CN111630383A - 测定试样稀释液及试剂盒及测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种测定试样稀释液，其灵敏度高、精度高、与HPLC法的相关性高，并且能够不受将测定试样与测定试样稀释液混合后到向HbA1c测定用免疫层析试验片滴加为止的时间的影响地测定测定试样中的HbA1c量相对于Hb量的比例、即HbA1c(％)，并且提供包含测定试样稀释液的试剂盒。本发明是一种测定试样稀释液，是用于对测定试样中的血红蛋白A1c量相对于血红蛋白量的比例、即血红蛋白A1c(％)进行定量的免疫层析用测定试样稀释液，是包含非离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂及缓冲剂的水溶液。

Description

测定试样稀释液及试剂盒及测定方法
技术领域
本发明涉及基于免疫层析法的测定试样中的血红蛋白A1c量相对于血红蛋白量的比例、即血红蛋白A1c(％)的测定方法、所述测定方法中使用的测定试样稀释液及包含测定试样稀释液的试剂盒。
背景技术
根据国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation)，世界的糖尿病患者数不仅在美国、欧洲等发达国家中急剧地增加，包括中国、印度、巴西等新兴国家在内也在急剧地增加，在2015年存在约4.2亿人，在2040年预测达到约6.4亿人，糖尿病诊断的重要性正在增大。
作为糖尿病诊断项目之一的所谓血红蛋白A1c(以下有时简称为HbA1c)，是指在血液中的担负搬运氧的作用的血红蛋白(以下有时简称为Hb)键合有糖(葡萄糖)的糖化Hb当中、位于Hb的β链的N末端侧的缬氨酸残基被糖化了的物质，由于作为HbA1c量相对于总Hb量的比例的HbA1c(％)反映过去1～2个月间的平均血糖值，因此被用于观察糖尿病的长期的过程。
以往，在HbA1c(％)的测定中，利用了HPLC法、毛细管电泳法、酶比色法、免疫比浊法等测定技术，然而这些测定方法由于要具有专业知识、分析装置大型且昂贵等理由，因此主要在大型医院、进行大量检查的检查中心使用，在小型医院无法简单地测定HbA1c(％)，这一点成为问题。
近年来，在医疗现场POCT这样的词语受到关注。所谓POCT，是Point Of CareTesting的简称，是指医疗从业人员在被测者的身旁进行的临床检查。POCT与大型医院的中央检查室等中进行的临床检查不同，能够在当场瞬间获得检查结果，因此在糖尿病诊断中POCT也在逐渐扩大。
在以HbA1c(％)的测定为目的的POCT中，提出过利用了免疫层析法的技术。所谓免疫层析法，是利用了毛细管现象的免疫测定法，在妊娠检查、流感检查等中已经在世界范围内普及。以往的免疫层析法通常为目视判定(定性评价)，然而近年来，正在开发利用免疫层析读数仪等分析装置对测定试样中含有的分析对象物质的量进行定量化的技术。
作为使用免疫层析法对分析对象物质的量进行定量的方法之一，可以举出利用了抗原抗体反应的夹心法。夹心法中利用相对于分析对象物质而言表位不同的2种抗体。一方的抗体作为与金胶体、着色胶乳粒子、荧光粒子等检测粒子发生敏化的检测抗体使用。另一方的抗体在多孔支撑体的表面作为以线状固定了的捕捉抗体形成检测线。此外，将特异性地捕捉所述检测抗体的抗体在多孔支撑体的表面的与所述检测线不同的位置以线状固定而形成质控线。测定试样中含有的分析对象物质从多孔支撑体的一端(上游侧)展开，在与检测抗体形成免疫复合体的同时移动，在检测线上与捕捉抗体接触而被捕捉并显色。没有与分析对象物质形成免疫复合体的游离的检测试剂在检测线上穿过，由质控线的抗体捕捉并显色。根据它们的显色强度，通过利用免疫层析读数仪等装置，能够对分析对象物质的量进行定量。
如前所述，在利用免疫层析法测定HbA1c(％)时，使用对于HbA1c的被糖化了的部位(位于Hb的β链的N末端侧的缬氨酸残基)为特异性的抗体，然而已判明所述糖化部位并不存在于Hb的表面，而是被埋在Hb的内部，在生理的条件下存在于抗体难以结合的场所。根据此种性状，为了使以所述糖化部位作为表位来识别的抗体有效地反应而进行测定，报告过使所述表位在Hb的表面露出(以下有时称作变性)的技术。
专利文献1、2中，公开过在测定试样稀释液中包含表面活性剂、在免疫层析试验片担载有环状多糖类的构成。针对不阻碍下游的抗原抗体反应、并且使表位露出这一点而言，即针对测定灵敏度的提高而言，对所述发明可以期待一定的效果。然而，所述发明由于产生向下游的展开不均，因此测定精度不够充分。另外，实际的免疫层析试剂盒的测定试样的稀释操作被设想为用手来进行，因此在将测定试样与测定试样稀释液混合后到向免疫层析试验片滴加为止的时间(以下有时简称为混合时间)中产生明确的个人差别。然而，所述发明没有考虑由测定试样稀释液中的表位露出反应的速度、即所述混合时间所致的测定结果的变动来进行表面活性剂种类的选择，因此因操作者不同而使测定精度进一步变差。此外，所述发明中使用金胶体或胶乳粒子作为检测粒子，因此从灵敏度、精度、以及与HPLC法的相关性的观点考虑不够充分。需要说明的是，在所述发明中虽然记载了测定试样稀释液的最佳组成根据使用的检测粒子而不同，然而关于纤维素粒子没有提及。
在专利文献3、4中，公开过在测定试样稀释液中包含非离子性表面活性剂、在免疫层析试验片担载有阴离子性表面活性剂的构成。所述发明针对展开不均的改善而言可以期待一定的效果。然而，所述发明由于担载于免疫层析试验片的表面活性剂无法在稀释测定试样展开的短暂时间中使表位在Hb的表面露出，因此测定灵敏度不够充分，另外很大程度上受到所述混合时间的影响。此外，由于所述发明使用金胶体作为检测粒子，因此从灵敏度、精度、以及与HPLC法的相关性的观点考虑不够充分。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2012－251789号公报
专利文献2：日本特开2015－158515号公报
专利文献3：日本特开2015－200517号公报
专利文献4：日本特开2016－161329号公报
发明内容
发明所要解决的问题
本发明鉴于上述的问题，目的在于，提供一种基于免疫层析法的测定试样中的HbA1c量相对于Hb量的比例即HbA1c(％)的测定方法，所述方法与现有技术相比灵敏度、精度、以及与HPLC法的相关性高，并且本发明的目的在于提供所述测定方法中使用的测定试样稀释液、包含测定试样稀释液的试剂盒。更具体而言，目的在于，提供一种测定试样中的HbA1c量相对于Hb量的比例即HbA1c(％)的测定方法，其与以往相比难以受到将测定试样与测定试样稀释液混合后到向HbA1c测定用免疫层析试验片滴加为止的时间的影响，并且目的在于提供所述测定方法中使用的测定试样稀释液、以及包含测定试样稀释液的试剂盒。
用于解决问题的方法
本发明人为了解决上述问题进行了深入研究，结果发现，通过使用至少包含非离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂及缓冲剂的水溶液作为测定试样稀释液，与现有技术相比，灵敏度、精度、以及与HPLC法的相关性大幅度提高，并且难以受到将测定试样与测定试样稀释液混合后到向免疫层析试验片滴加为止的时间的影响。另外发现，通过在所述测定试样稀释液中使用包含氧化剂和/或叠氮化剂的水溶液，灵敏度、精度、与HPLC法的相关性进一步提高，从而完成了本发明。需要说明的是，本发明的测定试样稀释液在检测粒子为纤维素粒子的情况下特别有效。
即，代表性的本发明如下所示。
1.一种测定试样稀释液，是用于对测定试样中的血红蛋白A1c量相对于血红蛋白量的比例即血红蛋白A1c(％)进行定量的免疫层析用测定试样稀释液，是包含阴离子性表面活性剂、非离子性表面活性剂及缓冲剂的水溶液。
2.根据1中记载的测定试样稀释液，其中，所述阴离子性表面活性剂为烷基硫酸盐。
3.根据1或2中记载的测定试样稀释液，其中，所述非离子性表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯。
4.根据1或2中记载的测定试样稀释液，其中，所述非离子性表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯与聚氧乙烯烷基苯基醚的混合物。
