JP6834979B2 - イムノクロマト試験片 - Google Patents
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Description
(1) 生体試料中の検出対象物質を定量するためのイムノクロマト試験片であって、
a)前記検出対象物質と特異的に結合する検出試薬及びコントロールライン検出試薬が含浸されたコンジュゲーションパッド、および
b)上流側にコントロールライン検出試薬を特異的に捕捉するための抗体が固定化されており、かつ下流側に前記検出対象物質を捕捉するための抗体が固定化されている多孔性メンブレンパッド
を有し、
前記コントロールライン検出試薬は、ビオチン標識タンパク質が結合した検出粒子を含み、
前記タンパク質は、Blocking Peptide Fragmentである、
ことを特徴とするイムノクロマト試験片。
(2) 前記コントロールライン検出試薬を特異的に捕捉するための抗体は、抗ビオチン抗体であることを特徴とする(1)に記載のイムノクロマト試験片。
(3) (1)または(2)に記載のイムノクロマト試験片を用いる、生体試料中の検出対象物質を定量する方法。
(4) (1)または(2)に記載のイムノクロマト試験片、検体希釈液および分析装置を含むイムノクロマト分析キット。
(5) (1)または(2)に記載のイムノクロマト試験片の製造方法。
本発明において、コントロールライン検出試薬は、ビオチン標識タンパク質が結合した検出粒子である。ビオチンの標識方法としては、N−ヒドロキシスクシンイミド法を挙げることができる。検出粒子は、特に制限されないが、金コロイド、ラテックス粒子、蛍光粒子などを例示することができる。ビオチン標識タンパク質と検出粒子の結合方法としては、疎水結合による物理吸着または共有結合を介した結合方法が例示できる。
本発明において、前記ビオチン標識タンパク質に用いるタンパク質は、特に制限されないが、微生物由来のタンパク質や動物由来のタンパク質などが好ましい。微生物由来のタンパク質としては、Blocking Peptide Fragmentが好ましく、動物由来のタンパク質としては、ウシ血清アルブミンまたはカゼインが好ましい。これらのタンパク質は市販されているものがあればそれを用いても良いし、別途公知の方法で製造しても良い。分子サイズも特に制限されないが、平均分子量で100kDa以下が好ましい。一般的に、タンパク質の分子サイズが小さいほど検出粒子1粒子に対するタンパク質の結合量は増加するので、感度などの性能が高くなる。
本発明において、前記検出粒子の種類は、特に制限されないが、発色粒子や蛍光粒子を用いることができる。発色粒子としては、金属粒子、ラテックス粒子などを例示することができる。金属粒子としては、金コロイド、銀コロイド、白金コロイドなどを例示することができる。金属粒子の粒径は、粒径1nm〜100nmが好ましい。より好ましくは20〜80nm、さらに好ましくは40〜60nmが好ましい。ラテックス粒子としては、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、アクリル酸重合体などの材質からなるものを例示することができる。ラテックス粒子の粒径は、粒径25nm〜500nmが好ましい。より好ましくは50〜250nm、さらに好ましくは80〜200nmである。蛍光粒子としては、特に制限されないが、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリビニルトルエン、シリカなどの材質からなるものを例示することができる。蛍光色素としては、特に制限されないが、FITC(フルオレセインイソチオシアネート)、ローダミンB誘導体、ヒドロキシクマリンなどを例示することができる。これらの中でも、汎用性が高く、視認性に優れた金コロイドやラテックス粒子を用いることが好ましい。
本発明において、前記ビオチン標識タンパク質のビオチンの標識方法は、特に限定されないが、N−ヒドロキシスクシンイミド法を例示できる。N−ヒドロキシスクシンイミド法を用いることでビオチンのカルボキシル基をN−ヒドロキシアミン系化合物と脱水縮合剤存在下で縮合反応し、選択的に活性化し、タンパク質のアミノ基とアミド結合を介して標識することができる。
