KR102255158B1 - 당 검출용 센서와 이의 제조방법 및 이를 이용한 당화 혈색소 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 보로닉 애시드(boronic acid)가 수식되어 3차원 망상 구조를 갖는 하이드로젤(hydrogel)로 합성된 반응층을 포함하는 당 검출용 센서와 이의 제조방법 및 이를 이용한 당화 혈색소 검출 방법에 관한 것으로, 높은 신호 수준을 통해 혈액 내 글루코스(glucose)또는 당화 혈색소(glycated hemoglobin; HbA1c)를 포함하는 당화 단백질(glycated protein)의 선택적이고 민감한 검출을 가능하게 하고, 이러한 당(saccharide) 검출용 센서의 내구성을 향상시키는 효과가 있다.

Description

당 검출용 센서와 이의 제조방법 및 이를 이용한 당화 혈색소 검출 방법 {Sensor for detecting saccharide and manufacturing method thereof and detection method of glycated hemoglobin using the same}
본 발명은 당(saccharide) 검출용 센서에 관한 것으로, 보다 상세하게는 보로닉 애시드(boronic acid)가 수식되어 3차원 망상 구조를 갖는 하이드로젤(hydrogel)로 합성된 반응층을 포함하는 당 검출용 센서와 이의 제조방법 및 이를 이용한 당화 혈색소 검출 방법에 관한 것이다.
고도의 산업화에 의한 비만인구의 증가와 기대수명의 증가로 인해 당뇨병(diabetes mellitus, DM)은 모든 연령대에 빈번히 발병되며 그 수가 점차 증가 하고 있는 질병이다.
당뇨병의 혈당 정도를 반영하는 중요한 지표로 가장 많이 이용되고 있는 것은 혈당(blood glucose)과 당화 혈색소(glycated hemoglobin; HbA1c)이다. 이 중 특히 당화 혈색소는 검사 시 공복 및 약물 복용 여부에 따른 검사상의 오류가 적고 당뇨병 환자의 채혈시점 이전 혈당치의 장기적인 상황을 추측할 수 있어 장기간의 혈장 조절 평가에 유용하며 그 특이도가 좋아 당뇨병 및 합병증을 예측하는데 좋은 지표로 알려져 있다. 적혈구의 수명이 120일인 것을 감안해 볼 때, 당화 혈색소는 최근 1 ~ 3개월간의 평균적인 혈당 상태를 반영하며, 특히 1개월간의 혈당 변화를 집중적으로 반영한다.
따라서 혈당에 더하여 당화 혈색소의 검사를 통한 당뇨병의 진단과 치료 과정의 판단 지표로써의 중요성이 강조되고 있으며 2010년 미국당뇨학회는 당뇨진단에 있어 당화 혈색소 검사를 수행하도록 진단기준을 정비하는 등의 적극적 대응을 보이고 있다.
당화 혈색소의 정량기준은 혈색소 총량에 대한 당화 혈색소의 분획의 백분율(%)로 나타내며 당뇨병 환자가 아닌 정상인의 경우 5 ~ 6% 이하 수준의 당화 혈색소가 존재한다. 당뇨병 환자의 경우 이 혈중 당화 혈색소의 비율은 7%를 초과하는 수준으로 증가하며 7% 부근의 당화 혈색소 비율을 갖는 사람의 경우 추가적인 관리를 통해 혈당 수치에 대한 조절 및 적극적 대책이 요구된다. 따라서 당화 혈색소 측정에 있어 가장 큰 의의를 갖는 검출농도는 당화 혈색소 7% 구간이며, 이를 기준으로 6.9%와 7% 사이의 차이를 명확히 구분할 수 있는 민감한 당화 혈색소 측정 시스템의 개발이 중요하다.
민감하고 정확한 목표 물질의 검출을 위해서는 검출목표 물질에 대해 높은 선택성과 반응 효율성을 가진 반응층의 개발 및 적용이 중요하다. 이 때 반응층은 적은 양의 검출목표 물질에 선택적으로 반응하여야 하며 높은 수준의 반응 수율이 보장되어야 한다. 이를 위해서는 검출목표 물질과 반응하는 인식물질이 높은 농도로 반응층에 존재하여야 한다.
일반적으로 바이오센싱 기판(substrate)에 대한 타겟 인식물질의 고정화를 위해 단순 흡착, 정전기적 결합, 자가조립 단분자막(self-assembled monolayer; SAM) 등의 방법이 사용되어 왔으며, 특히 SAM 기술의 경우 고체기판 표면에 대해 잘 정렬된 2차원적 생체물질의 고정화를 가능하게 하며 타 기술에 비해 상대적으로 용이한 표면 개질 및 생체물질 처리공정을 제공하기 때문에 전기화학 및 광학식 바이오센서의 제작에 널리 사용되고 있다.
하지만 SAM이 적용된 반응층에서 검출목표 물질은 2차원 평면의 제한된 면적에 단층 수준으로만 결합하게 되며 이는 보다 많은 검출목표 물질과의 결합반응에 공간적 제약을 야기한다. 또한 SAM의 경우 일반적으로 금 또는 화학처리 된 실리콘계열의 기판과 같은 제한적인 재료에만 적용이 가능하다는 단점을 지닌다.
따라서 2차원 평면이 아닌 3차원의 입체적 구조를 가지고, 해당 구조에 타겟 인식물질이 높은 밀도로 집적되어 있으면서 보다 효율적이고 민감하게 검출목표 물질을 인식할 수 있는 새로운 구조의 반응층의 개발 및 도입에 대한 관심이 증대되고 있다. 더하여 종래의 금속 전극 등과 같은 높은 제작단가를 갖는 기판이 아닌 종이 또는 멤브레인과 같은 보다 경제적인 재료로 조성된 기판에의 적용이 가능한 반응층의 개발 역시 요구되고 있다.
당화 혈색소 바이오센서에 있어서는 일반적으로 당류 물질과의 cis-diol 결합이 가능한 보로닉 애시드(boronic acid; BA)를 당화 혈색소 인지물질로 사용하고 있으며 머캅토페닐 보로닉애시드(mercaptophenyl boronic acid)와 같은 물질로 금 전극 표면에 보로닉 애시드 SAM을 형성하는 방법론 등이 보고되어 있다. 이들 역시 2차원 공간의 제약에 의한 당화 혈색소 결합 수율의 한계와 금 표면에만 적용이 가능하다는 제약이 존재한다.
따라서, 보다 민감한 당화 혈색소 검출을 구현하기 위해, 보로닉 애시드(boronic acid)가 제한된 면적에 3차원 구조로 고밀도로 배치된 새로운 구조의 반응층의 개발이 필요하다.
본 발명은 상기한 바와 같은 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 보로닉 애시드(boronic acid)가 수식되어 3차원 망상 구조를 갖는 하이드로젤(hydrogel)로 합성되어 선택적이고 민감한 검출을 가능하게 하는 반응층을 포함하는 당(saccharide) 검출용 센서를 제공하는 데 그 목적이 있다.
상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은, 보로닉 애시드(boronic acid)가 수식된 하이드로젤(hydrogel)로 합성된 반응층 및 반응층이 고정되는 다공성 멤브레인 기판(substrate)을 포함하는 당(saccharide) 검출용 센서를 제공한다.
본 발명의 일실시예에서, 당은 당화 단백질(glycated protein)의 당 부분 또는 글루코스(glucose)인 당 검출용 센서인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에서, 당화 단백질은 당화 혈색소(glycated hemoglobin; HbA1c)인 당 검출용 센서인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에서, 하이드로젤은 다공성 멤브레인 기판 내에서 고분자 단량체(monomer), 고분자 가교제(cross-linker) 및 보로닉 애시드를 포함하여 광중합된 것인 당 검출용 센서인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에서, 고분자 단량체는 아크릴아마이드(acrylamide) 유도체이고, 고분자 가교제는 2개의 N 기능기(N,N'-)를 갖는 아크릴아마이드 유도체이고, 보로닉 애시드는 아크릴기(acryl group)를 갖는 보로닉 애시드인 당 검출용 센서인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에서, 고분자 단량체는 N-(2-hydroxyethyl)acrylamide이고, 고분자 가교제는 N,N'-methylene-bisacrylamide인 당 검출용 센서인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에서, 보로닉 애시드는 3-(acrylamido)phenylboronic acid인 당 검출용 센서인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에서, 다공성 멤브레인 기판은 유리섬유로 구성된 LFA(lateral flow assay)용 멤브레인을 이용한 기판인 당 검출용 센서인 것이 바람직하다.
