TWI728486B

TWI728486B - 測定試樣稀釋液

Info

Publication number: TWI728486B
Application number: TW108135715A
Authority: TW
Inventors: 岡本淳; 米田圭三
Original assignee: 日商東洋紡股份有限公司
Priority date: 2018-10-25
Filing date: 2019-10-02
Publication date: 2021-05-21
Also published as: JP2020067395A; TW202022344A; WO2020085417A1

Abstract

本發明提供一種測定試樣稀釋液，可以高靈敏度、高精度、與HPLC法之高相關性且不受將測定試樣與測定試樣稀釋液混合起至向HbA1c測定用免疫層析試片滴加為止的時間的影響，而對測定試樣中的HbA1c量相對於Hb量之比率即HbA1c(%)進行測定。本發明的測定試樣稀釋液係用以定量測定試樣中的血紅蛋白A1c量相對於血紅蛋白量之比率即血紅蛋白A1c(%)，且前述測定試樣稀釋液係包含非離子性界面活性劑、陰離子性界面活性劑及緩衝劑之水溶液，包含聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯及聚氧乙烯烷基醚作為前述非離子性界面活性劑。

Description

測定試樣稀釋液

本發明係關於一種測定試樣稀釋液，係用以藉由免疫層析法對測定試樣中的血紅蛋白A1c量相對於血紅蛋白量之比率即血紅蛋白A1c(%)進行測定。

根據世界糖尿病聯盟(International Diabetes Federation)，世界上的糖尿病患者數包括美國、歐洲等發達國家，以及中國、印度、巴西等新興國家在內亦急遽增加，在2015年存在約4.2億人，預測在2040年將達到約6.4億人，糖尿病診斷的重要性增大。

作為糖尿病診斷項目之一的所謂血紅蛋白A1c(以下有時簡稱為HbA1c)，係指於擔負搬運血液中的氧之作用之血紅蛋白(以下有時簡稱為Hb)結合有糖(葡萄糖)之糖化Hb中，位於Hb的β鏈的N末端側之纈胺酸殘基被糖化之物質，由於HbA1c量相對於總Hb量之比率即HbA1c(%)反映過去1個月至2個月間的平均血糖值，故而被用於觀察糖尿病的長期過程。

先前，測定HbA1c(%)時，利用有HPLC(High Performance Liquid Chromatography；高效液相層析)法、毛細管電泳法、酶比色法、免疫比濁法等測定技術，但這些測定方法因具有專業知識或分析裝置大型且昂貴等原因，而主要被用於大規模醫院或進行大量檢查之檢查中心，小規模醫院中無法簡單地測定HbA1c(%)之方面成為問題。

近年來，醫療現場中POCT這一詞語備受關注。所謂POCT，係即時檢驗(Point Of Care Testing)之簡稱，係指醫療從事者在受驗者的旁邊進行之臨床檢查。POCT與在大規模醫院的中央檢查室等中進行之臨床檢查不同，可當場瞬間獲得檢查結果，故而糖尿病診斷中POCT亦不斷擴展。

以測定HbA1c(%)為目的之POCT中，提出有利用免疫層析法之技術。所謂免疫層析法，係利用毛細管現象之免疫測定法，於妊娠檢查或流行性感冒檢查等中在世界上普及。先前的免疫層析法通常為目視判定(定性評價)，但近年來，不斷開發出利用免疫層析讀取器等分析裝置對測定試樣中所含之分析對象物質的量進行定量化之技術。

作為使用免疫層析法對分析對象物質的量進行定量之方法之一，可列舉利用抗原抗體反應之三明治法。三明治法中對分析對象物質利用表位(epitop)不同之2種抗體。一抗體係作為與金膠體、著色乳膠粒子、螢光粒子等檢測粒子敏化之檢測抗體使用。另一抗體作為線狀固定於多孔質支撐體的表面之捕捉抗體而形成測試線。此外，將特異性地捕捉前述檢測抗體之抗體以線狀固定於多孔質支撐體的表面中的與前述測試線不同的位置而形成對照線。測定試樣中所含之分析對象物質係自多孔質支撐體的一端(上游側)展開，一面與檢測抗體形成免疫複合體一面移動，於測試線上與捕捉抗體接觸而被捕捉從而顯色。未與分析對象物質形成免疫複合體之游離的檢測試劑於測試線上通過，被對照線的抗體捕捉而顯色。這些的顯色強度可藉由利用免疫層析讀取器等裝置而定量分析對象物質的量。

如上所述，判明藉由免疫層析法測定HbA1c(%)時，於HbA1c的經糖化的部位(位於Hb的β鏈的N末端側之纈胺酸殘基)使用特異性抗體，但前述糖化部位不存在於Hb的表面，而是埋入Hb的內部，於生理條件下存在於抗體不易結合之部位。根據此種性狀，為了使將前述糖化部位識別為表位之抗體高效率地反應而進行測定，報告有使前述表位於Hb的表面露出(以下有時稱為改質)之技術。

專利文獻1、2中，揭示有於測定試樣稀釋液中包含界面活性劑，且於免疫層析試片擔載有環狀多糖類之構成。可期待前述發明對於不阻礙下游的抗原抗體反應且使表位露出之方面、亦即測定靈敏度提高有一定效果。然而，前述發明會產生向下游之展開不均，因此測定精度不充分。

專利文獻3、4中，揭示有於測定試樣稀釋液中包含非離子性界面活性劑，且於免疫層析試片擔載有陰離子性界面活性劑之構成。可期待前述發明對於展開不均改善有一定效果。然而，前述發明由於擔載於免疫層析試片之界面活性劑無法在稀釋測定試樣展開之短暫時間內使表位於Hb的表面露出，故而有如下問題：測定靈敏度不充分，另外，嚴重受到前述混合時間的影響。

[專利文獻]

專利文獻1：日本特開2012-251789號公報。

專利文獻2：日本特開2015-158515號公報。

專利文獻3：日本特開2015-200517號公報。

專利文獻4：日本特開2016-161329號公報。

本發明的課題在於提供一種測定試樣稀釋液，係用以對測定試樣中的HbA1c量相對於Hb量之比率即HbA1c(%)進行測定。更詳細而言，課題在於提供一種測定試樣稀釋液，相較於先前而言不易受到將測定試樣與測定試樣稀釋液混合起至向HbA1c測定用免疫層析試片滴加為止的時間經過的影響，可高精度且高靈敏度地對測定試樣中的HbA1c量相對於Hb量之比率即HbA1c(%)進行測定。

本發明者為了解決上述課題而進行了努力研究，結果發現，藉由使用含有包含聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯及聚氧乙烯烷基醚之非離子性界面活性劑、陰離子性界面活性劑及緩衝劑之水溶液作為測定試樣稀釋液，相較於先前技術而言靈敏度、精度、與HPLC法之相關性大幅提高，且不易受將測定試樣與測定試樣稀釋液混合起至滴加至免疫層析試片為止的時間經過的影響。

亦即，代表性的本發明如下所述。

(1)一種測定試樣稀釋液，係用以定量測定試樣中的血紅蛋白A1c量相對於血紅蛋白量之比率即血紅蛋白A1c(%)，且前述測定試樣稀釋液係包含非離子性界面活性劑、陰離子性界面活性劑及緩衝劑之水溶液，包含聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯及聚氧乙烯烷基醚作為前述非離子性界面活性劑。

