CN108949998B - 预测乳腺癌患者对抗her2治疗药物反应性的基因突变位点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了预测乳腺癌患者对抗HER2治疗药物反应性的基因突变位点及其应用。具体的,经过发明人的大规模筛选,首次发现HER2基因编码序列第3020位点基因型与乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼的药物反应性相关。基于上述研究成果,本发明开发了一种可用于预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼的药物反应性的产品。上述产品通过检测HER2基因编码序列第3020位点基因型发挥功能,可在临床上广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于医学领域,涉及预测乳腺癌患者对抗HER2治疗药物反应性的基因突变位点,具体涉及预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼的药物反应性的HER2基因突变位点及其应用。
背景技术
20-30%的乳腺癌患者中人类表皮生长因子受体2(HER2)过表达,HER2过表达与预后不良和高度恶性相关。HER2蛋白过表达或HER2基因扩增也是一个用于识别从靶向HER2疗法中受益的乳腺癌患者的重要预测性生物标志物。几个临床前和临床研究表明,HER2激活机制不仅涉及到HER2蛋白质过表达和基因扩增,也涉及到能够激活HER2的体细胞突变。HER2突变的影响在HER2阳性和her2阴性乳腺癌中可能会有所不同。尽管之前的研究表明,HER2阳性突变患者可能从现有的靶向HER2的药物中获益,但是也有一些HER2突变会导致患者对这些药物产生抗性。HER2基因没有扩增的患者可能从抗HER2的治疗中获益。
目前评价对肿瘤治疗疗效的金标准是基于影像学检查的实体肿瘤疗效评估标准,即RECIST标准。随着精准医学概念的提出以及生物靶向药物及免疫治疗在临床中的应用,基于细胞毒性药物的肿瘤疗效评价方法不足之处凸显,对现有的RECIST标准提出了挑战:化疗的疗效不仅仅只表现在形态的改变(如肿瘤体积的缩小),还表现在肿瘤生物活性的变化(如囊性变、空洞等)。虽然PET-CT融合了形态影像和功能影像的两大特点,但由于评价周期较长、价格昂贵,作为化疗疗效的判断标准临床应用仍受限制。而血液中肿瘤标记物检测虽然简单,重复性强,但其变化不能单独作为疗效判断的标准。如何发现血液中是否有癌细胞以及数量,以前我们无法通过影像学、血液检测做出判断。因此,亟待寻找更加敏感的早期疗效评价标志物。
肿瘤进展是一个动态的过程,在疾病发展和治疗过程中,肿瘤细胞的特征会发生不同程度的变化,表现出与原来异同的生物学特点,如耐药、侵袭能力增强、转入休眠等,带来肿瘤耐药、化疗不敏感、快速进展等一系列临床问题。因此,这就要求对肿瘤的监测应贯穿整个治疗过程,可多次、反复进行检查,目前可部分满足此要求的监测手段为影像学检查、血清肿瘤标记物检测等,但即使是高分辨率的影像学检查也仅能发现明显的转移灶、对比肿块大小等,血清肿瘤标记物则缺乏特异性。纵观目前的肿瘤监测手段:手术或活检标本检测、血清学标志物检测以及影像学检查,尚未出现一种手段可以同时满足上述两大要求。因此肿瘤监测手段已严重制约肿瘤个体化治疗的发展,成为亟待解决的瓶颈。
ctDNA(circulating tumor DNA,循环肿瘤DNA)是指人体血液循环系统中不断流动的携带一定特征(包括突变,缺少,插入,重排,拷贝数异常,甲基化等)来自肿瘤基因组的DNA片段。ctDNA的主要来源包括:(1)来自坏死的肿瘤细胞;(2)来自凋亡的肿瘤细胞;(3)循环肿瘤细胞;(4)来自肿瘤细胞分泌的外排体。
临床试验研究表明:(1)ctDNA浓度大小与肿瘤负荷大小成正比,但并不能确定肿瘤的分期、定位和大小;(2)ctDNA检测尤其是ctDNA突变的检测可监测肿瘤进展及预后,而且有研究指出ctDNA的水平可以作为评估某些肿瘤(如卵巢癌和子宫内膜癌)预后的一个独立指标;(3)通过对ctDNA水平的监测能够检测到肿瘤患者组织和血浆中存在的特有的突变以便准确地对肿瘤进行分型,从而指导临床靶向治疗;(4)ctDNA检测可反映肿瘤是否发生复发转移及是否伴有微小残留疾病的存在;(5)ctDNA检测可反映抗癌治疗是否起效及是否出现耐药性信息,以便及时调整治疗方案,减少昂贵的无效治疗,实现个体化用药和治疗。