5.根据1至4中任一项记载的测定试样稀释液，其包含0.05～2.0wt％的所述阴离子性表面活性剂，并且包含0.05～3.0wt％的所述非离子性表面活性剂。
6.根据1至5中任一项记载的测定试样稀释液，其还包含氧化剂。
7.根据6中记载的测定试样稀释液，其中，所述氧化剂为亚硝酸盐。
8.根据1至7中任一项记载的测定试样稀释液，其还包含叠氮化剂。
9.根据8中记载的测定试样稀释液，其中，所述叠氮化剂为叠氮化钠。
10.一种测定试剂盒，其用于对血红蛋白A1c量相对于血红蛋白量的比例进行定量，所述测定试剂盒包含1至9中任一项记载的测定试样稀释液、免疫层析试验片、以及免疫层析读数仪。
11.根据10中记载的测定试剂盒，其中，所述免疫层析试验片由如下部分构成：
(1)样品垫；
(2)结合垫，其担载有用于捕捉所述测定试样中的血红蛋白或血红蛋白A1c的抗体与纤维素粒子的复合体；
(3)膜，其以线状固定有用于特异性地捕捉测定试样中的血红蛋白或血红蛋白A1c的抗体；
(4)吸收垫。
12.一种定量方法，其使用1至11中任一项记载的测定试样稀释液或测定试剂盒，至少依次经过下述工序(i)至(iii)，对测定试样中的血红蛋白A1c量相对于的血红蛋白量的比例进行定量。
工序(i)：将测定试样与测定试样稀释液以体积比1：49～1：999混合并稀释的工序；
工序(ii)：将工序(i)的混合液向免疫层析试验片的样品垫滴加的工序；
工序(iii)：根据免疫层析试验片的检测线的反射吸光度和质控线的反射吸光度对血红蛋白A1c量相对于血红蛋白量的比例进行比色定量的工序。
13.根据12中记载的方法，其中，将测定试样与测定试样稀释液以体积比1：99～1：499混合并稀释。
发明效果
本发明的测定试样稀释液是包含非离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂及缓冲剂的水溶液，因此灵敏度高、精度高、与HPLC法的相关性高，并且能够不受将测定试样与测定试样稀释液混合后到向免疫层析试验片滴加为止的时间的影响地对测定试样中的HbA1c量相对于Hb量的比例即HbA1c(％)进行测定。
附图说明
图1是表示本发明中使用的免疫层析试验片的一例的(俯视)图。
图2是表示本发明中使用的免疫层析试验片的一例的(侧视)图。
具体实施方式
本发明中，测定试样没有特别限定，例如可以举出血液、淋巴液、脊髓液、汗、尿、泪液、唾液、皮肤、粘膜、毛发等生物试样。在血液中，除了可以将全血作为试样以外，还可以将离心分离血液而得的血清、血细胞或血浆作为试样。另外，测定试样并不限于来自于人，来自于狗、猫、牛等哺乳动物的生物试样也是对象。另外，本发明的测定项目是测定试样中的HbA1c量相对于Hb量的比例、即HbA1c(％)。
本发明的测定试样稀释液是至少包含非离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂及缓冲剂的水溶液。通过在所述测定试样稀释液中包含阴离子性表面活性剂，能够抑制由将测定试样与测定试样稀释液混合后到向免疫层析试验片滴加为止的时间差所致的测定值(例如后述的检测线的反射吸光度)的变动，提高测定灵敏度及测定精度。另外，通过在所述测定试样稀释液中包含非离子性表面活性剂，能够抑制经免疫层析试验片移动(流动)的测定试样的展开不均，因此能够提高测定精度。另外，若不包含缓冲剂，则下游的抗原抗体反应受到测定试样的pH阻碍，有测定灵敏度降低的情况。需要说明的是，由于本发明的测定项目为测定试样中的HbA1c量相对于Hb量的比例(HbA1c(％))，因此所述非离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂中的某个需要为显示溶血作用的表面活性剂。
作为所述阴离子性表面活性剂，只要立即将所述测定试样中的HbA1c变性、并且不阻碍下游的抗原抗体反应，就没有特别限定，可以举出十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂(LDS)等烷基硫酸盐、胆酸钠、脱氧胆酸钠等胆汁酸盐、聚氧乙烯十二烷基醚硫酸钠等聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、十二烷基苯磺酸钠等烷基苯磺酸盐、月桂酰基甲基丙氨酸、N－月桂酰基肌氨酸钠盐等酰基氨基酸盐、二烷基磺基琥珀酸钠、β萘磺酸甲醛缩合物钠盐及特殊聚羧酸型高分子表面活性剂等。它们当中，优选烷基硫酸盐，更优选十二烷基硫酸钠(SDS)。需要说明的是，所述烷基硫酸盐是显示溶血作用的表面活性剂。
本发明中，测定试样稀释液中的所述阴离子性表面活性剂的浓度没有特别限定，然而优选为0.05～2.0wt％，更优选为0.1～1.0wt％。若浓度低，则HbA1c的变性要花费时间，因此根据将测定试样与测定试样稀释液混合后到向免疫层析试验片滴加为止的时间的不同，有测定值(例如后述的检测线的反射吸光度)发生变动，测定灵敏度及测定精度降低的情况。另一方面，若浓度高，则阻碍下游的抗原抗体反应，因此有测定灵敏度降低的情况。
本发明中，作为所述非离子性表面活性剂，只要是具有提高所述测定试样的展开均匀性、并且促进下游的抗原抗体反应的作用的非离子性表面活性剂，就没有特别限定，可以举出聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton(注册商标)等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij(注册商标)等)、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(Tween(注册商标)等)、聚氧乙烯脂肪酸酯(Emanon(注册商标)等)、聚氧乙烯烷基胺(アミート(注册商标)等)、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(Reodol(注册商标)等)、失水山梨醇脂肪酸酯(Reodol(注册商标)等)、甘油脂肪酸酯(Reodol(注册商标)等)、烷基烷醇酰胺(Aminon(注册商标)等)、烷基咪唑啉(HOMOGENOL(注册商标)等)、蔗糖脂肪酸酯。它们当中，从测定试样的展开均匀性的观点考虑，优选聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(Tween(注册商标)等)，从促进下游的抗原抗体反应的观点考虑，优选聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton(注册商标)等)，更优选包含聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(Tween(注册商标)等)和聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton(注册商标)等)双方。需要说明的是，作为聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(Tween(注册商标)等)的市售品，可以合适地使用Tween(注册商标)20、Tween(注册商标)40、Tween(注册商标)60、或Tween(注册商标)80(均为和光纯药工业公司制)等，作为聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton(注册商标)等)的市售品，可以合适地使用TritonX(注册商标)100、TritonX(注册商标)114、Nonidet(注册商标)P－40(均为和光纯药工业公司制)等。需要说明的是，虽然所述聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(Tween(注册商标)等)缺乏溶血作用，然而聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton(注册商标)等)是显示溶血作用的表面活性剂。