(2)如(1)所記載之測定試樣稀釋液，其中前述聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯的HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance；親水親油平衡值)為14.0至18.0，前述聚氧乙烯烷基醚的HLB為10.0至16.0。

(3)如(1)或(2)所記載之測定試樣稀釋液，其中前述聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯為聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯，前述聚氧乙烯烷基醚為聚氧乙烯月桂醚。

(4)如(1)至(3)中任一項所記載之測定試樣稀釋液，其中包含前述聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯0.05wt%至3.0wt%，且包含前述聚氧乙烯烷基醚0.05wt%至3.0wt%。

(5)如(1)至(4)中任一項所記載之測定試樣稀釋液，其中前述陰離子性界面活性劑為烷基硫酸鹽。

(6)如(1)至(5)中任一項所記載之測定試樣稀釋液，其中包含前述陰離子性界面活性劑0.1wt%至1.0wt%。

(7)如(1)至(6)中任一項所記載之測定試樣稀釋液，其中前述緩衝劑為磷酸緩衝劑。

本發明的測定試樣稀釋液與測定試樣混合後的時間經過不會對測定值造成影響，另外，可抑制於免疫層析試片移動(流動)之測定試樣的展開(流動)不均，進而可促進抗原抗體反應，因此可迅速、高靈敏度、高精度地對測定試樣中的HbA1c量相對於Hb量之比率即HbA1c(%)進行測定。

1:樣品墊

2:接合墊

3:膜片

4:吸收墊

5:背襯片

6:測試線

7:對照線

8:黏著片

圖1係表示免疫層析試片的一例之(俯視)圖。

圖2係表示免疫層析試片的一例之(側視)圖。

本發明中，測定試樣並無特別限定，例如可列舉：血液、淋巴液、脊髓液、汗、尿、淚液、唾液、皮膚、黏膜、毛髪等生物試樣。血液中，除全血以外，亦可將對血液進行離心分離而獲得之血清、血球或血漿作為試樣。另外，測定試樣不限於來源於人類，來源於狗、貓、牛等哺乳動物之生物試樣亦為對象。另外，本發明中的測定項目係測定試樣中的HbA1c量相對於Hb量之比率即HbA1c(%)。

本發明的測定試樣稀釋液係包含非離子性界面活性劑、陰離子性界面活性劑及緩衝劑之水溶液。藉由於前述測定試樣稀釋液中包含聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯作為非離子性界面活性劑，可抑制於免疫層析試片移動(流動)之測定試樣的展開不均，因此可提高測定精度。另外，藉由於前述測定試樣稀釋液中包含聚氧乙烯烷基醚作為非離子性界面活性劑，可促進下游的抗原抗體反應，提高測定靈敏度。另外，藉由於前述測定試樣稀釋液中包含陰離子性界面活性劑，可抑制將測定試樣與測定試樣稀釋液混合起至向免疫層析試片滴加為止的時間經過所致之測定值(例如，後述之測試線的反射吸光度)的變動，提高測定精度。進而，藉由包含緩衝劑，可抑制因pH變動而阻礙抗原抗體反應，防止測定靈敏度之降低。此外，本發明中的測定項目係測定試樣中的HbA1c量相對於Hb量之比率即HbA1c(%)，因此前述非離子性界面活性劑、陰離子性界面活性劑之任一種均較佳為顯示溶血作用之界面活性劑。

本發明中，作為非離子性界面活性劑，就提高測定試樣的展開均勻性，且促進下游的抗原抗體反應之觀點而言，較佳為包含聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯及聚氧乙烯烷基醚之兩者。

本發明中，就測定試樣的展開均勻性之觀點而言，前述聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯的HLB較佳為14.0至18.0，更佳為15.0至18.0。

本發明中，HLB係使用Griffin法，利用HLB=20×(親水部的式量的總和/分子量)算出。

另外，作為前述聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯，可列舉：聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯(例如Tween(註冊商標)20)、聚氧乙烯山梨醇酐單棕櫚酸酯(例如Tween(註冊商標)40)、聚氧乙烯山梨醇酐單硬脂酸酯(例如Tween(註冊商標)60)、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯(例如Tween(註冊商標)80)等。這些之中，就測定試樣的展開均勻性之觀點而言，較佳為聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯。

前述聚氧乙烯烷基醚的HLB較佳為10.0至16.0，更佳為11.0至14.0。若HLB小，則難以溶解於水。另一方面，若HLB大，則有時下游的抗原抗體反應的促進不充分，測定靈敏度降低。

另外，作為前述聚氧乙烯烷基醚，可列舉：聚氧乙烯月桂醚(例如Emulgen(註冊商標)104P、105、106、108、109P、120、123P、147、150)、聚氧乙烯鯨蠟醚(例如Emulgen(註冊商標)210、220)、聚氧乙烯硬脂醚(例如Emulgen(註冊商標)306P、320P、350)、聚氧乙烯油醚(例如Emulgen(註冊商標)404、408、409PV、420、430)等。這些之中，就促進下游的抗原抗體反應之觀點而言，較佳為聚氧乙烯月桂醚。

本發明中，測定試樣稀釋液中的前述聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯的濃度較佳為0.05wt%至3.0wt%，更佳為0.1wt%至2.0wt%。若濃度低，則有時無法向下游展開，或者即便能夠展開，亦變得不均勻而測定精度降低。另一方面，若濃度高，則有時物理吸附之檢測粒子與檢測抗體、及/或膜片與捕捉抗體解離而無法獲得測定值，或者即便可獲得測定值，測定靈敏度亦大幅降低。另外，前述聚氧乙烯烷基醚的濃度較佳為0.05wt%至3.0wt%，更佳為0.1wt%至2.0wt%。若濃度低，則有時無法獲得下游的抗原抗體反應的促進效果，而測定靈敏度降低。另一方面，若濃度高，則物理吸附之檢測粒子與檢測抗體、及/或膜片與捕捉抗體解離而無法獲得測定值，或者即便可獲得測定值，測定靈敏度亦降低。

本發明中，作為陰離子性界面活性劑，若使前述測定試樣中的HbA1c立即改質，且不阻礙下游的抗原抗體反應，則並無特別限定，可列舉：十二烷基硫酸鈉(SDS；Sodium dodecyl sulfate)、十二烷基硫酸鋰 (LDS；lithium dodecyl sulfate)等烷基硫酸鹽、膽酸鈉、去氧膽酸鈉等膽汁酸鹽、聚氧乙烯月桂醚硫酸鈉等聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽、十二烷基苯磺酸鈉等烷基苯磺酸鹽、月桂醯甲基丙胺酸、N-月桂醯肌胺酸鈉鹽等醯基胺基酸鹽、二烷基磺基琥珀酸鈉、β萘磺酸福馬林縮合物鈉鹽及特殊聚羧酸型高分子界面活性劑等。這些之中，較佳為烷基硫酸鹽，更佳為十二烷基硫酸鈉(SDS)。此外，前述烷基硫酸鹽係顯示溶血作用之界面活性劑。

本發明中，測定試樣稀釋液中的陰離子性界面活性劑的濃度並無特別限定，較佳為0.05wt%至2.0wt%，更佳為0.1wt%至1.0wt%。若濃度低，則HbA1c之改質花費時間，因此有時會因將測定試樣與測定試樣稀釋液混合起至向免疫層析試片滴加為止的時間，使測定值(例如，後述之測試線的反射吸光度)變動，測定精度降低。另一方面，若濃度高，則會阻礙下游的抗原抗體反應，因此有時測定靈敏度降低。

