 서열의 결실, 및 E3 영역 내에 표지 물질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 암세포 검출용 아데노 바이러스에 관한 것이다.

일 구현예에 따르면, 상기 바이러스는, 5`ITR-C1-C2-C3-C4-C5-3`ITR 구조를 갖일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, C1은 기능이 상실된 E1A 또는 E1B를 포함하거나; E1A만을 포함하거나; E1B만을 포함하거나; hTERT 프로모터만을 포함할 수 있으며, 상기의 경우 모두 E1 기능이 상실되는 것일 수 있고, 상기 E1의 기능을 상실시킴으로써, 상기 바이러스를 이용하여 순환종양세포를 검출시, 순환종양세포를 사멸시키지 않고 추가적인 배양이 가능하여, 추가적인 배양을 통하여 순환종양세포를 통해 어떠한 암세포인지 확인할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, C2는 E2B-L1-L2-L3-E2a-L4를 포함할 수 있고, C2는 단순 결합일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, C3는 표지 유전자가 포함된 E3를 포함할 수 있고, 상기 표지 유전자는 E3 영역 내의 SwaI 제한효소 부위에 도입될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, C4는 L5를 포함하거나, L5를 포함하지 않는 단순 결합일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, C5는 E4를 포함하거나 포함하지 않는 단순결합일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 암세포 검출용 아데노 바이러스는 도 3의 벡터맵을 가지는 아데노 바이러스 벡터일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 표지는 형광 물질, 프로브 또는 택(tag)일 수 있다. 상기 표지 물질은 본 기술 분야에서 알려진 어떠한 방법에 의해 검출될 수 있는 어떠한 화학적 모이어티라도 될 수 있다. 검출가능한 표지의 예는 분광(spectroscopy), 광화학(photochemistry)에 의해 또는 생화학적(biochemical), 면역학적(immunochemical) 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있는 어떠한 모이어티라도 포함될 수 있다. 핵산 프로브에 표지하는 적절한 방법은 상기 표지의 종류 및 상기 표지의 위치 및 프로브에 따라 선택될 수 있다. 표지의 예는 효소, 효소 기질, 동위원소물질, 형광 다이, 발색단(chromophores), 화학발광 표지(chemiluminescent label), 전기화학적 발광 표지(electrochemical luminescent label), 특이적인 결합 파트너를 갖는 리간드, 및 서로 반응하여 검출 신호의 강도를 증가, 변형 또는 감소시킬 수 있는 기타 표지를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광 물질일 수 있으며, 형광 물질은 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP) 또는 변형된 적색 형광 단백질(modified red fluorescent protein; mRFP)일 수 있다.

일 구현예에서, 암세포는 순환종양세포일 수 있으며, 혈중 순환종양세포인 것이 가장 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 용어 "결실"은 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 삭제를 말하며, 본 발명의 일 실시예에서는 아데노바이러스의 E1 유전자 모두를 결실시켰거나, 특정 영역을 결실시켜, E1의 기능을 상실 시켰다.

본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 상기 AFP, HMMR, NXPH4, PITX1, THBS4 및/또는 UBE2T 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 상기 유전자 발현 정도를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 통상의 기술분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으므로 본 발명에서는 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명에서, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시키는 적합한 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, NucleicAcidHybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate),1mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

본 발명에서 이용된 바이러스는 또한 상기 기술된 것외의 다른 변형을 또한 포함할 수 있다. 어떠한 추가의 성분 또는 변형도 임의로 사용할 수 있지만 본 발명을 위해 의무적이지는 않다.

외인성 성분의 삽입은 바이러스의 효과를 향상시킬 수 있다. 외인성 조직 또는 종양-특이적인 프로모터의 사용은 재조합체 벡터에서 일반적이며 이들은 또한 본 발명에서 이용될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 암세포 검출용 아데노 바이러스를 포함하는, 암세포 검출용 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 암세포는 순환종양세포일 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "암세포 검출용"은 "암세포 동정용"과 서로 교차 또는 혼용되어 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "검출하다", "검출하는" 또는 "검출"은 검출가능하게 표지된 조성물의 발견 또는 식별 또는 특이적 관찰의 일반적 실시를 기재하는 것일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 개체로부터 분리된 시료에 본 발명의 암세포 검출용 아데노바이러스 벡터를 감염시키는 단계를 포함하는, 암세포 검출 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 복수, 누액, 뇌척수액, 흉수, 활액, 림프, 또는 뇨인, 암세포 검출 방법.혈액, 양수, 혈장, 혈청, 정액, 골수, 뇨, 조직 생검 또는 세포로부터 단백질을 추출한 용액일 수 있으며, 혈액인 것이 가장 바람직하다.