下一代测序(NGS)表明,HER2基因的体细胞突变在大约2%的原发性乳腺癌中被发现。绝大多数HER2体细胞突变也已经在HER2阴性乳腺癌中被发现。研究不同亚型乳腺癌中HER2突变以此断定这些突变和对靶向HER2疗法的反应性之间的关系是非常重要的。本申请使用NGS一方面用于分析循环肿瘤DNA(ctDNA)以确定不同亚型的晚期乳腺癌患者中HER2基因突变的频率和频谱,另一方面用于分析HER2基因突变和抗HER2疗法的疗效之间的关系。
发明内容
本发明的目的之一在于提供了一种预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼的药物反应性的HER2基因突变位点。
本发明的目的之二在于提供了前面所述的基因突变位点的用途。
本发明的目的之三在于提供了一种预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼的药物反应性的方法。
根据本发明的一个方面,本发明提供了一种预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼的药物反应性的基因突变位点,所述基因突变位点是HER2基因编码序列第3020位点。
根据本发明的另一个方面,本发明提供了一种前面所述的基因突变位点基因型的检测试剂。
所述试剂包括可以应用于本发明的检测前面所述的基因突变位点的基因型的方法中使用的试剂。所述方法包括但不限于,Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、等位基因特异性PCR-HRM。
进一步,所述试剂包括针对前面所述的基因突变位点的特异性扩增引物。
进一步,所述试剂还包括dNTPs、Taq酶、Mg2+和PCR反应缓冲液等PCR扩增反应中常规试剂。
根据本发明的又一个方面,本发明提供了前面所述的基因突变位点在制备预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼的药物反应性的产品的应用。
根据本发明的又一个方面,本发明提供了前面所述的试剂在制备预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼的药物反应性的产品中的应用。
本发明的所述产品通过检测样本中前面所述的基因突变位点的基因型来预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼的药物反应性。
进一步,所述产品包括试剂盒、芯片、或者试纸。
具体地,所述产品包括前面所述的试剂。
根据本发明的又一个方面,本发明提供了一种预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼的药物反应性的产品。
本发明的可用来检测基因突变位点的基因型来预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼的药物反应性的样本来源可以是肿瘤组织,可以是血液。当样本的来源是血液时,包括来源于血液中的cDNA、ctDNA,或循环肿瘤细胞(CTC)。在本发明具体实施方案中,本发明通过提取血液中cDNA进行测序的。
本发明是研究血液中ctDNA上的HER2突变位点,而在DNA提取测序使用的是cDNA。cDNA指的是血浆中的DNA片段,ctDNA即循环肿瘤DNA是cDNA中的一部分,检测的时候与正常细胞对照含有突变的DNA认为就是肿瘤的DNA。
根据本发明的又一个方面,本发明还提供了一种预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼的药物反应性的方法,该方法包含如下步骤:
(1)提取血液中的ctDNA;
(2)检测HER2基因编码序列第3020位点基因型。
ctDNA在外周血中含量很少,片段很小,容易与血浆蛋白结合,常规的提取效率不高,同时为排除凝血过程产生污染,目前多采用血浆进行ctDNA抽提。类似于PCR分子诊断的核酸前处理,常用于分离ctDNA的方法也有两种,二者并没有本质区别,只是二氧化硅微粒的载体不同。
