CN111215141A - 一种纳米酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种纳米酶及其制备方法和应用，所述纳米酶包括牛血清白蛋白骨架和附着于所述牛血清白蛋白骨架上的金纳米颗粒。本发明所涉及的纳米酶是一种多功能的纳米酶，其兼具氧化酶活性和过氧化物酶活性，在还原物质检测、酶联免疫技术等领域都具有潜在的应用价值；因其能够生产多种自由基还具有显著的抗菌效果。

Description

一种纳米酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于酶催化技术领域，具体涉及一种纳米酶及其制备方法和应用。

背景技术

自然界的一切生命进程都都离不开酶，天然酶是几乎所有生物体内存在的高效催化功能的生物分子，在生物体内的各个生物过程中都起着重要的作用，具有高催化效率和高底物特异性，由于其对生物进程及生物代谢的重要性，常被用于各类生物实际应用，如在食品工业、制药工艺和生物医学等领域均展现出良好的应用前景。然而，大多数天然酶均为蛋白质，其在酸、碱、热等非生理条件下，极易发生结构变化而失去活性，这使得其催化性能具有对外部因素的敏感性、不稳定性等不足，此外，由于天然酶在生物体内含量很低，产出量小，合成和纯化成本高。由于上述缺点，天然酶的广泛的应用受到限制。为了克服这些缺点，寻找天然酶的替代物一直是研究热点。在这之后研究人员尝试利用有机化学方法合成具有酶活性的简单非蛋白分子，即模拟酶，常见的模拟酶有环糊精、冠醚、卟啉等。

近年来，随着纳米技术和生物技术的发展，具有催化性能的功能纳米材料，即纳米酶，受到了广泛的关注。2007年，无机纳米材料Fe₃O₄具有类似辣根过氧化物酶活，经研究发现，其在催化活性及机理与辣根过氧化物酶相似，且相较于天然蛋白酶HRP，无机纳米材料Fe₃O₄具有稳定性高等优点；辣根过氧化物酶广泛应用于生物、化学工程及食品等领域，目前在临床检测应用，包括生化检测和免疫类检测，如ELISA等。这一发现，使得纳米酶受到各个领域的广泛关注，纳米酶本身在纳米技术的基础上，成为了一门新的研究领域。纳米酶的稳定性高、价格低廉且产出量大，这很大程度上地弥补了上述天然酶的不足。通常的，纳米酶会具有一种或一种以上的类酶活性例如过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性、氧化酶活性和超氧化物歧化酶等等；例如，前面提及的磁性纳米颗粒Fe₃O₄具有类似辣根过氧化物酶的过氧化物酶类活性；CeO₂纳米粒子具有氧化酶类活性；此外还有氧化石墨烯、碳纳米点、金铂纳米棒等金属及非金属纳米材料都具有不同的类酶活性，优异的性能使其被广泛应用于多种领域包括生物传感、免疫测定、癌症诊断治疗、神经保护、干细胞生长和污染物去除等。

CN107723284A公开了一种原位制备纳米酶膜的方法，包括以下步骤：原膜的预处理；膜表面的接枝聚合；膜表面纳米酶的配位自组装和原位生长：将接枝了聚丙烯酸的膜在MOFs前驱体溶液中浸渍一段时间，使前驱体溶液中的金属离子通过与聚丙烯酸上羧基的配位作用组装至膜表面，然后向前驱体溶液中加入有机配体溶液与酶液，将酶包裹在MOFs骨架结构中的同时实现纳米酶在膜表面的原位生长；以及纳米酶膜的后处理，从而得到负载纳米酶的纳米酶膜。

CN109884029A公开了一种银/石墨烯量子点纳米酶、SERS检测试剂盒及应用。所述银/石墨烯量子点纳米酶具有核壳结构，所述核壳结构中的核包含银，壳层包含石墨烯量子点，所述银/石墨烯量子点纳米酶的尺寸为7-15nm。本发明还公开了该银/石墨烯量子点纳米酶作为SERS基底具有良好的稳定性和SERS增强能力。本发明还公开了一种细胞内原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶催化试剂盒，用于检测癌细胞内过氧化氢。本发明还公开了一种原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶联免疫试剂盒，能够检测各种抗原、多肽或DNA等，尤其能够特异性识别检测肝癌标志物甲胎蛋白。