또한 본 발명은, 다공성 멤브레인 기판 내에 고분자 단량체, 고분자 가교제, 보로닉 애시드 및 광중합 반응 개시제를 주입하는 단계; 다공성 멤브레인 기판을 포토 마스크(photo-mask)로 패터닝하는 단계; 패터닝된 다공성 멤브레인 기판에 UV를 조사하는 단계; UV를 조사한 다공성 멤브레인 기판을 세척하는 단계; 및 세척된 다공성 멤브레인 기판을 건조하는 단계;를 포함하는 당 검출용 센서를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서, 고분자 단량체는 아크릴아마이드 유도체이고, 고분자 가교제는 2개의 N 기능기(N,N'-)를 갖는 아크릴아마이드 유도체이고, 보로닉 애시드는 아크릴기를 갖는 보로닉 애시드인 당 검출용 센서를 제조하는 방법인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에서, 고분자 단량체는 N-(2-hydroxyethyl)acrylamide이고, 고분자 가교제는 N,N'-methylene-bisacrylamide이고, 보로닉 애시드는 3-(acrylamido)phenylboronic acid이며, N-(2-hydroxyethyl)acrylamide, N,N'-methylene-bisacrylamide, 3-(acrylamido)phenylboronic acid 및 광중합 반응 개시제는 dimethyl sulfoxide 용매에 혼합되고, dimethyl sulfoxide 용매에 대하여, N-(2-hydroxyethyl)acrylamide의 중량비가 8.00 ~ 10.00%(w/v), N,N'-methylene-bisacrylamide의 중량비가 0.40 ~ 0.50%(w/v), 3-(acrylamido)phenylboronic acid의 중량비가 0.10 ~ 2.00%(w/v) 및 광중합 반응 개시제의 중량비가 0.05 ~ 0.14%(w/v)인 당 검출용 센서를 제조하는 방법인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에서, 다공성 멤브레인 기판은 유리섬유로 구성된 LFA(lateral flow assay)용 멤브레인을 이용한 기판인 당 검출용 센서를 제조하는 방법인 것이 바람직하다.
또한 본 발명은, 본 발명의 당 검출용 센서에 당화 혈색소 및 horseradish peroxidase를 혼합하여 반응시키는 단계; 반응 후 미반응한 단백질을 세척하는 단계; 당 검출용 센서에 상기 horseradish peroxidase에 대한 기질 및 발색 물질을 포함한 발색 물질 용액을 적하하여 발색을 유도하는 단계; 및 발색의 정도를 수치화하여 출력하는 단계;를 포함하는 당화 혈색소를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서, 기질은 과산화수소이고, 발색 물질은, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, o-phenylenediamine dihydrochloride, 2,2'-azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt, 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride, SAT-3(o-tolidine의 analog), N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline sodium salt dihydrate, N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline sodium salt monohydrate, N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline, sodium salt, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline sodium salt, N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline sodium salt), N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3,5-dimethylaniline disodium salt, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline sodium salt monohydrate, N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline disodium salt, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline sodium salt dihydrate 및 N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methylaniline sodium salt monohydrate로 이루어진 군에서 선택되는 당화 혈색소를 검출하는 방법인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에서, 당 검출용 센서에 당화 혈색소 및 horseradish peroxidase를 혼합하여 반응시키는 단계는, 당 검출용 센서에 PBS 용액에 각 1 내지 10㎍/㎖의 농도로 용해시킨 horseradish peroxidase 및 당화 혈색소를 1:1의 부피비로 혼합시킨 용액을 1 내지 100㎕ 적하하여 10 내지 600초의 시간 동안 반응시키는 것인 당화 혈색소를 검출하는 방법인 것이 바람직하다.
상기와 같은 본 발명은, 높은 신호 수준을 통해 혈액 내 글루코스(glucose)또는 당화 혈색소(glycated hemoglobin; HbA1c)를 포함하는 당화 단백질(glycated protein)의 선택적이고 민감한 검출을 가능하게 하고, 이러한 당(saccharide) 검출용 센서의 내구성을 향상시키는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 반응층의 하이드로젤 합성 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 HEAA, BIS 및 AAPBA를 이용해 하이드로젤을 합성하는 것을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 FUSION 5™ 멤브레인의 용매 안전성을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 FUSION 5™ 멤브레인에 대한 HRP의 비특이적 결합 여부를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 보로닉 애시드-하이드로젤에 대한 HRP 결합 여부를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 보로닉 애시드-하이드로젤에서, HEAA 농도에 따른 HRP 발색 신호의 변화를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 보로닉 애시드-하이드로젤에서, AAPBA 농도에 따른 HRP 발색 신호의 변화를 나타낸 도면이다.
도 8은 최적의 HRP 반응 시간을 나타낸 도면이다.
도 9는 당화 혈색소의 농도에 따른 HRP 발색 신호의 변화를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 보로닉 애시드-하이드로젤의 합성방법 및 이를 이용한 당화 혈색소의 분석 방법을 나타낸 도면이다.
도 11은 HRP/당화 혈색소의 농도 비율에 따른 HRP 발색 신호의 변화를 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명의 당화 혈색소를 검출하는 방법에 따라 당화 혈색소를 정량 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명의 당화 혈색소를 검출하는 방법에 따라 당화 혈색소를 정량 분석한 결과를 검정 곡선(calibration curve)으로 나타낸 도면이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러가지 실시예를 가질 수 있는바, 특정 실시예들을 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
나아가, 본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로 본 발명을 한정하려는 의도가 아니며, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미가 있다.
이하, 본 발명에 따른 바람직한 일실시예를 상세히 설명한다.
본 발명은, 보로닉 애시드(boronic acid)가 수식된 하이드로젤(hydrogel)로 합성된 반응층 및 반응층이 고정되는 다공성 멤브레인 기판(substrate)을 포함하는 당(saccharide) 검출용 센서이다.
보로닉 애시드는 당의 cis-diol기와 cis-diol interaction으로 특이적인 공유결합을 하여 특이적으로 당을 인지할 수 바이오 리셉터(bioreceptor)가 된다. 따라서, 보로닉 애시드는 cis-diol기를 갖는 당 또는 cis-diol기를 갖는 당에 의해 당화(glycosylation)된 당화 단백질을 인지할 수 있다. 예를 들어, 보로닉 애시드는 단당류 중 글루코스(glucose)를 cis-diol 결합을 통해 인지할 수 있다. 보로닉 애시드는 유리당 자체뿐만 아니라 단백질이 당화(glycosylation)된 형태인 당화 단백질의 당 부분도 cis-diol 결합을 통해 인지할 수 있으므로, 당화 단백질(glycated protein)까지 검출 할 수 있는 리셉터가 된다. 즉, 보로닉 애시드는 당을 포함하는 생체 물질에 대한 바이오 리셉터가 될 수 있다.
하이드로젤은 보로닉 애시드와 함께 광중합 반응을 통해 3차원 망상 구조로 합성되어 바이오 리셉터층(bioreceptor layer), 즉 반응층이 된다. 반응층은 하이드로젤에 광중합 반응을 통해 보로닉 애시드를 고밀도로 집적시킨 것이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 광중합 반응은 자외선 조사에 의해 활성화되며, 고분자 단량체(monomer), 고분자 가교제(cross-linker) 및 보로닉 애시드가 빛을 흡수하고 활성화되어 연쇄적으로 중합 반응이 일어나면서 하이드로젤이 형성된다. 이 때 보로닉 애시드가 당과의 반응기인 cis-diol기를 유지하면서 하이드로젤에 결합된다. 즉, 본 발명의 하이드로젤은 보로닉 애시드 고유한 성질인 당쇄에 대한 특이적 결합력을 잃지 않게 한다. 나아가, 보로닉 애시드가 수식된 하이드로젤로 합성된 반응층은 3차원의 그물 구조를 형성함으로써, 보로닉 애시드 기능기의 고분자 내 결합집적도를 높일 수 있다.
하이드로젤은 보로닉 애시드가 반응하는 유리당의 크기에 맞추어 합성될 수도 있고, 보로닉 애시드가 반응하는 당화 단백질의 크기에 맞추어 합성될 수도 있는 것으로, 검출하고자 하는 대상에 따라 최적의 밀도 및 구조로 합성될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 당 검출용 센서는, 당 뿐만 아니라, 당쇄를 포함하는 많은 종류의 당화 단백질에 기반한 질병의 마커로 이용될 수 있다.
