CN104152556A - 一种判断曲妥珠单抗辅助治疗乳腺癌疗效的试剂盒及应用 - Google Patents

一种判断曲妥珠单抗辅助治疗乳腺癌疗效的试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种判断曲妥珠单抗辅助治疗乳腺癌疗效的试剂盒及应用，该试剂盒包括能够用于检测HER2基因中rs1058808位点和/或rs2517954位点的基因型的试剂。发明人通过对患者进行基因分型，分析SNP位点基因型同曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效的相关性，发现根据rs1058808和/或rs2517954位点的基因型，可以判断曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效。本发明的试剂盒的开发为HER2阳性乳腺癌患者治疗方案的确定提供了一种可靠、灵敏的方式。

Description

一种判断曲妥珠单抗辅助治疗乳腺癌疗效的试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种判断曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效的试剂盒以及SNP在制备该试剂盒中的用途。 
背景技术
乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，大多数国家在过去20年中乳腺癌发病率持续增长。据世界卫生组织国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer，IARC)统计，2008年全球女性乳腺癌新发病例达138万，占全部女性恶性肿瘤发病的22.9％；46万女性因乳腺癌死亡，占所有女性恶性肿瘤死亡的13.7％，占所有女性死亡的1.7％。中国女性乳腺癌世界标准人口调整发病率为21.6/10万，死亡率为5.7/10万。我国2003-2007年全国32个肿瘤登记点女性乳腺癌合计发病率为41.64/10万，居女性癌症发病的第1位；合计死亡率为9.63/10万，居女性癌症死因的第6位。研究和了解中国女性乳腺癌的流行因素和遗传规律，并采取相应的干预措施，对降低乳腺癌的发病率具有重要意义。 
乳腺癌是一种高度异质性疾病，在组织形态、分子表型、临床表现、治疗效果及预后等各方面都存在很大的差异。人类基因组计划的研究结果表明，不同个体的基因99.9％是相同的，仅仅在序列上有极小(0.1％)的遗传差异。单核苷酸多态(SNP)是指在基因组DNA序列中单个核苷酸的变异，一般指频率大于1％的单核苷酸变异，是最常见的遗传变异类型。SNP在人类基因组中广泛存在，占所有已知多态性的90％以上，人类基因组中SNP总量约为3*106个，大概每1000个碱基就有一个SNP。研究SNP可以帮助解释不同群体和个体疾病易感性、个体间表型、对药物的耐受性及对环境因子的反应的差异。因此乳腺癌SNP导致的遗传变异如何决定了乳腺癌的表型及转归值得我们深入研究。 
在乳腺癌患者中，有20％-30％存在人表皮生长因子受体2(human epidermal  growth factor receptor 2,HER2)基因的扩增及其编码蛋白的过度表达[Slamon DJ et al.,1987]，且HER2过度表达常提示乳腺癌预后不良[Tandon AK et al.,1989]。曲妥珠单抗是人源化抗HER2单克隆抗体，已广泛用于HER2阳性乳腺癌的临床治疗，单药治疗HER2阳性转移性乳腺癌的有效率为35％。曲妥珠单抗单药或联合化疗可延长HER2阳性转移性乳腺癌病人的总生存期，改善这类病人的预后。NSABP B-31、NCCTG N9831、BCIRG 006和HERA 4个大型随机Ⅲ期临床研究的结果显示，曲妥珠单抗可使HER2阳性早期乳腺癌患者辅助化疗后的复发风险降低52％，死亡风险降低33％。2006年FDA批准曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性早期乳腺癌。 
本发明通过SNP分析，从基因表型分型上分析其与曲妥珠单抗治疗的HER2阳性早期乳腺癌的临床特征及预后是否相关。采用病例-对照研究的方法，深入研究这些关键基因的多态性与乳腺癌病理分型及治疗之间的关系，寻找有意义的分子标记物，为判断预后、筛选高危复发人群、选择个体化治疗提供依据，从而最终指导临床。 
发明内容
发明人发现了rs1058808位点和/或rs2517954位点与曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效的相关性，并据此开发了能够判断曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者疗效的试剂盒，和rs1058808位点和/或rs2517954位点在制备曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效的试剂盒中的应用。 