离心柱法:以硅胶滤膜作为固相载体的,基于二氧化硅选择性结合DNA的独特属性。其原理是带负电的DNA骨架与带正电的硅胶滤膜之间的高亲和力。钠离子起到阳离子桥的作用,它可以吸引核酸磷酸骨架里带负电荷的氧。在高盐条件(pH≦7)下,钠离子可破坏水中的氢与硅中带负电荷的氧之间的氢键。通过大量漂洗去掉所有杂物后,用TE或Tris-Hcl缓冲液或蒸馏水在低离子强度下(pH≧7)洗脱纯化的DNA。
磁珠法:带有磁荷的颗粒可通过磁场中的永磁将其移除。这些磁颗粒可用表面包被二氧化硅的氧化铁颗粒制成。因表面积大,结合核酸的能力较强,可作为较好的分离载体。如果赋予容器侧壁磁性,样品混合物中结合有核酸的磁珠则聚集到容器壁,直接倾倒容器可将其他杂质去除,避免了反复离心。磁珠表面包被有活性基团可特异性吸附核酸。
可用于本发明的检测基因突变位点基因型的方法包括Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、等位基因特异性PCR-HRM。常用的测序方法包括标记扩增深度测序(tagged-amplicon deepsequencing,TAm-Seq)技术和癌症个体化深度测序分析方法(cancer personalized profiling by deepsequencing,CAPP-Seq)。
根据本发明的又一个方面,本发明还提供了一种建立曲妥珠单抗耐药细胞模型的方法,所述方法包含如下步骤:将细胞中HER2基因编码序列第3020位点碱基由C突变成T。
根据本发明的又一个方面,本发明还提供了一种建立拉帕替尼耐药细胞模型的方法,所述方法包含如下步骤:将细胞中HER2基因编码序列第3020位点碱基由C突变成T。
本发明的基因突变可以通过化学诱变或基因定点突变的方式获得,化学诱变的方法包括用EMS等诱变剂处理所导致的诱变;基因定点突变的方法包括但不限于ZFN定点突变方法、TALEN定点突变方法、和/或CRISPR/Cas9等定点突变方法。
定义
本文术语“引物”是指能够与核酸杂交并且允许互补核酸的聚合(通常通过提供一个游离的3′-OH基团)的单链多核苷酸核酸。
本文术语“基因”是指一种DNA序列,其通过其模板或信使RNA编码特定的肽、多肽或蛋白质特有的氨基酸序列。术语“基因”还指编码RNA产物的DNA序列。如本文中参照基因组DNA所用,基因包括插入区、非编码区以及调控区,并且可以包括5′和3′末端。
本文术语“扩增”是指产生一个或多个拷贝的参比核酸序列或其互补序列的过程。扩增可以是线性的或指数的(例如,聚合酶链式反应(PCR))。“拷贝”不必意味着相对于模板序列的完美的序列互补性或同一性。例如,拷贝可以包括核苷酸类似物,如脱氧肌苷,在扩增过程中发生的故意的序列改变(诸如,通过包含可与模板杂交但是不与模板完全互补的序列的引物而引入的序列改变)和/或序列错误。
本文术语“芯片”是由生物大分子或组织附着于玻璃、陶瓷、金属片或尼龙膜、硝酸纤维素膜等芯片固相载体上构建而成的阵列。生物芯片的实例包括基因(核酸)芯片、细胞芯片、蛋白质芯片、抗体芯片或组织芯片等。
术语“循环肿瘤细胞”(CTC)意在表示受检者样本中存在的任何癌细胞或者癌细胞群集。通常,CTC从固体肿瘤来剥落。因此,CTC常常是从具有晚期癌的患者的循环中以极低浓度存在的固体肿瘤脱落的上皮细胞。CTC也可以是来自肉瘤的间皮或者来自黑素瘤的黑素细胞。CTC也可以是源自初生、次生或第三肿瘤的细胞。CTC也可以是循环癌干细胞。
本发明的“预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼的药物反应性”也可以描述成“预测曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼治疗乳腺癌患者的疗效”,或描述成“判断乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼治疗反应性”,或描述成“判断乳腺癌患者是否对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼存在耐药性”,或描述成“判断乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼的敏感性”。