虽然纳米酶取得了一些研究进展，但其在制备简易度、酶活性的提高、催化反应的多元化以及底物选择性方面仍有较大的发展潜力。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纳米酶及其制备方法和应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种纳米酶，所述纳米酶包括牛血清白蛋白骨架和附着于所述牛血清白蛋白骨架上的金纳米颗粒。

本发明所涉及的纳米酶是一种多功能的纳米酶，其兼具氧化酶活性和过氧化物酶活性，在还原物质检测、酶联免疫技术等领域都具有潜在的应用价值；因其能够生产多种自由基(包括羟基自由基、超氧自由基和单线态氧)，因此还具有显著的抗菌效果。

优选地，所述金纳米颗粒的尺寸为10-20nm，例如10nm、12nm、14nm、15nm、16nm、18nm或20nm等，范围内的其他点值均可选择，在此便不进行一一赘述。

第二方面，本发明提供一种如上所述的纳米酶的制备方法，所述制备方法包括：以牛血清白蛋白和氯金酸为原料，通过类生物矿化方式一步合成所述纳米酶。

相较于传统的纳米酶制备过程，本发明所涉及的纳米酶采用一步法合成，无需高温高压等极端条件，也无需强氧化剂的参与；另一方面，本发明所涉及的制备方法仅以BSA调控结晶过程，其合成方法符合类生物矿化，生物矿化指的是仅通过生物大分子对矿化结晶过程进行调控，特点是耗能低，且符合环保的理念。

优选地，所述制备方法包括：将牛血清白蛋白溶液和氯金酸溶液混合，搅拌反应，得到所述纳米酶。

优选地，所述牛血清白蛋白在混合后的终浓度为8-12mg/mL，例如8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL或12mg/mL等，范围内的其他点值均可选择，在此便不进行一一赘述。优选8mg/mL。

所述牛血清白蛋白在混合后的终浓度特定选择为8-12mg/mL范围，是因为若浓度过大会使得酶活性降低，若浓度过小会使得酶稳定性差。

优选地，所述氯金酸在混合后的终浓度为3-5mM，例如3mM、3.5mM、4mM、4.5mM或5mM等，范围内的其他点值均可选择，在此便不进行一一赘述。

优选地，所述反应的温度为20-40℃，例如20℃、25℃、30℃、35℃或40℃等，范围内的其他点值均可选择，在此便不进行一一赘述。

优选地，所述反应的时间为1-7天，例如1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天等，范围内的其他点值均可选择，在此便不进行一一赘述。优选4天。

所述反应的时间特定选择1-7天，是因为时间过长会使得酶活性降低，时间过短会使得酶稳定性差。

优选地，所述反应结束后对溶液进行透析。

优选地，所述透析是指使用8000-14000分子量(例如8000、9000、10000、12000、13000或14000等)的透析袋透析24-48h(例如24h、30h、35h、40h或48h等)。

此处的透析操作是为了去除未进行充分反应的原料氯金酸。

作为本发明的优选技术方案，所述纳米酶的制备方法具有为：

将牛血清白蛋白溶于纯水中，然后与氯金酸溶液混合，使牛血清白蛋白的终浓度为8-12mg/mL，氯金酸的浓度为3-5mM，在20-40℃下搅拌反应1-7天，然后用8000-14000分子量的透析袋透析24-48h，得到所述纳米酶。

第三方面，本发明提供一种氧化酶，所述氧化酶包括如上所述的纳米酶。

当本发明所涉及的纳米酶作为氧化酶进行使用时，pH值和反应温度均会对酶的活性产生影响，对于pH值，在pH值为2-7均有较好的酶活性，而pH为3处酶活性最高；而对于反应温度，酶活性随着温度升高而增强，在50℃达到最高且保持不变。