本发明中，测定试样稀释液中的非离子性表面活性剂的浓度优选为0.05～3.0wt％。另外，作为非离子性表面活性剂，在使用聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(Tween(注册商标)等)与聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton(注册商标)等)的混合物的情况下，前者的浓度优选为0.05～3.0wt％，更优选为0.1～2.0wt％。若浓度低，则有向下游的展开变得困难，或者即使展开也变得不均匀从而测定精度大幅度降低的情况。另一方面，若浓度高，则有物理地吸附着的检测粒子与检测抗体、和/或膜与捕捉抗体分离，无法获得测定值，或者即使获得测定值，测定灵敏度也大幅度降低的情况。另外，后者的浓度优选为0.1～2.0wt％，更优选为0.1～1.0wt％。若浓度低，则有无法获得下游的抗原抗体反应的促进效果，测定灵敏度降低的情况。另一方面，若浓度高，则有物理地吸附着的检测粒子与检测抗体、和/或膜与捕捉抗体分离，完全无法获得测定值，或者即使获得测定值，测定灵敏度也大幅度降低的情况。
本发明中，作为所述缓冲剂，只要在作为目标的pH范围中具有足够的缓冲能力，则无论使用任何种类的缓冲剂都可以，例如可以举出Tris、磷酸、邻苯二甲酸、柠檬酸、马来酸、琥珀酸、草酸、硼酸、酒石酸、乙酸、碳酸、Good’s缓冲液(MES、ADA、PIPES、ACES、(2-氨基乙基)三甲基氯化铵盐酸(cholamine chloride)、BES、TES、HEPES、乙酰胺甘氨酸(acetamidoglycine)、三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、甘氨酰胺、N,N-二羟乙基甘氨酸)。它们当中，从在本发明中使用的抗体的最佳pH范围、即7.0附近具有足够的缓冲能力等理由考虑，优选Tris、磷酸、MES、PIPES、TES、HEPES，更优选Tris、磷酸、PIPES。所述缓冲剂的浓度只要在作为目标的pH范围中具有足够的缓冲能力，就没有特别限定，然而优选为10～100mM左右。
本发明中，测定试样稀释液可以在包含非离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂及缓冲剂的基础上还包含氧化剂。作为所述氧化剂，只要将Hb氧化、并且不阻碍下游的抗原抗体反应，就没有特别限定，然而可以举出卤素含氧酸盐、过渡金属络合物的盐、过氧化物、高锰酸盐、铬酸盐、亚硝酸盐、以及超氧化物。作为卤素含氧酸盐，例如可以举出次氯酸、亚氯酸、氯酸、高氯酸、次溴酸、亚溴酸、溴酸、高溴酸、次碘酸、亚碘酸、碘酸、以及高碘酸的碱金属盐、碱土金属盐、以及铵盐。作为过渡金属络合物的盐，例如可以举出碱金属盐、碱土金属盐、以及铵盐的铁氰化盐。作为过氧化物，例如可以举出有机过氧化物。作为高锰酸盐，例如可以举出碱金属或碱土金属的高锰酸盐。它们当中，优选亚硝酸盐，更优选亚硝酸钠。通过包含氧化剂，能够抑制由测定试样中的Hb的氧化不均引起的抗原抗体反应不均，能够期待测定精度的提高。另外，还将测定试样中的成为非特异反应的原因的物质氧化，由此能够抑制非特异反应的推进，能够期待测定精度的提高。
本发明中，测定试样稀释液中的所述氧化剂的浓度没有特别限定，然而优选为0.01～1.0wt％。若浓度低，则有Hb的氧化变得不充分，测定值(例如后述的检测线的反射吸光度)变动，测定精度降低的情况。另一方面，若浓度高，则有阻碍下游的抗原抗体反应，因此测定灵敏度降低的情况。
本发明的测定试样稀释液可以在包含非离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂及缓冲剂的基础上，还包含叠氮化剂。作为所述叠氮化剂，只要将Hb叠氮化、并且不阻碍下游的抗原抗体反应，就没有特别限定，然而优选叠氮化钠。需要说明的是，所述叠氮化剂在保存时也作为防腐剂发挥作用。通过包含叠氮化剂，能够抑制由测定试样中的Hb的叠氮化不均引起的抗原抗体反应不均，能够期待测定精度的提高。另外，也将测定试样中的成为非特异反应的原因的物质叠氮化，由此能够抑制非特异反应的推进，能够期待测定精度的提高。
所述叠氮化剂的浓度没有特别限定，然而优选为0.01～0.1wt％。若浓度低，则有Hb的叠氮化变得不充分，测定值(例如后述的检测线的反射吸光度)变动，测定精度降低的情况。另一方面，若浓度高，则有阻碍下游的抗原抗体反应，因此测定灵敏度降低的情况。另外，由于0.1wt％以上的叠氮化钠为有毒物质，因此不优选。
本发明的测定试样稀释液可以根据需要添加封闭用蛋白质(封闭肽片段(BPF)、牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白等)、盐类(氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化铝等)、和/或抗体稳定化剂(单糖类、寡糖类、多糖类、糖醇、甘油、葡糖酸盐、氨基酸类、白蛋白类、球蛋白类、纤维性蛋白质等)。
利用所述测定试样稀释液的测定试样的稀释倍率没有特别限定，然而优选稀释50～1000倍，更优选稀释100～500倍。若测定试样的稀释倍率小，则向下游的展开变得困难。另外，也有易于受到测定试样中的夹杂物的影响，测定精度降低的情况。另一方面，若测定试样的稀释倍率大，则有测定试样中的Hb及HbA1c的浓度降低，测定灵敏度降低的情况。
本发明中，免疫层析测定试剂盒可以在包含测定试样稀释液的基础上，还包含免疫层析试验片、以及免疫层析读数仪。
本发明中，免疫层析试验片的构成没有特别限定，然而优选以免疫层析试验片的测定试样溶液的添加部(滴加部)作为上游侧、依次连接配置具有所述添加部的样品垫、结合垫、膜、吸收垫的构成。下面，参照附图，对本发明的免疫层析试验片的一例进行说明，然而对本发明没有任何限定。图1及2中，1表示样品垫，2表示结合垫，3表示膜，4表示吸收垫，5表示底板(backing sheet)，6表示检测线，7表示质控线，8表示粘合片。
图1及2的例子中，免疫层析试验片采用了宽3～5mm(优选为4mm左右)、长40～100mm(优选为60mm左右)的细长的条状的形态。需要说明的是，在免疫层析试验片的膜3的距离上游侧的端部约15mm的位置形成以线状固定有捕捉抗体的检测线6。另外，在距离所述端部约20mm的位置形成以线状固定有另外的捕捉抗体的质控线7。此外，在免疫层析试验片的结合垫2中担载有作为检测抗体与检测粒子的复合体的检测线检测试剂、以及作为进行了标记的封闭用蛋白质与检测粒子的复合体的质控线检测试剂。
样品垫1的材质只要是在快速地吸收测定试样后能够向下游的结合垫、膜、吸收垫展开的材质，就没有特别限定。例如，可以举出纤维素制的滤纸或无纺布、玻璃制的滤纸或无纺布、聚酯制的滤纸或无纺布、聚乙烯制的滤纸或无纺布。它们当中，优选纤维素制的滤纸。另外，所述样品垫1的厚度优选为0.1～2.0mm，更优选为0.2～1.0mm。若厚度薄，则有下游的测定试样的流动变得不均匀，测定精度降低的情况。另一方面，若厚度厚，则有向下游的展开变慢，测定时间变长的情况。另外，向下游的展开所必需的测定试样量变得需要很多。
结合垫2的材质只要是能够以干燥状态保持检测线检测试剂及质控线检测试剂、并且能够在测定试样向下游展开的同时快速地释放所述两检测试剂的材质，就没有特别限定，例如可以举出纤维素制的滤纸或无纺布、玻璃制的滤纸或无纺布、聚酯制的滤纸或无纺布、聚乙烯制的滤纸或无纺布。它们当中，优选玻璃制的滤纸。另外，所述结合垫2的厚度优选为0.1～2.0mm，更优选为0.2～1.0mm。若厚度薄，则有无法以干燥状态保持目标量的检测线检测试剂及质控线检测试剂的情况。另一方面，若厚度厚，则有向下游的展开变慢，测定时间变长的情况。另外，向下游的展开所必需的测定试样量变多。
膜3的材质只要是能够将测定试样精度优良地均匀展开的材质，就没有特别限定，例如可以举出纤维素、纤维素衍生物、硝基纤维素、乙酸纤维素、聚氨酯、聚酯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚偏二氟乙烯、或尼龙制的膜。它们当中，优选硝基纤维素制的膜。