本發明中，作為前述緩衝劑，只要在目標pH範圍內具有充分的緩衝能力，則可使用任意種類的緩衝劑，例如可列舉：三羥甲基胺基甲烷(Tris)、磷酸、鄰苯二甲酸、檸檬酸、順丁烯二酸、琥珀酸、草酸、硼酸、酒石酸、乙酸、碳酸、古德緩衝劑(MES(Morpholineethanesulfonic acid；嗎啉乙磺酸)、ADA(N-(Carbamoylmethyl)iminodiacetic acid；N-(2-乙醯胺基)亞胺基二乙酸)、PIPES(Piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)；哌嗪-N,N’-雙(2-乙磺酸))、ACES(N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid；N-(乙醯胺基)-2-胺基乙磺酸)、鹽酸乙醇胺、BES(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid；N,N-雙(2-羥乙基)-2-胺基乙磺酸)、TES(Tris乙磺酸)、HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-ethanesulphonic acid；N-2-羥乙基哌嗪-N-乙磺酸)、乙醯胺甘胺酸、三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、甘胺醯胺、二羥乙甘胺酸(bicine))。這些之中，因於本發明中所使用之抗體的最佳pH範圍即7.0附近具有充分的緩衝能力等原因，較佳為三羥甲基胺基甲烷、磷酸、MES、PIPES、TES(Tris乙磺酸)、HEPES，更佳為磷酸、三羥甲基胺基甲烷、PIPES，進而較佳為磷酸。

本發明中，測定試樣稀釋液中的前述緩衝劑的濃度較佳為10mM至80mM，更佳為20mM至60mM。若濃度低，則有時在目標pH範圍內不具有充分的緩衝能力而測定靈敏度大幅降低。另一方面，若濃度高，則有時會因檢測粒子之凝聚而無法向下游展開，或者即便能夠展開，亦變得不均勻而測定精度降低。

本發明中，測定試樣稀釋液亦可包含氧化劑。作為前述氧化劑，只要使Hb氧化且不阻礙下游的抗原抗體反應，則並無特別限定，可列舉：鹵素含氧酸鹽、過渡金屬錯合物之鹽、過氧化物、過錳酸鹽、鉻酸鹽、亞硝酸鹽、及超氧化物。作為鹵素含氧酸鹽，例如可列舉：次亞氯酸、亞氯酸、氯酸、過氯酸、次亞溴酸、亞溴酸、溴酸、過溴酸、次亞碘酸、亞碘酸、碘酸及過碘酸等鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽及銨鹽。作為過渡金屬錯合物之鹽，例如可列舉：鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽及銨鹽之鐵氰化鹽。作為過氧化物，例如可列舉有機過氧化物。作為過錳酸鹽，例如可列舉鹼金屬或鹼土金屬之過錳酸鹽。這些之中，較佳為亞硝酸鹽，更佳為亞硝酸鈉。藉由包含氧化劑，可抑制測定試樣中的Hb的氧化不均所引起之抗原抗體反應不均，因此可期待測定精度提高。另外，藉由亦將導致測定試樣中的非特異反應之物質氧化，可抑制非特異反應之進行，因此可期待測定精度提高。

本發明中，測定試樣稀釋液中的前述氧化劑的濃度並無特別限定，較佳為0.01wt%至1.0wt%。若濃度低，則有時Hb的氧化變得不充分，使測定值(例如，後述之測試線的反射吸光度)變動，測定精度降低。另一方面，若濃度高，則阻礙下游的抗原抗體反應，因此有時測定靈敏度降低。

本發明中，測定試樣稀釋液亦可包含疊氮化劑。作為前述疊氮化劑，只要使Hb疊氮化且不阻礙下游的抗原抗體反應，則並無特別限定，較佳為疊氮化鈉。此外，前述疊氮化劑於保存時亦作為防腐劑發揮作用。藉由包含疊氮化劑，可抑制測定試樣中的Hb的疊氮化不均所引起之抗原抗體反應不均，因此可期待測定精度提高。另外，藉由使導致測定試樣中的非特異反應之物質疊氮化，可抑制非特異反應之進行，因此可期待測定精度提高。

前述疊氮化劑的濃度並無特別限定，較佳為0.01wt%至0.2wt%。若濃度低，則有時Hb的疊氮化變得不充分，測定值(例如，後述之測試線的反射吸光度)變動，測定精度降低。另一方面，若濃度高，則會阻礙下游的抗原抗體反應，因此有時測定靈敏度降低。

本發明中，測定試樣稀釋液亦可視需要添加阻斷用蛋白質(阻斷肽片段(BPF；Blocking Peptide Fragment)、牛血清白蛋白(BSA；Bovine Serum Albumin)、酪蛋白等)、鹽類(氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、氯化鋁等)、及/或抗體穩定化劑(單糖類、寡糖類、多糖類、糖醇、甘油、葡萄糖酸鹽、胺基酸類、白蛋白類、球蛋白類、纖維性蛋白質等)。

利用前述測定試樣稀釋液之測定試樣的稀釋倍率並無特別限定，較佳為稀釋100倍至2000倍，更佳為稀釋200倍至1500倍。若測定試樣的稀釋倍率小，則難以向下游展開。另外，有時亦容易受到測定試樣中的夾雜物質的影響，測定精度降低。另一方面，若測定試樣的稀釋倍率大，則有時測定試樣中的Hb及HbA1c的濃度降低，測定靈敏度降低。

對於本發明的測定試樣稀釋液之使用，列舉使用免疫層析試片之HbA1c(%)之測定為例進行說明。此外，免疫層析試片的構成並無特別限定，較佳為以免疫層析試片的試樣添加部(滴加部)為上游側，按照具有前述添加部之樣品墊、接合墊、膜片、吸收墊之順序連接配置之構成。繼而，參照圖式對本發明的免疫層析試片的一例進行說明，但並不受本發明任何限定。圖1及圖2中，1表示樣品墊，2表示接合墊，3表示膜片，4表示吸收墊，5表示背襯片，6表示測試線，7表示對照線，8表示黏著片。

圖1及圖2之例中，免疫層析試片呈寬度3mm至5mm、長度40mm至100mm之細長的短條狀的形態。此外，於距離免疫層析試片的膜片3的上游側的端部約10mm的位置形成將捕捉抗體線狀固定之測試線6。另外，於距離前述端部約15mm的位置形成將另一捕捉抗體線狀固定之對照線7。進而，於免疫層析試片的接合墊2擔載有作為檢測抗體與檢測粒子之複合體的測試線檢測試劑、及作為經標記之阻斷用蛋白質與檢測粒子之複合體的對照線檢測試劑。