前記縮合反応に使用するN−ヒドロキシアミン系化合物は、例えば、N−ヒドロキシスクシンイミド、N−ヒドロキシノルボルネン−2,3−ジカルボン酸イミド、2−ヒドロキシイミノ−2−シアノ酢酸エチルエステル、2−ヒドロキシイミノ−2−シアノ酢酸アミド、N−ヒドロキシピペリジン、N−ヒドロキシフタルイミド、N−ヒドロキシイミダゾール、N−ヒドロキシマレイミド等が挙げられる。これら化合物を2種以上用いてもよい。中でも、N−ヒドロキシスクシンイミド(以下、NHSと表記する場合がある)が、比較的安価で、入手し易いことやペプチド合成分野等で実績があることから、より好適である。
前記縮合反応に使用する脱水縮合剤としては、例えば、1−エチル−3−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩、1−シクロヘキシル−(2−モルホニル−4−エチル)−カルボジイミド・メソp−トルエンスルホネート等が挙げられる。中でも、1−エチル−3−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩(以下、EDC・HClと表記する場合がある)が、ペプチド合成分野等で汎用的な水溶性縮合剤として実績があることから、より好適である。
本発明において、前記ビオチン標識タンパク質におけるビオチンの導入量は、タンパク質とビオチンのモル比を調整することで制御することができる。感度などの性能を高めるためには、ビオチンの導入量は高いものが望ましい。より具体的には、タンパク質のモル数に対してビオチンのモル数が、1.0モル倍以上であることが好ましく、5.0モル倍以上であることがより好ましく、10.0モル倍以上であることがさらに好ましい。前記モル比は一例であるためタンパク質の種類や現実の感度に応じて適宜増減すれば良い。
本発明において、前記ビオチン標識タンパク質と検出粒子の結合方法は、特に制限されないが、疎水結合による物理吸着あるいは共有結合を介した結合方法が例示できる。疎水結合においては、ビオチン標識タンパク質と検出粒子の表面層で直接的に結合するので、ビオチン標識タンパク質の等電点付近のpHで処理することが好ましい。共有結合においては、検出粒子表面の官能基によって結合方法は異なるが、一例を挙げると、検出粒子の表面に存在する官能基がアミノ基の場合は、前述したN−ヒドロキシスクシンイミド法を用いて結合することができる。
本発明において、前記検出対象物質と特異的に結合する検出試薬は、生体試料中の検出対象物質と結合できる抗体(以下、検出抗体と表記する場合がある)が検出粒子と結合したものである。検出抗体は、検出対象物質の種類によって異なるが、市販されているものがあればそれを用いても良いし、別途公知の方法で製造しても良い。分子サイズも特に制限されない。
本発明において、検出対象物質を捕捉するための抗体(以下、捕捉抗体と表記する場合がある)は、市販されているものがあればそれを用いても良いし、別途公知の方法で製造しても良い。検出対象物質に対する捕捉抗体の認識部位は、検出抗体とは異なる部位を認識する抗体を用いるのが好ましい。分子サイズも特に制限されない。ヒト絨毛性ゴナドトロピンを測定するための捕捉抗体としては、例えば、Anti hCG_1646157(V−24),Human(Rabbit)(Santa Cruz Biotechnology,Inc.製)、Anti hCG / Chorionic Gonadotropin,Human(Mouse)(LifeSpan Biosciences,Inc.製)、Anti CGB / hCG β ,Human(Mouse)(LifeSpan Biosciences,Inc.製)、Anti Chorionic Gonadotropin,Human(Rabbit)(EY Laboratories,Inc.製)、Anti β−HCG,Human(Mouse)(Boster Immunoleader社製)、Anti CG α (α HCG),Human(Rabbit)(R&D Systems Inc.製)等が挙げられる。
