KR20100137851A - 아조 보론산 염료를 이용한 당화단백질의 광학적 측정방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아조 보론산 염료를 이용한 당화단백질의 광학적 측정방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 특정 염료와 당화단백질 반응 후 붙지 않은 염료를 완전히 세척, 제거해야 하는 번거로움과, 완전한 제거가 어려운 경우에는 측정치를 신뢰할 수 없는 기존 당화단백질의 광학적 측정방법과는 달리, 아조 보론산 염료와 당화단백질이 결합 반응하여 생기는 에너지 전이에 의한 색변화(red-shift)가 일어나 별도의 세척 과정이 필요 없고 이로 인해 측정치의 신뢰성이 높은 새로운 당화단백질의 광학적 측정방법에 관한 것이다.
아조 보론산 염료, 당화단백질, 광학적 측정방법

Description

아조 보론산 염료를 이용한 당화단백질의 광학적 측정방법{Optical detection of glycated hemoglobin using azo-boronic acid dye}
본 발명은 아조 보론산 염료를 이용한 당화단백질의 광학적 측정방법에 관한 것이다.
바이오센서(Biosensors)는 단백질이나 DNA, 혹은 다른 생물학적 생체 물질들 (biological elements)을 목표 물질로 하며, 이들을 인식하는 부분(recognition element)과 이를 감지하여 용이한 신호로 전환하는 물리화학적 신호 변환기 부분 (physicochemical transducer element)으로 구성된 분석 장치이다. 1970년대 후반부터 약 35년 동안 꾸준히 개발되어 왔으며, 근래 15년 동안 매우 활발한 연구가 진행되고 있는 분야이다. 이는 생명공학 BT 기술과 나노공학 NT 기술이 결합된 융합기술의 한 분야로서 융합기술의 발전과 함께 주목받고 있다. LOC (Lab-on-a-chip)이나 μTAS(micro-total analysis system)의 형태로 측정 및 분석의 다단계 과정을 하나의 칩(chip) 상에서 이루어내는 방식으로 구현되고 있는 바이오센서는 소형화 및 고감도, 안정성, 신속성, 그리고 높은 신뢰성 등의 장점을 지니고 있다. 바이오센서는 생물공학 분야 중 진단, 의약, 환경, 식품 등의 분야에서 주로 연구되고 있으며, 이를 응용하여 많은 부분이 상용화에 적용되고 있다.
특히, 인간 질병의 조기 진단 관리 및 분석으로의 연구와 진단 산업화로의 상용화가 빠르게 확산되고 있다. 신호 변환기의 측정 원리에 따라 바이오센서는 크게 광학(Optical), 전기화학(Electrochemical), 열량학(Thermal), 역학(Mechanical)적인 방식의 시스템으로 나눌 수 있다. 이 중에서도 광학적인 측정 방법과 전기화학적인 측정방법의 바이오센서 연구가 활발히 진행되어 왔다[P. D’Orazio, “Biosensors in clinical chemistry”, Clinica Chimica Acta, vol. 334, pp.41-49, 2003; B. M. Cullum and T. Vo-Dinh, “The development of optical nanosensors for biological measurements”, Trends in Biotechnology, vol. 18, pp.388-393, 2000; P. T. Kissinger, “Biosensors-a perspective”, Biosensors and Bioelectronics, vol. 20, pp.2512-2516, 2005; 윤현철, 최형길, “면역센싱의 고도화를 위한 나노-바이오기술의 적용”, 전자공학회지, 제 32권, 제 8호, pp.52-61, 2005.].
광학적 측정 방식의 바이오센서(Optical Biosensors)는 가장 널리 응용되고 있는 것으로 SPR(Surface Plasmon Resonance)을 이용한 바이오센서, FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 원리를 이용한 바이오센서, 그리고 플루오로포어(fluorophore)이나 크롬포어 염료(chromophore dye)와 같은 발색단을 이용한 바이오센서 등이 있다. 진단 연구 및 산업 분야에서 가장 많이 쓰이고 있는 광학식 바이오센서의 측정방법은 간단하면서도 빠르고 정확한 광 스펙트럼(optical spectroscopy)을 이용한 방법이다. 이는 분석하고자 하는 생물학적 생체 물질과 빛(light) 간의 상호 작용을 기반으로 흡광도(Absorbance) 값 혹은 반사도(% Reflectance) 값의 신호를 얻음으로써 비침해적(noninvasive)이고 비파괴적 (nondestructive)이며, 연속적으로 많은 측정 물질의 분석이 가능하다는 장점을 지니고 있다. 이처럼 분광계(spectroscopy)를 이용한 바이오센서는 광학식 바이오센서의 많은 부분을 차지하고 있으며 빠르게 성장하고 있다. 앞으로는 더욱 더 향상된 체계로 발전하여 많은 분야에 적용될 것이다[윤현철, 최형길, “면역센싱의 고도화를 위한 나노-바이오기술의 적용”, 전자공학회지, 제 32권, 제 8호, pp.52-61, 2005.; S. Marose, C. Lindemann, R. Ulber and T. Scheper, “Optical sensor systems for bioprocess monitoring”, Trends in Biotechnology, vol. 17, pp.30-34, 1999.]
20년간 당뇨병(Diabetes Mellitus, DM)은 모든 연령대에 빈번히 발병되는 질병 중 하나로 꼽혀 왔다. 이런 당뇨병은 두 가지 형태가 있다. 제 1형 당뇨병(Type 1 DM)은 췌장 속에서 인슐린을 분비하는 세포군인 랑게르한스섬의 β 세포 파괴성 병변으로 인한 인슐린 결핍으로 발병되는 것으로 유전적인 요인이 많다. 제 2형 당뇨병(Type 2 DM)은 인슐린 저항성으로 인한 고혈당이 원인이 되는 것으로 주로 비만 및 과체중, 앉아서만 생활하는 사람들에게 발병된다. 이런 제 2형 당뇨병의 경우 그 합병증의 위험 또한 높다.
따라서, 당뇨병의 조기 진단 및 관리가 중요시되고 있다. 당뇨병의 혈당 정도를 반영하는 중요한 지표로 공복 혈장 혈당(Blood Glucose)과 당화혈색소 (Glycated Hemoglobin)가 이용되고 있다. 특히, 당화혈색소는 검사 시 공복 및 약물 복용 여부에 따른 검사 상의 오류가 적고 그 특이도가 좋아 당뇨병 및 합병증을 예측하는데 더 좋은 지표로 여겨진다[V. Wiwanitkit, “Energy consumption for the formation of hemoglobin A1c: A reappraisal and implication on the poor-control diabetes mellitus patients”, Journal of Diabetes and Its Complications, vol. 20, pp.384-386, 2006.].
혈색소(hemoglobin)는 네 개의 폴리펩타이드 체인(α, β, γ, δ chain)의 집합체인 글로빈(globin)과 각 체인에 하나의 헴(heme)이 비공유 결합으로 연결되어 있는 구조로 되어있다. 혈색소는 글로빈의 종류에 따라 혈색소 A(α2β2), 혈색소 A2(α2γ2), 혈색소 F(α2δ2)로 구분되며, 혈색소 A(Hemoglobin A)가 혈색소 총량의 97%를 차지한다.
당화혈색소(Glycated Hemoglobin)는 혈색소 A에 당이 부착하여 형성된 것으로 이는 A1a, A1b, A1c로 나뉜다. 그 중 혈색소 A1c(Hemoglobin A1c, HbA1c)가 60~80%로 가장 많으며, 이는 혈색소 β 체인의 N-말단의 발린(valine) 부위에 포도당이 비효소적인 방법으로 결합된 것이다[대한임상병리학회, “임상병리학”, 완전개정 3판, 고려의학, pp.199-203, 213, 2001.; 이귀녕, 긴진규, “임상화학”, 제 1판, 의학문화사, pp.153-155, 259-261, 1988.]. 적혈구의 수명이 120일인 것을 감안하여 볼 때 당화혈색소 HbA1c는 최근 1~3개월간의 평균적인 혈당 상태를 반영하며, 특히 1개월간의 혈당 변화를 가장 잘 반영한다. 따라서, HbA1c의 검사 를 통한 당뇨병의 진단 및 치료 효과 관찰로의 적용 중요성 또한 강조되고 있다[성연아, “HbA1c 검사의 임상적 의의”, 대한진단검사의학회지, 제 27권, 부록 2호, pp.S413-S417, 2007.]. 혈색소 총량에 대한 당화혈색소 HbA1c의 양은 퍼센타일(%)로 나타내며, 대략 HbA1c 7% 이전까지는 당뇨병이 아닌 정상 범위의 수치이고 그 이상의 수치는 당뇨병으로 판단된다. 그리하여 HbA1c 7%를 기준으로 6.9%와 7%의 명확한 차이를 구분 지을 수 있는 측정 시스템이 매우 중요하다.