吸收垫4的材质只要是能够在快速地吸收从上游展开过来的测定试样后、不发生倒流地保持的材质，就没有特别限定，然而例如可以举出纤维素制的滤纸或无纺布、玻璃制的滤纸或无纺布、聚酯制的滤纸或无纺布、聚乙烯制的滤纸或无纺布。它们当中，优选纤维素制的滤纸。另外，所述吸收垫4的厚度优选为0.2～5.0mm，更优选为0.5～2.0mm。若厚度薄，则根据测定试样的滴加量不同而有一度被吸收垫吸收了的测定试样向膜侧倒流的情况。另一方面，若厚度厚，则免疫层析试验片及覆盖免疫层析试验片的罩壳的尺寸也变大，从POCT的观点考虑不优选。
担载于结合垫2的检测线检测试剂没有特别限定，然而优选检测抗体与检测粒子的复合体。
所述检测抗体没有特别限定，然而优选抗Hb抗体或抗HbA1c抗体，更优选抗HbA1c抗体。抗Hb抗体或抗HbA1c抗体可以使用市售品，也可以利用公知的方法另行制造。另外，可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，分子尺寸也没有特别限定。
所述检测粒子没有特别限制，然而可以使用着色粒子、荧光粒子。作为着色粒子，可以例示出金属粒子、胶乳粒子、纤维素粒子等。作为金属粒子可以例示出金胶体、银胶体、铂胶体、钯胶体、金纳米棒、金纳米盘、银纳米盘等，平均粒径优选为1～100nm。作为胶乳粒子可以例示出由聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸聚合物等材质形成的胶乳粒子，平均粒径优选为25～500nm。作为荧光粒子可以例示出由聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯基甲苯、二氧化硅等材质形成的荧光粒子，作为荧光色素可以例示出荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、花青及其衍生物等。它们当中，优选分散性高、可视性优异的纤维素粒子。以下，对纤维素粒子进行详述。
所述纤维素粒子由于具有大量的羟基，因此不仅能够利用共价键保持大量的反应性染料，而且还能够在浓染化后保持在水等中的稳定分散性。作为纤维素粒子，可以使用再生纤维素、精制纤维素、天然纤维素等，也可以使用局部被衍生物化了的纤维素。优选所述纤维素粒子的重量的20～90wt％为纤维素来源，更优选20～80wt％，进一步优选20～70wt％。
所述纤维素粒子的平均粒径没有特别限定，然而优选为100～1000nm，更优选为200～800nm。若平均粒径大于1000nm，则向下游的展开变慢，测定时间变长。另外，有变得易于被捕捉于膜上，背景本身显色，由此检测线及质控线处的显色变得不清楚的情况。另一方面，若平均粒径小于100nm，则有能够物理吸附或化学结合的抗体量降低，测定灵敏度降低的情况。
所述纤维素粒子的颜色没有特别限定，然而例如可以举出红色、蓝色、黄色、绿色、黑色、白色、荧光色。它们当中，优选不易受到背景的Hb来源的红色影响的蓝色、黑色，更优选蓝色。作为此种纤维素粒子，可以举出旭化成公司制的着色纤维素纳米微球(NanoAct(注册商标))，其中优选Navy(BL1)、Dark Navy(BL2)、Black(KR1)，更优选Navy(BL1)、DarkNavy(BL2)。
所述检测线检测试剂优选利用封闭用蛋白质进行封闭。所述封闭用蛋白质没有特别限定，然而优选微生物来源蛋白质的封闭肽片段(以下有时简称为BPF)、动物来源蛋白质的牛血清白蛋白(以下有时简称为BSA)、酪蛋白，更优选微生物来源蛋白质的BPF。BPF(约22kDa)由于分子量小于BSA(约66kDa)，因此能够实现更高精度的测定。另外，由于BSA是牛来源，因此有由外来性物质引起的污染的风险，而BPF是微生物来源，因此没有所述风险。另一方面，由于在酪蛋白的溶解时需要使用碱条件(pH＝8.5～10)的硼酸缓冲液，因此有抗体失活，灵敏度降低的情况。另外，硼酸缓冲液的环境风险也高。另一方面，由于在BPF的溶解时可以使用中性条件的Tris、磷酸、PIPES等，因此优选。封闭用蛋白质可以使用市售品，也可以利用公知的方法另行制造。另外，分子尺寸也没有特别限定，然而以平均分子量计优选为100kDa以下。一般而言封闭用蛋白质的分子尺寸越小，则相对于1个检测粒子而言的封闭用蛋白质的结合量越是增加，因此有助于测定精度的提高。
所述检测抗体与所述纤维素粒子的结合方法没有特别限定，然而优选利用基于疏水结合的物理吸附或基于共价键的化学结合来发生敏化，更优选操作简便并且成本低廉的物理吸附。需要说明的是，为了提高敏化效率，可以向纤维素粒子导入反应性活性基。作为反应性活性基，没有特别限定，例如可以举出羧基、氨基、醛基、硫醇基、环氧基、羟基。它们当中，优选羧基、氨基。在羧基的情况下，可以使用碳二亚胺与配体的氨基形成共价键。
本发明中使用的担载于结合垫2的质控线检测试剂没有特别限定，然而优选进行了标记的封闭用蛋白质与检测粒子的复合体。
所述检测线检测试剂的检测粒子的平均粒径与所述质控线检测试剂的检测粒子的平均粒径优选实质上相同。此处，所谓实质上相同，是指平均粒径为±50nm以内。若两者的平均粒径不同，则有在向下游的展开速度、显色强度中产生差异，利用质控线进行的检测线的修正不能很好地发挥作用，测定精度降低的情况。
所述检测线检测试剂的检测粒子的颜色与所述质控线检测试剂的检测粒子的颜色优选实质上相同。此处，所谓实质上相同，是指最大吸光波长为±20nm以内。若两者的颜色不同，例如在利用一般的发光二极管(以下有时简称为LED)－光电二极管(以下有时简称为PD)的测定装置进行测定的情况下，需要与检测线和质控线的各色对应的多个LED－PD的组合，装置变得大型化。
所述进行了标记的封闭用蛋白质的标记物质没有特别限定，然而由于比较廉价、且易于获取、在蛋白质标记领域等有实效，因此优选生物素或地高辛，更优选生物素。
所述进行了标记的封闭用蛋白质的标记方法没有特别限定，然而优选利用化学反应形成共价键的标记方法，可以例示出N－羟基琥珀酰亚胺法。通过使用N－羟基琥珀酰亚胺法，例如可以将生物素的羧基在脱水缩合剂存在下与N－羟基胺系化合物进行缩合反应，选择性地活化，借助酰胺键与封闭用蛋白质的氨基进行标记。所述缩合反应中使用的N－羟基胺系化合物没有特别限定，例如可以举出N－羟基琥珀酰亚胺、N－羟基降冰片烯－2，3－二甲酰亚胺、2－羟基亚氨基－2－氰基乙酸乙酯、2－羟基亚氨基－2－氰基乙酸酰胺、N－羟基哌啶、N－羟基邻苯二甲酰亚胺、N－羟基咪唑、N－羟基马来酰亚胺。也可以使用2种以上的这些化合物。它们当中，N－羟基琥珀酰亚胺(以下有时简称为NHS)由于比较廉价、且易于获取、在肽合成领域等中有实效，因此优选。另外，作为所述缩合反应中使用的脱水缩合剂，没有特别限定，例如可以举出1－乙基－3－二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐、1－环己基－(2－吗啉基－4－乙基)－碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐。它们当中，1－乙基－3－二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐(以下有时简称为EDC)由于在肽合成领域等中作为通用的水溶性缩合剂有实效，因此优选。另外，反应温度没有特别限定，然而优选为10～50℃，更优选为20～40℃。反应时间根据反应温度而不同，然而通常为5分钟～24小时。需要说明的是，反应液中含有的未反应的N－羟基胺系化合物、脱水缩合剂可以利用过滤、离心分离等从水溶剂中容易地分离。
所述进行了标记的封闭用蛋白质的封闭用蛋白质没有特别限定，然而优选微生物来源蛋白质的封闭肽片段(以下有时简称为BPF)、动物来源蛋白质的牛血清白蛋白(以下有时简称为BSA)、酪蛋白，更优选微生物来源蛋白质的BPF。BPF(约22kDa)由于分子量小于BSA(约66kDa)，因此能够实现更高灵敏度的测定。另外，由于BSA是牛来源，因此有由外来性物质引起的污染的风险，而BPF由于是微生物来源，因此没有所述风险。另一方面，在酪蛋白的溶解时需要使用碱条件(pH＝8.5～10)的硼酸缓冲液，而硼酸缓冲液的环境风险高。另一方面，在BPF的溶解时可以使用中性条件的Tris、磷酸、PIPES等，因此优选。封闭用蛋白质可以使用市售品，也可以利用公知的方法另行制造。另外，分子尺寸也没有特别限定，然而以平均分子量计优选为100kDa以下。一般而言封闭用蛋白质的分子尺寸越小，则相对于1个检测粒子而言的封闭用蛋白质的结合量越是增加，因此有助于测定灵敏度的提高。