本発明において、前記コントロールライン検出試薬を捕捉する抗体は、ビオチンを捕捉する抗体(以下、抗ビオチン抗体と表記する場合がある)を用いるのが好ましい。抗ビオチン抗体としては、市販されているものがあればそれを用いても良いし、別途公知の方法で製造しても良い。分子サイズも特に制限されない。抗ビオチン抗体としては、例えば、Anti−Biotin antibody(GENETEX,inc.製)、Anti−Biotin, Goat−Poly(Bethyl Laboratories,Inc.製)、IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti−Biotin(岩井化学薬品株式会社製)等が挙げられる。
本発明において、前記抗ビオチン抗体を多孔性メンブレンパッドの上流側(コントロールライン)に、捕捉抗体を下流側(テストライン)に固定化することで、イムノクロマトグラフ等で使用可能な多孔性メンブレンパッドを作製することができる。これらの抗体は、イムノクロマトグラフ等で一般的に使用される多孔性メンブレンパッドに容易に固定化することができる。多孔性メンブレンパッドの材質は、特に限定されないが、セルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン等が挙げられる。これらの材質で構成された膜、布帛、繊維状又は不織布状マトリックス等が好適である。好ましくはセルロース誘導体の膜が用いられ、より好ましくはニトロセルロース膜が用いられる。
本発明のイムノクロマト試験片の製造方法は特に限定されない。例えば、コンジュゲーションパッドにおいては、帯状のガラスファイバーに一定量の検出試薬を均一に塗布した後、恒温槽内で適当な温度で一定時間乾燥することで作製することが出来る。捕捉抗体と抗ビオチン抗体は、多孔性メンブレンパッド上にそれぞれ一定量をライン状に塗布すればよい。多孔性メンブレンパッド上に塗布する方法は、特に限定されないが、市販のイムノクロマトディスペンサーを使用することができる。捕捉抗体と抗ビオチン抗体の塗布量は、好ましくはライン長10cmあたり10μl以下、より好ましくは8μl以下、さらに好ましくは6μl以下である。また、好ましくは4μl以上である。捕捉抗体と抗ビオチン抗体の濃度は、好ましくは0.1〜2.0mg/ml、より好ましくは0.2〜1.8mg/ml、さらに好ましくは0.3〜1.6mg/mlである。
上記のようなイムノクロマト試験片を用いて測定を行う方法は特に限定されない。例えば、以下の方法が例示される。まず、生体試料を必要に応じて適当な展開溶媒(検体希釈液)と混合して展開可能な混合液を得た後、前記混合液をサンプルパッド2上に注入(滴下)する。前記混合液は、サンプルパッド2を通過してコンジュゲーションパッド3に展開する。前記混合液は、コンジュゲーションパッド3に含浸された検出試薬とコントロールライン検出試薬を溶解しながら、生体試料中の検出対象物質と検出試薬が免疫複合体を形成し、多孔性メンブレンパッドに展開する。その後、毛細管現象によって吸収パッド4側に流れる。前記混合液が多孔性メンブレンパッド上のコントロールライン5に到達すると、前記コントロールライン検出試薬は、抗ビオチン抗体で捕捉され集積し、コントロールライン5が発色する。さらに、前記混合液は、コントロールライン5を通過してテストライン6に到達する。ここで、前記混合液中の免疫複合体は捕捉抗体で捕捉され集積し、テストライン6が発色する。残りの混合液は、最終的に吸収パッドで吸収される。コントロールライン5とテストライン6の発色強度をイムノクロマトリーダー等を使用して測定することで検出対象物質の濃度を測定(定量)することができる。
コントロールラインの発色強度は特に制限されないが、目視あるいはイムノクロマトリーダーで検出することが出来る範囲の発色強度であれば良い。好ましくは10mAbs〜500mAbs、より好ましくは50mAbs〜450mAbs、さらに好ましくは100mAbs〜400mAbsである。