% HbA1c의 측정 및 분석은 HPLC 방법과 면역검사(Immunoassay) 방법, POCT 방법 등으로 이루어진다. 이때, 사용되는 물질은 주로 보론산 기(boronate group)가 적용된 친화성 컬럼(affinity column)이나 비드(bead), 화학 염료(chemical dye)들이다. 이는 HbA1c의 당과 보론산 디올(boronic acid diol) 간의 시스-디올 작용(cis-diol interaction)에 의한 특이적인 결합 성질을 이용하여 %HbA1c 측정에 적용되는 것이다[F. Frantzen, K. Grimsrud, D. Heggli and E. Sundrehagen, “Protein-boronic acid conjugates and their binding to low-molecular-mass cis-diols and glycated hemoglobin”, Journal of Chromatography B, vol. 670, pp.37-45, 1995; W. G. John, “Haemoglobin A1c: Analysis and Standardisation”, Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, vol. 41, pp.1199-1212, 2003.; S. U. Son, J. H. Seo, Y. H. Choi and S. S. Lee, “Fabrication of a disposable biochip for measuring percent hemoglobin A1c(%HbA1c)”, Sensors and Actuators A, vol. 130-131, pp.267-272, 2006.].
근래 당뇨병의 자가 측정 및 관리가 가능한 간단하면서도 빠른 POCT 방법에 대한 당뇨병 환자들의 관심이 매우 증가하고 있다. %HbA1c 측정의 POCT 방법은 광학식 센싱 방법으로 많이 개발되어 왔으며, 이에 대한 연구도 활발히 진행되고 있다. 그리고 HbA1c에 특이적으로 결합을 하면서도 가격 면에서 경제적이며 간단한 시스템으로 광학식 센싱에 적용될 수 있는 보론산 기가 유도된 플루오로포어(fluorophore)나 크로모포어 염료(chromophore dye)들에 대한 연구 또한 활발히 진행되고 있다.
보론산(Boronic acid)은 지난 100년 동안 잘 알려져 왔으며 그에 대한 연구가 지금까지 진행되어 왔다. 1950년대부터는 보론산의 디올과 당(Sugar)과의 시스-디올 작용이 알려지면서 당을 측정하는 연구 분야에 보론산이 이상적인 인지 물질로서 많은 연구가 진행되어 왔다. 특히, 1990년대부터는 당이나 당단백질 (glycated protein)의 측정 및 분리를 위한 센서로의 적용 연구 또한 활발한 진행되어 왔다[H. S. Mader and O. S. Wolfbeis, “Boronic acid based probes for microdetermination of saccharides and glycosylated biomolecules”, Microchimica Act, vol. 162, pp.1-34, 2008.; M. Li, N. Ni, B. Wang and Y. Zhang, “Modeling the excitation 파장 (λex) of boronic acids”, Journal of Molecular Modeling, vol. 14, pp.441-449, 2008.].
보론산 기 중에서도 지난 10년 동안 가장 많은 연구가 진행된 것은 페닐 보 론산 기(phenyl boronic acid group)이다. 페닐 보론산 기는 수용액 환경에서 당뿐만 아니라 다른 디올들과도 빠르고 가역적인 작용으로 콤플렉스를 형성할 수 있다. 이런 특성의 페닐 보론산 형태에 발색단과 직접적으로, 혹은 링커를 통한 간접적으로 연결된 화합물들을 도입하여 당이나 당단백질, 다른 디올 등의 광학적 센싱에 많이 적용되고 있다[K. R. A. S. Sandanayake, T. D. James and S. Shinkai, “Molecular design of sugar recognition systems by sugar-diboronic acid macrocyclization”, Pure and Applied Chemistry, vol. 68, pp.1207-1212, 1996.; N. DiCesare and J. R. Lakowicz, “Evalucation of Two Synthetic Glucose Probes for Fluorescence-Lifetime-Based Sensing”, Analytical Biochemistry, vol. 294, pp.154-160, 2001.; N. DiCesare and J. R. Lakowicz, “Spectral Properties of Fluorophores Combining the Boronic Acid Group with Electron Donor or Withdrawing Groups. Implication in the Development of Fluorescence Probes for Saccharides”, The Journal of Physical Chemistry A, vol. 105, pp.6834-6840, 2001.].
600 nm 파장에서 최고의 흡광도를 가지는 페녹사진(phenoxazine) 등의 염료를 이용한 당화단백질의 광학 측정방법에 대한 연구 보고[US 05919708]가 있으나 , 이 방법은 염료와 당화단백질 간의 분자결합을 유도하고 당화단백질에 붙은 염료의 양을 측정하기 때문에 반응 후 붙지 않은 염료를 완전히 세척, 제거해야 하는 번거로움이 발생하고, 또한 완전한 제거가 어려운 경우에는 측정치를 신뢰할 수 없게 된다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 아조-벤조산 염료(azo-boronic acid dye, 이하, “아조-BA 염료”라 칭함)를 도입하여 아조-BA 염료의 보론산 기의 디올과 당의 디올이 시스-디올 작용에 의해 특이적으로 결합함으로써 아조-BA 염료의 스펙트럼 상 레드-시프트(red-shift) 및 육안으로도 관찰 가능한 색 변화가 일어나는 특성을 이용하여 당뇨병 진단이 가능한 당화단백질을 광학적으로 측정하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
특히, 아조-BA 염료를 이용한 당화단백질의 광학적 측정이 용액 상에서와 멤브레인 스트립(membrane strip) 상에서 모두 가능함을 보았고, 이 시스템이 임상학적으로도 적용 가능함을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 아조-BA 염료를 이용한 당화단백질의 광학적 측정방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법을 통하여 당화단백질의 광학적 바이오센서의 개발 가능성을 제공한다.
본 발명은 아조 보론산 염료 용액과 당화단백질 용액을 혼합 반응시켜 분광계(spectrometer)로 색 변화(red-shift)의 흡광도 값(Absorbance)을 측정하는 용액 상에서 당화단백질의 광학적 측정방법을 그 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 멤브레인 상에 아조 보론산 염료 용액과 당화단백질 용액의 혼합 반응 용액을 로딩(loading)하여 반사도값 측정기에서 반사도 값(% R)을 측정하는 멤브레인 상에서 당화단백질의 광학적 측정방법을 또 다른 특징으로 한다.
본 발명은 질병 진단의 중요한 지표 물질인 당화단백질의 측정을 위한 광학적인 바이오센싱 방법에 관한 것으로서, 용액 상에서 아조-BA 염료를 이용하여 당화단백질의 측정을 위한 최적 조건 실험들을 수행함으로써 결론적으로 질병 진단에 임상적으로 적용 가능한 측정 범위(3~15% 당화단백질)를 갖는 시스템을 구축하였다.