使结合垫2担载所述检测线检测试剂和所述质控线检测试剂的方法没有特别限定，例如可以通过如下操作来制作，即，将所述检测线检测试剂与所述质控线检测试剂以一定比率混合后，将所述混合液向结合垫均匀地涂布、喷雾或浸渗，然后在恒温槽内在适当的温度干燥一定时间，由此制作。所述混合液的涂布量没有特别限定，然而优选每1cm线长为5～50μL。另外，所述混合液的检测粒子浓度没有特别限定，然而优选为0.01～0.5wt％，更优选为0.02～0.2wt％，进一步优选为0.02～0.1wt％。若浓度低于0.01wt％，则有无法充分地捕捉、检测Hb及HbA1c，测定灵敏度降低的情况。另一方面，即使浓度高于0.5wt％，也观察不到测定灵敏度的提高，只是成本升高。然后，在所述涂布后优选进行干燥。干燥温度没有特别限定，然而优选为20℃～80℃，更优选为20℃～60℃。干燥时间根据干燥温度而不同，然而通常为5～120分钟。
本发明中使用的膜3上的形成检测线6的以线状固定的捕捉抗体没有特别限定，然而优选抗Hb抗体或抗HbA1c抗体，更优选抗Hb抗体。抗Hb抗体或抗HbA1c抗体可以使用市售品，也可以利用公知的方法另行制造。另外，可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，分子尺寸也没有特别限定。
本发明中使用的膜3上的形成质控线7的以线状固定的捕捉抗体没有特别限定，然而优选用于特异性地捕捉质控线检测试剂的标记物质的抗体，具体而言在标记物质为生物素的情况下是抗生物素抗体，在标记物质为地高辛的情况下是抗地高辛抗体。需要说明的是，抗生物素抗体或抗地高辛抗体可以使用市售品，也可以利用公知的方法另行制造。另外，可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，分子尺寸也没有特别限定。
在膜3以线状固定形成所述检测线的捕捉抗体和形成所述质控线的捕捉抗体的方法没有特别限定，例如可以如下制作，即，将形成所述检测线的捕捉抗体和形成所述质控线的捕捉抗体分别以线状在不同的位置涂布一定量后，在恒温槽内在适当的温度干燥一定时间，由此制作。所述两捕捉抗体的涂布量没有特别限定，然而优选每1cm线长为0.1～2μL。另外，所述两捕捉抗体的涂布浓度没有特别限定，然而优选为0.1～10mg/mL，更优选为0.2～5mg/mL，进一步优选为0.5～2mg/mL。若浓度低，则有无法充分地捕捉、检测Hb及HbA1c，测定灵敏度降低的情况。另一方面，即使提高浓度，也观察不到测定灵敏度的提高，只是成本提高。然后，在所述涂布后优选进行干燥。干燥温度没有特别限定，然而优选为20℃～80℃，更优选为20℃～60℃。干燥时间根据干燥温度而不同，然而通常为5～120分钟。
本发明中，免疫层析试验片可以如下制作，即，将所述制作出的膜3粘贴于粘合片8的中央附近，然后将结合垫2局部重合地粘贴于膜3的一个末端上，然后将样品垫1局部重合地粘贴于结合垫2的与重叠于膜3的末端相反的末端上，然后将吸收垫4局部重合地粘贴于膜3的另一个末端上后，切割为一定宽度的条状，由此制作。需要说明的是，检测线6及质控线7可以在制作试验片后制备，也可以在制作试验片前制备。
所述免疫层析试验片可以收容于适当的塑料制的罩壳中，所述罩壳至少具有用于向样品垫1上滴加测定试样的第一开口部、用于在膜3上测定检测线6和质控线7的第二开口部。
使用本发明的测定试样稀释液、以及免疫层析试验片在膜上进行HbA1c(％)的测定的方法没有特别限定，可以例示出以下的方法。首先，将测定试样和测定试样稀释液以给定的稀释倍率混合，由此得到能够展开的稀释测定试样。然后，将所述稀释测定试样向样品垫1滴加，由此使稀释测定试样利用毛细管现象通过样品垫1而在结合垫2展开。此时，在稀释测定试样将担载于结合垫2的检测线检测试剂及质控线检测试剂溶解的同时，稀释测定试样中的HbA1c与检测线检测试剂中的以抗HbA1c抗体敏化了的纤维素粒子形成免疫复合体。需要说明的是，稀释测定试样中的HbA1c以外的Hb(例如HbA0等)不与检测线检测试剂形成免疫复合体。然后，所述稀释测定试样在膜3展开。当稀释测定试样到达检测线6时，所述免疫复合体由形成检测线的捕捉抗体(抗Hb抗体)捕捉并富集，检测线6显色。需要说明的是，由于稀释测定试样中的HbA1c以外的Hb(例如HbA0等)也由形成检测线的捕捉抗体(抗Hb抗体)捕捉并富集，因此在检测线上产生免疫复合体与HbA1c以外的Hb(例如HbA0等)的竞争性的捕捉，被捕捉的概率依赖于测定试样中的HbA1c量相对于Hb量的比例、即HbA1c(％)。即，能够根据检测线的显色强度来直接测定HbA1c(％)。其后，当所述稀释测定试样到达质控线7时，以质控线检测试剂中的用标记物质(生物素)进行了标记的封闭用蛋白质敏化了的纤维素粒子由形成质控线的捕捉抗体(抗生物素抗体)捕捉并富集，质控线7显色。最后，所述稀释测定试样由吸收垫4吸收。
所述HbA1c(％)可以根据检测线的显色强度直接测定，也可以考虑稀释测定试样的流动不均，根据用检测线的显色强度除以质控线的显色强度而得的修正值来测定。
本发明中，免疫层析试验片的检测线及质控线的测定方法没有特别限定，可以使用市售的免疫层析读数仪，也可以利用公知的方法另行制造免疫层析读数仪。作为检测系统，没有特别限定，例如可以使用LED－FD、LED－CMOS、LED－CCD。
实施例
以下，基于实施例对本发明进行详细说明。本发明并不限定于这些实施例。需要说明的是，实施例中记载的HbA1c(％)均为NGSP值。
(实施例1)
(1)HbA1c测定用检测线检测试剂的制备
将8.57mg/mL的抗HbA1c单克隆抗体(HbA1c Antibody、OAMA02329、AVIVA SYSTEMBIOLOGY公司制)用蒸馏水(大塚蒸馏水、大塚制药公司制)调配成1.0mg/mL。然后，将1.0wt％的纤维素粒子(NanoAct(注册商标)、BL2：Dark Navy、平均粒径365nm、旭化成公司制)100μL、10mM的Tris缓冲液(204－07885、和光纯药工业公司制)(pH7.0)900μL、以及所述1.0mg/mL(0.1wt％)的抗HbA1c单克隆抗体100μL加入15mL的离心沉降管，用旋涡混合器进行搅拌。然后，放入调整为37℃的低温培养箱(IN604、YAMATO科学公司制)并静置120分钟。然后，加入包含1.0wt％的酪蛋白(030－01505、和光纯药工业公司制)、100mM的硼酸缓冲液(021－02195、和光纯药工业公司制)的封闭液(pH8.0)12mL，再在调整为37℃的低温培养箱(IN604、YAMATO科学公司制)中静置60分钟。然后，使用离心分离机(MX－307、TOMY精工公司制)、RACK-in-ROTOR(TMA－300、TOMY精工公司制)和离心管架(AR510－04、TOMY精工公司制)，在25℃进行15分钟的10000G的离心，使抗体敏化纤维素粒子沉降后除去上清液。然后，加入包含50mM的硼酸缓冲液(021－02195、和光纯药工业公司制)的清洗液(pH10.0)12mL，用超声波分散机(UH－50、SMT公司制)处理10秒。然后，使用离心分离机(MX－307、TOMY精工公司制)、RACK-in-ROTOR(TMA－300、TOMY精工公司制)和离心管架(AR510－04、TOMY精工公司制)，在25℃进行15分钟的10000G的离心，使抗体敏化纤维素粒子沉降后除去上清液。然后，加入包含15wt％的蔗糖(196－00015、和光纯药工业公司制)、0.2wt％的酪蛋白(030－01505、和光纯药工业公司制)、62mM的硼酸缓冲液(021－02195、和光纯药工业公司制)的涂布液(pH9.2)2.0mL，用超声波分散机(UH－50、SMT公司制)处理10秒，得到HbA1c测定用检测线检测试剂。需要说明的是，所述HbA1c测定用检测线检测试剂中的检测粒子浓度为0.5mg/mL(0.05wt％)，抗体浓度为0.05mg/mL(0.005wt％)。
(2)HbA1c测定用质控线检测试剂的制备