以下對使用免疫層析試片之HbA1c(%)之測定進行說明。

首先，以測定試樣成為預定的稀釋倍率之方式添加混合測定試樣稀釋液而獲得經稀釋的測定試樣。繼而，將前述經稀釋的測定試樣滴加至樣品墊1時，經稀釋的測定試樣藉由毛細管現象通過樣品墊1而於接合墊2展開。此時，經稀釋的測定試樣一面將擔載於接合墊2之測試線檢測試劑及對照線檢測試劑溶解，一面使經稀釋的測定試樣中的HbA1c與經測試線檢測試劑中的抗HbA1c抗體敏化之檢測粒子形成免疫複合體。此外，經稀釋的測定試樣中的HbA1c以外的Hb(例如HbA0等)未與測試線檢測試劑形成免疫複合體。繼而，前述經稀釋的測定試樣於膜片3展開。經稀釋的測定試樣到達測試線6時，前述免疫複合體被形成測試線之捕捉抗體(抗Hb抗體)捕捉而集聚，從而使測試線6顯色。此外，經稀釋的測定試樣中的HbA1c以外的Hb(例如HbA0等)亦被形成測試線之捕捉抗體(抗Hb抗體)捕捉而集聚，因此於測試線上產生免疫複合體與HbA1c以外的Hb(例如HbA0等)之競爭性捕捉，捕捉之概率依賴於測定試樣中的HbA1c量相對於Hb量之比率即HbA1c(%)。亦即，可由測試線的顯色強度直接測定HbA1c(%)。然後，前述經稀釋的測定試樣到達對照線7時，經利用對照線檢測試劑中的標記物質(生物素)標記之阻斷用蛋白質敏化之檢測粒子被形成對照線之捕捉抗體(抗生物素抗體)捕捉而集聚，從而使對照線7顯色。最後，前述經稀釋的測定試樣被吸收墊4吸收。

前述HbA1c(%)可由測試線的顯色強度直接測定，亦可考慮經稀釋的測定試樣的流動不均，根據將測試線的顯色強度除以對照線的顯色強度所算出之修正值進行測定。

本發明中，免疫層析試片的測試線及對照線的測定方法並無特別限定，可使用市售的免疫層析讀取器，亦可另外利用公知的方法製造免疫層析讀取器。作為檢測系統，並無特別限定，例如可使用LED-FD(Light Emitting Diode-Fluorophotometric Detector；發光二極體-螢光檢測器)、LED-CMOS(Light Emitting Diode-Complementary Metal Oxide Semiconductor；發光二極體-互補金屬氧化物半導體)、LED-CCD(Light Emitting Diode-Charge Coupled Device；發光二極體-電荷耦合裝置)。

本發明中，檢測粒子並無特別限制，可使用著色粒子或螢光粒子。作為著色粒子，可例示金屬粒子、乳膠粒子、纖維素粒子等。作為金屬粒子，可例示金膠體、銀膠體、鉑膠體、鈀膠體、金奈米棒、金奈米板、銀奈米板等，平均粒徑較佳為1nm至100nm。作為乳膠粒子，可例示由聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸聚合物等材質所構成之乳膠粒子，平均粒徑較佳為25nm至500nm。作為螢光粒子，可例示由聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯基甲苯、二氧化矽等材質所構成之螢光粒子，作為螢光色素，可例示螢光素及其衍生物、玫瑰紅及其衍生物、花青及其衍生物等。這些之中，較佳為分散性高，視認性優異之纖維素粒子。

前述纖維素粒子具有大量羥基，因此不僅可藉由共價鍵保持大量反應性染料，而且在濃染化後，亦可保持在水等中的穩定分散性。作為纖維素粒子，可使用再生纖維素、精製纖維素、天然纖維素等，亦可使用一部分成為衍生物之纖維素。較佳為前述纖維素粒子的重量的20wt%至90wt%來源於纖維素，更佳為20wt%至80wt%，進而較佳為20wt%至70wt%。

前述纖維素粒子的平均粒徑並無特別限定，較佳為100nm至1000nm，更佳為200nm至800nm。若平均粒徑大於1000nm，則向下游之展開變慢，測定時間變長。另外，容易被捕捉到膜片上，因背景本身顯色而有時會導致測試線及對照線處的顯色變得不清晰。另一方面，若平均粒徑小於100nm，則有時可物理吸附或化學鍵結之抗體量降低，測定靈敏度降低。

前述纖維素粒子的顏色並無特別限定，例如可列舉紅色、藍色、黃色、綠色、黑色、白色、螢光色。這些之中，較佳為可利用最通用的市售的金膠體(紅色)測定用的免疫層析讀取器測定，且不易產生由非特異吸附所致之假陽性之紅色。作為此種纖維素粒子，可列舉旭化成公司製造的著色纖維素奈米珠(NanoAct(註冊商標))，其中，較佳為Red(RE1)、Dark Red(RE2)，更佳為Dark Red(RE2)。通常，紅色纖維素微粒子不易產生由非特異吸附所致之假陽性，但有測定靈敏度低之問題。但是，藉由使用本發明的檢體稀釋液，不僅可抑制非特異吸附，而且可提高抗原抗體反應，因此可實現與藍色或黑色纖維素微粒子同等或同等以上的高測定靈敏度。

[實施例]

以下基於實施例詳細地說明本發明，但本發明並不限定於這些實施例。此外，實施例中所記載之HbA1c(%)全部為NGSP(National Glycohemoglobin Standardization Program；國家糖化血紅蛋白標準化計劃)值。

(實施例1)

[(1)HbA1c測定用測試線檢測試劑之製備]

利用蒸餾水(大塚蒸餾水，大塚製藥公司製造)將8.57mg/mL之抗HbA1c單株抗體(HbA1c Antibody，OAMA02329，AVIVA SYSTEM BIOLOGY公司製造)製備成1.0mg/mL。繼而，將1.0wt%之纖維素粒子(NanoAct(註冊商標)，RE2：Dark Red，平均粒徑340nm，旭化成公司製造)100μL、10mM之三羥甲基胺基甲烷緩衝液(204-07885，和光純藥工業公司製造)(pH8.0)900μL、及前述1.0mg/mL(0.1wt%)之抗HbA1c單株抗體100μL添加至15mL之離心管，利用渦旋進行攪拌。繼而，放入至調整為37℃之低溫保溫箱(IN604，Yamato Scientific公司製造)並靜置120分鐘。繼而，添加由1.0wt%之酪蛋白(030-01505，和光純藥工業公司製造)、100mM之硼酸緩衝液(021-02195，和光純藥工業公司製造)所構成之阻斷液(pH8.0)12mL，進而於調整為37℃之低溫保溫箱(IN604，Yamato Scientific公司製造)中靜置60分鐘。繼而，使用離心分離機(MX-307，TOMY SEIKO公司製造)、轉子支架(rack in rotor)(TMA-300，TOMY SEIKO公司製造)、及支架(rack)(AR510-04，TOMY SEIKO公司製造)，於25℃進行15分鐘10,000G之離心，使抗體敏化纖維素粒子沈澱後，去除上清液。繼而，添加由50mM 之硼酸緩衝液(021-02195，和光純藥工業公司製造)所構成之洗淨液(pH10.0)12mL，利用超音波分散機(UH-50，SMT公司製造)處理10秒。繼而，使用離心分離機(MX-307，TOMY SEIKO公司製造)、轉子支架(TMA-300，TOMY SEIKO公司製造)、及支架(AR510-04，TOMY SEIKO公司製造)，於25℃進行15分鐘10,000G之離心，使抗體敏化纖維素粒子沈澱後，去除上清液。繼而，添加由15wt%之蔗糖(196-00015，和光純藥工業公司製造)、0.2wt%之酪蛋白(030-01505，和光純藥工業公司製造)、62mM之硼酸緩衝液(021-02195，和光純藥工業公司製造)所構成之塗佈液(pH9.2)2.0mL，利用超音波分散機(UH-50，SMT公司製造)處理10秒，獲得HbA1c測定用測試線檢測試劑。