一方面，本发明提供了用于判断曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效的两个SNP位点，所述的SNP位点是rs1058808位点和rs2517954，当rs1058808位点基因型是CC时，曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效差，应改变患者的治疗方案，当rs1058808位点基因型为CG或GG时，曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效好，患者不易复发；当rs2517954位点基因型是CC时，曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效好，患者不易复发，当rs2517954位点基因型是CT或TT时，曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效差，应改变患者的治疗方案。 
另一方面，本发明提供了用于检测SNP位点基因型的试剂，所述试剂可以为采用本领域已知的任何技术检测SNP所需的试剂，只要其能够检测样本中 rs1058808位点和/或rs2517954位点的基因型即可。 
本领域技术人员已知，可以用多种技术在DNA水平上体外检测CETP基因序列的多态性位点。可以经与用放射性标记的反义RNA或DNA探针与扩增后的DNA序列杂交，以鉴别位点多态性。也可以基于已知的核苷酸顺序的改变，合成正常的和具有特定多态性的PCR引物，在聚合酶链式反应(PCR反应)的底物中加入荧光标记的核苷酸，根据反应产物中有无荧光出现，确定在扩增所用的引物中有无碱基变化，从而检测特定多态性。通过DNA直接测序可以直接揭示对照基因和携带具有特定多态性基因之间的序列差异。当与PCR结合使用时，这种方法的灵敏性大大提高。各种DNA及DNA片段的核苷酸序列的测定也可用常规方法如双脱氧链终止法。此外，核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒或自动测序仪等。常规的自动测序法用放射性标记或荧光标记来确定核酸序列。也可以采用限制性片段多态性分析(RFLP)来体外检测CETP基因序列的多态性位点。 
本发明提供的用于检测SNP位点基因型的试剂，包括用于扩增SNP位点在内的核苷酸序列的引物和/或能够使用MassARRAY Sequenom检测SNP位点基因型的单碱基扩展引物。对于rs1058808位点来说，用于扩增rs1058808位点在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5’-ACGTTGGATGACCTGCTGGTGCCACTCTG-3’；反向引物5’-ACGTTGGATGAAAACGTCTTTGACGACCCC-3’；对于rs2517954位点来说，所述用于扩增所述rs2517954位点在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5’-ACGTTGGATGCCCCATCTGTAAAACTGGGA-3’；反向引物5’-ACGTTGGATGTTGAGCACTCACTGTGTGAC-3’。对于rs1058808位点来说，所述单碱基扩展引物序列为：5’-GCCACTCTGGAAAGG-3’；对于rs2517954位点来说，所述单碱基扩展引物序列为：5’-aTCAAAGGGTGTGATAAAAATTAC-3’。 
又一方面，本发明提供了用于检测SNP位点基因型的试剂盒，该试剂盒包括采用本领域已知的任何技术检测SNP所需的试剂，只要其能够检测样本中rs1058808位点和/或rs2517954位点的基因型。 
本发明提供的用于检测SNP位点基因型的试剂盒包括用于扩增SNP位点在内的核苷酸序列的引物和/或能够使用MassARRAY Sequenom检测SNP位点基因 型的单碱基扩展引物。对于rs1058808位点来说，用于扩增rs1058808位点在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5’-ACGTTGGATGACCTGCTGGTGCCACTCTG-3’；反向引物5’-ACGTTGGATGAAAACGTCTTTGACGACCCC-3’；对于rs2517954位点来说，所述用于扩增所述rs2517954位点在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5’-ACGTTGGATGCCCCATCTGTAAAACTGGGA-3’；反向引物5’-ACGTTGGATGTTGAGCACTCACTGTGTGAC-3’。对于rs1058808位点来说，所述单碱基扩展引物序列为：5’-GCCACTCTGGAAAGG-3’；对于rs2517954位点来说，所述单碱基扩展引物序列为：5’-aTCAAAGGGTGTGATAAAAATTAC-3’。 