根据本发明的研究成果,可以得出以下结论:当乳腺癌患者HER2基因编码序列第3020位点碱基由C突变成T时,该患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼存在耐药性,而对吡咯替尼敏感。
与现有技术相比,本发明具有的有益效果为:
(1)本发明提供了能够预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼的药物反应性的生物标志物;通过检测乳腺癌患者肿瘤组织基因组或者血液中ctDNA上的HER2基因编码序列第3020位点的基因型,即可判断出该患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼是否耐药。
(2)本发明提供了一种非侵入式的,无创的方式用于预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼的药物反应性,在治疗之前即可获知患者的耐药性,从而有效的指导临床用药。
(3)本发明通过基因检测的方式在用药之前对患者耐药性进行判断,防止临床上使用药物浪费,即减轻了患者的负担也减轻了国家的负担。
附图说明
图1显示HER2点突变乳腺癌患者与非点突变乳腺癌患者的中位PFS期的统计图;
图2显示HER2野生型乳腺癌患者对吡咯替尼、拉帕替尼和曲妥珠单抗的药物反应图,其中,WT代表野生型;
图3显示HER2基因编码序列第3020位点突变乳腺癌患者对吡咯替尼、拉帕替尼和曲妥珠单抗的药物反应图,其中,3020代表HER2基因编码序列第3020位点突变;
图4显示lentiCRISPRv2质粒的图谱。
具体实施方案
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与乳腺癌患者耐药相关的基因突变位点
1、病人和样本收集
收集120例肿瘤医院正在接受治疗的女性ABC病人,这些病人经病理检测确诊为乳腺癌;其中,119个病人患有非侵袭性的导管癌,1例病人患有骨髓癌。
HER2阳性水平通过免疫组化3+,或者免疫组化2+/荧光原位杂交+(FISH+)来定义。本研究的乳腺癌患者是超过18周岁的被诊断为转移性乳腺癌的病人。使用streck管收集病人的外周血在72h内离心以将血浆和外周血细胞分离。本研究获得了中国医学科学院和北京协和医院的国家肿瘤中心/肿瘤医院的伦理委员会认可。病人和病人家属均签署了知情同意书。
2、DNA提取
利用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kits(Qiagen,Hilden,Germany)抽提0.5-2.0ml血浆样本的循环DNA(cDNA),利用QIAamp DNABlood Mini Kits(Qiagen,Hilden,Germany)抽提外周血细胞中的基因组DNA(gDNA)。具体提取步骤参见说明书。gDNA用作正常对照样本。
3、目标捕获和下一代测序
利用KAPA DNA Library Preparation Kit(Kapa Biosystems,Wilmington,MA,USA)构建gDNA和cDNA测序文库。目标区域包括HER2基因的全部外显子。文库与包括所有HER2基因外显子区域的定制的生物素化的寡核苷酸探针(Integrated DNA Technologies,Iowa,IA,USA))杂交。使用具有2×101-bp paired-end reads的HiSeq 3000测序系统(Illumina,San Diego,CA,USA)进行DNA测序。
4、测序数据分析
从原始数据中将低质量reads和末端接头序列过滤掉。利用BWA(version 0.7.12-r1039)将clean reads与参考人类基因组(hg19)比对。使用Pivard标记PCR倍增。使用GATK(version 3.4-46-gbc02625)重新排列和重新校准。使用MuTect(version 1.1.4)和NChot(研究热点突变的软件)识别单核苷酸变体(SNVs)。使用GATK识别小片段的插入和缺失。使用CONTRA(v2.0.8)识别体细胞拷贝数变异(CNVs)。重要的拷贝数变异表达为ctDNA和gDNA之间调整后的深度的比率。在整合基因组学查看器(IGV)中验证了所有最终候选变异。