또한, 용액 상에서 뿐만 아니라 멤브레인 스트립 상에서도 여러 조건 실험들을 통해 아조-BA 염료를 이용한 당화혈색소의 측정이 임상적으로도 당뇨병 진단에 적용될 수 있는 시스템을 구축하였다. 용액 상에서의 센싱 시스템이 멤브레인 스트립 상에서도 가능함으로써 당뇨병 진단 산업화로의 상용화 가능성을 확인하였다. 이로서 고가의 항체나 단백질을 사용하지 않고, 또한 복잡한 측정 시스템을 이용하지 않고도 보론산을 포함하고 있는 화학 발색단을 이용하여 흡광도 값(Absorbance) 및 반사도 값(% Reflectance)의 측정을 통해 간단하고 빠른 %당화단백질의 바이오센싱이 가능하였다. 앞으로 더 나아가 아조-BA 염료의 특성을 이용하여 광학적으로 측정하는 시스템이 HbA1c 뿐만 아니라 다른 질병의 지표물질인 당화단백질이나 당들도 측정할 수 있으며, POCT(point-of-care-test)와 같은 시스템으로도 응용될 수 있을 것이라 판단된다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 특정 염료와 당화단백질 반응 후 붙지 않은 염료를 완전히 세척, 제거해야 하는 번거로움과, 완전한 제거가 어려운 경우에는 측정치를 신뢰할 수 없는 기존 당화단백질의 광학적 측정방법과는 달리, 아조 보론산 염료와 당화단백질이 결합 반응하여 생기는 에너지 전이에 의한 색변화(red-shift)가 일어나 별도의 세척 과정이 필요 없고 이로 인해 측정치의 신뢰성이 높은 새로운 당화단백질의 광학적 측정방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 당화단백질의 광학적 측정방법은 용액 상에서, 멤브레인 스트립 상에서 모두 가능하며, 이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
아조-BA 염료는 N. DiCesare와 J. R. Lakowicz에 의해 발표된 물질로, 페닐 보론산 기에 아로마틱 염료 기가 아조(azo, R-N=N-R’) 결합에 의해 직접적으로 연결된 형태이다. 이러한 아조-BA 염료의 구조는 다음 화학식 1과 같다. 아조-BA 염료는 495 nm의 파장에서 최대 흡광도 값을 나타내며, 중성 pH의 수용액 환경에서 용액 상 오렌지 빛의 색을 띤다. 또한, 아조-BA 염료는 당과 반응시키면 시스-디올 작용에 의해 결합을 함으로써 스펙트럼 상 최대 515 nm까지 red-shifting이 일어나고 용액 상 색깔이 오렌지 빛에서 붉은 보라 빛으로 변한다. 아조-BA 염 료의 보론산 기는 수용액 상에서 주로 도 1의 A와 같은 중성 상태(-B(OH)2)로 존재한다. 아조-BA 염료가 보론산 기에 아로마틱 염료 기가 아조 결합으로 연결된 구조를 함으로써 아조-BA 염료의 보론산 기는 CT(charge transfer) 능력을 가지게 된다. 그리하여 아조-BA 염료는 수용액 상의 OH-를 받아들여 도 1의 B와 같은 음이온 상태(-B(OH)3 -)가 되며, 아조-BA 염료의 광학적 특성 변화를 일으킬 수 있는 활성화 상태가 된다. 즉, 보론산 기의 중성 상태와 음이온 상태 간의 전자 특성 변화가 아조-BA 염료의 광학적 특성에도 영향을 주는 것이다. 이때, 수용액 상에 당이 존재하게 되면 도 1의 C와 같은 형태로 보론산 기와 당이 시스-디올 작용을 통해 결합한다. 그러므로 아조-BA 염료의 분광광도 특성뿐만 아니라 광물리(photophysical) 특성 변화가 초래되어 아조-BA 염료 흡수 밴드(absorption band)의 스펙트럼 시프트(red-shift) 및 육안으로도 관찰이 가능한 색 변화가 발생하게 된다. 또한, 아조-BA 염료가 중성 상태(도 1의 A)에서 당과 결합된 음이온 상태(도 1의 C)가 될 때, pKa 값이 8.5에서 6.1로 낮아지므로 중성 pH의 수용액 환경에서 최대의 스펙트럼 시프트 변화 및 색 변화가 일어난다[N. DiCesare and J. R. Lakowicz, “Spectral Properties of Fluorophores Combining the Boronic Acid Group with Electron Donor or Withdrawing Groups. Implication in the Development of Fluorescence Probes for Saccharides”, The Journal of Physical Chemistry A, vol. 105, pp.6834-6840, 2001.; N. DiCesare and J. R. Lakowicz, “New Color Chemosensors for Monosaccharides Based on Azo-Dyes”, Organic Letters, vol. 3, pp.3891-3893, 2001.; N. DiCesare, D. P. Adhikari, J. J. Heynekamp, M. D. Heagy and J. R. Lakowicz, “Spectroscopic and Photophysical Characterization of Fluorescent Chemosensors for Monosaccharides Based on N-phenylboronic Acid Derivatives of 1,8-Naphthalimide”, Journal of Fluorescence, vol. 12, pp.147-154, 2002.]. 이와 같은 광학적 특성 변화의 성질을 지닌 아조-BA 염료는 중성 pH 상태에서 당, 당단백질, 혹은 디올 물질들의 측정에 응용될 수 있다. 따라서, 아조-BA 염료의 특성을 기반으로 본 발명의 광학적 센싱에 적용한다.
[화학식 1]
Figure 112009038058658-PAT00001
본 발명에서는 발색단 염료로 보론산 기를 가지고 있는 아조-BA 염료를 이용하여 당화단백질 측정을 위한 광학식 바이오센서로서의 적용을 위해 모델 실험을 수행하였다. 아조-BA 염료 보론산기의 디올과 당의 디올이 시스-디올 작용에 의해 특이적으로 결합함으로써 아조-BA 염료의 스펙트럼 상 레드-시프팅(red-shifting) 및 육안으로도 관찰 가능한 색 변화가 일어나는 특성을 이용하여 당화단백질의 광학적 센싱 방법에 적용하였다. 용액 상에서 아조-BA 염료를 이용하여 당화단백질의 측정이 가능한지에 대한 여부와 센서로서 적용이 가능한지에 대한 여부의 확인 실험 및 여러 조건 실험들을 수행하여 용액 상에서 아조-BA 염료를 이용한 당화단백질의 검출이 가능함을 보였다. 용액 상에서 아조-BA 염료에 의해 분광광도법를 이용하여 당화단백질의 흡광도(Absorbance) 값을 측정을 위한 최적 조건 실험들을 수행함으로써 결론적으로 당뇨병 진단에 임상적으로 적용 가능한 측정 범위를 갖는 시스템을 구축하였다.
따라서, 본 발명은 아조 보론산 염료와 당화단백질을 용액 상 혼합 반응시켜 분광계(spectrometer)로 색 변화(red-shift)의 흡광도 값(Absorbance)을 측정하는 용액 상에서 당화단백질의 광학적 측정방법을 포함한다. 상기 혼합 반응은 15 ~ 35 ℃에서 5 ~ 20 분간, 특히 UV에 노출되지 않은 조건 하에서 실시하는 것이 바람직하다.
한편, 용액 상에서 이루어졌던 아조-BA 염료를 이용한 당화단백질의 광학적 센싱 방법을 상용화에 적용하기 위하여 그 가능성을 확인하고자 멤브레인 스트립 상에서의 측정 시스템으로 전환하여 실험을 진행하였다. 먼저, 멤브레인 스트립을 제작한 후, 당화단백질의 검출을 위한 여러 최적 조건 실험들을 수행한 결과 아조-BA 염료를 이용하여 당화단백질의 측정이 멤브레인 스트립 상에서도 가능함을 보였다. 멤브레인 상에서도 여러 조건 실험들을 통해 아조-BA 염료에 의해 반사도값 측정기를 이용하여 당화혈색소의 반사도(% Reflectance) 값을 측정이 임상적으로도 당뇨병 진단에 적용될 수 있는 시스템을 구축하였다.
따라서, 본 발명은 멤브레인 상에 아조 보론산 염료와 당화단백질의 혼합 반 응 용액을 로딩(loading)하여 반사도값 측정기에서 반사도 값(% R)을 측정하는 멤브레인 상에서 당화단백질의 광학적 측정방법을 포함한다. 상기 멤브레인 스트립은 플라스틱 스트립(strip)에 멤브레인을 부착시킨 후 메쉬(mesh)를 부착시켜 제조되며, 특히 멤브레인은 앞면과 뒷면이 비대칭이고, 공경(pore size)이 0.5 ~ 1.5 ㎛인 것 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 추가적으로 비이온성 계면활성제를 처리하여 친수성을 구현하여 당화단백질의 반사도 값 측정을 더 정확히 부여할 수 있다. 상기 비이온성 계면활성제로는 티리톤 X-100(TRITON X-100), Brij-35, Genapol X-080, Igepal CA-630 등이 바람직하다. 상기 혼합 반응은 15 ~ 35 ℃에서 5 ~ 20 분간, 특히 UV에 노출되지 않은 조건 하에서 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 측정 가능한 당화단백질은 당화알부민 또는 당화혈색소(Glycated Hemoglobin, HbA1c)이 바람직하다. 또한, 상기 용액 상 또는 멤브레인 스트립 상에서 당화단백질을 광학적으로 측정하기 위해서는 아조 보론산 염료 용액과 당화단백질 용액은 혼합시키고, pH 6.5 ~ 8.0(더욱 바람직하게는 pH 7.0 ~ 7.5)의 중성 조건 하에서 실시하는 것이 바람직하다.
특히, 본 발명에서의 목적하는 질환의 진단을 하기 위해서는 3 ~ 15 퍼센타일(%)의 당화단백질을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따른 당화단백질의 광학적 측정방법은 고가의 항체나 단백질을 사용하지 않고, 또한 복잡한 측정 시스템을 이용하지 않고도 보론산을 포함하고 있는 화학 발색단을 이용하여 흡광도 값(Absorbance) 및 반사도 값(% Reflectance)의 측정을 통해 간단하고 빠른 당화단백질의 바이오센싱이 가능하다.