本发明提供了用于判断曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效的试剂盒，该试剂盒的判断原理是利用试剂盒中的试剂检测rs1058808位点和/或rs2517954位点的基因型，根据所测患者的上述SNP位点的基因型判断曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效。当rs1058808位点基因型是CC时，曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效差，应改变患者的治疗方案，当rs1058808位点基因型为CG或GG时，曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效好，患者不易复发；当rs2517954位点基因型是CC时，曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效好，患者不易复发，当rs2517954位点基因型是CT或TT时，曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效差，应改变患者的治疗方案。 
该试剂盒中包括采用本领域已知的任何技术检测SNP基因型所需的试剂，只要其能够检测样本中rs1058808位点和/或rs2517954位点的基因型即可。本发明提供的用于判断曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效的试剂盒包括用于扩增SNP位点在内的核苷酸序列的引物和/或能够使用MassARRAY Sequenom检测SNP位点基因型的单碱基扩展引物。对于rs1058808位点来说，用于扩增rs1058808位点在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5’-ACGTTGGATGACCTGCTGGTGCCACTCTG-3’；反向引物5’-ACGTTGGATGAAAACGTCTTTGACGACCCC-3’；对于rs2517954位点来说，所述用于扩增所述rs2517954位点在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5’-ACGTTGGATGCCCCATCTGTAAAACTGGGA-3’；反向引物5’- ACGTTGGATGTTGAGCACTCACTGTGTGAC-3’。对于rs1058808位点来说，所述单碱基扩展引物序列为：5’-GCCACTCTGGAAAGG-3’；对于rs2517954位点来说，所述单碱基扩展引物序列为：5’-aTCAAAGGGTGTGATAAAAATTAC-3’。 
本发明还提供了rs1058808位点和/或rs2517954位点在制备检测SNP位点基因型的试剂中的应用。所述试剂可以为采用本领域已知的任何技术检测SNP基因型所需的试剂，只要其能够检测样本中rs1058808位点和/或rs2517954位点的基因型即可。 
本发明还提供了rs1058808位点和/或rs2517954位点在制备检测SNP位点基因型的试剂盒中的应用。所述试剂盒中包括能够检测SNP位点基因型的试剂。在一个具体的实施方案中，所述试剂包括用于扩增SNP位点在内的核苷酸序列的引物和/或能够使用MassARRAY Sequenom检测SNP位点基因型的单碱基扩展引物。对于rs1058808位点来说，用于扩增rs1058808位点在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5’-ACGTTGGATGACCTGCTGGTGCCACTCTG-3’；反向引物5’-ACGTTGGATGAAAACGTCTTTGACGACCCC-3’；对于rs2517954位点来说，所述用于扩增所述rs2517954位点在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5’-ACGTTGGATGCCCCATCTGTAAAACTGGGA-3’；反向引物5’-ACGTTGGATGTTGAGCACTCACTGTGTGAC-3’。对于rs1058808位点来说，所述单碱基扩展引物序列为：5’-GCCACTCTGGAAAGG-3’；对于rs2517954位点来说，所述单碱基扩展引物序列为：5’-aTCAAAGGGTGTGATAAAAATTAC-3’。 
本发明还提供了rs1058808位点和/或rs2517954位点在制备用于判断曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效的试剂盒中的应用。所述试剂盒的判断原理是利用试剂盒中的试剂检测rs1058808位点和/或rs2517954位点的基因型，根据所测患者的上述SNP位点的基因型判断曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效。当rs1058808位点基因型是CC时，曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效差，应改变患者的治疗方案，当rs1058808位点基因型为CG或GG时，曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效好，患者不易复发；当rs2517954位点基因型是CC时，曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效好，患者不易复发，当rs2517954位点基因型是CT或TT时，曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效差，应改变患者的治疗方案。 
