CN108398413A - 一种检测白蛋白的方法 - Google Patents

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郭小峰
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Abstract

本发明公开了一种检测生物样品中白蛋白的方法，向含白蛋白的样品中，加入式(I)所示结构的荧光探针，在温度为20‑37℃条件下，培养20分钟以上；无需分离，直接检测培养液的黄色荧光强度；其中，式(I)所示结构的荧光探针如说明书中所定义。在生理条件下，该荧光探针的水分散液没有荧光，但该荧光探针可以选择性地和白蛋白结合，荧光恢复，整个过程仅需5分钟，且其结合物可稳定存在，绝大多数蛋白质不干扰少数特定蛋白质的检测，生物介质背景干扰小，可用荧光分光光度计进行直接检测。该检测方法条件温和，反应迅速，灵敏度高。

Description

一种检测白蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种检测白蛋白的方法，属于蛋白质的生物检测技术领域。
背景技术
蛋白质是生命的物质基础，许多疾病及衰老等生物过程与蛋白质有着密切的关系，因此蛋白质的测定在生命科学、生物化学、临床医学中具有重要意义。近些年来发展了很多蛋白质分析方法，包括共振光散射技术、荧光光度法和紫外分光光度法，其中荧光分析法以其高选择性和高灵敏度的优势备受关注。这些荧光分析方法基于探针和蛋白质的结合方式分为共价结合和非共价键结合，所用探针多为小分子有机荧光探针，这些探针通常具备对蛋白质种类不具备选择性，通常用于检测总蛋白，而难以实现特定蛋白质的检测。
发明内容
本发明针对小分子荧光探针检测蛋白质的选择性问题，提出一种非共价结合且具备较好选择性的解决方案及所需荧光探针，以用于特定蛋白质的快速检测。
本发明所采用的技术方案具体如下：
一种检测白蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)向含白蛋白的样品中，加入式(I)所示结构的荧光探针，在温度为20-37℃条件下，培养20分钟以上；
(2)检测步骤(1)获得的培养液的黄色荧光强度；
其中，R1-R3独立地选自C1-10烷基，R4-R8独立地选自H或C1-10烷基。
优选地：
本发明使用的荧光探针的结构为：
所述的白蛋白为人血清白蛋白或牛血清白蛋白。
培养液的pH值为2-4或7-9。
培养液的pH值为8。
培养液中荧光探针的浓度为5μM-60μM。
步骤(2)中，激发波长为572nm，发射波长为586nm。
本发明所采用的荧光探针具有较强的疏水性，在有机溶剂中具有强荧光，在水溶液中不能溶解，几乎没有荧光。在生理条件下，该荧光探针的水分散液没有荧光，但该荧光探针可以选择性地和某些蛋白质结合，荧光恢复，整个过程仅需5分钟，且其结合物可稳定存在，具体原理尚不明确。该检测方法简单，无需复杂的共价标记过程，适用于检测能与该荧光探针发生作用的少数几种蛋白质。
本发明具有以下优点和有益效果：
1.本发明采用的荧光探针与特定蛋白质在反应前后荧光强度变化显著，灵敏性高，且不易受生物体中其他常见蛋白质的干扰。
2.该检测方法简单，反应迅速，条件温和。
附图说明
图1为荧光探针TMSHOB与牛血清白蛋白的反应随时间增加荧光强度的变化图。
图2为荧光探针TMSHOB与不同浓度的牛血清白蛋白在20mM磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)中反应后的荧光光谱图，荧光强度随牛血清白蛋白的浓度增大而增强。
图3为10μg/mL-60μg/mL浓度范围内牛血清白蛋白浓度和荧光强度的线性关系图。
图4为荧光探针TMSHOB在不同pH的20mM磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)中与牛血清白蛋白反应后的荧光强度变化图。
图5为荧光探针TMSHOB与牛血清白蛋白及其他蛋白质在20mM磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)中反应后的荧光强度对比图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述，仅在于说明本发明而绝不限制本发明。
实施例1
本发明所采用的荧光探针TMSHOB性质测定：
(1)光谱性质