예를 들어, 당화 단백질 중 특히 당화 혈색소의 검출 용도로 최적화된 3차원 망상 구조를 위해, 반응층으로 합성되기 위한 고분자 단량체 : 보로닉 애시드의 농도(w/v)비는 4 : 1 내지 100 : 1의 범위 내에서 조절될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 당 검출용 센서는, 다공성 멤브레인 기판 내에 고분자 단량체, 고분자 가교제 및 보로닉 애시드를 포함한 하이드로젤 전구체(precuror)가 침습된 상태에서, 자외선 조사에 의한 광중합 반응으로 하이드로젤이 합성되고, 합성과 동시에 다공성 멤브레인 기판 내에 고정되어 제조될 수 있다. 즉 하이드로젤의 광중합 반응은 다공성 멤브레인 기판 내부에서 진행되므로, 다공성 멤브레인 기판의 두께, 수분 흡수량 또는 흡수율 등의 기질 특성에 따라 하이드로젤의 형태 내지 크기 등이 제어될 수 있다. 반응층이 다공성 멤브레인 기판의 고정된 외형을 가짐으로써 젤리 형태의 하이드로젤만 존재할 경우보다 취급 및 이동 등이 용이해진다. 또한, 다공성 구조 내부에서 하이드로젤 형태를 이룸으로써 외부에 노출되는 면적이 증가되어, 결국 생체물질 반응의 효율을 높일 수 있다. 나아가, 다공성 멤브레인 기판의 모세관력은 세척액의 이동을 용이하게 하므로, 당 검출 반응에 필수적인 세척 과정을 매우 단순하고 효율적으로 수행할 수 있도록 한다.
본 발명의 일실시예에서, 하이드로젤은 다공성 멤브레인 기판 내에서 고분자 단량체(monomer), 고분자 가교제(cross-linker) 및 중합 반응 개시제를 포함하여 광중합될 수 있다.
고분자 단량체는 중합 반응의 원료가 되는 단위를 말하며, 예를 들어 아크릴아마이드(acrylamide) 유도체가 사용될 수 있다.
고분자 가교제는 중합 반응의 결합을 강하게 하기 위해 사용되는 반응성 단분자를 말하며, 가교성 관능기를 부여하여 광중합된 반응층의 내구신뢰성 및 응집력을 조절하는 역할을 한다. 고분자 가교제로서 2개의 N 기능기(N,N'-)를 갖는 아크릴아마이드 유도체를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, N 기능기를 갖는 단량체 외에 OH 기능기를 갖는 단량체도 사용될 수 있다. 나아가, 일종 또는 이종 이상의 혼합을 사용할 수도 있다. 이렇게 광중합된 하이드로젤 고분자는 친수성이면서 불용성인 특징이 있다.
보로닉 애시드는 고분자 단량체 및 고분자 가교제와 동일한 기능기를 포함하기 때문에, 하이드로젤에 함께 광중합될 수 있다. 이에 따라 보로닉 애시드 고유한 성질인 당쇄에 대한 특이적 결합력을 잃지 않으면서, 보로닉 애시드 기능기의 고분자 내 결합집적도를 높일 수 있다. 고분자 단량체, 고분자 가교제 및 보로닉 애시드에 포함된 동일한 기능기는 예를 들어 아크릴기일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
중합 반응 개시제는 자외선 조건 하에서 라디칼을 형성하고, 이러한 라디칼들이 고분자 단량체에 포함된 아크릴기(acryl group) 등의 기능기를 활성화시켜 라디칼 중합반응을 유도하게 된다. 이 때, 고분자 단량체와 고분자 가교제의 농도 및 비율에 의해 하이드로젤 내 미세통로의 크기를 조절할 수 있다. 중합 반응 개시제로 IRGACURE®2959가 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, alpha-hydroxy-ketone이 포함된 혼합물 등의 일반적인 광개시제가 모두 사용될 수 있다. 광중합 반응은, 열중합 반응과 달리, UV조사의 개시-중단으로 중합반응을 제어할 수 있다는 운용 편의성을 지니며, 이를 이용하면 원하는 위치에서만 고분자를 합성, 수식할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 고분자 단량체는 N-(2-hydroxyethyl)acrylamide(이하, 'HEAA'라 함)일 수 있고, 고분자 가교제는 N,N'-methylene-bisacrylamide(이하, 'BIS'라 함)일 수 있다.
UV 조사 및 중합 반응 개시제에 의해 활성 라디칼이 생성되고, 활성 라디칼이 활성 라디칼이 HEAA와 BIS에 포함된 아크릴기를 활성화시켜 라디칼 중합 반응을 유도하게 되며, 하나의 아크릴기만 갖는 HEAA는 고분자의 중합체 백본(polymer backbone)을 형성하게 되고, 두 개의 아크릴기를 갖는 가교제인 BIS는 이러한 HEAA 고분자 사슬 사이를 가교하게 된다. 특히 HEAA는, 말단에 OH 기를 가지고 있어 고분자의 친수성을 증가시키고, 물 분자와의 수소결합을 유도함으로써 물에 의해 팽창(swelling)될 수 있는 하이드로젤 고유의 특성을 부여할 수 있다. 또한 이러한 OH 기는 중합체 백본에 대한 생체 물질의 비특이적 결합 (non-specific binding; NSB)을 줄이는 역할을 할 수 있다.
다공성 멤브레인 기판은 모세관력에 의해 용매에 용해되어 액체 상태인 하이드로젤 전구체를 흡수할 수 있도록 한다. 이러한 모세관력에 의해 액체 상태의 시료 운용 및 하이드로젤의 취급에 있어 편의성을 높일 수 있으므로, 반응층에 대한 지지체로 적합하다.
본 발명의 일실시예에서, 다공성 멤브레인 기판은 유리섬유로 구성된 LFA(lateral flow assay)용 멤브레인을 이용한 기판인 당 검출용 센서일 수 있다.
예를 들어, FUSION 5™ 멤브레인(두께 370㎛, 수분 흡수량 40㎎/㎠ 및 흡수율 43.9s/4㎝)을 이용한 기판인 당 검출용 센서일 수 있다. FUSION 5™ 멤브레인은 유기용매를 포함하는 대부분의 용매 조건에서 안정된 구조를 유지하며, 다공성 멤브레인에 대한 단백질의 비특이적 결합을 줄일 수 있다(실시예 2 참조).
본 발명의 일실시예에서, 보로닉 애시드는 아크릴기를 갖는 보로닉 애시드인 당 검출용 센서일 수 있다.
아크릴기를 갖는 보로닉 애시드는, 아크릴기를 통해 중합 반응에 참여함으로써 HEAA-BIS 고분자 사이에 수식될 수 있으며, 예를 들어 (3-(acrylamido)phenylboronic acid(이하 'AAPBA'라 함), 2-acetamido-5-acrylamidophenylboronic acid, 5-acrylamido-2-((dimethylamino)methyl)phenylboronic acid, 5-acrylamido-2-(hydroxymethyl)phenylboronic acid 또는 2-acrylamidophenylboronic acid 등이 사용될 수 있다. 아크릴기를 갖는 보로닉 애시드는, 아크릴기를 통해 하이드로젤에 함께 광중합되면서 3차원 망상 구조를 형성함으로써, 아크릴 하이드로젤 층에 고밀도로 집적될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 반응층은, 그 지지체의 단가가 종래의 SAM 기술에 이용된 금 등의 고가 금속에 비해 매우 낮기 때문에, 당화 혈색소 검출용 센서의 생산의 경제성을 향상시킬 수 있다.
또한 본 발명의 당 검출용 센서를 제조하는 방법은, 다공성 멤브레인 기판 내에 고분자 단량체, 고분자 가교제, 보로닉 애시드 및 광중합 반응 개시제를 주입하는 단계; 다공성 멤브레인 기판을 포토 마스크(photo-mask)로 패터닝하는 단계; 패터닝된 다공성 멤브레인 기판에 UV를 조사하는 단계; UV를 조사한 다공성 멤브레인 기판을 세척하는 단계; 및 세척된 다공성 멤브레인 기판을 건조하는 단계;를 포함할 수 있다.
다공성 멤브레인 기판 내에, 고분자 단량체, 고분자 가교제, 보로닉 애시드 및 광중합 반응 개시제를 주입하는 단계는, 자연광에 의한 간섭을 피하기 위해 적외선 건조로(red room)에서 진행될 수 있으며, 다공성 멤브레인 기판에 고분자 단량체, 고분자 가교제, 보로닉 애시드, 광중합 반응 개시제 및 이들의 용매를 포함하는 용액을 적하하는 방법에 의할 수 있다.
포토 마스크(photo-mask)로 패터닝하는 단계에 있어서, 포토 마스크의 슬릿 넓이는 멤브레인 기판의 크기에 맞춰질 수 있고, 폭이 22㎜인 FUSION 5™ 멤브레인을 이용한 기판을 사용하는 경우에는 포토 마스크의 슬릿 넓이가 1㎝로 할 수 있다. 포토 마스크는 마스크되는 부분에 대한 자외선 조사를 차단시킴으로써 멤브레인 기판의 일정 부분에서만 하이드로젤이 형성되도록 유도할 수 있다.