또한, 특정 염료와 당화단백질 반응 후 붙지 않은 염료를 완전히 세척, 제거해야 하는 번거로움과, 완전한 제거가 어려운 경우에는 측정치를 신뢰할 수 없는 기존 당화단백질의 광학적 측정방법과는 달리, 아조 보론산 염료와 당화단백질이 결합 반응하여 생기는 에너지 전이에 의한 색변화(red-shift)가 일어나 별도의 세척 과정이 필요 없고 이로 인해 측정치의 신뢰성이 높은 장점이 있다.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
참조예 : 실험 재료 및 방법
GOX(Glucose oxidase, EC 1.1.3.4. from Aspergillus niger)는 Sigma 사에서 구입하였고, 당화혈색소(HbA1c)는 Fluka 사의 RM 405 Glycated haemoglobin in human haemolysate를 구매하여 사용하였다.
아조-BA 염료의 합성을 위해, 2-나프톨-3,6-디설폰산 디소디움 염(2-Naphthol-3,6-disulfonic acid disodium salt)은 Fluka 사에서, 4-아미노페닐보론산 피나콜 에스테르(4-Aminophenylboronic acid pinacol ester) 97%는 Aldrich 사에서 구매하였으며, 소디움 니트리트(Sodium nitrite, NaNO2)는 Daejung chemical 사에서 구매하여 사용하였다. PBS(0.1 M pH 7.2)은 Pierce 사로부터 구매해 만들어 사용하였고, 포스페이트 버퍼는 소디움 포스페이트 모노베이직(Sodium phosphate monobasic)과 소디움 포스페이트 디베이직 12-수(Sodium phosphate dibasic 12-water)를 Duksan pure chemical 사에서 구매하여 0.1M의 pH 7.2로 만들어 사용하였다. TRITON X-100은 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다.
실험에 사용된 모든 시약은 더 이상의 정제 과정 없이 사용하였으며, 모든 수용액은 비저항이 18 MΩqcm 이상인 증류 탈이온수(3차 증류수, DDW)를 사용하였다. 아조 벤조산 염료 용액이나 당화혈색소 용액은 모두 PBS(Phosphate Buffer saline)를 이용하였다.
NMR 분석 실험은 Varian Mercury plus 400(400 MHz)을 이용하여 수행하였다.
광학식 측정방법 중 용액 상 흡광도(Absorbance) 측정은 PerkinElmer 사의 Lambda 35 UV/VIS Spectrometer를 사용하였고, 멤브레인 스트립 상 반사도(% Reflectance) 값 측정은 allmedicus 사에서 제공한 Philosys 사의 Kinetics Station을 랩탑(laptop) 컴퓨터에 연결하여 전용 소프트웨어를 통해 수행하였다. 멤브레인 스트립 상 반사도(% Reflectance, % R) 값 측정 시 사용된 멤브레인 스트립은 allmedicus 사에서 제공해주는 플라스틱 스트립과 멤브레인, 메쉬(mesh)를 이용하여 제작하였다.
제조예 1: 아조 - BA 염료의 합성
보론산 기와 아로마틱 염료 기를 포함하는 아조-BA 염료의 합성은 N. DiCesare와 J. R. Lakowicz에 의해 발표된 프로토콜을 기반으로 수행하였다[N. DiCesare and J. R. Lakowicz, “New Color Chemosensors for Monosaccharides Based on Azo-Dyes”, Organic Letters, vol. 3, pp.3891-3893, 2001.](도 2).
먼저, 0 ℃에서 10 ㎖의 DDW와 1.5 ㎖의 HCl이 섞인 용액에 1 g의 4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)아닐린을 첨가하여 녹였다. 그 후 20 ℃에서 이 용액에 15 ㎖의 소디움 니트라이트 용액을 한 방울씩 떨어뜨려가면서 약 15분 동안 반응시켰다. 0 ℃에서 상기 생성된 4-보로노벤젠 디아조니움산 용액에 10 ㎖의 DDW에 녹인 3-하이드록시나프탈렌-2,7-디설폰산 디소이움 염 용액을 첨가하여 약 15 분 동안 섞어 주면서 반응시켰다. 이 반응으로 용액 내에 아조-BA 염료가 합성되었다. 그 다음에 실온에서 pH 6 정도의 20% NaOH로 염석(salting out)하여 아조-BA 염료가 합성된 용액 내 붉은색의 침전물을 얻었다. 이를 여과 과정을 거친 뒤 소량의 DDW와 아세톤으로 세척 과정을 거쳐줌으로써 부반응 물질들을 제거한 붉은색의 침전물인 합성된 아조-BA 염료만을 얻었다. 이렇게 침전과 정제 과정을 거친 아조-BA 염료를 진공 건조하여 분말의 형태로 얻었으며, 495.98의 분자량을 갖는다.
아조-BA 염료의 합성 및 구조 확인을 위하여 합성된 분말형태의 아조-BA 염료를 D2O에 녹여 NMR 분석 실험을 수행하였다. 이를 통하여 1H-NMR 스펙트럼을 기록하였다.
아조-BA 염료의 화학 구조에 상응하는 피크들을 도 3의 1H-NMR 스펙트럼에 ⅰ과 ⅱ로 표시하였다. 표시된 ⅰ은 보론산 기 디올의 1H-NMR 특성 피크를 나타내며, ⅱ는 보론산 기의 벤젠 링과 아로마틱 염료 기의 벤젠 링에 대한 1H-NMR 특성 피크를 나타내었다.
[용액 상에서의 흡광도 값 측정을 통한 광학적 측정을 통한 검출]
실시예 1: 아조 - BA 염료를 이용한 GOX ( Glucose oxidase ) 측정
아조-BA 염료와 GOX의 결합 반응을 확인하기 위하여, 다음과 같이 실험을 진행하였다.
4.92 x 10-2 mM 농도의 아조-BA 염료 용액과 0.5 mg/㎖과 1 mg/㎖ 농도의 GOX 용액을 준비하였다. 이때, 각 용액은 pH 7.2의 0.1 M PBS를 사용하였다. 이렇게 준비한 아조-BA 염료 용액과 각 농도의 GOX 용액을 1대 1의 부피비로 혼합하여 반응시켜 바로 분광계로 광학적 측정을 하였다. GOX와 반응하여 결합된 아조-BA 염료의 스펙트럼과 아조-BA 염료만의 고유 스펙트럼을 비교하기 위하여, 아조-BA 염료 용액과 DDW를 앞에서와 마찬가지로 1대 1의 부피비로 혼합하여 아조-BA 염료만의 고유 스펙트럼을 스캔하였다.
GOX는 잘 알려진 효소이면서 그 표면에 약 16% 정도의 당쇄를 포함하고 있는 당단백질이기도 하다[J. J. O’Malley and J. L. Weaver, “Subunit Structure of Glucose Oxidase from Aspergillus niger”, Biochemistry, vol. 11, pp.3527-3532, 1972.]. 따라서, 아조-BA 염료의 보론산과 GOX 표면의 당쇄 간의 시스- 디올 작용을 통하여 GOX의 광학적 센싱이 가능할 것이라 판단하였다. GOX 용액과 아조-BA 염료 용액을 혼합하여 반응시켜 줌으로써 GOX 표면의 당쇄와 아조-BA 염료의 보론산 기의 디올 간의 시스-디올 작용이 일어나 도 4의 (A)에서와 같이 결합하게 된다. 이와 같은 형태로 결합을 함으로써 변하는 아조-BA 염료의 광학적 특성을 이용하여 GOX의 측정을 수행하였다.
도 4의 (B)의 작은 그래프는 아조-BA 염료와 반응한 GOX 농도별로 스펙트럼들을 스캔한 결과이다. GOX와 반응하지 않은 아조-BA 염료의 스펙트럼을 보면 파장 495 nm에서 최대 흡광도를 보이고 있다. 그리고 GOX 농도가 높을수록 전체적으로 스펙트럼이 오른쪽으로 레드-시프트가 일어난 것을 확인할 수 있다. 농도에 따른 뚜렷한 차이를 보고자 파장 540 nm 부근의 스펙트럼을 확대하여 비교해 보니 도 4의 (B)와 같은 결과를 얻었다. GOX 농도에 따른 파장 543 nm에서의 흡광도를 비교하니 도 4의 (C)와 같은 결과를 얻었다. 이로서 아조-BA 염료와 반응하는 GOX의 농도가 높을수록 스펙트럼의 더 많은 레드-시프트의 결과를 가져왔고 그 결과 한 파장 대에서의 농도 별 흡광도를 비교하여 보면 농도가 높을수록 더 높은 흡광도를 나타냈다.
그리하여 아조-BA 염료를 이용한 GOX 농도별 측정이 가능함을 확인하였다. 따라서, 아조-BA 염료를 이용한 당단백질의 측정이 가능함을 확인하였다.