5、数据分析
每2轮或者根据实体瘤疗效评价标准(RECIST v.1.1)表征疾病发展的症状出现的任何时候可以使用计算机断层扫面(CT)或磁共振成像(MRI)扫描来评价治疗反应。从样本收集的日期到疾病发展的日期或来自任何起因的死亡的日期计算无进展生存期(PFS)。没有终点(进展或死亡)的病例在最后的随访日被删除。根据基因突变绘制Kaplan-Meier生存图,使用时序检验(log-rank tests)对生存曲线进行对比。本申请中所用到的统计学检验方法是双尾法,p<0.05代表具有统计学意义。使用SPSS version 19.0(Chicago,IL,USA)完成所有的数据分析。
6、结果
(1)样本和临床数据
本申请收集的120例病人的主要临床特征在表1中列出。乳腺癌病人的平均年龄是45.7岁(范围:22-72岁)。其中包括75例HER2阳性患者和45例HER2阴性患者。使用NGS检测患者外周血中体细胞HER2基因突变。
表1病人临床特征
(2)HER2体细胞突变的识别
通过与患者血细胞中的DNA比对分析同一患者血浆DNA的测序数据,发现120例患者中有16例患者(13.3%)具有23个HER2的体细胞点突变。75例HER2阳性患者中有13例患者(17.3%)具有HER2突变。HER2阳性患者比HER2阴性患者具有更好的突变频率(3/45,6.7%)。HER2 SNVs的中位数是5.0%(范围:0.2%-84.3%)。另外,在75例阳性患者中发现了8例患者具有HER2基因拷贝数增加。10个基因突变存在于HER2基因的细胞外结构域上,其他13个突变存在于HER2基因的细胞内酪氨酸激酶结构域上。其中,检测到的HER2阳性患者中存在的一个点突变是c.3020C>T,p.S1007L。
(3)HER2阳性患者中HER2突变和抗HER2治疗的相关性
42例HER2阳性患者在进行ctDNA突变检测后接受了曲妥珠单抗治疗,之后统计了42例HER2阳性患者的PFS。具有HER2体细胞突变的16例患者中的9例在ctDNA突变检测后接受了曲妥珠单抗治疗。具有HER2突变的所有9例患者的PFS均小于6个月。这些患者被认为是对曲妥珠单抗是具有抗性的。具有HER2点突变的患者的中位PFS是5个月,不具有HER2点突变的患者的中位生存期是8.4个月(p=0.0002,图1)
实施例2 HER2点突变c.3020C>T抗HER2治疗细胞试验
一、实验材料
1、菌株
大肠杆菌DH5α,stbl3,为中国医学科学院分子肿瘤学国家重点实验室(后简称为“重点实验室”)保存。
2、质粒
LentiCRISPRV2:慢病毒表达载体,由麻省理工学院张峰博士实验室惠赠,其胶回收产物为重点实验室所保存。
LenticrisprV2-HER2:插入相应sgRNA的慢病毒表达载体,由本申请构建。(具体构建方法见下实验方法部分)
PCMV-GFP:绿色荧光蛋白慢病毒表达载体,为重点实验室所保存。
3、细胞株
BT474:乳腺癌细胞株,为重点实验室所保存。
细胞系培养基:BT474:RPMI-1640培养基。
细胞培养条件:10%进口胎牛血清,100U/ml青霉素,100U/ml链霉素,于37℃、5%CO2的潮湿孵箱中培养。
4、药品
拉帕替尼:购买自selleckchem公司;
曲妥珠单抗:购买自selleckchem公司;
吡咯替尼:江苏恒瑞医药股份有限公司惠赠。
5、试剂
表2试剂清单
氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、甲醇、乙醇、冰醋酸、氯仿、异丙醇、甲醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚兰、硼酸、盐酸、甘油、TritonX-100等产品均为国产分析纯试剂,购自北京化学试剂公司。
抗体:
表3抗体清单
6、Crispr相关序列(具体设计方法如下实验方法所示,均为5’-3’方向):特异性sgRNA靶区互补序列
GTGGTCATCCAGAATGAGGACTTGGGCCCAGCCAGTCCCTTGGACAGCACCTTCTACCGCTCACTGCTGGAGGACGATGACATGGGGGACCTGGTGGATGCTGAGGAGTATCTGGTACCCCAGCAGGGCTTCTTCTGTCC(SEQID NO.1)HER2突变序列:c.3020C>T,S1007L