[(2)HbA1c測定用對照線檢測試劑之製備]

將D生物素(04822-91，Nacalai Tesque公司製造)16mg、及二甲基亞碸：DMSO(08904-14，Nacalai Tesque公司製造)1000μL添加至1.5mL微型管，利用渦旋進行攪拌，獲得D生物素溶液。繼而，將1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽：EDC(15022-86，Nacalai Tesque公司製造)20mg、N-羥基琥珀醯亞胺：NHS(18948-02，Nacalai Tesque公司製造)20mg、及蒸餾水(大塚蒸餾水，大塚製藥公司製造)100μL添加至1.5mL微型管，利用渦旋進行攪拌，獲得EDC/NHS溶液。繼而，將前述D生物素溶液100μL及前述EDC/NHS溶液100μL混合後，放入至調整為25℃之低溫保溫箱(IN604，Yamato Scientific公司製造)並靜置15分鐘，獲得D生物素/EDC/NHS溶液。繼而，將阻斷肽片段(Blocking Peptide Fragment)：BPF(BPF-301，東洋紡公司製造)10mg、及蒸餾水(大塚蒸餾水，大塚製藥公司製造)100μL添加至1.5mL微型管，利用渦旋進行攪拌，獲得BPF溶液。繼而，將前述D生物素/EDC/NHS溶液100μL與前述BPF溶液100μL混合後，放入至調整為25℃之低溫保溫箱(IN604，Yamato Scientific公司製造)並靜置30分鐘，獲得D生物素-BPF溶液。繼而，將1.0wt%之纖維素粒子(NanoAct(註冊商標)，RE2：Dark Red，平均粒徑340nm，旭化成公司製造)100μL、10mM之三羥甲基胺基甲烷緩衝液(204-07885，和光純藥工業公司製造)(pH8.0)900μL、及前述D生物素-BPF溶液100μL添加至15mL之離心管，利用渦旋進行攪拌。繼而，放入至調整為37℃之低溫保溫箱(IN604，Yamato Scientific公司製造)並靜置120分鐘。繼而，添加由1.0wt%之酪蛋白(030-01505，和光純藥工業公司製造)、100mM之硼酸緩衝液(021-02195，和光純藥工業公司製造)所構成之阻斷液(pH8.0)12mL，進而利用調整為37℃之低溫保溫箱(IN604，Yamato Scientific公司製造)靜置60分鐘。繼而，使用離心分離機(MX-307，TOMY SEIKO公司製造)、轉子支架(TMA-300，TOMY SEIKO公司製造)、及支架(AR510-04，TOMY SEIKO公司製造)，於25℃進行15分鐘10,000G之離心，使D生物素敏化纖維素粒子沈澱後，去除上清液。繼而，添加由50mM之硼酸緩衝液(021-02195，和光純藥工業公司製造)所構成之洗淨液(pH10.0)12mL，利用超音波分散機(UH-50，SMT公司製造)處理10秒。繼而，使用離心分離機(MX-307，TOMY SEIKO公司製造)、轉子支架(TMA-300，TOMY SEIKO公司製造)、及支架(AR510-04、TOMY SEIKO公司製造)，於25℃進行15分鐘10,000G之離心，使D生物素敏化纖維素粒子沈澱後，去除上清液。繼而，添加由15wt%之蔗糖(196-00015，和光純藥工業公司製造)、0.2wt%之酪蛋白(030-01505，和光純藥工業公司製造)、62mM之硼酸緩衝液(021-02195，和光純藥工業公司製造)所構成之塗佈液(pH9.2)2.0mL，利用超音波分散機(UH-50，SMT公司製造)處理10秒，獲得HbA1c測定用對照線檢測試劑。

[(3)HbA1c測定用膜片卡之製作]

利用蒸餾水(大塚蒸餾水，大塚製藥公司製造)將3.6mg/mL之抗Hb單株抗體(HBA1 Antibody，OAMA02326，AVIVA SYSTEM BIOLOGY公司製造)製備成1.0mg/mL。繼而，利用蒸餾水(大塚蒸餾水，大塚製藥公司製造)將1.0mg/mL之抗生物素多株抗體(Biotin Antibody，A150-111A，BETHYL公司製造)製備成0.5mg/mL。繼而，對距離於上游側由20mm×300mm之黏著帶部所構成，於中央由25mm×300mm之膜片部所構成，於下游側由15mm×300mm之黏著帶部所構成之60mm×300mm之膜片卡(Hi-Flow Plus 120 Membrane Cards，HF120，Millipore公司製造)的膜片部的上游側10mm之位置，使用分注平台(XYZ3060，BIODOT公司製造)、及Bio Jet噴嘴(BHQHR-XYZ，BIODOT公司製造)，以1.0μL/cm之塗佈量塗佈前述1.0mg/mL之抗Hb單株抗體後，利用調整為45℃之乾燥機(WFO-510，東京理化器械公司製造)乾燥30分鐘，形成線寬約1mm之測試線。進而，於距離形成有前述測試線之膜片卡的膜片部的上游側15mm之位置，使用分注平台(XYZ3060，BIODOT公司製造)、及Bio Jet噴嘴(BHQHR-XYZ，BIODOT公司製造)，以1.0μL/cm之塗佈量塗佈前述0.5mg/mL之抗生物素多株抗體後，利用調整為45℃之乾燥機(WFO-510，東京理化器械公司製造)乾燥30分鐘，形成線寬約1mm之對照線，藉此獲得HbA1c測定用膜片卡。

[(4)HbA1c測定用接合墊之製作]

將前述HbA1c測定用測試線檢測試劑及前述HbA1c測定用對照線檢測試劑以6：1之比率(質量比)混合。此外，於HbA1c測定用測試線檢測試劑及HbA1c測定用對照線檢測試劑中的粒子濃度相同之情形時，只要以體積比6：1之比率混合即可。繼而，於10mm×300mm之接合墊(GLASSFIBER DIAGNOSTIC PAD，GFDX001050，Millipore公司製造)的整面，使用分注平台(XYZ3060，BIODOT公司製造)、及Air Jet噴嘴(AJQHR-XYZ，BIODOT 公司製造)，以15μL/cm之塗佈量均勻地塗佈前述混合液後，利用調整為45℃之乾燥機(WFO-510，東京理化器械公司製造)乾燥30分鐘，獲得HbA1c測定用接合墊。

[(5)HbA1c測定用免疫層析試片之製作]

於前述HbA1c測定用膜片卡的上游側的20mm×300mm之黏著帶部，以與膜片部重疊5mm之方式貼合前述HbA1c測定用接合墊。繼而，進而於上游側以與前述接合墊重疊5mm之方式貼合20mm×300mm之樣品墊(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS，CFSP002000，Millipore公司製造)。繼而，於前述HbA1c測定用膜片卡的下游側的15mm×300mm之黏著帶部，以與膜片部重疊5mm之方式貼合20mm×300mm之吸收墊(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS，CFSP002000，Millipore公司製造)。繼而，使用截斷式切割模組(CM5000，BIODOT公司製造)，切割成寬度4mm、長度60mm之短條狀，藉此獲得HbA1c測定用免疫層析試片。

[(6)測定試樣稀釋液之製備]