실시예 2: 당화혈색소 측정을 위한 용액 상에서의 최적화 조건 실험
1) 스펙트럼 상 레드 - 시프팅 확인 실험
아조-BA 염료만의 스펙트럼과 HbA1c만의 스펙트럼, 그리고 아조-BA 염료와 HbA1c가 반응하여 결합된 컨쥬게이트 스펙트럼들의 비교와 아조-BA 염료와 HbA1c가 반응하여 컨쥬게이트가 형성되면 스펙트럼의 레드-시프팅이 일어나는지에 대한 확인 실험을 위해 염분이 없는 pH 7.2의 0.1 M 포스페이트 버퍼를 사용하여 아조-BA 염료와 HbA1c의 농도를 최대한 묽게 제작하였다.
스펙트럼 간의 차이를 확인하기 위하여 아조-BA 염료 용액은 6.15 μM로 준비하였고 HbA1c 용액은 12.5 ㎍/㎖로 준비하였다. 아조-BA 염료만의 스펙트럼을 얻기 위해서는 DDW와 아조-BA 염료 용액을 혼합하였고, HbA1c만의 스펙트럼을 확인하기 위해서는 DDW와 HbA1c 용액을 혼합하였다. 그리고 아조-BA 염료와 HbA1c가 반응하여 결합된 컨쥬게이트의 스펙트럼을 확인하고자 아조-BA 염료 용액과 HbA1c 용액을 상온에서 혼합하여 약 5 분간 반응시킨 뒤 분광계로 측정하였다. 용액들의 모든 혼합은 부피비 1대 1로 하였다. 그리고 아조-BA 염료와 HbA1c가 결합함으로써 스펙트럼의 레드-시프팅이 일어나는 것을 확인하기 위해 6.15 x 10-1 μM의 아조-BA 염료 용액과 5, 7.5, 10 ㎍/㎖의 HbA1c 용액을 준비하였다. 아조-BA 염료 용액과 각 농도의 HbA1c 용액을 1대 1의 부피비로 혼합하여 상온에서 10 분 동안 반응시켰다. 그 후 분광계 측정을 통하여 기록된 스펙트럼들을 비교함으로 써 HbA1c 농도에 따라 스펙트럼의 레드-시프팅이 일어나는 정도를 확인하였다.
아조-BA 염료의 보론산 기은 HbA1c β 체인의 N-말단의 발린기에 있는 당과 시스-디올 작용에 의해 결합한다. 이에 대한 간단한 모식도를 도 5의 (A)에 나타내었다. 제일 먼저 아조-BA 염료와 HbA1c, 그리고 아조-BA 염료와 결합한 HbA1c 각각의 스펙트럼이 어떠한 차이가 있는지 확인이 필요했다. 그리하여 각각의 용액을 분광계로 측정하였다.
도 5의 (B)에서와 같이, 아조-BA 염료만의 스펙트럼은 파장 495 nm에서 최대 흡광도를 보이는 피크를 가졌으며 HbA1c만의 스펙트럼은 파장 415 nm에서 최대 흡광도를 보이는 피크를 가졌음을 확인하였다. 그리고 HbA1c와 반응한 아조-BA 염료의 스펙트럼은 아조-BA 염료의 스펙트럼과 HbA1c의 스펙트럼이 합쳐진 형태로 파장 415 nm와 495 nm 부근에 피크가 나타났다. 이에, 아조-BA 염료와 HbA1c의 결합으로 인한 스펙트럼의 레드-시프트가 뚜렷하게 나타나지 않아 이를 확인하는 실험이 필요했다. 이를 확인 실험을 위해 아조-BA 염료와 HbA1c의 농도를 최대한 묽게 제작한 용액들을 준비하였다. 먼저, 아조-BA 염료(6.15 x 10-1 μM) 용액을 분광계로 측정한 뒤 5, 7.5, 10 ㎍/㎖의 HbA1c를 아조-BA 염료와 각각 반응시킨 뒤 분광계로 측정하여 스펙트럼들을 HbA1c 농도별로 아조-BA 염료만의 스펙트럼과 비교하였다. 도 6에서 (A)는 아조-BA 염료와 5 ㎍/㎖의 HbA1c의 반응으로 일어난 시프트 정도를 나타내며, (B)는 아조-BA 염료와 7.5 ㎍/㎖의 HbA1c의 반응으로 일어난 시프트 정도를 나타낸 것이다. 그리고 도 6의 (C)는 아조-BA 염료와 10 ㎍/㎖의 HbA1c의 반응으로 일어난 시프트 정도를 나타낸 것이다. 도 6의 (A)와 (B), (C)에 나타낸 그래프와 화살표 길이의 차이처럼 HbA1c의 농도가 증가할수록 레드-시프트가 더 많이 일어나는 것을 보였다. 이 실험의 결과로 아조-BA 염료와 HbA1c의 반응으로 스펙트럼의 레드-시프트가 일어남을 확인하였고, 또한 아조-BA 염료와 반응하는 HbA1c의 농도가 높을수록 스펙트럼 상 일어나는 레드-시프트의 정도도 더 많이 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
2) UV 조사 유무에 따른 영향 확인 실험
첫 번째 최적 조건 실험으로 UV(ultraviolet) 조사 유무에 따른 영향 확인 실험을 수행하였다.
아조-BA 염료 용액(4.92 x 10-2 mM)과 HbA1c 용액(150 ㎍/㎖)을 충분한 양으로 준비하여 아조-BA 염료 용액과 DDW가 혼합된 용액, 그리고 아조-BA 염료 용액과 HbA1c 용액을 혼합하여 반응시킨 용액을 각각 두 쌍씩 준비하여 투명한 용기(vials)에 담았다. 모든 용액의 혼합은 부피비 1대 1로 하였다. 그리고 UV 램프를 준비하여 상온에 암실 조건의 공간을 제작하였다. 아조-BA 염료/DDW 용액과 아조-BA 염료/HbA1c 컨쥬게이트 용액의 한 쌍은 은박지로 용기를 감싸주어 UV 조사 시 노출이 되지 않도록 하였고, 남은 한 쌍은 UV 조사 시 노출이 되도록 투명 용기 그대로 두었다. 이 네 개의 용액을 UV 램프가 설치된 암실 조건의 공간 속에 넣었다. 측정은 UV 램프 상자에 넣기 직전에 각각의 용액을 한 번씩 측정하였고, 그 뒤 UV 램프 상자에 넣어 보관하면서, 이를 11 일 동안 여섯 번 측정하여 각각의 스펙트럼을 기록하여 비교하였다.
그 결과, UV에 노출시켰던 아조-BA 염료 용액의 스펙트럼뿐만 아니라 HbA1c와 반응시킨 아조-BA 염료 용액의 스펙트럼이 노출시키지 않았던 용액들의 스펙트럼에 비해 전체적으로 더 작은 흡광도 값의 찌그러진 형태의 스펙트럼으로 나타났다. 반면에 노출시키지 않았던 용액들은 여섯 번 측정할 때마다 스펙트럼 상 큰 변화가 없었고 흡광도 값에 있어서도 큰 차이가 없었다. UV에 노출된 용액들과 노출되지 않은 용액들의 각 스펙트럼을 비교하여 파장 495 nm에서 상대적으로 감소한 흡광도 값 차이의 결과를 도 7에 나타내었다. (A)는 아조-BA 염료 용액에 대한 결과이고, (B)는 HbA1c와 반응시킨 아조-BA 염료 용액에 대한 결과이다. UV에 노출된 아조-BA 염료 용액의 스펙트럼에서는 파장 495 nm에서 나타나는 아조-BA 염료만의 고유 피크가 점차 작아져 UV를 조사한지 11 일이 지난 후에는 그 피크 조차 나오지 않았다. 그리고 UV에 노출된 HbA1c와 반응한 아조-BA 염료 용액의 스펙트럼에서는 파장 495 nm에서의 아조-BA 염료만의 고유 피크뿐만 아니라 파 장 415 nm에서 나타나는 HbA1c만의 고유 피크도 점차 작아져 11 일이 지난 후에는 그 피크가 제대로 나타나지 않았다. 그리하여 흡광도 값 차이를 비교하였을 때 전체적으로 약 35~40%의 감소율을 보였다. 즉, HbA1c 뿐만 아니라 아조-BA 염료 역시 UV 조사에 의해 매우 파괴적인 영향을 받았다.
따라서, 아조-BA 염료를 이용하여 HbA1c를 측정할 시에는 UV에 대한 영향을 받지 않는 시스템 환경 내에서 이루어져야 함을 확인하였다.
3) 용액 상 pH 에 따른 영향 확인 실험
용액 상의 pH 변화에 따라 아조-BA 염료가 어떠한 영향을 받는지, 그리고 아조-BA 염료와 HbA1c의 반응에도 영향을 주는지 확인하기 위하여, 다음과 같이 수행하였다.