本発明のイムノクロマト分析キットは、イムノクロマト試験片に加えて、生体試料の前処理や希釈を目的とした検体希釈液および分析装置を含む。なお、イムノクロマト試験片は、生体試料を滴下するための検体滴下部と検出ラインの発色強度を測定するための観測窓を有するプラスチック製のハウジングケースに収納された状態でも良い。
(hCG検出試薬の調製)
125μlの金コロイド液(OD520=12)(WRGH1、株式会社ワインレッドケミカル社製)に50μlの10mM Tris−HCl pH9.2を加え、ボルテックスで撹拌した。市販の抗hCGモノクローナル抗体(製品名:Anti CGB/hCG β,Human (Mouse)、品番:LS−C196902−100、LifeSpan Biosciences,Inc.製)を10mM Tris−HClで0.1mg/mlに調製した。100μlの抗hCGモノクローナル抗体溶液を金コロイド液に加え、ボルテックスで撹拌した後、室温で15分間静置した。200μlの0.3wt%Blocking Peptide Fragment(東洋紡株式会社製)(以下、BPFと表記する場合がある)+1.0wt%PEG20000水溶液(Santa Cruz Biotechnology Inc製)(以下、PEGと表記する場合がある)を加え、ボルテックスで撹拌した後、15分間室温で静置した。その後、7000rpmで10分間遠心分離し、上清を除去した。200μlの0.3wt%BPF+1.0wt%PEG水溶液を加え、ボルテックスで撹拌した後、15分間室温で静置した。7000rpmで10分間遠心分離し、上清を除去した。1mlの0.3wt%BPF+5.0wt%D(+)-トレハロース(ナカライテスク株式会社製)水溶液を加え、ボルテックスで撹拌した後、15分間室温で静置した。
3.15mgのD−ビオチン(ナカライテスク株式会社製)を72μlの蒸留水で溶解した。また、10mgの1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(ナカライテスク株式会社製)と10mgのN−ヒドロキシスクシンイミド(ナカライテスク株式会社製)を100μlの蒸留水に溶解した。これに前記D−ビオチン溶液を加え、室温で1時間緩やかに攪拌した。得られた溶液に80μlの3wt%BPF溶液を加えて30分間室温で静置し、ビオチン標識BPF溶液を調製した。次に、50μlの金コロイド液(OD520=12)に450μlの10mM Tris−HCl pH9.2を加え、ボルテックスで撹拌した。得られた溶液に15μlのビオチン標識BPF溶液を加え、ボルテックスで撹拌した後、15分間室温で静置した。200μlの0.3wt%BPF+1.0wt%PEG水溶液(Santa Cruz Biotechnology Inc製)を加え、ボルテックスで撹拌した後、15分間室温で静置した。その後、7000rpmで10分間遠心分離し、上清を除去した。200μlの0.3wt%BSA+1.0wt%PEG水溶液を加え、ボルテックスで撹拌した後、15分間室温で静置した。7000rpmで10分間遠心分離し、上清を除去した。1mlの0.3wt%BPF+5wt%D(+)−トレハロース(ナカライテスク株式会社製)水溶液を加え、ボルテックスで撹拌した後、15分間室温で静置した。
25mm×150mmのニトロセルロースメンブレン(商品名:Hi−Flow PlusタイプHF120(メルクミリポア株式会社製))の一端(上流側)から約10mmの位置にライン幅約1mmのコントロールラインとして、1.0mg/mlの抗ビオチンモノクローナル抗体(製品名:Anti−Biotin antibody、品番:GTX44344、GENETEX,inc.製)溶液(50mM KH2PO4,pH7.0+5wt%スクロース)をイムノクロマトディスペンサーを用いて約1.0μl/cmの塗布量で塗布した。次に、ニトロセルロースメンブレンの一端(上流側)から約15mmの位置にライン幅約1mmのテストラインとして、0.5mg/mlの抗hCGモノクローナル抗体(製品名:Anti Chorionic Gonadotropin,Human(Rabbit)、品番:AT−2601−2、EY Laboratories,Inc.製)溶液(50mM KH2PO4,pH7.0+5wt%スクロース)をイムノクロマトディスペンサーを用いて約1.0μl/cmの塗布量で塗布した。その後、50℃で30分乾燥した。