UV를 조사하는 단계는 광중합 반응 개시제를 활성화시켜 고분자 단량체, 고분자 가교제, 보로닉 애시드의 중합 반응이 일어나게 하는 단계로, 자외선 강도는 0.3 내지 0.4㎽/㎠로 할 수 있다.
멤브레인 기판을 세척하는 단계는 하이드로젤로 형성되지 아니하고 용액 상태로 남아 있는 고분자 단량체, 고분자 가교제, 보로닉 애시드 및 광중합 반응 개시제를 제거하는 단계로, 세척액으로는 dimethyl sulfoxide, 에탄올 또는 증류수를 사용할 수 있으며, 세척 방법은 30분간 담지하는 것일 수 있다. 증류수는 3차 증류수(distilled and deionized water; 이하 'DDW'라 함)를 사용할 수 있다.
세척된 멤브레인 기판을 건조시키는 단계는 수용성 세척액 성분을 제거하는 단계로, 상온에서 건조시키는 방법일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 당 검출용 센서를 제조하는 방법에서, 고분자 단량체는 아크릴아마이드 유도체이고, 고분자 가교제는 2개의 N 기능기(N,N'-)를 갖는 아크릴아마이드 유도체이고, 보로닉 애시드는 아크릴기를 갖는 보로닉 애시드일 수 있다.
광중합된 하이드로젤 고분자는 친수성이면서 불용성인 특징이 있으며, 보로닉 애시드는 고분자 단량체 및 고분자 가교제와 동일한 기능기를 포함하기 때문에 하이드로젤에 함께 광중합되어 반응층을 형성할 수 있다. 이에 따라 보로닉 애시드 고유한 성질인 당쇄에 대한 특이적 결합력을 잃지 않으면서, 보로닉 애시드 기능기의 고분자 내 결합집적도를 높일 수 있다. 고분자 단량체, 고분자 가교제 및 보로닉 애시드에 포함된 동일한 기능기는 예를 들어 아크릴기일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
고분자 가교제는, 가교성 관능기를 부여하여, 광중합된 반응층의 내구신뢰성 및 응집력을 조절하는 역할을 한다. 고분자 가교제로서 2개의 N 기능기(N,N'-)를 갖는 아크릴아마이드 유도체를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, N 기능기를 갖는 단량체 외에 OH 기능기를 갖는 단량체도 사용될 수 있다. 나아가, 일종 또는 이종 이상의 혼합을 사용할 수도 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 당 검출용 센서를 제조하는 방법에서, 고분자 단량체는 N-(2-hydroxyethyl)acrylamide이고, 고분자 가교제는 N,N'-methylene-bisacrylamide이고, 보로닉 애시드는 3-(acrylamido)phenylboronic acid이며, dimethyl sulfoxide 용매에 대하여, N-(2-hydroxyethyl)acrylamide의 중량비가 8.00 ~ 10.00%(w/v), N,N'-methylene-bisacrylamide의 중량비가 0.40 ~ 0.50%(w/v), 3-(acrylamido)phenylboronic acid의 중량비가 0.10 ~ 2.00%(w/v) 및 광중합 반응 개시제의 중량비가 0.05 ~ 0.14%(w/v)일 수 있다.
광중합 반응에 참가하는 N-(2-hydroxyethyl)acrylamide는 백본을 형성하는 고분자 단량체로 사용되고, N,N'-methylene-bisacrylamide는 2개의 기능기를 통해 화합물을 비가역적으로 중합시키는 가교제로 사용되며, 중합 반응 개시제는 자외선 조건 하에서 라디칼을 형성하고, 이러한 라디칼들이 아크릴아마이드 유도체에 포함된 아크릴기를 활성화시켜 라디칼 중합반응을 유도하는 역할을 한다. AAPBA 역시 아크릴기를 통해 광중합 반응에 참여하는데, 보로닉 애시드 고유한 성질인 당쇄에 대한 특이적 결합력을 잃지 않으면서 아크릴 하이드로젤에 수식될 수 있다(실험예 1 참조).
더욱 바람직하게는, dimethyl sulfoxide 용매에 대하여, N-(2-hydroxyethyl)acrylamide의 중량비가 8.00 ~ 10.00%(w/v), N,N'-methylene-bisacrylamide의 중량비가 0.40 ~ 0.50%(w/v), 광중합 반응 개시제의 중량비가 0.05 ~ 0.14%(w/v) 및 AAPBA의 중량비가 0.10 ~ 2.00%(w/v)인 것이다.
본 발명의 일실시예에 따른 당 검출용 센서를 제조하는 방법에서, 당화 단백질 중 특히 당화 혈색소의 검출 용도로 최적화된 3차원 망상 구조를 위해, 반응층으로 합성되는 AAPBA 및 하이드로젤 전구체(precuror)의 농도가 조절될 수 있으며, 각 최적의 농도 범위를 실험을 통해 확인하였다(실험예 2 참조).
본 발명의 일실시예에 따른 당 검출용 센서를 제조하는 방법에서 사용된 다공성 멤브레인 기판은 유리섬유로 구성된 LFA용 멤브레인을 이용한 기판일 수 있다.
다공성 멤브레인 기판은 모세관력에 의해 용매에 용해되어 액체 상태인 하이드로젤 전구체를 흡수할 수 있도록 한다. 이러한 모세관력에 의해 액체 상태의 시료 운용 및 하이드로젤의 취급에 있어 편의성을 높일 수 있으므로, 반응층에 대한 지지체로 적합하다.
예를 들어, FUSION 5™ 멤브레인(두께 370㎛, 수분 흡수량 40㎎/㎠ 및 흡수율 43.9s/4㎝)을 이용한 기판인 당 검출용 센서일 수 있다. FUSION 5™ 멤브레인은 유기용매를 포함하는 대부분의 용매 조건에서 안정된 구조를 유지하며, 다공성 멤브레인에 대한 단백질의 비특이적 결합을 줄일 수 있다(실시예 2 참조).
또한 본 발명의 당화 혈색소를 검출하는 방법은, 본 발명의 일실시예에 따른 당 검출용 센서에 당화 혈색소 및 horseradish peroxidase(이하 'HRP'라 함)를 혼합하여 반응시키는 단계; 반응 후 미반응한 단백질을 세척하는 단계; 당 검출용 센서에 HRP에 대한 기질 및 발색 물질을 포함한 발색 물질 용액을 적하하여 발색을 유도하는 단계; 및 발색의 정도를 수치화하여 출력하는 단계;를 포함한다.
당 검출용 센서에 당화 혈색소 및 HRP를 혼합하여 반응시키는 단계는, 보로닉 애시드와 당화 혈색소 및 HRP를 경쟁적으로 반응시키는 단계이다. 예를 들어, HEAA, BIS 및 AAPBA를 재료로 하여 합성된 AAPBA-아크릴 하이드로젤이 고정된 다공성 멤브레인 기판을 사용하여, 당화 단백질인 당화 혈색소 및 HRP간의 경쟁적인 cis-diol 결합 반응을 유도할 수 있다. 검출 목표 물질인 당화 혈색소를 신호 발생 물질인 HRP와 혼합하여 반응층에 처리하게 되며, 두 가지 물질은 보로닉 애시드-하이드로젤에 대해 경쟁적으로 결합하게 된다.
미반응한 단백질을 세척하는 단계는, 반응 후 세척을 통해 단백질 반응량의 정량시에 나타날 수 있는 노이즈(noise)를 제거하도록 할 수 있다. 예를 들어, 미반응한 HRP를 제거하기 위해 HRP를 용해시키는 PBS 용액 등을 세척액으로 사용할 수 있다.
당 검출용 센서에 HRP에 대한 기질 및 발색 물질을 포함한 발색 물질 용액을 적하하여 발색을 유도하는 단계는, HRP와 기질간의 반응에 의한 생성물이 다시 발색 물질과 반응하여 발색하게 하는 단계이다. 이는 당화 혈색소의 농도가 높아질수록 발색 물질 기질에 대한 HRP 효소 발색 반응의 수준이 낮아지게 되는 현상에 의해 당화 혈색소의 농도를 간접적으로 정량할 수 있도록 하기 위한 것으로, 당화 혈색소 및 HRP간의 경쟁적 결합 이후 기질을 포함한 발색 물질의 발색 반응을 유도하면, 혈색소의 농도에 반비례하는 발색 신호를 얻게 되며, 이러한 발색 신호의 변화를 분석하여 당화 혈색소의 농도를 계산할 수 있다.