0.1 M, pH 7.2의 PBS의 pH를 조절하여 pH 9.2와 pH 10.1을 만들었다. pH 7.2와 9.2, 10.1의 PBS로 pH에 따라 각각 4.92 x 10-2 mM의 아조-BA 염료 용액과 10, 50, 100 ㎍/㎖의 HbA1c 용액을 준비하였다. 아조-BA 염료 용액과 HbA1c 용액을 이전 실험과 동일하게 1대 1의 부피비로 혼합하여 분광계로 측정하여 그 스펙트럼들을 비교하였다.
pH 7.2, pH 9.2, pH 10.1의 PBS로 각각 준비한 아조-BA 염료 용액(4.92 x 10-2 mM)과 농도별 HbA1c 용액(10, 50 100 ㎍/㎖)을 반응시킨 후 분광계로 측정하여 도 8과 같은 결과를 얻었다. 도 8의 (A), (B), (C) 각각 상단 그래프(top)는 파장 300 nm에서 600 nm까지 스펙트럼을 스캔한 뒤 파장 550 nm 부근의 스펙트럼을 확대한 것이고, 하단 그래프(bottom)는 파장 543 nm에서의 각 HbA1c 농도 별 흡광도 값을 비교한 것이다. pH 7.2 환경에서 아조-BA 염료와 HbA1c의 반응 후 측정 결과를 보면 도 8의 (A)에서와 같이 HbA1c 농도에 따라 스펙트럼 상 red-shift가 일어나 파장 543 nm에서 HbA1c 농도별 흡광도 값을 비교해 보니 농도가 증가할수록 흡광도 값 역시 증가하였다. 그러나, 용액 상 pH 9.2나 pH 10.1의 환경에서 아조-BA 염료와 HbA1c를 반응시킨 뒤 측정한 결과를 보면 도 8의 (B)와 (C)에서처럼 HbA1c 농도에 따라 스펙트럼 상 오른쪽으로의 레드-시프트가 아닌 반대 방향으로의 시프트가 일어났다. 그리하여 파장 543 nm에서 HbA1c 농도에 따른 흡광도 값을 비교해 보면 농도가 증가할수록 흡광도 값은 감소하여 나타났다. 그 흡광도의 감소 형태도 무작위로 농도에 따라 경향성 없이 감소하여 HbA1c 농도에 따른 정확한 비교가 힘들었다. 이런 결과를 얻은 데에는 아조-BA 염료의 pKa 값과 관련이 있다. 아조-BA 염료의 경우 pKa 값이 8.5이고 용액 상에 당(sugar) 존재 시 당과 결합하여 그 pKa 값이 6.1로 변한다[N. DiCesare and J. R. Lakowicz, “New Color Chemosensors for Monosaccharides Based on Azo-Dyes”, Organic Letters, vol. 3, pp.3891-3893, 2001.]. 당화단백질인 HbA1c와 결합된 상태의 아조-BA 염료의 낮은 pKa 값과 차이가 많이 나는 높은 pH의 환경으로 인하여 아조-BA 염료의 보론 산기가 음이온(anionic) 상태에서 전자 전이(electron transfer)의 능력이 손실되어 레드-시프트(red-shift)가 아닌 그 반대의 블루-시프트(blue-shift)가 일어났다[N. DiCesare and J. R. Lakowicz, “Spectral Properties of Fluorophores Combining the Boronic Acid Group with Electron Donor or Withdrawing Groups. Implication in the Development of Fluorescence Probes for Saccharides”, The Journal of Physical Chemistry A, vol. 105, pp.6834-6840, 2001.]. 본 실험의 결과를 바탕으로, 용액 상에서 아조-BA 염료를 이용한 HbA1c의 측정은 중성의 pH 환경 조건 하에서 이루어져야 함을 확인하였다.
4) 아조 - BA 염료와 HbA1c 의 반응 시간에 따른 영향 확인
스펙트럼의 레드-시프팅이 일어날 수 있는 아조-BA 염료와 HbA1c의 반응 시간을 찾는 것에 대한 실험을 수행하였다.
4.92 x 10-2 mM의 아조-BA 염료 용액과 150 ㎍/㎖의 HbA1c 용액을 준비하였다. 아조-BA 염료 용액과 DDW를 혼합한 용액, 그리고 HbA1c 용액과 아조-BA 염료 용액을 반응시킨 용액을 준비하였다. 이때, 용액들의 혼합은 부피비 1대 1로 하였다. 이렇게 준비한 두 종류의 용액을 분광계를 이용하여 20 분 동안 1 분 간격으로 스펙트럼을 스캐닝하였다. 기록한 스펙트럼을 비교하여 그 결과를 분석하였다(0.1 M PBS, pH 7.2 조건 하에서).
도 9의 (A)는 각 용액들을 20 분 동안 1 분 간격으로 스캔한 스펙트럼들을 비교한 것으로 (a)는 아조-BA 염료의 스펙트럼들이고 (b)는 HbA1c와 반응시킨 아조-BA 염료의 스펙트럼들이다. (a)와 (b) 둘 다 20 분 동안 거의 같은 흡광도 값을 갖는 형태의 스펙트럼이 나타났으며, 아조-BA 염료와 HbA1c의 결합으로 (b)가 (a)보다 조금 오른쪽으로 레드-시프트된 형태의 스펙트럼으로 나타났다. 좀 더 정확한 비교를 위해 각각의 스펙트럼들에서 파장 543 nm에서의 흡광도 값 차이를 반응 시간대 별로 비교했다[도 9의 (B)]. 그 결과 1 분마다 측정된 흡광도 값이 아조-BA 염료는 평균 0.07 정도, HbA1c와 반응한 아조-BA 염료는 평균 0.10 정도로 매분 거의 일정한 값을 보였다. 이를 통해 아조-BA 염료와 HbA1c의 결합 반응 역시 즉각적으로 일어나는 것을 확인하였고, 이런 빠른 결합 반응으로 용액 상에서 아조-BA 염료를 이용하여 HbA1c를 광학적으로 측정할 때, 그 측정 시간이 단축된다는 장점을 얻을 수 있었다.
5) 아조 - BA 염료를 이용한 퍼센타일 (%) HbA1c 측정
당뇨병(Diabetes Mellitus, DM) 진단을 위한 HbA1c 측정에서는 주로 퍼센타일(%) HbA1c, 즉 %HbA1c를 진단 기준의 표준 단위로 이용하며, 이 %HbA1c는 당화혈색소인 HbA1c 양을 전체 혈색소(hemoglobin) 양에 대한 퍼센타일(%)로 나타낸 것이다
아조-BA 염료를 이용한 HbA1c의 용액 상 측정이 임상학적으로도 적용 가능하게 하기 위하여 HbA1c 퍼센타일(%)별 보정 곡선(calibration curve)을 얻고자 선행 실험들의 결과로부터 얻은 최적 조건을 토대로 아조-BA 염료를 이용하여 %HbA1c 별 측정 실험을 진행하였다. 측정을 위해 pH 7.2의 0.1 M PBS를 이용하여 0, 3, 6, 7, 9, 12, 15%의 HbA1c 용액을 준비하였고 아조-BA 염료 용액은 4.92 x 10-2 mM로 준비하였다. 제작한 각 퍼센타일별의 HbA1c 용액과 아조-BA 염료 용액은 1대 1의 부피비로 혼합하여 분광광도법으로 측정하였다. 그리하여 각 퍼센타일별 HbA1c에 대한 스펙트럼을 기록하였고, 그 결과로 응답곡선(response curve)과 보정 곡선(calibration curve)을 얻었다.
도 10의 (A)는 아조-BA 염료와 반응한 HbA1c 퍼센타일에 따른 스펙트럼들을 스캔하여 파장 550 nm 부근 대를 확대하여 나타낸 그래프이다. HbA1c 퍼센타일에 따라 스펙트럼 상 레드-시프트가 되는 정도가 달랐으며 아조-BA 염료와 반응하는 HbA1c가 더 많을수록, 즉 %HbA1c가 높을수록 더 많은 레드-시프트가 일어났다. 따라서, 한 파장(파장 543 nm) 대에서 %HbA1c에 따른 흡광도 값 차이의 비교가 가능하였고, HbA1c의 퍼센타일이 높을수록 더 높은 값의 흡광도 값을 나타냈다[도 10의 (B)]. 이로서 3% HbA1c에서 15% HbA1c까지 신뢰할 수 있는 측정 범위를 갖는 보정 곡선을 얻었고, 2.1%의 LOD(Limit of Detection) 값을 얻었다[도 10의 (B)]. 결과적으로 얻은 3~15% HbA1c의 측정범위는 당뇨병 진단 기준 범위에 속하며, 이로서 본 시스템이 충분히 임상적으로도 적용 가능함을 확인하였다.