GTGGTCATCCAGAATGAGGACTTGGGCCCAGCCAGTCCCTTGGACAGCACCTTCTACCGCTTACTGCTGGAGGACGATGACATGGGGGACCTGGTGGATGCTGAGGAGTATCTGGTACCCCAGCAGGGCTTCTTCTGTCC(划线碱基为突变碱基)(SEQ ID NO.2)
二、实验方法
1、细胞培养
细胞系的培养条件都是37℃恒温,湿度恒定,CO2的浓度维持在5%。BT474培养基使用RPMI1640,加入10%的胎牛血清,每天在显微镜下观察细胞的生长状态,每两天更换新的完全培养基,细胞生长的汇合度达到80%时进行消化传代。
2、质粒构建
2.1序列设计与合成
本研究所使用质粒为张峰实验室利用慢病毒载体整合cas9酶及sgRNA结合区构建的lentiCRISPRv2质粒(质粒图谱来源网页:
http://www.addgene.org/browse/sequence/43248/,具体参见图4)。在该质粒bsmb1酶切位点插入靶定基因组靶区的20nt序列即完成该质粒的功能激活,该靶区后面有NGG序列,又称PAM序列。故需要在目标突变附近寻找PAM序列后,再取其上游20nt碱基序列作为特异性sgRNA,而ssODN则取以剪接位点为中心左右各50nt以上的序列。设计sgRNA时,还需加上可插入lentiCRISPRv2质粒的bsmb1酶切位点引物接头。
(1)sgRNA靶区互补序列设计
寻找到突变位点附近PAM序列后取其上游(或下游)20个碱基,加上特异性接头,由上海生工公司合成;
(2)ssODN序列设计
以cas9酶切割位点为中心,左右各取65个碱基,将所需要引入的突变位点碱基更替为目标碱基,苏州泓迅生物科技股份有限公司合成,ssODN序列如SEQ ID NO.2所示。
2.2退火连接
(1)在PCR仪中进行退火。
表4退火反应体系
表5退火反应条件
(2)取1μl退火产物加入199μl ddH2O中,将其稀释200倍。
(3)对lentiCRISPRv2工具质粒进行bsmb1酶切及胶回收。
(4)将退火产物及已酶切的质粒进行连接。
表6连接反应体系
连接反应条件:室温下放置30min。
2.3感受态细菌制备
(1)从37℃培养过夜(16-20小时)的新鲜平板上挑取单个DH5α菌落,接种到含5mlLB液体培养基的试管中,37℃振荡培养过夜;
(2)从试管中取出1ml菌液,接种到称有100ml液体培养基的三角瓶中,37℃300rpm振荡培养2-3小时,OD600在0.3-0.5时为宜;
(3)在无菌条件下,将细菌培养物转入灭菌的用冰预冷的50ml离心管中,冰浴10分钟;
(4)3000rpm 4℃离心5分钟,收集细菌沉淀,尽可能除去培养液;
(5)用冰预冷的0.1M CaCl2重悬细菌沉淀,冰上放置30分钟,4℃3000rpm离心5分钟,弃尽上清;
(6)用4ml冰预冷的0.1M CaCl2重新悬起细菌沉淀,加甘油至终浓度15%,每管200μl分装至无菌1.5ml的EP管中,-80℃保存备用;
(7)取一管分为两份,一份转化标准质粒,一份不加质粒,分别做阳性和阴性对照实验,对所制备的感受态进行鉴定。
2.4细菌的转化
(1)在无菌操作台中,取5μl连接产物加入100μl感受态细胞中,轻轻混匀后冰浴30分钟;
(2)42℃热激90秒后,立即放于冰浴中2-3分钟,加入400μl LB液体培养基,于37℃振荡培养45分钟;
(3)3000rpm离心5分钟,弃去大部分上清,仅留200μl培养基,轻轻重悬菌体,将其涂布于含有50μg/ml Amp的LB琼脂平板上,37℃过夜培养。
2.5菌液测序
从每个培养皿中挑取3个菌落,加入10ml培养基,于37℃振荡培养2小时,取250μl菌液加入新的离心管内,标记后,使用封口膜封闭管盖,确保密封后送北京诺赛公司,利用LenticrisprV2载体自带的U6启动子对菌液进行sanger单端测序验证。
2.6质粒提取
连接成功的菌液进行如下操作:
(1)取100ml过夜培养的菌液加入离心管,室温8,000rpm离心3min收集细菌,尽量吸除上清;
(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入8ml溶液P1,使用移液器彻底悬浮细菌细胞沉淀;