10mm×150mmのコンジュゲーションパッド(商品名:シュアウィック(メルクミリポア株式会社製))に前記hCG検出試薬とコントロールライン検出試薬の混合液(混合比1:1)1.0mlを均一に塗布した。その後、デシケータ内で一晩、室温で減圧乾燥し、hCG検出試薬とコントロールライン検出試薬を含浸したhCG測定用コンジュゲーションパッドを作製した。
hCG測定用試験片は、イムノクロマトグラフで一般的に使用されるスライド構成で作製した。具体的には、サンプルパッド(商品名:シュアウィック(メルクミリポア株式会社製))、コンジュゲーションパッド(商品名:シュアウィック(メルクミリポア株式会社製))、ニトロセルロースメンブレン(商品名:Hi−Flow PlusタイプHF120(メルクミリポア株式会社製))、吸収パッド(商品名:シュアウィック(メルクミリポア株式会社製))を直列連結し作製した。次に、横幅約4mm、縦幅約60mmの試験片状に裁断機を用いてカットした。
市販のhCG抗原を50mM KH2PO4,pH7.2+1.0wt%BSA+0.1wt%NaN3で希釈し、100IU/LのhCG試料を調製した。
作製したhCG測定用試験片を水平な台に設置した。次に、調製した100IU/LのhCG試料を40μlピペットで取り、サンプルパッドに滴下した。検体を滴下してから2分毎にイムノクロマトリーダー(C10060−10(浜松ホトニクス社製))を用いて発色強度を測定した。結果を図2および表1に示す。コントロールラインの発色強度は、測定開始から12分後に310mAbsに到達し、14分後に308mAbsであったことから、測定開始から14分後に安定化したと判断した。次に、14分後のテストラインの発色強度は303mAbsであった。コントロールラインとテストラインを測定するために要した時間は約14分であった。
(hCG測定用試験片の作製)
実施例1と同様の試薬および材料を用いて、コントロールラインとテストラインの配置を入れ替えたhCG検出用多孔性メンブレンパッドを作製した。得られた多孔性メンブレンパッドを用いて、実施例1と同様にしてhCG試験片を作製した。
前記作製したhCG試験片を用いて、実施例1と同様の方法でhCGを測定した。結果を図3および表2に示す。コントロールラインの発色強度は測定開始から18分後に312mAbsに到達し、20分後に314mAbsであったことから、測定開始から20分後に安定化したと判断した。次に、20分後のテストラインの発色強度は313mAbsであった。コントロールラインとテストラインを測定するために要した時間は約20分であった。
2.サンプルパッド
3.コンジュゲーションパッド
4.吸収パッド
5.コントロールライン
6.テストライン
7.粘着シート
Claims (5)
- 生体試料中の検出対象物質を定量するためのイムノクロマト試験片であって、
a)前記検出対象物質と特異的に結合する検出試薬及びコントロールライン検出試薬が含浸されたコンジュゲーションパッド、および
b)上流側にコントロールライン検出試薬を特異的に捕捉するための抗体が固定化されており、かつ下流側に前記検出対象物質を捕捉するための抗体が固定化されている多孔性メンブレンパッド
を有し、
前記コントロールライン検出試薬は、ビオチン標識タンパク質が結合した検出粒子を含み、
前記タンパク質は、Blocking Peptide Fragmentである、
ことを特徴とするイムノクロマト試験片。 - 前記コントロールライン検出試薬を特異的に捕捉するための抗体は、抗ビオチン抗体であることを特徴とする請求項1に記載のイムノクロマト試験片。
- 請求項1または2に記載のイムノクロマト試験片を用いる、生体試料中の検出対象物質を定量する方法。
- 請求項1または2に記載のイムノクロマト試験片、検体希釈液および分析装置を含むイムノクロマト分析キット。
- 請求項1または2に記載のイムノクロマト試験片の製造方法。
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