将D生物素(04822－91、Nacalai Tesque公司制)16mg、以及二甲亚砜：DMSO(08904－14、Nacalai Tesque公司制)1000μL加入1.5mL微型管，用旋涡混合器搅拌，得到D生物素溶液。然后，将1－乙基－3－(3－二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐：EDC(15022－86、Nacalai Tesque公司制)20mg、N－羟基琥珀酰亚胺：NHS(18948－02、Nacalai Tesque公司制)20mg、以及蒸馏水(大塚蒸馏水、大塚制药公司制)100μL加入1.5mL微型管，用旋涡混合器搅拌，得到EDC/NHS溶液。然后，将所述D生物素溶液100μL及所述EDC/NHS溶液100μL混合后，放入调整为25℃的低温培养箱(IN604、YAMATO科学公司制)并静置15分钟，得到D生物素/EDC/NHS溶液。然后，将Blocking Peptide Fragment：BPF(BPF－301、东洋纺公司制)10mg、以及蒸馏水(大塚蒸馏水、大塚制药公司制)100μL加入1.5mL微型管，用旋涡混合器搅拌，得到BPF溶液。然后，将所述D生物素/EDC/NHS溶液100μL与所述BPF溶液100μL混合后，放入调整为25℃的低温培养箱(IN604、YAMATO科学公司制)并静置30分钟，得到D生物素－BPF溶液。然后，将1.0wt％的纤维素粒子(NanoAct(注册商标)、BL2：Dark Navy、平均粒径365nm、旭化成公司制)100μL、10mM的Tris缓冲液(204－07885、和光纯药工业公司制)(PH7.0)900μL、以及所述D生物素－BPF溶液100μL加入15mL的离心沉降管，用旋涡混合器搅拌。然后，放入调整为37℃的低温培养箱(IN604、YAMATO科学公司制)并静置120分钟。然后，加入包含1.0wt％的酪蛋白(030－01505、和光纯药工业公司制)、100mM的硼酸缓冲液(021－02195、和光纯药工业公司制)的封闭液(pH8.0)12mL，再在调整为37℃的低温培养箱(IN604、YAMATO科学公司制)中静置60分钟。然后，使用离心分离机(MX－307、TOMY精工公司制)、RACK-in-ROTOR(TMA－300、TOMY精工公司制)和离心管架(AR510－04、TOMY精工公司制)，在25℃进行15分钟的10000G的离心，使D生物素敏化纤维素粒子沉降后除去上清液。然后，加入包含50mM的硼酸缓冲液(021－02195、和光纯药工业公司制)的清洗液(pH10.0)12mL，用超声波分散机(UH－50、SMT公司制)处理10秒。然后，使用离心分离机(MX－307、TOMY精工公司制)、RACK-in-ROTOR(TMA－300、TOMY精工公司制)和离心管架(AR510－04、TOMY精工公司制)，在25℃进行15分钟的10000G的离心，使D生物素敏化纤维素粒子沉降后除去上清液。然后，加入包含15wt％的蔗糖(196－00015、和光纯药工业公司制)、0.2wt％的酪蛋白(030－01505、和光纯药工业公司制)、62mM的硼酸缓冲液(021－02195、和光纯药工业公司制)的涂布液(pH9.2)2.0mL，用超声波分散机(UH－50、SMT公司制)处理10秒，得到HbA1c测定用质控线检测试剂。需要说明的是，所述HbA1c测定用质控线检测试剂中的检测粒子浓度为0.5mg/mL(0.05wt％)，封闭用蛋白质的标记导入比为1：7。
(3)HbA1c测定用膜卡的制作
将3.6mg/mL的抗Hb单克隆抗体(HBA1 Antibody、OAMA02326、AVIVA SYSTEMBIOLOGY公司制)用蒸馏水(大塚蒸馏水、大塚制药公司制)调配为1.0mg/mL。然后，将1.0mg/mL的抗生物素多克隆抗体(Biotin Antibody、A150－111A、BETHYL公司制)用蒸馏水(大塚蒸馏水、大塚制药公司制)调配为0.5mg/mL。然后，在由上游侧的20mm×300mm的粘合带部、中央的25mm×300mm的膜部、下游侧的15mm×300mm的粘合带部构成的60mm×300mm的膜卡(Hi－Flow Plus120 Membrane Cards、HF120、Millipore公司制)的膜部的距离上游侧15mm的位置，使用分注平台(XYZ3060、BIODOT公司制)和Bio Jet喷嘴(BHQHR－XYZ、BIODOT公司制)，以1.0μL/cm的涂布量涂布所述1.0mg/mL的抗Hb单克隆抗体后，在调整为45℃的干燥机(WFO－510、东京理化器械公司制)中干燥30分钟，形成线宽约1mm的检测线。此外，在形成有所述检测线的膜卡的膜部的距离上游侧20mm的位置，使用分注平台(XYZ3060、BIODOT公司制)和Bio Jet喷嘴(BHQHR－XYZ、BIODOT公司制)，以1.0μL/cm的涂布量涂布所述0.5mg/mL的抗生物素多克隆抗体后，在调整为45℃的干燥机(WFO－510、东京理化器械公司制)中干燥30分钟，形成线宽约1mm的质控线，由此得到HbA1c测定用膜卡。
(4)HbA1c测定用结合垫的制作
将所述HbA1c测定用检测线检测试剂及所述HbA1c测定用质控线检测试剂以6：1的比例(质量比)混合。需要说明的是，在HbA1c测定用检测线检测试剂及HbA1c测定用质控线检测试剂中的粒子浓度相同的情况下，只要以体积比6：1的比例混合即可。然后，在10mm×300mm的结合垫(GLASS FIBER DIAGNOSTIC PAD、GFDX001050、Millipore公司制)的整个面，使用分注平台(XYZ3060、BIODOT公司制)和Air Jet喷嘴(AJQHR－XYZ、BIODOT公司制)，以15μL/cm的涂布量均匀地涂布所述混合液后，在调整为45℃的干燥机(WFO－510、东京理化器械公司制)中干燥30分钟，得到HbA1c测定用结合垫。
(5)HbA1c测定用免疫层析试验片的制作
在所述HbA1c测定用膜卡的上游侧的20mm×300mm的粘合带部，以与膜部重合5mm的方式贴合所述HbA1c测定用结合垫。然后，再在上游侧以与所述结合垫重合5mm的方式贴合20mm×300mm的样品垫(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS、CFSP002000、Millipore公司制)。然后，在所述HbA1c测定用膜卡的下游侧的15mm×300mm的粘合带部，以与膜部重合2mm的方式贴合20mm×300mm的吸收垫(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS、CFSP002000、Millipore公司制)。然后，使用断头台式切割模块(CM5000、BIODOT公司制)，切成宽4mm、长63mm的条状，由此得到HbA1c测定用免疫层析试验片。
(6)测定试样稀释液的制备
将磷酸缓冲生理食盐粉末(162－19321、和光纯药工业公司制)1袋、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯：Tween(注册商标)20(166－21213、和光纯药工业公司制)2.0g、十二烷基硫酸钠：SDS(194－13985、和光纯药工业公司制)1.0g、亚硝酸钠(199－02565、和光纯药工业公司制)0.2g、叠氮化钠(199－11095、和光纯药工业公司制)0.2g溶解于蒸馏水(大塚蒸馏水、大塚制药公司制)150mL中，用蒸馏水(大塚蒸馏水、大塚制药公司制)定容为200mL后，转移到500mL玻璃瓶中，制备出测定试样稀释液(50mM PBS、1.0wt％Tween 20、0.5wt％SDS、0.1wt％亚硝酸钠、0.1wt％叠氮化钠)。
(7)稀释试样的制备
将市售的作为HbA1c标准物质的HbA1c测定性能评价用试样(QRM HbA1c 2007－1、检查医学标准物质机构公司制、L1～L5的5个水平)分别用所述测定试样稀释液稀释为500倍，由此得到HbA1c(％)为L1＝5.01％、L2＝5.65％、L3＝7.35％、L4＝9.51％、L5＝11.26％、并且Hb浓度为L1～L5＝0.280g/L的稀释HbA1c试样(L1～L5)。
(8)HbA1c测定用免疫层析试验片的评价：灵敏度的评价