第四方面，本发明提供一种过氧化物酶，所述过氧化物酶包括如上所述的纳米酶。

当本发明所涉及的纳米酶作为过氧化物酶进行使用时，pH值和反应温度均会对酶的活性产生影响，对于pH值，pH为3处酶活性最高，随着pH值增大，酶活性下降；而对于反应温度，酶活性在25-60℃随着温度升高而增强。

第五方面，本发明提供一种如上所述的纳米酶在抗菌中的应用。

第六方面，本发明提供一种如上所述的纳米酶在还原性物质检测中的应用。

第七方面，本发明提供一种如上所述的纳米酶在酶联免疫检测中的应用。

在酶联免疫检测应用中，涉及到纳米酶联抗体的制备，其具体操作方法示例性地为：

取纳米酶溶液，加入Na₂IO₄-磷酸盐缓冲液混匀，室温避光静置20min后转入超滤管中，继续添加醋酸盐缓冲液，4℃离心，重复用醋酸盐缓冲液超滤，将其转入新的离心管中待用。取溶于PBS缓冲液的某单克隆抗体加入新的超滤管中，4℃离心，将其转入离心管中并添加碳酸盐缓冲液使其pH值为9.5后与上述纳米酶溶液合并，轻轻混匀，25℃、避光、轻微振荡2h后加入现配制的NaBH₄溶液，混匀、25℃、避光孵育1.5h。最后将混合溶液全部转入超滤管中，加满PBS，4℃离心，重复用PBS超滤多次，使溶液pH值达到7.4。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明所涉及的纳米酶是一种多功能的纳米酶，其兼具氧化酶活性和过氧化物酶活性，在还原物质检测、酶联免疫技术等领域都具有潜在的应用价值；因其能够生产多种自由基(包括羟基自由基、超氧自由基和单线态氧)，因此还具有显著的抗菌效果。

附图说明

图1是实施例1制得的纳米酶的TEM成像图；

图2是实施例1制得的纳米酶的X射线光电子能谱图；

图3是实施例1制得的纳米酶的红外光谱图；

图4是实施例7中三组的紫外分光光谱图；

图5是实施例7中三组在测定时的溶液外观图；

图6是实施例7中TMB组和OPD组的紫外分光光谱图；

图7是实施例7中TMB组和OPD组在测定时的溶液外观图；

图8是实施例7中各酶浓度下的紫外分光光谱图(图中曲线由上至下依次表示51.2μg/mL、25.6μg/mL、12.8μg/mL、6.4μg/mL、3.2μg/mL、0μg/mL)；

图9是实施例7中各酶浓度下在测定时的溶液外观图(图中从左至右依次表示51.2μg/mL、25.6μg/mL、12.8μg/mL、6.4μg/mL、3.2μg/mL、0μg/mL)；

图10是实施例7中不同反应时间下的紫外分光光谱图(图中曲线由上至下依次对应于60min、40min、20min、10min、5min)；

图11是实施例8中三组的紫外分光光谱图；

图12是实施例8中TMB组和OPD组的紫外分光光谱图；

图13是实施例8中各酶浓度下的紫外分光光谱图(图中曲线由上至下依次表示51.2μg/mL、25.6μg/mL、12.8μg/mL、6.4μg/mL、3.2μg/mL、0μg/mL)；

图14是实施例8中各酶浓度下加入浓硫酸终止反应后的紫外分光光谱图(图中曲线由上至下依次表示51.2μg/mL、25.6μg/mL、12.8μg/mL、6.4μg/mL、3.2μg/mL、0μg/mL)；

图15是为超氧自由基的测定结果图；

图16是单线态氧的测定结果图；

图17是羟基自由基的测定结果图；

图18是本发明所涉及的纳米酶在处理金黄色葡萄球菌和大肠杆菌后的SEM图；

图19是实施例12中“谷胱甘肽浓度-吸光度差值”关系的拟合曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