本发明还提供了用于检测rs1058808位点和/或rs2517954位点基因型的试剂在制备用于检测rs1058808位点和/或rs2517954位点基因型的试剂盒中的应用。 
本发明还提供了用于检测rs1058808位点和/或rs2517954位点基因型的试剂在制备用于判断曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效的试剂盒中的应用。 
本发明优点和有益效果如下：首次发现HER2基因中rs1058808位点和/或rs2517954位点与曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效的相关性，通过检测上述SNP位点的基因型即可判断HER2阳性乳腺癌患者对曲妥珠单抗辅助治疗的敏感性，为医生确定患者的治疗方案提供一种可靠、灵敏的方法。 
具体的实施方式 
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，应注意，如无特别指出，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限定本发明的保护范围。 
1.研究对象：研究纳入的对象为中国汉族女性，中国医学科学院肿瘤医院内科收治的经曲妥珠单抗治疗的HER2阳性早期乳腺癌患者，且收集有血液标本的患者共190例。所有研究对象均有可供病理组织学或细胞学诊断的标本，并经我院病理科医生阅片诊断，无第二原发肿瘤。HER2阳性定义为免疫组化3+或荧光原位杂交(FISH)方法检测HER2基因扩增。ER和PR根据免疫组化进行判断。肿瘤分期按照2002年美国肿瘤研究联合委员会(AJCC)乳腺癌分期标准(第6版)进行。回顾性查阅患者在医院收治的病历记录，详细记录患者肿瘤类型、分期、术后化疗方案、复发及转移情况，采用门诊随访及电话随访的方式对入组患者进行随访。 
2.用药方法：曲妥珠单抗的应用为3周方案(首次8mg/kg，以后每次6mg/kg)或与化疗同时进行时采用每周方案(首次4mg/kg，以后每次2mg/kg)，曲妥珠单抗用药时间为1年。 
3.HER2基因SNP位点的选择：在国际人类基因组单体型图计划提供的SNP公共数据库(http://hapmap:ncbi.nlm.nih.gov/)中检索HER2基因，首先选取已知汉族人群中信息的SNP位点，再以其中的标签SNP作为进一步分型的候选多态位点，然后结合最小基因频率(MAF)以及哈迪-温伯格平衡P值(HWPval)等统计特 征对候选标签SNP进行筛选以得出最佳的标签SNP。选取要求：MAF>0.1且HWPval>0.1。针对HER2基因进行了基于标签SNP为主体的全面SNP位点选择，并且将与之关联的部分功能SNP替换进去，HER2基因的候选SNP位点信息如表1所示： 
表1 HER2基因候选SNP位点信息 
4.实验方法 
4.1基因组DNA提取 
采集病例研究对象2ml抗凝外周血标本，采用酚-氯仿法提取基因组DNA。DNA标本分离自外周血白细胞，简述如下： 
(1)将收集的抗凝血标本从–80℃取出后置于室温，待溶化后将血转入另一干净的离心管，盖严后于5,000×g离心15min； 
(2)将离心后的血上层弃去，留血细胞，加入适量裂解缓冲液(含10mM pH为8.0的Tris-HCl、0.1M EDTA、20μg/ml胰RNA酶、0.5％SDS)，混匀，于37℃温浴1h，加蛋白酶K(100μg/ml)混匀后37℃温浴过夜； 
(3)温浴结束后加入等体积经Tris-HCl饱和过的平衡酚(pH7.4)充分混匀后于8,000×g离心15min； 
(4)将上层水相移至另一离心管并加入等体积酚：氯仿(1:1)，充分混匀后8,000×g离心15min； 
(5)将上层水相移入另一离心管中，加入10％体积的乙酸铵溶液(10M)，混匀后加入2倍体积的无水乙醇，混匀后放入–20℃。沉淀出的DNA经75％乙醇洗涤两次后，溶于适量TE缓冲液。使用分光光度计测定DNA浓度。 
提取出的DNA通过分光光度法来测定其浓度，Sequenom技术要求DNA达以下标准:浓度在10ng/μl以上；OD260/280＝1.8～2.0。DNA样品置于1.5ml EP 管中储存于-80℃超低温冰箱内。进行SNP分型检测时，样品被编码后分装于96孔板内。 
4.2候选多态的基因分析 
4.2.1SNP分型方法 
根据NCBI GenBank数据库中相关的基因序列，设计PCR引物和单核苷酸扩展引物，采用高通量的MassARRAY时间飞行质谱生物芯片系统(Sequenom)分析候选SNP的基因型。SNP分型由博淼生物科技(北京)有限公司协助完成。MassARRAY系统的工作原理是利用杂交探针与PCR产物结合后进行延伸反应时不同等位基因延伸长度不同，通过质谱飞行时间不同鉴别探针延伸长度来确定不同基因型，其基因分型准确率达到97％以上。MassARRAY系统是目前唯一采用质谱法直接检测SNP的设备，其反应体系不依赖杂交，因此不受杂交错配的干扰。该系统与TaqMan分型平台不同，也不需要对引物或探针进行荧光标记，避免了荧光物质对基因分型过程的干扰。 