将所述HbA1c测定用免疫层析试验片设置于水平的台上。然后，用微量移液器分取混合时间为10秒的所述稀释HbA1c试样(L1、L4)100μL，向样品垫缓慢地滴加，在25℃静置10分钟。然后，使用免疫层析读数仪(C10060－10、测定模式：Latex、Line、滨松光子学公司制)测定出膜上的质控线及检测线的反射吸光度(mAbs)。对所述稀释HbA1c试样(L1、L4)分别以N＝10(合计使用20条所述HbA1c测定用免疫层析试验片)的所述实验操作。作为灵敏度的指标，算出所述稀释HbA1c试样(L4)的检测线的反射吸光度(mAbs)的N＝10平均值与所述稀释HbA1c试样(L1)的检测线的反射吸光度(mAbs)的N＝10平均值的差、即ΔL4－L1(mAbs)，将ΔL4－L1≥180mAbs评价为3分(优)，将150mAbs≤ΔL4－L1＜180mAbs评价为2分(良)，将100mAbs≤ΔL4－L1＜150mAbs评价为1分(中)，将ΔL4－L1＜100mAbs评价为0分(差)。实施例1的HbA1c测定用免疫层析试验片的灵敏度为ΔL4－L1＝170mAbs，评价为2分，能够实现高灵敏度的测定。
(9)HbA1c测定用免疫层析试验片的评价：精度的评价
将所述HbA1c测定用免疫层析试验片设置于水平的台上。然后，用微量移液器分取混合时间为10秒的所述稀释HbA1c试样(L1、L4)100μL，向样品垫缓慢地滴加，在25℃静置10分钟。然后，使用免疫层析读数仪(C10060－10、测定模式：Latex、Line、滨松光子学公司制)测定出膜上的质控线及检测线的反射吸光度(mAbs)。对所述稀释HbA1c试样(L1、L4)分别以N＝10(合计使用20条所述HbA1c测定用免疫层析试验片)进行所述实验操作。作为精度的指标，分别算出用所述稀释HbA1c试样(L1、L4)的检测线的反射吸光度(mAbs)除以质控线的反射吸光度(mAbs)而得的修正值(L1、L4)后，分别算出所得的修正值(L1、L4)的N＝10处的CV(L1、L4)(％)，再算出CV(L1)(％)与CV(L4)(％)的平均值：CV(％)，将CV＜3％评价为3分(优)，将3％≤CV＜5％评价为2分(良)，将5％≤CV＜10％评价为1分(中)，将CV≥10％评价为0分(差)。实施例1的HbA1c测定用免疫层析试验片的精度为CV＝3.3％，评价为2分，能够实现高精度的测定。
(10)HbA1c测定用免疫层析试验片的评价：与HPLC法的相关性的评价
将所述HbA1c测定用免疫层析试验片设置于水平的台上。然后，用微量移液器分取混合时间为10秒的所述稀释HbA1c试样(L1～L5)100μL，向样品垫缓慢地滴加，在25℃静置10分钟。然后，使用免疫层析读数仪(C10060－10、测定模式：Latex、Line、滨松光子学公司制)测定出膜上的质控线及检测线的反射吸光度(mAbs)。对所述稀释HbA1c试样(L1～L5)分别以N＝10(合计使用50条所述HbA1c测定用免疫层析试验片)进行所述实验操作。作为相关性的指标，分别算出用所述稀释HbA1c试样(L1～L5)的检测线的反射吸光度(mAbs)除以质控线的反射吸光度(mAbs)而得的修正值(L1～L5)后，算出所得的修正值(L1～L5)与所述稀释HbA1c试样(L1～L5)的HbA1c(％)、L1＝5.01％、L2＝5.65％、L3＝7.35％、L4＝9.51％、L5＝11.26％的皮尔森相关系数：r，将r≥0.95评价为3分(优)，将0.90≤r＜095评价为2分(良)，将0.85≤r＜0.90评价为1分(中)，将r＜0.85评价为0分(差)。实施例1的HbA1c测定用免疫层析试验片的相关性为r＝0.96，评价为3分，具有与HbA1c(％)的高相关性。
(11)HbA1c测定用免疫层析试验片的评价：混合时间依赖性的评价
将所述HbA1c测定用免疫层析试验片设置于水平的台上。然后，用微量移液器分取混合时间为10秒及15分钟的所述稀释HbA1c试样(L4)100μL，向样品垫缓慢地滴加，在25℃静置10分钟。然后，使用免疫层析读数仪(C10060－10、测定模式：Latex、Line、滨松光子学公司制)测定出膜上的质控线及检测线的反射吸光度(mAbs)。对混合时间为10秒的稀释HbA1c试样(L4)及混合时间为15分钟的稀释HbA1c试样(L4)分别以N＝10(合计使用20条所述HbA1c测定用免疫层析试验片)进行所述实验操作。作为混合时间依赖性的指标，算出所述混合时间为15分钟的稀释HbA1c试样(L4)的检测线的反射吸光度(mAbs)的N＝10平均值与所述混合时间为10秒的稀释HbA1c试样(L4)的检测线的反射吸光度(mAbs)的N＝10平均值的差：Δ15－10(mAbs)，将Δ15－10≤20mAbs评价为3分(优)，将20mAbs＜Δ15－10≤100mAbs评价为2分(良)，将100mAbs＜Δ15－10≤200mAbs评价为1分(中)，将Δ15－10＞200mAbs评价为0分(差)。实施例1的HbA1c测定用免疫层析试验片的混合时间依赖性为Δ15－10＝－10mAbs，评价为3分，确认基本上没有由混合时间造成的检测线的反射吸光度的变动，所述混合时间是将测定试样与测定试样稀释液混合后到向HbA1c测定用免疫层析试验片滴加为止的时间。
(实施例2～27)
除了变更测定试样稀释液的组成以外，与实施例1同样地制作并评价了HbA1c测定用免疫层析试验片。将所使用的测定试样稀释液的组成及所得的评价结果表示于表1中。需要说明的是，表1中的LDS表示十二烷基硫酸锂(121－02741、和光纯药工业公司制)，Tween(注册商标)80表示聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯(163－21625、和光纯药工业公司制)，TritonX(注册商标)100表示聚氧乙烯(10)辛基苯基醚(160－24751、和光纯药工业公司制)，NP－40表示Nonidet(注册商标)P－40(23640－65、Nacalai Tesque公司制)，KNO2表示亚硝酸钾(169－27325、和光纯药工业公司制)，PIPES表示PIPES缓冲液(pH7.5)(28104－16、Nacalai Tesque公司制)，Tris表示Tris缓冲液(pH7.5)(204－07885、和光纯药工业公司制)。
(实施例28～31)
在稀释测定试样的制备工序中，不是将市售的作为HbA1c标准物质的HbA1c测定性能评价用试样(QRM HbA1c 2007－1、检查医学标准物质机构公司制、L1～L5的5个水平)分别用测定试样稀释液稀释为500倍，而是稀释为50倍(实施例28)、100倍(实施例29)、1000倍(实施例30)、2000倍(实施例31)，除此以外，与实施例1同样地制作并评价了HbA1c测定用免疫层析试验片。将所得的评价结果表示于表1中。
[表1]
Figure BDA0002579156630000251
(比较例1～5)
除了变更测定试样稀释液的组成以外，与实施例1同样地制作并评价了HbA1c测定用免疫层析试验片。将所使用的测定试样稀释液的组成及所得的评价结果表示于表2中。
如表2中所示，使用了不包含表面活性剂的测定试样稀释液的比较例1中，作为测定对象物的HbA1c未被变性，在结合垫中HbA1c与以抗HbA1c抗体敏化了的检测粒子无法形成免疫复合体，因此检测线浅到无法辨认，得到测定灵敏度明显低的结果。需要说明的是，比较例1中，由于检测线的反射吸光度为检测下限附近，因此未进行精度、相关性、混合时间依赖性的评价。
另外，使用了不包含阴离子性表面活性剂、即仅包含作为非离子性表面活性剂的Tween(注册商标)20的测定试样稀释液的比较例2也相同，作为测定对象物的HbA1c未被变性，在结合垫中HbA1c与以抗HbA1c抗体敏化了的检测粒子无法形成免疫复合体，因此检测线浅到无法辨认，得到测定灵敏度明显低的结果。需要说明的是，比较例2中，由于检测线的反射吸光度为检测下限附近，因此不进行其后的精度、相关性、混合时间依赖性的评价。