本实施例提供一种纳米酶，所述纳米酶包括牛血清白蛋白骨架和附着于所述牛血清白蛋白骨架上的金纳米颗粒。其制备方法为：

将200mg牛血清白蛋白溶于15mL纯水中，然后将10mL 25mM的氯金酸溶液与其混合，在25℃下搅拌反应4天，然后用14000分子量的透析袋透析24h，得到所述纳米酶。

实施例2

本实施例提供一种纳米酶，所述纳米酶包括牛血清白蛋白骨架和附着于所述牛血清白蛋白骨架上的金纳米颗粒。其制备方法为：

将250mg牛血清白蛋白溶于15mL纯水中，然后将10mL 20mM的氯金酸溶液与其混合，在20℃下搅拌反应7天，然后用12000分子量的透析袋透析48h，得到所述纳米酶。

实施例3

本实施例提供一种纳米酶，所述纳米酶包括牛血清白蛋白骨架和附着于所述牛血清白蛋白骨架上的金纳米颗粒。其制备方法为：

将300mg牛血清白蛋白溶于15mL纯水中，然后将10mL 30mM的氯金酸溶液与其混合，在35℃下搅拌反应2天，然后用14000分子量的透析袋透析36h，得到所述纳米酶。

实施例4

本实施例对实施例1-3制备得到的纳米酶进行TEM成像表征试验，实施例1的成像结果如图1所示，由图可知：本发明所述的纳米酶是以金纳米颗粒均匀分散于BSA骨架中的形式存在的。实施例2和3的成像结果与图1类似。

实施例5

本实施例对实施例1-3制备得到的纳米酶进行X射线光电子能谱分析(XPS)，实施例1的图谱如图2所示，由图可知：颗粒元素构成有C、N、O、Au4f，其中N和Au4f的存在证实了BSA-Au的成功合成。实施例2和3的图谱特征与图2类似。

实施例6

本实施例对实施例1-3制备得到的纳米酶进行红外光谱分析，实施例1的光谱图结果如图3所示，由图可知：BSA和BSA-Au图谱能够相互对应，证明BSA成功修饰于金颗粒表面。实施例2和3的图谱特征与图3类似。

实施例7

氧化酶活性评估试验

本实施例通过对实施例1产品进行一系列的氧化酶活性测定实验来评估本发明所涉及的纳米酶(用BSA-Au表示)的氧化酶活性。测定实验条件为：将缓冲液HAc-NaAc(pH＝4,0.2M,140μL)、TMB(5mM,40μL)、20μL BSA-Au混合，37℃水浴中静置20min后，通过紫外分光光度仪在652nm处检测吸光度。

为了论证氧化酶活性不是来自BSA本身，选用等浓度BSA的BSA-Au、单纯BSA和水进行对比实验，结果如图4和图5所示(图4为三组的紫外分光光谱图，图5为三组在测定时的溶液外观图(由左至右依次为BSA-Au组、BSA组和水组))：仅BSA-Au组产生显色反应，证明氧化酶活性源于BSA-Au而不是BSA。

为了论证本发明所涉及的BSA-Au不仅对TMB能产生显色反应，其他常见的显色底物如领苯二胺(OPD)亦能在BSA-Au的作用下显色，将缓冲液HAc-NaAc(pH＝4,0.2M,140μL)、OPD(5mM,40μL)、20μL BSA-Au混合，37℃水浴中静置20min后，通过全紫外分光光谱图进行检测，结果如图6和图7所示(图6为TMB组和OPD组的紫外分光光谱图，图7为TMB组和OPD组进行测定时的溶液外观图(由左至右依次为TMB组、OPD组))：BSA-Au不仅对TMB能产生显色反应，其他常见的显色底物如领苯二胺(OPD)亦能在BSA-Au的作用下显色。