[ 멤브레인 스트립 상에서의 반사도(% Reflectance ) 값 측정을 통한 검출]
제조예 2: 멤브레인 스트립의 제작
멤브레인 스트립 상에서의 검출을 위해 일단 먼저 스트립을 제작해야 한다. 플라스틱 소재로 된 스트립은 0.6 cm x 4.8 cm의 크기이며 이 스트립의 가운데 부분과 끝 부분에 각각 구멍이 뚫려 있다. 끝 부분의 작은 구멍은 반사도 값 측정 시 스트립이 측정기에 걸릴 수 있게 뚫린 것이다. 이로서 스트립이 측정기에 잘 맞물려 고정되면 가운데 부분의 구멍이 측정기의 LED(light-emitting diode) 부분과 정확히 교차되는 위치에 놓이도록 제작되었다. 반사도 값 측정 시 이 가운데 구멍을 통해 LED의 빛이 통과할 수 있다.
이런 플라스틱 스트립을 이용한 멤브레인 스트립 제작은 두 단계로 나눌 수 있다. 그 첫 단계는 플라스틱 스트립에 멤브레인을 부착하는 것이다. 본 발명에 사용된 멤브레인의 구멍(pore)들은 비대칭 형태로 구성되어 있어 앞면과 뒷면이 구분되었다. 따라서, 스트립 제작 시 측정하고자 하는 의도에 따라 멤브레인의 앞, 뒤 면을 구분하여 제작할 수 있다.
멤브레인들은 0.6 cm x 0.6 cm의 크기로 절단하여 사용하였다. 그리고 나서 두 번째 단계로 멤브레인이 부착된 스트립에 0.6 cm x 1.5 cm 크기로 준비한 메쉬(mesh)를 부착하여 멤브레인 스트립 제작을 완성하였다. 이때, 메쉬는 측정하고자 하는 샘플 용액을 로딩하였을 때 그 용액이 멤브레인 상에 골고루 퍼져 잘 스며들도록 해준다. 멤브레인 스트립의 제작에 대한 간단한 모식도를 도 11에 나타내었다.
실시예 3: 반사도 값 측정을 위한 영점 보정
상기 제조예 2에서 제작한 멤브레인 스트립을 이용하여 반사도 값(% Reflectance)을 측정하는 방법은 다음과 같다.
분광광도법으로 측정 시 처음에 오토-제로(auto-zero) 혹은 블랭크(blank, zero-point)를 잡아주듯이 마찬가지로 반사도 값 측정 시에도 제일 먼저 영점(zero-point)을 잡아주었다. 즉, 제작한 스트립을 반사도 값 측정기에 꽂아 고정시킨 뒤 고정된 파장의 LED(파장 540 nm) 빛을 스트립의 멤브레인 부분에 조사함으로써 영점 보정하였다.
그 다음 측정할 아조-BA 염료/샘플 용액을 멤브레인 스트립의 멤브레인 부분에 로딩하였다. 아조-BA 염료/샘플 로딩 후에는 측정기에서 반사도 값을 자동적으로 3 분 동안 측정하게 된다. 이와 같은 반사도 값 측정의 과정을 도 12에 간단한 모식도로 나타내었다.
실시예 4: 당화혈색소 측정을 위한 멤브레인 스트립 상에서의 최적화 조건 실험
1) 멤브레인의 공경( pore size )에 따른 영향 확인
멤브레인 스트립 상에서 본 발명의 목표 물질인 HbA1c을 측정하기 위해, 스트립 제작 시 적용 가능한 멤브레인은 공경(pore size)이 0.5 ~ 1.5 ㎛ 정도의 멤브레인이 가장 적합하다. 따라서, 멤브레인 공경(pore size)에 따라 측정된 반사도 값에 있어 어떠한 차이가 있는지, 그리고 본 발명에 어떤 공경(pore size)의 멤브레인이 가장 적합한지에 대한 확인이 필요하다고 판단했다. 공경(pore size)이 0.5 ㎛인 멤브레인과 0.7 ㎛인 멤브레인으로 두 종류의 스트립을 제작하였으며, 미리 0.1 mM의 아조-BA 염료 용액과 1대 1의 부피비로 혼합하여 15~35 ℃에서 5~20분 동안 반응시킨 15%의 HbA1c 용액을 각각의 공경(pore size)별로 제작한 멤브레인 스트립을 이용하여 8 ㎕씩 로딩하여 바로 측정하여 반사도 값(% Reflectance)을 기록하였다.
도 13의 (A)는 공경(pore size)이 0.5 ㎛인 멤브레인 스트립으로, (B)는 공경(pore size)이 0.7 ㎛인 멤브레인 스트립으로 반사도 값을 측정한 것으로 각 그래프에서 -○-은 아조-BA 염료 용액만을 로딩하였을 때이고, -●-은 아조-BA 염료와 HbA1c를 반응시킨 용액을 로딩하였을 때이다. 각 그래프에서 180 초대의 아조-BA 염료의 반사도 값과 15% HbA1c와 반응한 아조-BA 염료의 반사도 값 차이를 비교하여 나타낸 것이 도 13의 (C)이다. 0.7 ㎛ 공경(pore size)의 멤브레인 스트립에서의 반사도 값 차이(△ %R = 1.32)가 0.5 ㎛ 공경(pore size)의 멤브레인 스트립에서의 반사도 값 차이(△ %R = 0.94)보다 더 크게 나타났다. 이로서 멤브 레인 스트립 상에서 HbA1c를 측정하기 위한 스트립은 0.7 ㎛의 공경(pore size)을 갖는 멤브레인을 이용하여 제작하는 방식으로 채택하였다. 같은 측정 범위의 퍼센타일별 HbA1c를 측정할 때, 각 퍼센타일 마다 좀 더 큰 차이의 반사도 값을 보이며 측정되는 시스템이 바이오센싱을 하는 본 발명의 의도에 적합하다고 판단하였기 때문이다.
2) 멤브레인 앞, 뒷면에 따른 영향 확인
멤브레인은 구멍(pore)이 비대칭 형태로 구성되어 있어 멤브레인의 앞면과 뒷면의 구분이 가능하다. 즉, 멤브레인의 앞면이 뒷면에 비해 공경(pore size)이 조금 더 크다. 이는 육안으로도 확실히 구분되었다. 앞면은 뒷면에 비해 공경(pore size)이 조금 더 크기에 그 표면이 시각적으로 좀 거칠어 보였으며, 뒷면은 공경(pore size)이 상대적으로 조금 작아 그 표면이 좀 매끈해 보였다. 이런 차이를 가지고 멤브레인 앞면으로 제작한 스트립과 멤브레인 뒷면으로 제작한 스트립을 준비하였다. 그리고 아조-BA 염료 용액 0.1 mM과 농도별 HbA1c 용액(5, 10, 15% HbA1c 용액)을 각각 혼합하여 15~35 ℃에서 5~20분 동안 반응시켰다. 혼합 비율은 부피비 1대 1로 하였다. 이렇게 반응시킨 용액을 두 종류로 제작한 스트립에 각각 8 ㎕씩 로딩하여 반사도 값(% Reflectance)을 측정하였다.
도 14의 (A)는 멤브레인 앞면으로, (B)는 멤브레인 뒷면으로 제작한 스트립 을 이용하여 180 초 동안 HbA1c 퍼센타일별로 반사도 값을 측정하여 스캔한 그래프이다. (A)와 (B) 모두 HbA1c의 퍼센타일이 높을수록 낮은 반사도 값을 갖는 결과를 얻었다. 그리고, 각각 퍼센타일 마다 눈에 띄는 반사도 값 차이를 보이며, 측정되었다. 그러나, (A)와 (B)에서 180 초대에서의 퍼센타일별 반사도 값 차이를 비교해 보면, (A)에서의 결과 보다 (B)에서의 결과가 HbA1c 각각의 퍼센타일 마다 좀 더 큰 차이의 반사도 값을 보였다[도 14의 (C)].
이로서 본 발명인 멤브레인 스트립 상에서 HbA1c 퍼센타일별 광학적 센싱을 위해서는 멤브레인의 뒷면으로 제작한 스트립을 이용하는 것이 적합함을 확인하였다. 같은 측정 범위의 HbA1c를 퍼센타일별로 측정하더라도 좀 더 큰 차이의 신호 값으로 각 HbA1c 퍼센타일 마다의 정확한 측정 구분이 가능한 센싱 방법이 본 발명의 목적과 상응된다고 판단되었다.
3) 멤브레인에 계면활성제 처리에 따른 영향 확인
멤브레인에 좀 더 친수성(hydrophilic)을 부여하여 스트립을 제작한다면 반사도 값 측정을 위한 샘플 로딩 시 샘플 용액이 멤브레인 상으로 좀 더 빠르고 고르게 스며들어 퍼질 것이라 판단되었다. 멤브레인에 친수성을 구현하고자 계면활성제(surfactant)인 TRITON X-100을 선정하였다.