HRP 효소 반응의 기질은 과산화수소로 할 수 있고, HRP 발색 반응에 대한 발색 물질은, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine(이하 'TMB라 함), o-phenylenediamine dihydrochloride(이하 'OPD'라 함), 2,2'-azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt(이하 'ABTS'라 함), 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride(이하 'DAB'이라 함), SAT-3(o-tolidine의 analog), N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline sodium salt dihydrate, N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline sodium salt monohydrate, N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline, sodium salt, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline sodium salt, N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline sodium salt), N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3,5-dimethylaniline disodium salt, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline sodium salt monohydrate, N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline disodium salt, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline sodium salt dihydrate 및 N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methylaniline sodium salt monohydrate로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
예를 들어, 보로닉 애시드가 수식된 하이드로젤 및 멤브레인 기판을 포함하는 당화 혈색소 검출용 센서에 다양한 농도의 당화 혈색소와 일정한 농도의 HRP를 혼합하여 반응시키게 되면 BA 반응기에 대해 당화 혈색소와 HRP가 서로 경쟁적으로 결합하게 된다. 이 때 당화 혈색소의 농도가 높을수록 보다 높은 농도의 당화 혈색소가 경쟁적으로 HRP와 경쟁하며 결과적으로 HRP와 BA의 결합을 방해하게 된다. 세척과정을 통해 미반응한 단백질을 제거한 후, TMB 시료를 처리하여 발색을 유도하게 되는데, 당화 혈색소와 HRP 사이의 경쟁은 HRP 결합 수준의 저하를 유도하고, 결국 당화 혈색소의 농도가 높아질수록 TMB 기질에 대한 HRP 효소 발색 반응의 수준이 낮아지게 된다. 이렇게 감소된 발색 반응에서 나타난 발색의 정도를 수치화하여 출력 및 분석함으로써 최종적으로 처리된 시료에 포함된 당화 혈색소의 농도를 유추할 수 있게 된다. 해당 TMB 발색 반응은 HRP와 기질인 과산화수소에 의해서 생긴 생성물에 의해 발색이 진행되며, 통상 TMB의 농도는 0.2 ~ 0.8㎎/㎖로 사용할 수 있고, 과산화수소는 0.02 ~ 0.05%의 농도 범위로 사용할 수 있다.
TMB 이외에도 OPD, ABTS, DAB 또는 SAT-3와 같은 물질도 발색 물질로 동일하게 사용될 수 있다. OPD의 경우 0.5 ~ 1.0㎎/㎖의 농도 및 과산화수소 0.03% 조건으로 사용할 수 있고, ABTS의 경우 1㎎/㎖의 농도 및 과산화수소 0.03%의 조건으로 사용할 수 있다. 이 외에도 상기 조건에서 4-aminoantipyrin (4-AAP)과 결합하여 발색을 나타내는 물질들로 Trinder's reagent라고 불리는 발색 물질들(N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline sodium salt dihydrate, N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline sodium salt monohydrate, N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline, sodium salt, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline sodium salt, N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline sodium salt), N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3,5-dimethylaniline disodium salt, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline sodium salt monohydrate, N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline disodium salt, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline sodium salt dihydrate 및 N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methylaniline sodium salt monohydrate)을 사용할 수 있다.
발색의 정도를 수치화하여 출력하는 단계는, TMB 용액에 의해 발색된 이미지를 디지털 카메라로 활영하는 단계; 촬영한 이미지를 포토샵(Adobe Photoshop) 프로그램에 로드하는 단계; 포토샵 프로그램 내에서 발색 부위를 선택한 후 "분석 tool"로 이동하는 단계; 포토샵 프로그램 내에서 "RGB 모드"를 선택한 후 "BLUE PIXEL 분석"을 선택하는 단계; 및 "BLUE PIXEL 분석"에 의한 평균 광량값을 기록하는 단계를 포함할 수 있다. 이렇게 발색의 정도를 수치화한 값을 분석함으로써 본 발명의 당화 혈색소를 검출하는 방법에 따라 검출된 당화 혈색소를 정량할 수 있다. 이 때 "Internal Reference"에 해당하는 색도 표준을 이용하여 외부광 등에 의한 간섭을 보정할 수 있다. 도 13은 본 발명의 당화 혈색소를 검출하는 방법에 따라 당화 혈색소를 정량 분석한 결과를 검정 곡선(calibration curve)으로 나타낸 것이다.
또한 당 검출용 센서에 당화 혈색소 및 HRP를 혼합하여 반응시키는 단계는, 당 검출용 센서에 PBS 용액에 각 1 내지 10㎍/㎖의 농도로 용해시킨 HRP 및 당화 혈색소를 1:1의 부피비로 혼합시킨 용액을 1 내지 100㎕ 적하하여 10 내지 600초의 시간 동안 반응시키는 것일 수 있다(실험예 3, 4 참조).
미반응한 단백질을 세척하는 단계는, 50mM의 Tris 완충액(Tris buffer)에 0.1%의 TX-100 및 0.01%의 PEG (MW=3400)를 용해시켜 pH 8.0인 세척 용액으로 반응층을 2회 세척한 후, 다시 50mM의 PBS 완충액(PBS buffer)에 0.1%의 TX-100 및 0.01%의 PEG (MW=3400)를 용해시켜 pH 7.4인 세척 용액으로 1회 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 이 때, HRP를 용해시키는 PBS 용액은, 50mM의 PBS 완충액(PBS buffer)에 0.1%의 TX-100 및 0.01%의 PEG (MW=3400)를 용해시켜 pH 7.4로 할 수 있다.
하기의 실시예 3에서 설명하는 바와 같이, 본 발명에 따른 당화 혈색소를 검출하는 방법은 정상인 및 당뇨병 환자의 임상학적 당화 혈색소 진단 범위를 모두 만족시키는 결과를 나타냈다.
보로닉 애시드-하이드로젤의 합성
단량체, 가교제 및 중합 반응 개시제를 혼합하여 광중합 반응에 기반한 하이드로젤을 합성하였다. 암조건에서 DMSO 용매에 단량체로서 HEAA는 10%, 가교제로서 BIS는 0.5% (단량체와 20 : 1의 비율) 및 중합 반응 개시제는 0.1%의 농도로 녹여 혼합한 후 UV를 조사하면 중합 반응 개시제의 라디칼 생성을 통해 위 전구체(precursor)들의 분자구조에 존재하는 아크릴기간의 라디칼 중합반응이 일어나게 된다. 광중합 반응은 UV조사의 개시-중단으로 중합반응을 제어할 수 있다는 운용 편의성을 지니며, 이를 이용하면 원하는 위치에서만 고분자를 합성, 수식할 수 있다. 하이드로젤이 합성 될 경우 고형상의 형태가 되어 테스트-튜브(test tube)를 뒤집어도 내용물이 흘러내리지 않게 되며, 합성이 되지 않은 경우엔 수용액 상태로 남아있게 된다. 이러한 물성적 변화를 육안으로 확인함으로써 합성 여부를 판단하였다.
실험 결과, 도 1과 같이 하이드로젤이 합성되는 것을 확인할 수 있었다. 하이드로젤 합성을 위한 전구체로 선택된 HEAA, BIS, 중합 반응 개시제 및 AAPBA의 분자 구조는 도 2와 같으며, 이들을 통해 합성되는 하이드로젤(HEAA, BIS, AAPBA를 전구체로 하여 합성된 하이드로젤은 이하 'HEAA-BIS-AAPBA 하이드로젤'이라 함)의 분자 구조 역시 도 2에 나타내었다.
보로닉 애시드-하이드로젤이 고정화되는 멤브레인 기판
보로닉 애시드가 수식된 하이드로젤로 합성된 반응층을 고정하기 위해 다공성 멤브레인 기판을 사용하면, 다공성 멤브레인이 갖는 모세관력에 의해 바이오센싱에 필연적인 세척과정을 매우 단순하고 효율적으로 수행할 수 있도록 한다.
대표적인 다공성 멤브레인으로서 LFA(lateral flow assay; 측방 유동형 면역검정키트)는 외부적인 유체이송용 펌프(pump) 및 유로 등의 사용 없이 LFA 스트립을 구성하는 멤브레인이 갖는 자체 모세관력을 이용해 시료의 이동과 세척을 구현할 수 있다.
HEAA-BIS-AAPBA 하이드로젤은 DMSO 용매 조건에서 합성될 수 있으므로, 이 때 사용되는 다공성 멤브레인 기판은 DMSO 용매 조건에서 안정적으로 형태와 구조를 유지하고 있어야 한다. FUSION5™ 멤브레인에 대해 Tris buffer(aqueous phase), 에탄올, DMSO를 각각 처리하여 그에 따른 변화를 관찰한 결과, 도 3과 같이, FUSION5™ 멤브레인은 모든 용매 조건에서 안정되게 구조를 유지함을 확인할 수 있었다.