在酶浓度与反应程度关系的测定实验中，固定初始BSA-Au浓度，依次二倍稀释进行显色实验并采全紫外分光光谱图进行对比，结果如图8和图9所示(图8为各酶浓度下的紫外分光光谱图(图中曲线由上至下依次表示51.2μg/mL、25.6μg/mL、12.8μg/mL、6.4μg/mL、3.2μg/mL、0μg/mL)，图9为各酶浓度下的溶液外观图(由左至右依次对应于51.2μg/mL、25.6μg/mL、12.8μg/mL、6.4μg/mL、3.2μg/mL、0μg/mL))，由图可知：随着酶浓度增大，吸光度增高。

在反应时间与反应程度关系的测定实验中，设置五个反应组，不同时间(5min、10min、20min、40min、60min)下对652nm处吸光度测定同时采全对应时间的紫外分光光谱图，同时进行对比。结果如图10所示(图中曲线由上至下依次对应于60min、40min、20min、10min、5min)，由图可知：随着反应时间的推移，反应速率先增大，20min后开始降低。

实施例8

过氧化物酶活性评估试验

本实施例通过对实施例1产品进行一系列的过氧化物酶活性测定实验来评估本发明所涉及的纳米酶(用BSA-Au表示)的过氧化物酶活性。测定实验条件为：将缓冲液HAc-NaAc(pH＝4,0.2M,80μL)、H₂O₂(40μL,100mM终浓度)、TMB(5mM,40μL)、20μL BSA-Au混合，37℃水浴中静置20min后，通过紫外分光光度仪在652nm处检测吸光度。

为了论证过氧化物酶活性不是来自BSA本身，选用等浓度BSA的BSA-Au、单纯BSA和H₂O₂进行对比实验，结果如图11所示(图11为三组的紫外分光光谱图)：仅BSA-Au组产生显色反应，证明氧化酶活性源于BSA-Au而不是BSA。

为了论证本发明所涉及的BSA-Au不仅对TMB能产生显色反应，其他常见的显色底物如领苯二胺(OPD)亦能在BSA-Au的作用下显色，将缓冲液HAc-NaAc(pH＝4,0.2M,140μL)、OPD(5mM,40μL)、H₂O₂(40μL,100mM终浓度)、20μL BSA-Au混合，37℃水浴中静置20min后，通过全紫外分光光谱图进行检测，结果如图12所示(图12为TMB组和OPD组的紫外分光光谱图)：BSA-Au不仅对TMB能产生显色反应，其他常见的显色底物如领苯二胺(OPD)亦能在BSA-Au的作用下显色。

在酶浓度与反应程度关系的测定实验中，固定初始BSA-Au浓度，依次二倍稀释进行显色实验并采全紫外分光光谱图进行对比，结果如图13所示(图13为各酶浓度下的紫外分光光谱图(图中曲线由上至下依次对应于51.2μg/mL、25.6μg/mL、12.8μg/mL、6.4μg/mL、3.2μg/mL、0μg/mL))，由图可知：随着酶浓度增大，吸光度增高。在测定完成后加入浓硫酸(20μL,1M)后，发生终止反应，溶液变黄且450nm处有明显吸收峰，结果如图14所示(图中曲线由上至下依次对应于51.2μg/mL、25.6μg/mL、12.8μg/mL、6.4μg/mL、3.2μg/mL、0μg/mL)。

实施例9

酶活性产生机理探究试验

通常氧化酶活性和过氧化物酶活性来自于自由基的产生，我们利用电子顺磁共振技术对BSA-Au进行测试。实验通过电子顺磁共振实现对自由基的捕获，分别是羟基自由基、超氧自由基和单线态氧。三种自由基具体测定步骤如下：