以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂，测定了荧光探针TMSHOB的紫外可见吸收光谱、荧光光谱、摩尔吸光系数及荧光量子产率。荧光量子产率的测定以溶解在甲醇溶液中的罗丹明B(荧光量子产率为0.98)为标准，测得TMSHOB的荧光量子产率为0.545。TMSHOB(1μM)的荧光测定结果见表1。
表1.荧光探针TMSHOB的光谱性质
实验结果表明，荧光探针TMSHOB在DMSO溶液中的激发波长和发射波长分别为577nm、598nm，荧光强度非常大；而在水溶液中时，TMSHOB本身的荧光强度非常弱，而TMSHOB与牛血清白蛋白反应后得到的衍生产物荧光强度大幅度增强，其激发发射波长分别为572nm、586nm。
实施例2：荧光探针TMSHOB用于牛血清白蛋白测定时反应时间的影响
牛血清白蛋白是TMSHOB可用于检测的蛋白质之一。在浓度为20mM的磷酸盐缓冲溶液中(pH＝7.4)中，加入TMSHOB的储备液，使其浓度为10μM；再加入牛血清白蛋白溶液，使其浓度为100μg/mL；在25℃和37℃反应不同时间进行荧光测定。结果如图1所示，随着时间增加，荧光强度急剧增强；20分钟后到达拐点，荧光强度缓慢增加。
实施例3：荧光探针TMSHOB用于牛血清白蛋白的测定
在浓度为20mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)中，加入10μM探针TMSHOB的储备液，再加入不同浓度的牛血清白蛋白溶液，37℃反应20分钟后测定荧光强度。结果如图2所示，随着牛血清白蛋白浓度的增加，荧光强度逐渐增强。如图3所示，牛血清白蛋白的浓度在10μg/mL-60μg/mL范围内时，其荧光强度与浓度呈线性关系，检测限为17.5μg/mL。
实施例4：缓冲液的pH值对荧光探针TMSHOB和牛血清白蛋白反应的影响
将荧光探针TMSHOB(10μM)和牛血清白蛋白(100μg/mL)在不同pH值(2.0-12.0)的磷酸缓冲溶液(20mM)中衍生20分钟，测定衍生液的荧光强度。结果如图4所示，在弱酸性(pH＝2-4)和弱碱性(pH＝7-9)的衍生条件下，其荧光强度较高，在pH＝8的衍生条件下，其荧光强度最高。
实施例6：荧光探针TMSHOB对不同蛋白质的选择性
分别考察了荧光探针TMSHOB与牛血清白蛋白、人血清白蛋白、溶菌酶、胃蛋白酶、血红蛋白、胰酶、转铁蛋白、细胞色素C、核糖核苷酶、络氨酸酶的反应情况。反应均在20mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)中进行，37℃反应20分钟，TMSHOB的浓度为10μM，牛血清白蛋白为100μg/mL，其余蛋白质浓度均为100μg/mL。测定结果如图5所示，TMSHOB与溶菌酶、胃蛋白酶、血红蛋白、胰酶、转铁蛋白、细胞色素C、核糖核苷酶、酪氨酸酶这些蛋白质反应后，荧光强度变化很微弱；与人血清白蛋白反应后荧光有明显的增强，与牛血清白蛋白反应后荧光强度大幅增加，表明TMSHOB对特定蛋白质测定具有良好的选择性。
表2.荧光探针TMSHOB的选择性
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种检测白蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向含白蛋白的样品中，加入式(I)所示结构的荧光探针，在温度为20-37℃条件下，培养20分钟以上；
(2)检测步骤(1)获得的培养液的黄色荧光强度；
其中，R1-R3独立地选自C1-10烷基，R4-R8独立地选自H或C1-10烷基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：R1-R3均为-CH3，R4-R8均为H。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的白蛋白为人血清白蛋白或牛血清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：培养液的pH值为2-4或7-9。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：培养液的pH值为8。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：培养液中荧光探针的浓度为5μM-60μM。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，激发波长为572nm，发射波长为586nm。
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