멤브레인의 구조적 안정성 이외에도 멤브레인에 대한 단백질의 비특이적 결합 여부는 바이오센싱에 있어 매우 중요한 고려사항이다. 이를 확인하기 위해 FUSION5™ 멤브레인에 대해 신호화 물질로 사용될 HRP를 처리, 그에 따른 TMB 발색 반응 정도를 관찰하였다. FUSION5™ 멤브레인에 대해 아무것도 처리하지 않은 상태의 실험군과 BSA(6%) 및 PEG(7%)를 이용해 블로킹(blocking)을 수행한 실험군을 준비하고, FUSION5™ 멤브레인에 대해 10㎍/㎖의 HRP를 5분간 반응한 후 세척, TMB 용액을 처리하여 발색 정도를 확인하였다.
도 4의 결과와 같이, 아무런 블로킹 과정을 수행하지 않은 실험군에서도 HRP에 의한 발색반응이 거의 관찰되지 않았다.
따라서, DMSO 용매 조건에서 안정하게 구조를 유지하며, 신호화 물질인 HRP에 대한 NSB가 거의 관찰되지 않은 FUSION5™ 멤브레인을 본 발명의 일실시예의 멤브레인 기판으로 선택하였다.
[실험예 1] 보로닉 애시드-하이드로젤로 합성된 반응층의 당화 단백질에 대한 결합력 확인
본 발명의 일실시예에 따른 당 검출용 센서의 효과를 확인하기 위해, 먼저 당화 단백질이 반응층 물질에 효율적으로 결합하는지 여부를 확인하였다. 대표적인 당화 단백질이자 자체의 효소반응을 통해 발색반응을 유도할 수 있는 산화환원 효소인 HRP를 농도 별로 반응층 물질에 반응시켜 TMB 발색 반응을 유도하고, 그에 따라 발생하는 발색신호의 크기를 분석하여 해당 반응층에 대한 당단백질의 결합능을 확인하였다.
하이드로젤이 고정되는 다공성 멤브레인 기판에 대해 농도별의 HRP (0 ~ 8㎍/㎖)를 반응시키고 TMB 발색 반응을 유도하였을 때, 도 5의 결과와 같이, 보로닉 애시드가 처리된 경우 HRP의 농도에 비례하여 효소 발색 반응의 발색 강도가 증가하여 나타나는 것을 관찰하였다. 이와 대조적으로, 보로닉 애시드가 존재하지 않는 대조군에서는 4㎍/㎖의 HRP 농도 수준까지 발색이 나타나지 않는 것을 확인하여, 합성된 하이드로젤에 대한 HRP가 소수성 상호반응(hydrophobic interaction) 등의 비특이적 결합이 나타나지 않음을 확인하였다. 보로닉 애시드 유무에 따라 발색수준이 크게 달라지는 것은 보로닉 애시드에 의한 선택적인 당단백질의 결합이 형성된 것임을 증명하며, 이를 통해 본 발명에 따라 HEAA-BIS-AAPBA 하이드로젤이 당화 혈색소의 측정에 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다. 이 후의 실험들은 가장 강한 발색이 나타나면서 NSB의 크기가 가장 작았던 4㎍/㎖의 HRP 농도를 기본 조건으로 적용하여 진행하였다.
[실험예 2] 보로닉 애시드이 수식된 하이드로젤의 반응층의 합성 조건 최적화
당화 혈색소의 효율적인 검출을 위해서는 HEAA-BIS-AAPBA 하이드로젤의 합성과정에서 고분자 사슬의 조밀도 및 보로닉 애시드 그룹의 집적도 등에 대한 조절이 필수적이다. 이에 따라 HEAA, BIS 및 AAPBA의 농도를 조절하여 당화 혈색소를 효과적으로 포집하고 최적의 광학신호를 제공할 수 있는 반응층을 합성하기 위한 실험을 수행하였다.
가. 보로닉 애시드가 수식된 하이드로젤 반응층 합성에 사용되는 고분자 단량체의 농도 선정
HEAA-BIS-AAPBA 하이드로젤은 HEAA와 BIS가 주요 성분이며 이들의 가교 반응을 통해 하이드로젤이 형성된다. 이 때 하이드로젤의 너무 조밀하게 구성되면 HRP 및 당화 혈색소와 같은 단백질이 하이드로젤 내부로 침투할 수 없으며, 너무 낮은 밀도를 갖도록 하이드로젤을 합성하면 보로닉 애시드 수식 정도가 낮아져서 높은 신호 수득이 불가능해지거나 하이드로젤 자체가 형성되지 않을 수도 있다. 이에 따라, 최적의 HEAA-BIS 농도를 찾기 위해 HEAA의 농도를 6%부터 14%까지 변화시켜 보로닉 애시드-하이드로젤을 합성하였다. 모든 하이드로젤 합성은 FUSION5™ 멤브레인에서 이루어졌으며 BIS의 농도는 각 HEAA농도의 1/20로 고정하여 사용하였다. AAPBA는 0%와 1% 두 가지 조건으로 설계하였으며, 0% AAPBA에서는 NSB신호를 관찰하도록 실험을 준비하였다. 각각의 HEAA-BIS-AAPBA 하이드로젤이 고정된 다공성 멤브레인 기판에 대해 4㎍/㎖의 HRP를 5분간 반응시켰으며, 세척 후 TMB를 처리하여 발색 강도를 비교하였다.
도 6에서 보여지는 것과 같이, 10% 초과의 HEAA 농도에서는 HRP에 의한 발색반응이 매우 약하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이는 10% 초과의 HEAA가 존재할 경우 하이드로젤이 너무 조밀하게 합성되어 HRP의 확산 및 결합반응 유도가 잘 일어나지 않게 되기 때문이다. 이와 반대로 8% HEAA에서는 매우 강한 발색 반응이 관찰되었으며 이는 HRP의 확산 및 BA에 대한 결합이 높은 수준으로 이루어졌기 때문으로 해석된다. 6% HEAA농도에서는 하이드로젤이 너무 묽게 형성되어 멤브레인에 하이드로젤 분자가 거의 남아있지 않게 됨을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 HEAA 8%, BIS 0.4% 조건을 이후 실험에 적용하기로 결정하였다.
나. 보로닉 애시드가 수식된 하이드로젤 반응층 합성에 사용되는 보로닉 애시드 농도 최적화
보다 많은 당화 단백질을 효율적으로 결합시키기 위해서는 보로닉 애시드 분자가 하이드로젤 내부에 높은 농도로 존재해야 한다. 효율적인 당 검출을 위한 보로닉 애시드 농도를 확인하기 위해, 다양한 농도의 AAPBA(0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 2, 3, 4, 5%)를 준비하고 각각 HEAA-BIS(8%, 0.4%)에 첨가하여 HEAA-BIS-AAPBA 하이드로젤을 합성하였다. 모든 반응은 FUSION5™ 멤브레인에서 진행되었으며, 4㎍/㎖의 HRP를 5분간 반응한 후 TMB를 처리하여 발색 강도를 비교하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 0 ~ 1% AAPBA 농도까지는 HRP에 의한 발색 반응의 강도가 AAPBA 농도에 비례하는 것을 확인할 수 있었으며, 이후의 농도에서는 조금씩 감소하는 현상이 관찰되었다. 높은 BA 농도(2% 이상)에서의 발색 신호 감소는 HEAA 고농도의 경우와 비슷하게 AAPBA 농도 증가에 따라 하이드로젤의 밀도가 증가하면서 HRP의 투과가 저해되었기 때문으로 판단되었다. 1% 농도의 AAPBA 조건에서 발색 신호가 가장 높게 나타났으며, 이 후의 실험에서는 해당 농도 조건에서 HEAA-BIS-AAPBA 하이드로젤을 합성하여 사용하였다.
[실험예 3] 보로닉 애시드가 수식된 하이드로젤의 horseradish peroxidase(HRP) 신호 발생 조건 최적화
본 발명의 일실시예에 의한 당화 혈색소 검출 방법에서 사용되는 HRP의 반응양 및 반응시간을 알아보기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
보로닉 애시드와 HRP의 cis-diol 반응에서 반응 시간이 길어지게 되면 보다 많은 HRP가 결합되어 높은 신호를 나타낼 수 있지만, 이러한 반응 시간의 증가는 비특이적인 HRP의 결합역시 증가시켜 정확한 신호의 수득을 방해하는 결과를 야기할 수 있다. 이러한 이유로 NSB는 최소화하면서 높은 발색신호를 얻을 수 있는 최적의 신호물질(HRP) 반응양 및 반응시간을 선정하였다.
FUSION5™ 멤브레인에 HEAA-BIS-AAPBA (각 8%, 0.4%, 1%) 하이드로젤을 형성하고 4㎍/㎖의 HRP를 각각 10초, 30초, 1분, 3분, 5분, 10분 간 반응한 후 TMB를 처리하여 발색 강도를 비교하였다. 대조군으로는 AAPBA를 처리하지 않은 멤브레인을 사용하였다.