为了质量控制，基因分型检测时均设平行重复样品和阴性对照(不含DNA的空白)，平行样品分析结果的重现率为100％。此外，每一样品的疾病状态对分型操作及分析人员保持盲态。 
4.2.2 Sequenom实验操作步骤 
4.2.2.1引物设计 
根据SNP位点序列信息，使用sequenom公司的引物设计软件Assay design3.1，设计并合成PCR反应和单碱基扩展引物(表2)。 
表2 各SNP位点PCR反应引物和延伸引物 
4.2.2.2 PCR反应 
反应体系(384孔PCR板+38％的试剂损耗) 
表3 反应体系 
试剂 浓度 体积(μl)
水，HPLC级 NA 927.5
含有15mM MgCl2的PCR缓冲液 10x 331.25
MgCl2 25mM 172.25
dNTP混合物 25mM 53
引物混合物 0.5μM 530
HotStar Taq 5U/μl 106
DNA模板 10ng/μl 1/孔
总计   5/孔
反应条件 
表4 反应条件 
4.2.2.3 SAP消化 
反应体系(384孔PCR板+38％的试剂损耗) 
表5 SAP消化反应体系 
试剂 浓度 体积(μl)
水 NA 810.9
SAP缓冲液 10x 90.1
SAP 1.7U/μl 159.0
总计   2/孔
反应条件 
表6 SAP消化反应条件 
温度(℃) 时间(min) 循环数
37 40 1
85 5 1
4 ∞ 1
4.2.2.4延伸反应 
反应体系(384孔PCR板+38％的试剂损耗) 
表7 反应体系 
试剂 浓度 体积(μl)
水 NA 400.2
iPLEX buffer plus 10x 106
iPLEX terminator NA 106
引物混合物 0.6-1.3μM 426.1
iPlex酶 NA 21.7
总计   2/孔
反应条件 
表8 反应条件 
4.2.2.5上机检测 
将反应产物(共9μl)稀释3倍，使用树脂进行脱盐；将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶；上机进行质谱检测，并收集数据。 
5.统计分析 
统计学分析用SPSS16.0软件进行。以χ2检验比较病例组和对照组之间各等位基因和基因型分布的差异；以非条件性logistic回归模型计算的比值比(odds ratio，OR)及其95％可信区间(confidence interval，CI)表示基因型与肿瘤发生的相对风险度；所有的OR值均经混杂因素如年龄、吸烟状况等校正；所有的统计检验均为双侧概率检验，以P＜0.05作为具有统计学显著性差异标准。 
6.实验结果 
1.研究人群的临床基本资料 
本研究共入组经曲妥珠单抗辅助治疗的HER2阳性早期乳腺癌患者190例，中位年龄为47岁(25-70岁)。其中已经出现复发和转移的患者为40例，3年以上无病生存的患者为150例。中位随访时间52.0个月(18.0-147.1个月)。复发转移组及无病生存组两组间肿瘤临床分期、淋巴结转移有显著统计学意义，复发转移组的临床分期较无病生存组的临床分期晚。而年龄、病理类型、病理分级、肿瘤大小、激素受体状态和术后辅助化疗方案等其他临床资料两组间基本平衡，无显著统计学差异(详见表9)。 
表9 190例乳腺癌患者的临床基本资料 
2.基因分型结果 
无病生存组与复发转移组患者的各SNP位点的基因型分布见表10。HER2基因rs1058808位点检测到CC、CG和GG三种基因型，CC基因型在无病生存组与复发转移组中的频率分别为30.2％和17.5％，CG基因型在两组间的分布频率分别为54.4％和50.0％，GG基因型在两组间的分布频率分别为15.4％和32.5％，三组基因型在两组间的分布频率有显著统计学差异(P＝0.034)。HER2基因rs2517954位点检测到CC、CT和TT三种基因型，CC基因型在无病生存组与复发转移组中的频率分别为16.0％和34.2％，CT基因型在两组间的分布频率分别为54.7％和47.4％，TT基因型在两组间的分布频率分别为29.3％和18.4％，三组基因型在两组间的分布频率有显著统计学差异(P＝0.034)。 
表10 两组间各基因SNP位点基因型分布 
*注：有1例没有检测出分型，故而rs1058808位点检测的CC、CG、GG共149例。 
3.rs1058808、rs2517954与HER2阳性早期乳腺癌主要临床参数的关系 
分析rs1058808、rs2517954的基因多态在190例入组的HER2阳性早期乳腺癌患者中，不同的临床特征(包括年龄、肿瘤分期、肿瘤大小、淋巴结转移、病理类型、受体状态、辅助化疗)基因型是否不同，结果显示，rs1058808、rs2517954基因位点的多态性在不同临床特征的患者中分布并无显著性差异，具体见表11、12。 
表11 rs1058808与HER2阳性早期乳腺癌主要临床参数的关系 
表12 rs2517954与HER2阳性早期乳腺癌主要临床参数的关系 
4.各基因SNP位点与HER2阳性早期乳腺癌复发转移风险的分析 