(1)羟基自由基：取实施例1中产品溶液100μL，加入100μL浓度为100mM的DMPO溶液，吸入毛细管，然后装进样品管中测试；

(2)超氧自由基：取实施例1中产品溶液50μL，加入50μL甲醇，加入100μL浓度为100mM的DMPO溶液，吸入毛细管，然后装进样品管中测试；

(3)单线态氧：取液体100μL，加入100μL浓度为100mM的TEMP溶液，吸入毛细管，然后装进样品管中测试(温度37℃，反应30min)。

结果如图15-17所示(图15为超氧自由基的测定结果图，图16为单线态氧的测定结果图，图17为羟基自由基的测定结果图)，由图可知：本发明所涉及的纳米酶能产生三种不同的自由基，依次为超氧自由基、单线态氧和羟基自由基。

实施例10

抑菌性能试验

本实施例探究实施例1-3制得的纳米酶对多种细菌的抑菌效果，通过最小抑菌浓度(MIC)和SEM成像结果来表征，具体操作为：

在96孔板中的9个孔各加入100μL培养基，并分别编号1-9，然后在1号孔中加入100μL BSA-Au(浓度为512μg/mL)，并反复抽吸3-5次使其混合均匀后，抽取100μL溶液至2号孔，重复上述操作至8号孔，完成上述操作后八号孔抽出100μL弃置，9号孔作为对照孔。最后在各孔加入10μL，浓度为10⁶CFU/mL的各种菌液，置于培养箱，温度为37℃，孵育24h后进行结果判定。结果如表1所示，由表可知：本发明所涉及的纳米酶具有相对广谱的抑菌效果，对革兰氏阳性(耐药或非耐药)菌或革兰氏阴性(耐药或非耐药)菌均有显著的抑菌效果。

表1

上述细菌的来源为：大肠杆菌(ATCC号：25922)；鲍曼不动杆菌(ATCC号：180331054)；铜绿假单胞菌(ATCC号：27853)；金黄色葡萄球菌(ATCC号：29213)；屎肠球菌(ATCC号180404507)；粪肠球菌(ATCC号：33186)；多重耐药型大肠杆菌1-3和耐甲氧西林金葡菌1-3均为深圳南山医院临床分离菌。

对实施例1纳米酶和PBS缓冲液处理(4h)金黄色葡萄球菌(纳米酶浓度为32μg/mL)和大肠杆菌(纳米酶浓度为8μg/mL)前后分别进行SEM成像，结果如图18所示(a1为PBS缓冲液处理金黄色葡萄球菌后的SEM图，a2为BSA-Au处理金黄色葡萄球菌后的SEM图，b1为PBS缓冲液处理大肠杆菌后的SEM图，b2为BSA-Au处理大肠杆菌后的SEM图)，由图可知：BSA-Au组相对于对照组对金黄色葡萄球菌或大肠杆菌菌体结构具有显著的破坏作用，即抑菌作用。

实施例11

水体杀菌试验

本实施例对实施例1制得的纳米酶进行水体杀菌试验，具体操作为：将96孔板中的9个孔中加入100μL河水，编号1-9后，1号孔加入100μL BSA-Au(浓度为512μg/mL)，然后在2号孔加入2倍稀释的BSA-Au(浓度为256μg/mL)，如实施例10中的方法依次稀释BSA-Au加入孔至8号孔后，9号孔加入100μL无菌水作为对照后，置于培养箱，温度为37℃，孵育24h后，每个孔中取50μL溶液进行涂板，涂板完成后，置于培养箱，温度为37℃，孵育24h后根据平板菌落数对水体抗菌性能进行评估。结果显示：4μg/mL组的溶液涂板后，平板上几乎不见菌落生长。

实施例12

还原性物质检测试验

本发明所涉及的纳米酶BSA-Au具有氧化酶活性，可氧化还原性底物TMB显色，如在显色体系中加入其他还原性物质，则加入的还原性物质与底物形成竞争关系，影响底物显色的深浅，此颜色深浅可用吸光度值定量给出。基于此原理可进行还原性物质的检测，如谷胱甘肽，半胱氨酸，抗坏血酸等。