(3)向离心管中加入8ml溶液P2,立即温和地上下翻转6-8次,室温放置5min;
(4)向离心管中加入8ml溶液P4,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀,至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10min左右。8,000rpm离心5-10min,使白色沉淀离至管底,将全部溶液小心倒入过滤器CS1中,慢慢推动推柄过滤,滤液收集在干净的50ml的管中;
(5)向吸附柱CP6中(吸附柱放入50ml收集管中)加入2.5ml的平衡液BL,8,000rpm离心2min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;
(6)向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇,上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中;
(7)室温8,000rpm离心2min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP6重新放回收集管中;
(8)向吸附柱CP6中加入10ml漂洗液PW,8,000rpm离心2min,弃掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中,再重复操作此步骤;
(9)向吸附柱CP6中加入3ml无水乙醇,室温8,000rpm离心2min,倒掉废液;
(10)将吸附柱CP6重新放回收集管中,8,000rpm离心5min;
(11)将吸附柱CP6置于一个干净的50ml收集管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2ml洗脱缓冲液TB,室温放置5min,然后室温8,000rpm离心2min,将50ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5ml离心管;
(12)采用Thermo nanodrop 2000c分光光度计测定核酸在260nm和280nm的吸光度值(Optical Density,OD)。按照OD260值计算DNA的浓度。良好质量的DNA其OD260/280在1.8-2.0之间;
(13)测定浓度后,放于-20℃保存。
2.6琼脂糖凝胶电泳
按照常规方法进行。
2.7质粒测序
取20μl质粒加入新的离心管内,标记后,使用封口膜封闭管盖,确保密封后送苏州泓迅生物科技股份有限公司,利用LentiCRISPRv2载体自带的U6启动子对菌液进行sanger单端测序验证。
3、转染及未转染混合细胞系的构建
3.1质粒转染
(1)转染前一天将细胞接种于六孔板中,控制细胞密度在转染时到达70%-80%;
(2)配置如下混合液:
A液:在300μl无血清培养基中加入适当浓度的2μg质粒(分别是lenticrisprV2-HER2、PCMV-GFP),分别加入0.5μg HER2 SSODN、0.5μg无血清培养基,轻柔混匀;
B液:在300μl无血清培养基中加入5μl LipofectamineTM2000,轻柔混匀;
(3)室温静置5分钟;
(4)将A液与B液轻柔混合,室温静置20分钟;
(5)将第4步的混合液600μl加入细胞培养皿中,用无血清培养基补至5ml,轻柔混匀,放入37℃、潮湿的CO2孵箱培养6小时,更换为含10%胎牛血清的培养基;
(6)细胞转染后24小时,在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光表达状态。
3.2构建转染及未转染混合细胞系
(1)在10ml含血清培养基中加入10μl 3mg/ml嘌呤霉素,将原培养基更换为加嘌呤霉素培养基,每孔加2ml;
(2)加嘌呤霉素后24小时、48小时分别在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光表达状态;
(3)加嘌呤霉素48小时后,更换为正常含血清培养基;
(4)消化转染、筛选后细胞以及未转染细胞,分别进行计数,将转染后细胞及未转染细胞进行1:4混合,再分别种于4个60mm皿中;