將磷酸緩衝生理食鹽粉末(162-19321，和光純藥工業公司製造)1袋、聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯：Tween(註冊商標)20(35624-02，Nacalai Tesque公司製造)2.0g、聚氧乙烯月桂醚：Emulgen(註冊商標)108(HLB：12.1，花王公司製造)1.0g、十二烷基硫酸鈉：SDS(194-13985，和光純藥工業公司製造)1.0g、亞硝酸鈉(199-02565，和光純藥工業公司製造)0.2g、疊氮化鈉(199-11095，和光純藥工業公司製造)0.2g溶解於蒸餾水(大塚蒸餾水，大塚製藥公司製造)150mL中，利用蒸餾水(大塚蒸餾水，大塚製藥公司製造)在量瓶中稀釋成200mL後，移至500mL玻璃瓶，製備測定試樣稀釋液(50mM PBS(phosphate buffer saline；磷酸鹽緩衝液)、1.0wt%Tween(註冊商標)20、0.5wt%Emulgen(註冊商標)108、0.5wt%SDS、0.1wt%亞硝酸鈉、0.1wt%疊氮化鈉)。

[(7)稀釋試樣之製備]

將市售之作為HbA1c標準物質之HbA1c測定性能評價用試樣(QRM HbA1c2007-1，檢查醫學標準物質機構公司製造，L1至L5之5水準)分別利用前述測定試樣稀釋液稀釋成1000倍，藉此獲得利用HPLC測定之HbA1c(%)為L1=5.01%、L2=5.65%、L3=7.35%、L4=9.51%、L5=11.26%之稀釋HbA1c試樣(L1至L5)。

[(8)HbA1c測定用免疫層析試片之評價：靈敏度之評價]

將前述HbA1c測定用免疫層析試片設置於水平台。繼而，利用微量吸管分取混合時間為10秒之前述稀釋HbA1c試樣(L1、L4)100μL，緩慢地滴加至樣品墊，於25℃靜置10分鐘。繼而，使用免疫層析讀取器(C10060-10，測定模式：金膠體(Gold Colloid)，線狀(Line)，Hamamatsu Photonics公司製造)測定膜片上的對照線及測試線的反射吸光度(mAbs)。對前述稀釋HbA1c試樣(L1、L4)分別以N=10(合計使用前述HbA1c測定用免疫層析試片20片)進行前述實驗操作。作為靈敏度的指標，算出前述稀釋HbA1c試樣(L4)的測試線的反射吸光度(mAbs)的N=10平均值、與前述稀釋HbA1c試樣(L1)的測試線的反射吸光度(mAbs)的N=10平均值之差：△L4-L1(mAbs)，將△L4-L1>180mAbs評價為3分(優異(excellent))，將150mAbs<△L4-L1≦180mAbs評價為2分(良好(good))，將100mAbs<△L4-L1≦150mAbs評價為1分(普通(average))，將△L4-L1≦100mAbs評價為0分(不良(bad))。實施例1的HbA1c測定用免疫層析試片的靈敏度為△L4-L1=240mAbs而評價為3分，可實現高靈敏度之測定。

[(9)HbA1c測定用免疫層析試片之評價：精度之評價]

將前述HbA1c測定用免疫層析試片設置於水平台。繼而，利用微量吸管分取混合時間為10秒之前述稀釋HbA1c試樣(L1、L4)100μL，緩慢地滴加至樣品墊，於25℃靜置10分鐘。繼而，使用免疫層析讀取器(C10060-10，測定模式：金膠體，線狀，Hamamatsu Photonics公司製造)測定膜片上的對照線及測試線的反射吸光度(mAbs)。對前述稀釋HbA1c試樣(L1、L4)分別以N=10(合計使用前述HbA1c測定用免疫層析試片20片)進行前述實驗操作。作為精度的指標，分別算出將前述稀釋HbA1c試樣(L1、L4)的測試線的反射吸光度(mAbs)除以對照線的反射吸光度(mAbs)所得之修正值(L1、L4)後，分別算出所獲得之修正值(L1、L4)的N=10中的CV(L1、L4)(%)，進而算出CV(L1)(%)與CV(L4)(%)之平均值：CV(%)，將CV<3%評價為3分(優異)，將3%≦CV<5%評價為2分(良好)，將5%≦CV<10%評價為1分(普通)，將CV≧10%評價為0分(不良)。實施例1的HbA1c測定用免疫層析試片的精度為CV=2.1%而評價為3分，可實現高精度之測定。

[(10)HbA1c測定用免疫層析試片之評價：與HPLC法之相關性之評價]

將前述HbA1c測定用免疫層析試片設置於水平台。繼而，利用微量吸管分取混合時間為10秒之前述稀釋HbA1c試樣(L1至L5)100μL，緩慢地滴加至樣品墊，於25℃靜置10分鐘。繼而，使用免疫層析讀取器(C10060-10，測定模式：金膠體，線狀，Hamamatsu Photonics公司製造)測定膜片上的對照線及測試線的反射吸光度(mAbs)。對前述稀釋HbA1c試樣(L1至L5)分別以N=10(合計使用前述HbA1c測定用免疫層析試片50片)進行前述實驗操作。作為相關性的指標，分別算出將前述稀釋HbA1c試樣(L1至L5)的測試線的反射吸光度(mAbs)除以對照線的反射吸光度(mAbs)所得之修正值(L1至L5)後，算出所獲得之修正值(L1至L5)、與前述稀釋HbA1c試樣(L1至L5) 之HbA1c(%)、L1=5.01%、L2=5.65%、L3=7.35%、L4=9.51%、L5=11.26%之皮爾森相關係數：r，將r>0.95評價為3分(優異)，將0.90<r≦095評價為2分(良好)，將0.85<r≦0.90評價為1分(普通)，將r≦0.85評價為0分(不良)。實施例1的HbA1c測定用免疫層析試片的相關性為r=0.99而評價為3分，具有與利用HPLC法測定之HbA1c(%)之高相關性。

[(11)HbA1c測定用免疫層析試片之評價：混合時間依賴性之評價]

將前述HbA1c測定用免疫層析試片設置於水平台。繼而，利用微量吸管分取混合時間為10秒及15分鐘之前述稀釋HbA1c試樣(L4)100μL，緩慢地滴加至樣品墊，於25℃靜置10分鐘。繼而，使用免疫層析讀取器(C10060-10，測定模式：金膠體，線狀，Hamamatsu Photonics公司製造)測定膜片上的對照線及測試線的反射吸光度(mAbs)。對混合時間為10秒之稀釋HbA1c試樣(L4)及混合時間為15分鐘之稀釋HbA1c試樣(L4)分別以N=10(合計使用前述HbA1c測定用免疫層析試片20片)進行前述實驗操作。作為混合時間依賴性的指標，算出前述混合時間為15分鐘之稀釋HbA1c試樣(L4)的測試線的反射吸光度(mAbs)的N=10平均值、與前述混合時間為10秒之稀釋HbA1c試樣(L4)的測試線的反射吸光度(mAbs)的N=10平均值之差：△15-10(mAbs)，將△15-10<20mAbs評價為3分(優異)，將20mAbs≦△15-10<45mAbs評價為2分(良好)，將45mAbs≦△15-10<100mAbs評價為1分(普通)，將△15-10≧100mAbs評價為0分(不良)。確認到實施例1的HbA1c測定用免疫層析試片的混合時間依賴性為△15-10=-10mAbs而評價為3分，將測定試樣與測定試樣稀釋液混合起至向HbA1c測定用免疫層析試片滴加為止的時間：幾乎不產生混合時間所引起之測試線的反射吸光度的變動。