일 구현예에서, 상기 방법은 시료 내 형광 발현 세포가 순환종양세포인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 순환종양세포 검출 방법은 개체의 혈액 내에 존재하는 순환종양세포를 검출 및 분리 동정하는 방법을 포함한다.

일 측면에서, 본 발명은 암환자로부터 분리된 혈액에 본 발명의 암세포 검출용 아데노바이러스 벡터를 감염시키는 단계; 혈액 내 형광 발현 세포를 분리하는 단계; 및 분리한 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 순환종양세포의 분리 및 배양 방법에 관한 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 개체로부터 분리된 혈액에 본 발명의 암세포 검출용 아데노바이러스 벡터를 감염시키는 단계; 혈액 내 형광 발현 세포를 분리하는 단계; 분리한 세포를 배양하는 단계; 원발성 암(primary cancer)을 판단하는 단계를 포함하는, 원발성 암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 원발성 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계(central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 다형성교모세포종 및 뇌하수체선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 개체로부터 분리된 혈액에 본 발명의 암세포 검출용 아데노바이러스 벡터를 감염시키는 단계; 혈액 내 형광 발현 세포를 분리하는 단계; 분리한 세포를 배양하는 단계; 배양된 세포에 후보 항암제를 반응시키는 단계; 상기 후보 항암제 반응을 분석하는 단계; 및 상기 분석된 후보 항암제 반응 정보를 활용하여 개인 맞춤형 항암제를 선별하는 단계를 포함하는, 개인 맞춤형 항암제 선정 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 혈액 내 형광 발현 세포는 순환종양세포일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 순환종양세포 검출용 아데노 바이러스 제조

도 1의 구조와 같이 E1 유전자가 제거되고 GFP를 발현하는 아데노바이러스를 제작하기 위해, E1 유전자를 결실시킨 Adenoeasy (Agilent) 기본 백본의 E3 유전자 위치에 SwaI 사이트를 디자인하여 삽입한 뒤 (도 2), SwaI 사이트에 CMV-eGFP를 클로닝하여 삽입하였다 (도 3). 이 후, (주)씨드모젠 (충북 오송)에 의뢰하여 생산하였다.

실시예 2. 아데노바이러스의 암세포 사멸 확인

E1 유전자가 존재하고 GFP를 발현하는 종래의 종양분해성(Oncolytic) 아데노 바이러스와 E1 유전자를 제거한 본 발명의 순환종양세포 검출용 아데노 바이러스의 암세포 사멸 여부를 확인하였다. 구체적으로, 48웰 플레이트에 A549 세포주를 1x10⁴ cell/well로 분주하고, 그 다음날, 상기 바이러스 (10⁹ vp/10㎕)를 배지로 연속희석(serial dilution)하여 각 MOI(multiplicity of infection) 별로 각각 감염시켰다. 감염 24, 48 및 72시간 후 형광현미경으로 세포 사멸을 확인하였다 (10x, Exposure time 350m/s, Gain 2정도에서 측정함).

그 결과, 시간이 지남에 따라 종래의 종양분해성 아데노 바이러스는 암세포를 사멸시키는 것을 알 수 있었으며 (도 4), 감염 72시간 후 동그란 모양으로 바이러스에 감염된 암세포주 A549가 세포사멸하는 것을 확인할 수 있었다 (도 5). 반면, 본 발명의 E1 유전자를 제거한 아데노 바이러스는 암세포주에서 GFP를 발현하면서도 세포사멸은 유발하지 않는 것으로 나타났다 (도 6).