스트립 제작 전 제작할 멤브레인을 0.1%의 TRITON X-100 용액에 약 30 분 동 안 담가두었다가 상온에서 약 30 분간 건조시켰다. 이렇게 TRITON X-100이 처리된 멤브레인과 아무것도 처리하지 않은 멤브레인을 가지고 스트립을 제작하였다. 0.1 mM의 아조-BA 염료 용액과 5, 10, 15%의 HbA1c 용액을 준비하였다. 각각의 스트립을 이용하여 먼저 아조-BA 염료만의 반사도 값(% Reflectance)을 측정하였고 그 다음에 아조-BA 염료 용액과 HbA1c 용액을 15~35 ℃에서 5~20분 동안 반응시켜 반사도 값을 측정하였다. 이때, 반응은 부피비 1대 1로 하였으며, 반응시킨 측정 용액은 스트립에 모두 8 ㎕씩 로딩하였다.
반사도 값 측정은 HbA1c 퍼센타일별로 180 초 동안 하였으며, 180 초대에서 %HbA1c에 따른 반사도 값들의 차이를 도 15에 나타내었다. (A)의 경우는 TRITON X-100이 처리된 멤브레인 스트립을 이용하여 측정한 결과이고, (B)의 경우는 TRITON X-100이 처리되지 않은 멤브레인 스트립을 이용하여 측정한 결과이다. (A)와 (B)의 결과를 비교해 봄으로써 TRITON X-100이 처리된 멤브레인 스트립을 이용하여 HbA1c 퍼센타일별 반사도 값을 측정한 것이 각각의 HbA1c 퍼센타일 마다 좀 더 일정한 크기의 변화로 반사도 값 차이를 보이며 측정되었다. 그리고 그 측정값들의 linear fit을 통하여 얻은 일차식의 신뢰도 값 역시 (B)의 경우 약 98%이였으나, (A)의 경우 약 99%였다. 1%의 작은 차이지만 멤브레인에 TRITON X-100을 처리하여 친수성을 구현함으로써 멤브레인 스트립 상에서 아조-BA 염료를 이용한 %HbA1c의 반사도 값 측정에 좀 더 정확성을 부여한다고 판단하였다. 그리하여 본 발명은 멤브레인을 TRITON X-100에 처리한 뒤 스트립을 제작하여 수행하는 것이 더욱 바람직하다.
4) 아조 - BA 염료를 이용한 퍼센타일 (%) HbA 1c 측정
아조-BA 염료를 이용한 용액 상에서의 HbA1c 퍼센타일 별 흡광도 값 측정이 당뇨병의 임상적 진단으로서 적용 가능함을 확인하였듯이, 멤브레인 스트립 상에서의 반사도 값 측정 또한 임상적으로 적용 가능하도록 하기 위하여 %HbA1c에 따른 보정 곡선을 얻고자 하였다. 사전에 멤브레인 스트립 상의 최적 조건을 찾기 위한 선행 실험들로부터 얻은 결과를 바탕으로 멤브레인 스트립을 제작하여 HbA1c 퍼센타일별 반사도 값 측정을 하였다. 즉, 멤브레인 스트립은 0.7 ㎛의 공경(pore size)을 갖는 멤브레인을 선택하여 0.1%의 TRITON X-100을 처리한 뒤 멤브레인 뒷면으로 스트립을 제작하여 이용하였다. 그리고 0, 3, 6, 7, 9, 12, 15%의 HbA1c 용액과 0.0125 mM의 아조-BA 염료 용액을 준비하였다. 각 용액들은 각각 부피비 1대 1로 반응시킨 뒤 측정 스트립에 8 ㎕씩 로딩하여 반사도 값(% R)을 측정하였다.
도 16의 (A)는 3분 동안 HbA1c 퍼센타일별로 반사도 값을 측정한 것으로 %HbA1c가 높을수록 낮은 반사도 값을 보였다. 그리고 각각의 퍼센타일 마다 뚜렷한 반사도 값 차이를 보였다. 이는 180 초대에서 %HbA1c별 반사도 값 차이를 비교함으로써 확인할 수 있었다. 도 16의 (B)에 나타낸 것과 같이, 3~15% HbA1c의 측정범위를 신뢰할 수 있는 보정 곡선을 얻었고, 1.4%의 LOD(Limit of Detection) 값을 얻었다. 용액 상에서와 마찬가지로 멤브레인 스트립 상에서도 당뇨병 진단에 임상적으로 적용 가능한 측정 범위를 갖는 시스템을 구축하였다. 따라서, 멤브레인 스트립 상에서 아조-BA 염료를 이용하여 %HbA1c를 광학적으로 센싱하는 시스템의 상용화 또한 가능할 것이라 판단하였다.
도 1은 당 결합 여부에 따른 아조-BA 염료 보론산기의 다른 형태를 나타낸 것이다
도 2는 아조-BA 염료 합성 반응식을 나타낸 것이다.
도 3은 D2O에서 아조-BA 염료의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 아조-BA 염료와 GOX의 결합 반응을 확인한 것이다.
도 5는 아조-BA 염료와 HbA1c의 결합 반응을 확인한 것이다.
도 6은 HbA1c 농도별로 아조-BA 염료의 스펙트럼을 비교한 것이다.
도 7은 아조-BA 염료 용액(A)과 HbA1c와 반응시킨 아조-BA 염료 용액(B)에 대한 UV 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 아조-BA 염료와 HbA1c와 반응시킨 아조-BA 염료에 대한 pH 효과를 나타낸 것이다[(A) pH 7.2, (B) pH 9.2, (C) pH 10.1].
도 9는 아조-BA 염료와 HbA1c의 반응 시간에 따른 영향을 확인한 것이다.
도 10은 용액 상에서의 %HbA1c별 보정 곡선을 나타낸 것이다.
도 11은 멤브레인 스트립 제작에 대한 간단한 모식도이다.
도 12는 멤브레인 스트립을 이용한 반사도 값 측정 과정에 대한 모식도이다.
도 13은 공경(pore size)이 0.5 ㎛(A)와 0.7 ㎛(B)인 멤브레인 스트립으로 반사도 값을 측정한 것이다.
도 14는 멤브레인 앞면(A)과 멤브레인 뒷면(B)으로 각각 제작한 스트립을 이용하여 180 초 동안 HbA1c 퍼센타일별로 반사도 값을 측정한 것이다.
도 15는 TRITON X-100이 처리된 멤브레인 스트립(A)과 TRITON X-100이 처리되지 않은 멤브레인 스트립(B)에 대한 %HbA1c에 따른 반사도 값들의 차이를 측정한 것이다.
도 16은 멤브레인 스트립 상에서의 %HbA1c별 보정 곡선을 나타낸 것이다.

Claims (12)

  1. 아조 보론산 염료 용액과 당화단백질 용액을 혼합 반응시켜 분광계(spectrometer)로 색 변화(red-shift)의 흡광도 값(Absorbance)을 측정하는 것을 특징으로 하는 용액 상에서 당화단백질의 광학적 측정방법.
  2. 멤브레인(membrane)에 아조 보론산 염료 용액과 당화단백질 용액의 혼합 반응 용액을 로딩(loading)하여 반사도값 측정기에서 반사도 값(% R)을 측정하는 것을 특징으로 하는 멤브레인 상에서 당화단백질의 광학적 측정방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 아조 보론산 염료는 다음 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 측정방법.
    [화학식 1]
    Figure 112009038058658-PAT00002
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 당화단백질은 당화혈색소(Glycated Hemoglobin, HbA1c) 또는 당화알부민인 것을 특징으로 하는 측정방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 반응은 15 ~ 35 ℃에서 5 ~ 20 분간 실시하는 것을 특징으로 하는 측정방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 반응은 UV에 노출되지 않은 조건 하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 측정방법.
  7. 제 2 항에 있어서, 상기 멤브레인은 앞면과 뒷면이 비대칭인 것을 특징으로 하는 측정방법.
  8. 제 2 항에 있어서, 상기 멤브레인은 공경(pore size)이 0.5 ~ 1.5 ㎛인 것을 특징으로 하는 측정방법.
  9. 제 2 항에 있어서, 상기 멤브레인에 추가적으로 비이온성 계면활성제를 처리하는 것을 특징으로 하는 측정방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 반응은 pH 6.5 ~ 8.0에서 실시하는 것을 특징으로 하는 측정방법.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 당화단백질은 3 ~ 15 퍼센타일(%)의 당화단백질인 것을 특징으로 하는 측정방법.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 측정방법은 당뇨병 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는 측정방법.
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