실험결과, 5분동안 HRP를 반응시킨 실험군에서 높은 발색 강도와 낮은 NSB신호가 확인되었다(도 8 참조). 10분 동안 반응시킨 경우에서 가장 강한 발색반응이 나타났으나, 보로닉 애시드가 없는 실험군에서 NSB에 의한 비교적 높은 수준의 발색이 관찰되었다.
[실험예 4] 보로닉 애시드가 수식된 하이드로젤의 horseradish peroxidase(HRP) 신호 발생 결과
도 9는 세 가지 농도 (0.1, 0.3, 0.6㎍/㎖)의 당화 혈색소 시료(당화 혈색소만 존재)와 동일한 양(4㎍/㎖)의 HRP를 혼합하여 HEAA-BIS-AAPBA 하이드로젤에 처리하였을 때의 발색 수준을 비교한 결과이다.
실험 결과, 당화 혈색소와 HRP 사이의 경쟁반응에 의해 당화 혈색소의 농도가 증가할수록 HRP에 의한 발색이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 당화 혈색소 검출용 반응층이 실제 당화 혈색소 정량분석에 응용될 수 있음을 나타내며, 이 결과를 바탕으로 실제 당화 혈색소의 정량분석 연구를 진행하였다.
보로닉 애시드가 수식된 하이드로젤 반응층을 이용한 당화 혈색소 정량분석
본 발명의 일실시예에 따라 당화 혈색소를 검출하는 방법은(도 10 참조), 당화 혈색소 검출용 센서에 당화 혈색소 및 HRP를 혼합하여 반응시키는 단계를 포함함으로써, 당화 혈색소 및 HRP의 경쟁 반응을 통해 당화 혈색소의 정량 효율을 높일 수 있다.
당화 혈색소의 농도의존적 발색 신호 수득에 있어 가장 중요한 고려사항은 당화 혈색소와 HRP간의 혼합비율이다. 본 발명의 일실시예에 따라 당화 혈색소를 검출하는 방법은, HEAA-BIS-AAPBA 하이드로젤 반응층에서 경쟁 반응하면서 최적의 신호를 제공할 수 있는 Hb와 HRP의 최종 농도비율을 다음 표 1과 같이 세 가지 비율로 하였다.
Hb : HRP 비율
40㎍/㎖ : 4㎍/㎖ 10 : 1
4㎍/㎖ : 4㎍/㎖ 1 : 1
4㎍/㎖ : 40㎍/㎖ 1 : 10
당화 혈색소가 혼합된 전체 헤모글로빈(total hemoglobin; 이하 'Hb'라 함) 시료의 경우, 실제로 채혈된 혈액에서 헤모글로빈만을 분리 및 정제한 후 당화 혈색소 시약을 첨가하는 방식으로 준비하였으며, 5%와 12%의 당화 혈색소 농도를 갖도록 조절하였다. 해당 Hb 시료의 전체 단백질 농도는 0 ~ 80㎍/㎖ 범위로 다양하게 준비하였으며, PBS를 이용해 희석하였다. HRP는 50mM의 PBS 용액(0.1% TX-100, 0.01% PEG)를 이용하여 8㎍/㎖와 80㎍/㎖의 농도로 준비하였다. Hb 시료와 HRP 시료는 동일한 부피(1:1)로 혼합하였다.
각각의 시료를 HEAA-BIS-AAPBA 하이드로젤이 고정된 다공성 멤브레인 기판에 5분간 반응시켰으며. 이 후 세척용 완충용액(50 mM Tris, pH 8, 0.1% TX-100, 0.01% PEG)을 이용해 잔여 미반응 물질들을 제거하고, TMB 용액을 이용한 발색 반응을 유도하여 그 결과를 비교하였다.
도 11에 나타난 결과와 같이, Hb와 HRP의 농도비율이 10:1, 1:1 및 1:10인 조건에서 모두 발색의 차이가 나타났으며, 이 중 1:1인 조건의 발색이 더욱 강한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 5%와 12% 당화 혈색소의 결과를 비교하여 보면 Hb와 HRP 1:1인 경우에서 발색 강도의 확연한 차이를 관찰할 수 있었다. HRP가 최종 농도 40㎍/㎖인 실험에서는 Hb의 농도와 무관하게 모두 NSB에 의한 강한 발색 반응이 관찰되었다. 대조군으로 수행한 보로닉 애시드가 없는 조건에서는 HRP의 최종 농도가 4㎍/㎖인 경우에는 모두 발색이 나지 않았으며, 최종 농도 40㎍/㎖인 경우에는 강한 발색이 나타남을 확인하였다.
이후의 실험에서는 Hb와 HRP의 최종농도 비율을 "Hb 4㎍/㎖ : HRP 4㎍/㎖ (1:1)"로 하여 당화 혈색소 농도에 따른 측정을 진행하였다.
8㎍/㎖의 Hb와 8㎍/㎖ HRP 시료들을 1:1의 부피비로 혼합하여 각각의 최종 농도가 4㎍/㎖이 되도록 준비하였다. 각각의 Hb시료는 5, 7, 9, 12, 15%의 %당화 혈색소농도를 갖도록 준비하였다. 0% 당화 혈색소 시료는 이론적으로 불가능하므로 동일 부피의 PBS를 HRP와 혼합하여 사용하였다. 준비된 Hb-HRP 혼합시료는 HEAA-BIS-AAPBA 하이드로젤로 합성된 반응층 표면에 5분 동안 반응되었고 세척용 완충 용액으로 3회 세척한 후, TMB 발색 반응을 유도하였다. 발색된 광학적 신호는 TMB 반응 후 5분 뒤에 디지털 카메라로 측정하였으며, 기록된 이미지를 Photoshop 소프트웨어로 분석하여 발색 부위의 Blue pixel의 광도를 정량하였다.
도 12의 결과에 나타낸 바와 같이, 당화 혈색소의 농도가 높아질수록 발색강도가 약해지는 것을 확인할 수 있었다. 당화 혈색소 및 당화 혈색소가 없는 0% 시료의 경우 가장 강한 발색이 나타났으며, 15% 당화 혈색소시료의 경우 발색이 거의 나타나지 않는 것을 관찰할 수 있었다. 대조군으로 사용된 보로닉 애시드이 처리되지 않은 하이드로젤에서는 모두 발색이 나타나지 않았으며, 0% 실험군에서만 미약한 신호가 관찰되었다. 이러한 결과를 바탕으로 보로닉 애시드을 당화 단백질 분석에 적용할 수 있음을 확인하였으며, 당뇨병의 바이오마커인 당화 혈색소를 경쟁반응을 통하여 정량적으로 분석할 수 있음을 확인하였다. 보다 정량적으로 발색 정도를 확인하기 위해 Photoshop software를 이용하여 청색 pixel 광도를 측정해 도 15와 같은 당화 혈색소 검정 곡선(calibration curve)을 작성하였다.
4회에 걸친 반복실험 결과, 본 발명에 따른 당화 혈색소 검출용 반응층을 이용하여 당화 혈색소를 검출하는 방법의 재현성(coefficient of variation; COV = SD/mean)은 약 7%로 나타났으며, 당화 혈색소 5 ~ 12% 구간에서 선형 검출 범위(linear detection range)가 형성됨을 확인할 수 있었다. 해당 선형 검출 범위에서의 직선추세선의 기울기는 -6.3이었으며 신뢰도(R2)는 0.96으로 나타났다. 반응층에 대한 시료 결합반응시간은 5분이었으며 실제 발색반응 역시 5분 이내에 종료되었다.
본 발명에 따른 당화 혈색소 검출용 반응층을 이용하여 당화 혈색소를 검출하는 방법에 따라 당뇨병의 진단에 가장 중요하게 요구되는 7% 부근의 당화 혈색소 농도변화를 민감하게 검출할 수 있었으며(5% ~ 12% 직선 구간 기울기 = 6.3), COV 7% 수준의 재현성을 나타내었다. 세척과정을 제외한 총 당화 혈색소 검출 반응 시간은 10분이었으며 (시료반응 5분 + 발색반응 5분) 멤브레인의 모세관력에 의해 별도의 유체제어 장비는 요구되지 않았다. 이와 같은 결과를 다음 표 1에 요약하여 정리하였다.
Figure 112014100242929-pat00001
[합성된 보로닉 애시드-하이드로젤 반응층을 이용한 당화 혈색소의 검출 정량평가 결과]
이상에서 본 발명에 따른 실시예들이 설명되었으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 분야에서 통상적 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 범위의 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다.