(5)待细胞贴壁后,提取四皿中任一皿细胞的DNA。
4、药物处理
4.1药物IC50测定
(1)接种细胞:取生长状态良好,汇合度达到80%的BT474转染前及转染后细胞,按照常规方法使用胰蛋白酶进行消化,制成均一的细胞悬液,并进行细胞计数,将细胞悬液稀释成4×103个/ml,充分混匀细胞悬液后使用排枪小心从孔一侧加入96孔板内,每孔100μl细胞悬液。为使细胞在96孔板内分布均匀,可将96孔板置于生物安全柜内静置15-20分钟,轻轻将96孔板置于细胞培养箱内,正常培养24小时。
(2)配制药物:从-80℃内取出拉帕替尼、吡咯替尼、曲妥珠单抗,室温下融化。待充分融化后,分别等比稀释成如下7个药物浓度,2ng/ml、1ng/ml、
0.5ng/ml、0.25ng/ml、0.125ng/ml、0.0625ng/ml、0.03125ng/ml;
(3)加药:每孔加入已配制好含有不同浓度药物的培养基100μl,对照组加入等体积的培养基。每组3个复孔。将96孔板置于细胞培养箱内,正常培养72小时;
(4)配制MTS:将1ml MTS加入10.5ml培养基中,小心吸去含有药物的旧培养基,每孔加入含有MTS溶液的培养基110μl,置于细胞培养箱内孵育1小时;
(5)上机检测:提前预热酶标仪,并设置好相应参数,从细胞培养箱内取出96孔板,置于酶标仪内检测450nm处的吸光值。
5、结果
对比图2(野生型组)和图3(突变组)的结果,说明乳腺癌细胞在HER2c.3020C>T,S1007L突变后对吡咯替尼仍然敏感,但对于曲妥珠单抗和拉帕替尼耐药。
此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国医学科学院肿瘤医院
<120> 预测乳腺癌患者对抗HER2治疗药物反应性的基因突变位点及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 140
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtggtcatcc agaatgagga cttgggccca gccagtccct tggacagcac cttctaccgc 60
tcactgctgg aggacgatga catgggggac ctggtggatg ctgaggagta tctggtaccc 120
cagcagggct tcttctgtcc 140
<210> 2
<211> 140
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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ttactgctgg aggacgatga catgggggac ctggtggatg ctgaggagta tctggtaccc 120
cagcagggct tcttctgtcc 140
Claims (6)
1.基因突变位点基因型的检测试剂,所述基因突变位点是HER2基因编码序列第3020位点,所述突变是c.3020C>T。
2.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述试剂包括针对含有所述基因突变位点的核酸序列的特异性扩增引物。
3.根据权利要求2所述的试剂,其特征在于,所述试剂还包括dNTPs、Taq酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。
4.权利要求1-3中任一项所述的试剂在制备预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼的药物反应性的产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述产品包括试剂盒、芯片、或者试纸。
6.一种预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗、拉帕替尼或吡咯替尼的药物反应性的基因突变位点的产品,其特征在于,所述产品包括权利要求1-3中任一项所述的试剂。
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