실시예 3. 순환종양세포 특이적 검출 여부 확인

본 발명의 아데노 바이러스가 혈액 내에서 순환종양세포를 특이적으로 검출할 수 있는지 확인하기 위하여, 혈액 내 암세포의 검출 여부를 PBMC와 비교하여 확인하였다. 구체적으로, 자원자로부터 얻은 혈액 샘플을 7.9ml 이상 준비하여, 50개의 A549 세포를 혈액 샘플에 넣어주었다. 그 후, 1xRBC 파쇄 버퍼 40ml이 들어있는 50ml 튜브를 3개 준비하여, 상기 A549 세포가 포함된 혈액 샘플을 각 튜브당 2.9ml씩 담았다. 혈액 샘플이 담긴 튜브를 위아래로 10회씩 뒤집어 잘 섞고, 상온에 5~10분 놓아두었다. 적혈구가 파쇄되어 혈액 샘플이 투명해지면 원심 분리하여 (25℃, 300xg, 5분) 상층액을 제거하였다. 적혈구가 파쇄되어 제거된 샘플 (A549 세포가 포함된 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell))는 A549 세포의 배양액으로 세척한 뒤 15ml 튜브에 모아서 25℃, 300xg 및 5분의 조건으로 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 다시 한번 배양액으로 세척하고 25℃, 300xg 및 5분의 조건으로 원심 분리하여 흰색의 펠렛을 확인한 후 상층액을 제거하였다. 상기 펠릿을 본 발명의 순환종양세포 검출용 아데노 바이러스와 1ml의 배양액에서 20분 이내로 섞은 뒤, 37℃의 인큐베이터에서 로테이터로 24시간 동안 반응시켰다. 24시간 반응시킨 샘플을 25℃에서 300xg로 5분 동안 원심 분리하여, 상층액을 제거하였다. 그 후, 10% FBS/PBS에서 2시간 동안 블로킹한 후, 2% FBS/PBS를 1ml로 여러 번 세척하였다. 25℃에서 300xg로 5분 동안 원심 분리하여, 상층액을 제거한 뒤, 항-EpCAM 항체와 30분 동안 반응시킨 뒤, 2% FBS/PBS로 세척하고, 25℃에서 300xg로 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 그 후, 4% 파라포름알데하이드/PBS로 10분 동안 고정한 뒤, PBST로 세척하고, 25℃에서 300xg로 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 0.15% Triton-X/10% FBS/PBS로 10분 동안 투과시키고(permeabilize) 2% FBS/PBS로 세척하여 25℃에서 300xg로 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 핵 염색을 위해, DAPI로 10분 동안 반응시킨 뒤, 관찰 버퍼(observation buffer)에 세포를 풀어서 96웰 플레이트에 넣고 형광현미경을 이용하여 GFP가 발현된 세포를 확인하였다.

그 결과, 순환종양세포 마커인 EpCAM가 양성으로 나타난 혈액 내 A549 세포가 GFP를 발현하고 있었으며, DAPI 염색을 통해 혈액 내 다른 세포들인 PBMC에서는 GFP가 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다 (도 7). 이를 통해, 본 발명의 아데노바이러스는 혈액 내 암세포를 감염시켜 GFP를 발현하며, 이는 암세포에만 특이적임을 알 수 있었다.

실시예 4. 분리한 순환종양세포의 배양 가능 여부 확인

본 발명의 아데노바이러스에 감염되어 혈액 내에서 분리된 순환종양세포가 분리 후에 배양이 가능한지 확인하기 위하여, A549 세포를 종래의 종양분해성 아데노 바이러스 (E1 존재) 또는 본 발명의 순환종양세포 검출용 아데노 바이러스 (E1 제거)로 감염시켰다. 그 후, 세포들을 0.3% 아가 및 20% FBS가 포함된 DMEM 배지와 혼합한 뒤, 0.6% 아가가 함유된 배양 배지가 고형화된 배지 위에 10⁴의 세포수로 3회 분주하였다. 배지는 3 내지 4일마다 교체하였고, 4주 후에 콜로니를 평가하였다.

그 결과, 종래의 종양분해성 아데노 바이러스로 감염된 A549 세포는 콜로니를 형성하지 않아 배양 불가능한 형태로 나타났으나, 본 발명의 순환종양세포 검출용 아데노 바이러스로 감염된 A549 세포는 콜로니를 형성하여 본 발명의 아데노 바이러스는 암세포에 감염 후에도 암세포의 배양이 가능함을 알 수 있었다 (도 8).

실시예 5. 본 발명의 바이러스를 이용한 신장암 또는 전립선암 진단의 임상결과 확인

본 발명의 바이러스가 종양순환세포를 이용하여, 신장암 또는 전립선암을 진단할 수 있는지 확인하기 위하여, 냉장 보관한 대상자(신장암 또는 전립선암 환자)로부터 얻은 전혈검체 7.5mL에 lysis buffer를 추가해서 용혈작용을 통해 적혈구를 제거하여 백혈구 분획을 준비하였다. 실시예 1의 E1 영역이 결실되고 E3 영역 내에 GFP가 도입된 바이러스를 감염시키기 위하여, 36℃, 5% CO₂Incubator에서 24시간동안 반응시켰다. 하루밤 동안 반응 후 4% 파라포말데하이드(paraformaldehyde)로 고정 후에 CD45를 추가적으로 염색한 후, 96 well plate에 분주(seeding)하였다. 형광현미경을 사용하여 GFP 양성세포와 CD45 (백혈구 표지자) 음성세포의 구별한 후 순환종양세포를 카운팅하였다.