非条件Logistic回归分析显示，HER2基因的rs1058808，rs1136201和rs2517954位点均是HER2阳性早期乳腺癌DFS的影响因素，将阳性的基因位点纳入可能的混杂因素(年龄、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移状况、激素受体 状态、辅助化疗方案、病理类型)进行多因素Logistci回归分析，结果显示，HER2基因的rs1058808和rs2517954两个位点是HER2阳性早期乳腺癌术后DFS的影响因素，OR值分别为2.448和0.440。rs1058808位点有CC、CG、GG三种基因型，CC基因型是DFS的危险因素；rs2517954位点有CC、CT、TT三种基因型，CC基因型是DFS的保护因素(表13、表14)。 
表13 rs1058808位点多因素Logistic回归分析结果 
表14 rs2517954位点多因素Logistic回归分析结果 
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。 

Claims (10)

1.一种检测用于判断曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者疗效的SNP marker的基因型的试剂，其特征在于，所述SNP marker是rs1058808位点和/或rs2517954位点。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，对于rs1058808位点来说，所述试剂包括用于扩增所述rs1058808位点在内的核苷酸序列的引物；对于rs2517954位点来说，所述试剂包括用于扩增所述rs2517954位点在内的核苷酸序列的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，对于rs1058808位点来说，所述用于扩增所述rs1058808位点在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5’-ACGTTGGATGACCTGCTGGTGCCACTCTG-3’；反向引物5’-ACGTTGGATGAAAACGTCTTTGACGACCCC-3’；对于rs2517954位点来说，所述用于扩增所述rs2517954位点在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5’-ACGTTGGATGCCCCATCTGTAAAACTGGGA-3’；反向引物5’-ACGTTGGATGTTGAGCACTCACTGTGTGAC-3’。
4.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，对于rs1058808位点来说，所述试剂还包括能够使用MassARRAY Sequenom检测rs1058808位点基因型的单碱基扩展引物；对于rs2517954位点来说，所述试剂还包括能够使用MassARRAYSequenom检测rs2517954位点基因型的单碱基扩展引物。
5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，对于rs1058808位点来说，所述单碱基扩展引物序列为：5’-GCCACTCTGGAAAGG-3’；对于rs2517954位点来说，所述单碱基扩展引物序列为：5’-aTCAAAGGGTGTGATAAAAATTAC-3’。
6.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，对于rs1058808位点来说，所述试剂包括能够使用MassARRAY Sequenom检测rs1058808位点基因型的单碱基扩展引物；对于rs2517954位点来说，所述试剂包括能够使用MassARRAYSequenom检测rs2517954位点基因型的单碱基扩展引物。
7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，对于rs1058808位点来说，所述单碱基扩展引物序列为：5’-GCCACTCTGGAAAGG-3’；对于rs2517954位点来说，所述单碱基扩展引物序列为：5’-aTCAAAGGGTGTGATAAAAATTAC-3’。
8.一种检测权利要求1所述的SNP marker基因型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的试剂和/或权利要求6所述的试剂。
9.一种用于判断曲妥珠单抗辅助治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的试剂和/或权利要求6所述的试剂。
10.权利要求1所述的SNP marker在制备权利要求2和/或权利要求6所述的试剂、和/或权利要求8或权利要求9所述的试剂盒中的用途，权利要求2至7中任一项所述的试剂在制备权利要求8或权利要求9所述的试剂盒中的用途。
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