另外，使用了包含2种非离子性表面活性剂(Tween(注册商标)20及Triton X(注册商标)100)的测定试样稀释液的比较例3、4中，由于到作为测定对象物的HbA1c被变性为止需要花费很多时间，因此得到检测线的反射吸光度根据混合时间不同而大幅度变动的结果，所述混合时间为将测定试样与测定试样稀释液混合后到向HbA1c测定用免疫层析试验片滴加为止的时间。另外，因所述混合时间依赖性的影响，尤其会得到如下的结果，即，在通常的免疫层析试验中所设想的、刚刚混合后的测定灵敏度、测定精度明显低。
另外，使用了仅包含作为阴离子性表面活性剂的SDS的测定试样稀释液的比较例5中，产生稀释了的测定试样的向下游的展开不均(根据情况在测定时间内不向下游展开)，得到测定精度明显低的结果。
(比较例6)
将磷酸缓冲生理食盐粉末(162－19321、和光纯药工业公司制)1袋、十二烷基硫酸钠：SDS(194－13985、和光纯药工业公司制)10g溶解于蒸馏水(大塚蒸馏水、大塚制药公司制)150mL中，用蒸馏水(大塚蒸馏水、大塚制药公司制)定容为200mL后，转移到500mL玻璃瓶中，制备出样品垫涂布液(50mM PBS、5wt％SDS)。然后，在20mm×300mm的样品垫(CELLULOSEFIBER SAMPLE PADS、CFSP002000、Millipore公司制)的整个面，使用分注平台(XYZ3060、BIODOT公司制)和Air Jet喷嘴(AJQHR－XYZ、BIODOT公司制)，将所述样品垫涂布液以30μL/cm的涂布量均匀地涂布后，在调整为45℃的干燥机(WFO－510、东京理化器械公司制)中干燥30分钟，得到担载有表面活性剂的样品垫。在HbA1c测定用免疫层析试验片的制作工序中，取代20mm×300mm的样品垫(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS、CFSP002000、Millipore公司制)而使用担载有所述表面活性剂的样品垫，除此以外，与比较例2同样地制作并评价了HbA1c测定用免疫层析试验片。将所使用的测定试样稀释液的组成及所得的评价结果表示于表2中。
在使用了仅包含作为非离子性表面活性剂的Tween(注册商标)20的测定试样稀释液、并且使用了在样品垫担载有作为阴离子性表面活性剂的SDS的免疫层析试验片的比较例6中，检测线淡，得到测定灵敏度低的结果。对此可以认为是因为，在稀释测定试样通过样品垫的短暂时间中，SDS的溶解及HbA1c的变性未被完全地推进，在结合垫中HbA1c与以抗HbA1c抗体敏化了的检测粒子难以形成免疫复合体。即表明，阴离子性表面活性剂不是需要包含于样品垫中，而是需要包含于测定试样稀释液中。
(比较例7)
将磷酸缓冲生理食盐粉末(162－19321、和光纯药工业公司制)1袋、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯：Tween(注册商标)20(166－21213、和光纯药工业公司制)20g溶解于蒸馏水(大塚蒸馏水、大塚制药公司制)150mL中，用蒸馏水(大塚蒸馏水、大塚制药公司制)定容为200mL后，转移到500mL玻璃瓶中，制备出样品垫涂布液(50mM PBS、10wt％Tween20)。然后，在20mm×300mm的样品垫(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS、CFSP002000、Millipore公司制)的整个面，使用分注平台(XYZ3060、BIODOT公司制)和Air Jet喷嘴(AJQHR－XYZ、BIODOT公司制)，将所述样品垫涂布液以30μL/cm的涂布量均匀地涂布后，在调整为45℃的干燥机(WFO－510、东京理化器械公司制)中干燥30分钟，得到担载有表面活性剂的样品垫。在HbA1c测定用免疫层析试验片的制作工序中，取代20mm×300mm的样品垫(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS、CFSP002000、Millipore公司制)而使用担载有所述表面活性剂的样品垫，除此以外，与比较例5同样地制作并评价了HbA1c测定用免疫层析试验片。将所使用的测定试样稀释液的组成及所得的评价结果表示于表2中。
在使用了仅包含作为阴离子性表面活性剂的SDS的测定试样稀释液、并且使用了在样品垫担载有作为非离子性表面活性剂的Tween(注册商标)20的免疫层析试验片的比较例7中，也得到测定灵敏度低的结果。对此可以认为是因为，在稀释测定试样通过样品垫的短暂时间中，Tween(注册商标)的溶解未被完全地推进，无法完全地消除展开不均。即表明，非离子性表面活性剂不是需要包含于样品垫中，而是需要包含于测定试样稀释液中。
[表2]
Figure BDA0002579156630000291
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供一种免疫层析试验片，其灵敏度高、精度高、与HPLC法的相关性高，并且能够不受将测定试样与测定试样稀释液混合后到向免疫层析试验片滴加为止的时间的影响地测定测定试样中的HbA1c量相对于Hb量的比例、即HbA1c(％)。
符号说明
1样品垫，2结合垫，3膜，4吸收垫，5底板，6检测线，7质控线，8粘合片。

Claims (13)

1.一种测定试样稀释液，是用于对测定试样中的血红蛋白A1c量相对于血红蛋白量的比例即血红蛋白A1c％进行定量的免疫层析用测定试样稀释液，
所述测定试样稀释液为包含阴离子性表面活性剂、非离子性表面活性剂及缓冲剂的水溶液。
2.根据权利要求1所述的测定试样稀释液，其中，
所述阴离子性表面活性剂为烷基硫酸盐。
3.根据权利要求1或2所述的测定试样稀释液，其中，
所述非离子性表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯。
4.根据权利要求1或2所述的测定试样稀释液，其中，
所述非离子性表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯与聚氧乙烯烷基苯基醚的混合物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的测定试样稀释液，其包含0.05wt％～2.0wt％的所述阴离子性表面活性剂，并且包含0.05wt％～3.0wt％的所述非离子性表面活性剂。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的测定试样稀释液，其还包含氧化剂。
7.根据权利要求6所述的测定试样稀释液，其中，
所述氧化剂为亚硝酸盐。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的测定试样稀释液，其还包含叠氮化剂。
9.根据权利要求8所述的测定试样稀释液，其中，
所述叠氮化剂为叠氮化钠。
10.一种测定试剂盒，其用于对血红蛋白A1c量相对于血红蛋白量的比例进行定量，
所述测定试剂盒包含权利要求1至9中任一项所述的测定试样稀释液、免疫层析试验片以及免疫层析读数仪。
11.根据权利要求10所述的测定试剂盒，其中，
所述免疫层析试验片由如下部分构成：
(1)样品垫；
(2)结合垫，其担载有用于捕捉所述测定试样中的血红蛋白或血红蛋白A1c的抗体与纤维素粒子的复合体；
(3)膜，其以线状固定有用于特异性地捕捉测定试样中的血红蛋白或血红蛋白A1c的抗体；
(4)吸收垫。
12.一种定量方法，其使用权利要求1至11中任一项所述的测定试样稀释液或测定试剂盒，至少依次经过下述工序(i)至(iii)，对测定试样中的血红蛋白A1c量相对于血红蛋白量的比例进行定量，
工序(i)：将测定试样与测定试样稀释液以体积比1：49～1：999混合并稀释的工序；
工序(ii)：将工序(i)的混合液向免疫层析试验片的样品垫滴加的工序；
工序(iii)：根据免疫层析试验片的检测线的反射吸光度和质控线的反射吸光度对血红蛋白A1c量相对于血红蛋白量的比例进行比色定量的工序。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，
将测定试样与测定试样稀释液以体积比1：99～1：499混合并稀释。
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