전립선암 환자 (Patient, P) 3명의 치료 전후 방문 (Visit, V)별 CTC의 개수 변화를 측정한 결과, 환자 1 (P1)의 경우 14개 (V1)에서 9개 (V2)로 감소하였고, 환자2 (P2)의 경우 20개 (V1)에서 5개 (V2)로 감소하였고, 환자3 (P3)의 경우 8개 (V1)에서 0개 (V2)로 감소하였다(도 9).

신장암 환자 (Patient, P) 2명의 치료 전후 방문 (Visit, V)별 CTC의 개수 변화를 측정한 결과, 환자 1 (P1)의 경우 176개 (V1)에서 1개 (V2)로 감소하였고, 환자2 (P2)의 경우 43개 (V1)에서 6개 (V2)로 감소하였다(도 10).

그 결과 본 발명의 바이러스가 암 치료 전후의 모니터링이 가능함을 확인하였다.

Claims

E1 영역 내 핵산 서열의 결실, 및 E3 영역 내에 표지 유전자를 포함하는, 암세포 검출용 아데노 바이러스.
제 1항에 있어서, 상기 바이러스는, 5`ITR-C1-C2-C3-C4-C5-3`ITR 구조를 갖되, C1은 hTERT 프로모터와 작동가능하게 연결된 E1A 또는 E1B를 포함하거나; hTERT 프로모터와 작동가능하게 연결된 E1A만을 포함하거나; hTERT 프로모터와 작동가능하게 연결된 E1B만을 포함하거나; hTERT 프로모터만을 포함하고;
C2는 E2B-L1-L2-L3-E2a-L4를 선택적으로 포함하고,
C3는 표지 유전자가 포함된 E3를 포함하며,
C4는 L5를 선택적으로 포함하고, C5는 E4를 선택적으로 포함하는, 암세포 검출용 아데노 바이러스.
제 1항에 있어서, 표지는 형광 물질, 프로브 또는 택(tag)인, 암세포 검출용 아데노 바이러스.
제 3항에 있어서, 형광 물질은 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP) 또는 변형된 적색 형광 단백질(modified red fluorescent protein; mRFP)인, 암세포 검출용 아데노 바이러스.
제 1항에 있어서, 암세포는 순환종양세포인, 암세포 검출용 아데노 바이러스.
제 1항의 암세포 검출용 아데노 바이러스를 포함하는, 암세포 검출용 조성물.
제 6항에 있어서, 암세포는 순환종양세포인, 암세포 검출용 조성물.
개체로부터 분리된 시료에 제 1항의 암세포 검출용 아데노바이러스 벡터를 감염시키는 단계를 포함하는, 암세포 검출 방법.
제 7항에 있어서, 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 복수, 누액, 뇌척수액, 흉수, 활액, 림프, 또는 뇨인, 암세포 검출 방법.혈액, 양수, 혈장, 혈청, 정액, 골수, 뇨, 조직 생검 또는 세포로부터 단백질을 추출한 용액인, 암세포 검출 방법.
제 7항에 있어서, 암세포는 순환종양세포인, 암세포 검출 방법.
제 7항에 있어서, 시료 내 형광 발현 세포가 순환종양세포인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 암세포 검출 방법.
1) 개체로부터 분리된 혈액에 제 1항의 암세포 검출용 아데노바이러스 벡터를 감염시키는 단계;
2) 혈액 내 형광 발현 세포를 분리하는 단계; 및
3) 분리한 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 순환종양세포의 분리 및 배양 방법.
1) 개체로부터 분리된 혈액에 제 1항의 암세포 검출용 아데노바이러스 벡터를 감염시키는 단계;
2) 혈액 내 형광 발현 세포를 분리하는 단계;
3) 분리한 세포를 배양하는 단계;
4) 원발성 암을 판단하는 단계를 포함하는, 원발성 암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제 12항에 있어서, 원발성 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계(central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 다형성교모세포종 및 뇌하수체선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 원발성 암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
1) 개체로부터 분리된 혈액에 제 1항의 암세포 검출용 아데노바이러스 벡터를 감염시키는 단계;
2) 혈액 내 형광 발현 세포를 분리하는 단계;
3) 분리한 세포를 배양하는 단계;
4) 배양된 세포에 후보 항암제를 반응시키는 단계;
5) 상기 후보 항암제 반응을 분석하는 단계; 및
6) 상기 분석된 후보 항암제 반응 정보를 활용하여 개인 맞춤형 항암제를 선별하는 단계를 포함하는, 개인 맞춤형 항암제 선정 방법.
제 15항에 있어서, 형광 발현 세포는 순환종양세포인, 개인 맞춤형 항암제 선정 방법.