本实施例以谷胱甘肽(GSH)为例，首先测定检测GSH的动态范围和线性定量范围，具体测定过程为：将HAc-NaAc(pH＝4,0.2M,80μL)，50μL TMB、40μL不同浓度的谷胱甘肽水溶液(0，1，2，5，10，25，40，100μM)与30μLBSA-Au在水浴37℃下反应20min后测定各溶液吸光度值，用谷胱甘肽为0时的吸光度值减去加入不同浓度谷胱甘肽的溶液吸光度值得出吸光度差值，作“谷胱甘肽浓度-吸光度差值”关系图，找到了具有良好线性关系的检测范围1-25μM，其拟合曲线为y＝-0.005x+0.012，R²＝0.998，如图19所示。后续如若有一未知浓度的谷胱甘肽溶液，即按照测试线性范围的步骤操作，将其中40μL谷胱甘肽水溶液换成40μL待测溶液即可，测出吸光度差值，带入拟合曲线，即可求出该溶液的谷胱甘肽浓度。

实施例13

纳米酶标抗体的制备及应用试验

首先制备酶标抗体：取6mL实施例1得到的纳米酶溶液，加入150μL 0.1mol/LNa₂IO₄-磷酸盐缓冲液混匀，室温避光静置20min后转入15mL超滤管中，继续添加1.0mmol/L，pH 4.0的醋酸盐缓冲液至15mL刻度处，4℃、3000r/min离心20min，重复用醋酸盐缓冲液超滤3次至残留溶液在1.0mL时将其转入新的15mL的离心管中待用。取溶于PBS缓冲液的兔抗小鼠IgG 2.0mg加入新的超滤管中，4℃、3000r/min离心10min至抗体溶液总体积在0.5mL时将其转入15mL离心管中并添加0.5mL，0.2mol/L pH 9.5的碳酸盐缓冲液使其pH值为9.5后与上述纳米酶溶液合并，轻轻混匀，25℃、避光、轻微振荡2h后加入40μL现配制的4.0mg/mL的NaBH₄溶液，混匀、25℃、避光孵育1.5h。最后将混合溶液全部转入15mL超滤管中，加满PBS，4℃、3000r/min离心20min，重复用PBS超滤4次，使溶液pH值达到7.4，混合液体积达到2.0mL时为止，加入等体积的甘油后分装，在-20℃保存待用。

在双抗夹心ELISA中，采用(1)孵育捕获抗体(2)BSA封闭(3)孵育抗原(4)孵育上述酶标抗体(5)加TMB底物显色，用酶标仪读取450nm处吸光度值即可。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种纳米酶及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种纳米酶，其特征在于，所述纳米酶包括牛血清白蛋白骨架和附着于所述牛血清白蛋白骨架上的金纳米颗粒。

2.如权利要求1所述的纳米酶，其特征在于，所述金纳米颗粒的尺寸为10-20nm。

3.如权利要求1或2所述的纳米酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：以牛血清白蛋白和氯金酸为原料，通过类生物矿化方式一步合成所述纳米酶。

4.如权利要求3所述的纳米酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将牛血清白蛋白溶液和氯金酸溶液混合，搅拌反应，得到所述纳米酶。

5.如权利要求3或4所述的纳米酶的制备方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白在混合后的终浓度为8-12mg/mL，优选8mg/mL；

优选地，所述氯金酸在混合后的终浓度为3-5mM；

优选地，所述反应的温度为20-40℃；

优选地，所述反应的时间为1-7天；优选4天；

优选地，所述反应结束后对溶液进行透析；

优选地，所述透析是指使用8000-14000分子量的透析袋透析24-48h。

6.一种氧化酶，其特征在于，所述氧化酶包括如权利要求1或2所述的纳米酶。

7.一种过氧化物酶，其特征在于，所述过氧化物酶包括如权利要求1或2所述的纳米酶。

8.如权利要求1或2所述的纳米酶在抗菌中的应用。

9.如权利要求1或2所述的纳米酶在还原性物质检测中的应用。

10.如权利要求1或2所述的纳米酶在酶联免疫检测中的应用。

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