따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 다음의 특허청구범위에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (15)

  1. 보로닉 애시드(boronic acid)가 수식된 하이드로젤(hydrogel)로 합성된 반응층 및 상기 반응층이 고정되는 다공성 멤브레인 기판(substrate)을 포함하고,
    상기 하이드로젤은 상기 다공성 멤브레인 기판 내에서 고분자 단량체(monomer), 고분자 가교제(cross-linker) 및 보로닉 애시드를 포함하여 광중합된 것이고,
    상기 고분자 단량체는 N-(2-hydroxyethyl)acrylamide이고, 상기 고분자 가교제는 N,N'-methylene-bisacrylamide이고, 상기 보로닉 애시드는 3-(acrylamido)phenylboronic acid이며
    상기 N-(2-hydroxyethyl)acrylamide, 상기 N,N'-methylene-bisacrylamide 및 상기 3-(acrylamido)phenylboronic acid가 혼합된 용매에 대하여, 상기 N-(2-hydroxyethyl)acrylamide의 중량비가 8.0%(w/v) ~ 10.0 %(w/v), 상기 N,N'-methylene-bisacrylamide의 중량비가 0.40 ~ 0.50%(w/v) 및 상기 3-(acrylamido)phenylboronic acid의 중량비가 0.10 ~ 2.0%(w/v)인 당(saccharide) 검출용 센서.
  2. 제1항에 있어서,
    당은 당화 단백질(glycated protein)의 당 부분 또는 글루코스(glucose)인 당 검출용 센서.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 당화 단백질은,
    당화 혈색소(glycated hemoglobin; HbA1c)인 당 검출용 센서.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 멤브레인 기판은,
    유리섬유로 구성된 LFA(lateral flow assay)용 멤브레인을 이용한 기판인 당 검출용 센서.
  9. 다공성 멤브레인 기판 내에 고분자 단량체, 고분자 가교제, 보로닉 애시드 및 광중합 반응 개시제를 주입하는 단계;
    상기 다공성 멤브레인 기판을 포토 마스크(photo-mask)로 패터닝하는 단계;
    패터닝된 상기 다공성 멤브레인 기판에 UV를 조사하는 단계;
    UV를 조사한 상기 다공성 멤브레인 기판을 세척하는 단계; 및
    세척된 상기 다공성 멤브레인 기판을 건조하는 단계;를 포함하고,
    상기 고분자 단량체는 N-(2-hydroxyethyl)acrylamide이고, 상기 고분자 가교제는 N,N'-methylene-bisacrylamide이고, 상기 보로닉 애시드는 3-(acrylamido)phenylboronic acid이며
    상기 N-(2-hydroxyethyl)acrylamide, 상기 N,N'-methylene-bisacrylamide 및 상기 3-(acrylamido)phenylboronic acid가 혼합된 용매에 대하여, 상기 N-(2-hydroxyethyl)acrylamide의 중량비가 8.0%(w/v) ~ 10.0 %(w/v), 상기 N,N'-methylene-bisacrylamide의 중량비가 0.40 ~ 0.50%(w/v) 및 상기 3-(acrylamido)phenylboronic acid의 중량비가 0.10 ~ 2.0%(w/v)인 당 검출용 센서를 제조하는 방법.
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서,
    상기 N-(2-hydroxyethyl)acrylamide, 상기 N,N'-methylene-bisacrylamide, 상기 3-(acrylamido)phenylboronic acid 및 상기 광중합 반응 개시제는 dimethyl sulfoxide 용매에 혼합되는 것인 당 검출용 센서를 제조하는 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 다공성 멤브레인 기판은,
    유리섬유로 구성된 LFA(lateral flow assay)용 멤브레인을 이용한 기판인 당 검출용 센서를 제조하는 방법.
  13. 제9항, 및 제11항 내지 제12항 중 어느 한 항의 제조하는 방법에 따라 제조된 당 검출용 센서에 당화 혈색소 및 horseradish peroxidase를 혼합하여 반응시키는 단계;
    상기 반응 후 미반응한 단백질을 세척하는 단계;
    상기 당 검출용 센서에 상기 horseradish peroxidase에 대한 기질 및 발색 물질을 포함한 발색 물질 용액을 적하하여 발색을 유도하는 단계; 및
    상기 발색의 정도를 수치화하여 출력하는 단계;를 포함하는 당화 혈색소를 검출하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 기질은 과산화수소이고,
    상기 발색 물질은, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, o-phenylenediamine dihydrochloride, 2,2'-azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt, 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride, SAT-3(o-tolidine의 analog), N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline sodium salt dihydrate, N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline sodium salt monohydrate, N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline, sodium salt, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline sodium salt, N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline sodium salt), N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3,5-dimethylaniline disodium salt, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline sodium salt monohydrate, N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline disodium salt, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline sodium salt dihydrate 및 N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methylaniline sodium salt monohydrate로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 당화 혈색소를 검출하는 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 당 검출용 센서에 당화 혈색소 및 horseradish peroxidase를 혼합하여 반응시키는 단계는,
    상기 당 검출용 센서에 PBS 용액에 각 1 내지 10㎍/㎖의 농도로 용해시킨 horseradish peroxidase 및 당화 혈색소를 1:1의 부피비로 혼합시킨 용액을 1 내지 100㎕ 적하하여 10 내지 600초의 시간 동안 반응시키는 것인 당화 혈색소를 검출하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023149596A1 (ko) * 2022-02-07 2023-08-10 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단 기재의 표면에 포도당 감응 시약이 작용기에 의해 화학 결합되어 있는 고정화물, 그 제조방법 및 용도

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101981844B1 (ko) * 2016-11-09 2019-05-23 전자부품연구원 색변화를 이용하여 표적물질을 검출하는 하이드로젤을 포함하는 화학 센서 및 그 제조방법
EP3329840B1 (en) 2016-12-05 2022-10-19 BIOTRONIK SE & Co. KG Sensor system for detecting the presence or concentration of analytes
KR101960585B1 (ko) * 2017-01-19 2019-03-21 전자부품연구원 하이드로젤을 포함하는 부착형 화학 센서 및 그 제조방법
KR102070508B1 (ko) * 2018-03-21 2020-03-02 한양대학교 에리카산학협력단 당화 헤모글로빈 검출용 구조체, 그 구조체의 제조 방법, 그 당화 헤모글로빈 검출용 구조체를 이용한 당화 헤모글로빈 검출용 센서, 및 그 센서를 이용한 당화 헤모글로빈의 검출 방법
TWI703323B (zh) * 2018-11-14 2020-09-01 及安生物科技股份有限公司 於單一檢測試片同步偵測葡萄糖濃度和糖化血色素百分比的方法
CN111426841A (zh) * 2020-03-31 2020-07-17 中科康磁医疗科技（苏州）有限公司 一种具有防污微凝胶芯片的制备方法、芯片，以及传感器

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120150006A1 (en) * 2009-08-10 2012-06-14 Sensile Pat Ag Stimuli responsive membrane
JP2013074877A (ja) * 2011-09-15 2013-04-25 Toyobo Co Ltd 糖化ヘモグロビン測定用多層試験片、およびそれを用いた測定方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5565299A (en) * 1998-08-17 2000-03-06 California Institute Of Technology Devices and methods for analysis of non-ionic solutes
US6475750B1 (en) * 1999-05-11 2002-11-05 M-Biotech, Inc. Glucose biosensor
AUPS295702A0 (en) * 2002-06-17 2002-07-04 Proteome Systems Intellectual Property Pty Ltd Coated hydrophilic membranes for electrophoresis applications
AU2005245996A1 (en) * 2004-05-21 2005-12-01 Atonomics A/S Surface acoustic wave sensor comprising a hydrogel
US8003397B2 (en) * 2008-01-29 2011-08-23 University Of South Carolina Glucose monitoring by viscometric sensing of polymeric fluid

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120150006A1 (en) * 2009-08-10 2012-06-14 Sensile Pat Ag Stimuli responsive membrane
JP2013074877A (ja) * 2011-09-15 2013-04-25 Toyobo Co Ltd 糖化ヘモグロビン測定用多層試験片、およびそれを用いた測定方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mugweru A. et al., 'Electrochemical Sensor Array for Glucose Monitoring Fabricated by Rapid Immobilization of Active Glucose Oxidase within Photochemically Polymerized Hydrogels', Journal of Diabetes*
Sajid M. et al., 'Designs, formats and applications of lateral flow assay: A literature review', Journal of Saudi Chemical Society, (2014.09.), Vol. 19, pp 689-705. 1부.*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2023149596A1 (ko) * 2022-02-07 2023-08-10 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단 기재의 표면에 포도당 감응 시약이 작용기에 의해 화학 결합되어 있는 고정화물, 그 제조방법 및 용도

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