(實施例2至實施例25)

變更測定試樣稀釋液的組成，除此以外，以與實施例1相同的方式，製作HbA1c測定用免疫層析試片而進行評價。所使用之測定試樣稀釋液的組成及所獲得之評價結果示於表1。此外，表1中的T20表示聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯：Tween(註冊商標)20(35624-02，HLB16.7，Nacalai Tesque公司製造)，T40表示聚氧乙烯山梨醇酐單棕櫚酸酯：Tween(註冊商標)40(35701-82，HLB15.6，Nacalai Tesque公司製造)，T60表示聚氧乙烯山梨醇酐單硬脂酸酯：Tween(註冊商標)60(35702-72，HLB14.9，Nacalai Tesque公司製造)，T80表示聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯：Tween(註冊商標)80(35703-62，HLB15.0，Nacalai Tesque公司製造)，E105表示聚氧乙烯月桂醚：Emulgen(註冊商標)105(HLB9.7，花王公司製造)，E106表示聚氧乙烯月桂醚：Emulgen(註冊商標)106(HLB10.5，花王公司製造)，E108表示聚氧乙烯月桂醚：Emulgen(註冊商標)108(HLB12.1，花王公司製造)，E109表示聚氧乙烯月桂醚：Emulgen(註冊商標)109P(HLB13.6，花王公司製造)，E120表示聚氧乙烯月桂醚：Emulgen(註冊商標)120(HLB15.3，花王公司製造)，SDS表示十二烷基硫酸鈉(194-13985，和光純藥工業公司製造)，LDS表示十二烷基硫酸鋰(121-02741，和光純藥工業公司製造)，NaNO₂表示亞硝酸鈉(199-02565，和光純藥工業公司製造)，NaN₃表示疊氮化鈉199-11095，和光純藥工業公司製造)，TX100表示聚氧乙烯辛基苯基醚：Triton(註冊商標)X-100(169-21105，和光純藥工業公司製造)。

(比較例1至比較例8)

變更測定試樣稀釋液的組成，除此以外，以與實施例1相同的方式，製作HbA1c測定用免疫層析試片而進行評價。所使用之測定試樣稀釋液的組成及所獲得之評價結果示於表2。

如表2所示，使用不含界面活性劑之測定試樣稀釋液之比較例1中，或許由於經稀釋的測定試樣難以向下游展開，且作為測定對象物之HbA1c未改質，於接合墊中HbA1c與經抗HbA1c抗體敏化之檢測粒子無法形成免疫複合體，故而成為無法視認之程度薄的測試線，測定靈敏度明顯低之結果。此外，比較例1中，測試線的反射吸光度為檢測下限附近，因此未對後續的精度、相關性、混合時間依賴性進行評價。

另外，使用僅包含作為非離子性界面活性劑之聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯之Tween(註冊商標)20之測定試樣稀釋液之比較例2中，或許由於作為測定對象物之HbA1c未改質，於接合墊中HbA1c與經抗HbA1c抗體敏化之檢測粒子無法形成免疫複合體，故而成為無法視認之程度薄的測試線，測定靈敏度明顯低之結果。此外，比較例2中，測試線的反射吸光度為檢測下限附近，因此未對後續的精度、相關性、混合時間依賴性進行評價。

另外，使用僅包含作為非離子性界面活性劑之聚氧乙烯烷基醚之Emulgen(註冊商標)108之測定試樣稀釋液之比較例3中，或許由於產生經稀釋的測定試樣向下游的展開不均(有時未在測定時間內向下游展開)，故而成為測定精度明顯低之結果。另外，或許由於作為測定對象物之HbA1c改質為止花費時間，故而成為如下結果：因將測定試樣與測定試樣稀釋液混合起至向HbA1c測定用免疫層析試片滴加為止的時間：混合時間而導致測試線的反射吸光度大幅變動。

另外，使用僅包含作為陰離子性界面活性劑之SDS之測定試樣稀釋液之比較例4中，或許由於產生經稀釋的測定試樣向下游的展開不均(有時未在測定時間內向下游展開)，故而成為測定精度明顯低之結果。另外，或許由於下游的抗原抗體反應的促進效果不充分，故而成為測定靈敏度低之結果。

另外，使用包含作為非離子性界面活性劑之聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯之Tween(註冊商標)20及作為非離子性界面活性劑之聚氧乙烯烷基醚之Emulgen(註冊商標)108之測定試樣稀釋液之比較例5中，或許由於作為測定對象物之HbA1c改質為止花費時間，故而成為如下結果：因將測定試樣與測定試樣稀釋液混合起至向HbA1c測定用免疫層析試片滴加為止的時間：混合時間而導致測試線的反射吸光度大幅變動。

另外，使用包含作為非離子性界面活性劑之聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯之Tween(註冊商標)20及作為陰離子性界面活性劑之SDS之測定試樣稀釋液之比較例6中，或許由於下游的抗原抗體反應的促進效果不充分，故而成為測定靈敏度低之結果。

另外，使用包含作為非離子性界面活性劑之聚氧乙烯烷基醚之Emulgen(註冊商標)108及作為陰離子性界面活性劑之SDS之測定試樣稀釋液之比較例7中，或許由於產生經稀釋的測定試樣向下游的展開不均(有時未在測定時間內向下游展開)，故而成為測定精度明顯低之結果。

另外，使用作為非離子性界面活性劑之聚氧乙烯烷基苯基醚之Triton(註冊商標)X-100代替作為非離子性界面活性劑之聚氧乙烯烷基醚之Emulgen(註冊商標)108之比較例8中，或許由於下游的抗原抗體反應的促進效果不充分，故而成為測定靈敏度低之結果。此外，Triton(註冊商標)X-100亦為REACH(Registration,Evaluation,Authorization,and Restriction of Chemicals；化學藥品的註冊，評估，授權和限制)限制對象物質，故而較佳為不使用。

(比較例9)

將磷酸緩衝生理食鹽粉末(162-19321，和光純藥工業公司製造)1袋、聚氧乙烯月桂醚：Emulgen(註冊商標)108(HLB：12.1，花王公司製造)10g、十二烷基硫酸鈉：SDS(194-13985，和光純藥工業公司製造)10g溶解於蒸餾水(大塚蒸餾水，大塚製藥公司製造)150mL，利用蒸餾水(大塚蒸餾水，大塚製藥公司製造)在量瓶中稀釋成200mL後，移至500mL玻璃瓶，製備樣品墊塗佈液1(50mM PBS、5wt%Emulgen(註冊商標)108、5wt%SDS)。繼而，於20mm×300mm之樣品墊(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS，CFSP002000，Millipore公司製造)的整面，使用分注平台(XYZ3060，BIODOT公司製造)、及Air Jet噴嘴(AJQHR-XYZ，BIODOT公司製造)，將前述樣品墊塗佈液1以30μL/cm之塗佈量均勻地塗佈後，利用調整為45℃之乾燥機(WFO-510，東京理化器械公司製造)乾燥30分鐘，獲得擔載有界面活性劑之樣品墊1。HbA1c測定用免疫層析試片的製作步驟中，使用擔載有前述界面活性劑之樣品墊1代替20mm×300mm之樣品墊(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS，CFSP002000，Millipore公司製造)，除此以外，以與比較例2相同的方式，製作HbA1c測定用免疫層析試片而進行評價。所使用之測定試樣稀釋液的組成及所獲得之評價結果示於表2。

使用僅包含作為非離子性界面活性劑之聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯之Tween(註冊商標)20之測定試樣稀釋液，且使用於樣品墊擔載有作為非離子性界面活性劑之聚氧乙烯烷基醚之Emulgen(註冊商標)108及作為陰離子性界面活性劑之SDS之免疫層析試片之比較例9中，成為測定靈敏度低之結果。認為原因在於，在稀釋測定試樣通過樣品墊之短暫時間內，Emulgen(註冊商標)108及SDS之溶解及HbA1c之改質未完全進行，於接合墊中HbA1c與經抗HbA1c抗體敏化之檢測粒子不易形成免疫複合體。亦即，顯示於需要POCT等迅速測定之情形時，作為非離子性界面活性劑之聚氧乙烯烷基醚之Emulgen(註冊商標)108及作為陰離子性界面活性劑之SDS必須包含於測定試樣稀釋液，而不包含於樣品墊。

(比較例10)

將磷酸緩衝生理食鹽粉末(162-19321，和光純藥工業公司製造)1袋、聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯：Tween(註冊商標)20(35624-02，Nacalai Tesque公司製造)20g、十二烷基硫酸鈉：SDS(194-13985，和光純藥工業公司製造)10g溶解於蒸餾水(大塚蒸餾水，大塚製藥公司製造)150mL，利用蒸餾水(大塚蒸餾水，大塚製藥公司製造)在量瓶中稀釋成200mL後，移至500mL玻璃瓶，製備樣品墊塗佈液2(50mM PBS、10wt%Tween20、5wt%SDS)。繼而，於20mm×300mm之樣品墊(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS，CFSP002000，Millipore公司製造)的整面，使用分注平台(XYZ3060，BIODOT公司製造)、及Air Jet噴嘴(AJQHR-XYZ，BIODOT公司製造)，將前述樣品墊塗佈液2以30μL/cm之塗佈量均勻地塗佈後，利用調整為45℃之乾燥機(WFO-510，東京理化器械公司製造)乾燥30分鐘，獲得擔載有界面活性劑之樣品墊2。HbA1c測定用免疫層析試片的製作步驟中，使用前述擔載有界面活性劑之樣品墊2代替20mm×300mm之樣品墊(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS，CFSP002000，Millipore公司製造)，除此以外，以與比較例3相同的方式，製作HbA1c測定用免疫層析試片而進行評價。所使用之測定試樣稀釋液的組成及所獲得之評價結果示於表2。

使用僅包含作為非離子性界面活性劑之聚氧乙烯烷基醚之Emulgen(註冊商標)108之測定試樣稀釋液，且使用於樣品墊擔載有作為非離子性界面活性劑之聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯之Tween(註冊商標)20及作為陰離子性界面活性劑之SDS之免疫層析試片之比較例10中，成為測定靈敏度及精度低之結果。認為原因在於，在稀釋測定試樣通過樣品墊之短暫時間內，Tween(註冊商標)20及SDS之溶解未完全進行，未消除展開不均。亦即，顯示作為非離子性界面活性劑之聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯之Tween(註冊商標)20及作為陰離子性界面活性劑之SDS必須包含於測定試樣稀釋液，而不包含於樣品墊。

(比較例11)

將磷酸緩衝生理食鹽粉末(162-19321，和光純藥工業公司製造)1袋、聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯：Tween(註冊商標)20(35624-02，Nacalai Tesque公司製造)20g、聚氧乙烯月桂醚：Emulgen(註冊商標)108(HLB：12.1，花王公司製造)10g溶解於蒸餾水(大塚蒸餾水，大塚製藥公司製造)150mL，利用蒸餾水(大塚蒸餾水，大塚製藥公司製造)在量瓶中稀釋成200mL後，移至500mL玻璃瓶，製備樣品墊塗佈液3(50mM PBS、10wt%Tween20、5wt%Emulgen(註冊商標)108)。繼而，於20mm×300mm之樣品墊(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS，CFSP002000，Millipore公司製造)的整面，使用分注平台(XYZ3060，BIODOT公司製造)、及Air Jet噴嘴(AJQHR-XYZ，BIODOT公司製造)，將前述樣品墊塗佈液3以30μL/cm之塗佈量均勻地塗佈後，利用調整為45℃之乾燥機(WFO-510，東京理化器械公司製造)乾燥30分鐘，獲得擔載有界面活性劑之樣品墊3。HbA1c測定用免疫層析試片的製作步驟中，使用前述擔載有界面活性劑之樣品墊3代替20mm×300mm之樣品墊(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS，CFSP002000，Millipore公司製造)，除此以外，以與比較例4相同的方式，製作HbA1c測定用免疫層析試片而進行評價。所使用之測定試樣稀釋液的組成及所獲得之評價結果示於表2。

使用僅包含作為陰離子性界面活性劑之SDS之測定試樣稀釋液，且使用於樣品墊擔載有作為非離子性界面活性劑之聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯之Tween(註冊商標)20及作為非離子性界面活性劑之聚氧乙烯烷基醚之Emulgen(註冊商標)108之免疫層析試片之比較例11中，成為測定靈敏度及精度低之結果。認為原因在於，在稀釋測定試樣通過樣品墊之短暫時間內，Tween(註冊商標)及Emulgen(註冊商標)108之溶解未完全進行，未完全消除展開不均。亦即，顯示作為非離子性界面活性劑之聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯之Tween(註冊商標)20及作為非離子性界面活性劑之聚氧乙烯烷基醚之Emulgen(註冊商標)108必須包含於測定試樣稀釋液，而不包含於樣品墊。

[產業可利用性]

藉由本發明，可以高靈敏度、高精度、與HPLC法之高相關性且不受將測定試樣與測定試樣稀釋液混合起的時間經過的影響，而對測定試樣中的HbA1c量相對於Hb量之比率即HbA1c(%)進行測定，因此大有助於工業。

無。

Claims

一種測定試樣稀釋液，係用以定量測定試樣中的血紅蛋白A1c量相對於血紅蛋白量之比率即血紅蛋白A1c(%)，且前述測定試樣稀釋液係包含非離子性界面活性劑、陰離子性界面活性劑及緩衝劑之水溶液，包含聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯及聚氧乙烯烷基醚作為前述非離子性界面活性劑；且前述測定試樣稀釋液不含有烷基葡糖苷類。
如請求項1所記載之測定試樣稀釋液，其中前述聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯的親水親油平衡值為14.0至18.0，前述聚氧乙烯烷基醚的親水親油平衡值為10.0至16.0。
如請求項1或2所記載之測定試樣稀釋液，其中前述聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯為聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯，前述聚氧乙烯烷基醚為聚氧乙烯月桂醚。
如請求項1或2所記載之測定試樣稀釋液，其中包含前述聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯0.05wt%至3.0wt%，且包含前述聚氧乙烯烷基醚0.05wt%至3.0wt%。
如請求項1或2所記載之測定試樣稀釋液，其中前述陰離子性界面活性劑為烷基硫酸鹽。
如請求項1或2所記載之測定試樣稀釋液，其中包含前述陰離子性界面活性劑0.1wt%至1.0wt%。
如請求項1或2所記載之測定試樣稀釋液，其中前述緩衝劑為磷酸緩衝劑。