JP7467886B2 - イムノクロマト試験片およびそれを用いた測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、イムノクロマト法により測定試料中に含まれる測定対象物質を測定するためのイムノクロマト試験片およびそれを用いた測定方法に関する。詳しくは、測定精度の高いイムノクロマト試験片およびそれを用いた測定方法に関する。

近年、医療現場ではＰＯＣＴという言葉が注目を集めている。ＰＯＣＴとはＰｏｉｎｔＯｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇの略であり、医療従事者が被験者の傍らで行う臨床検査のことをいう。ＰＯＣＴは大規模病院の中央検査室等で行う臨床検査とは異なり、その場で瞬時に検査結果が得られることから、幅広い検査項目においてＰＯＣＴが広まりつつある。

ＰＯＣＴの代表例としてイムノクロマト法が挙げられる。イムノクロマト法とは、測定試料中に含まれる測定対象物質と特異的に結合する抗体を固定化した多孔質体の一端から、測定試料が毛細管現象によって多孔質体内に展開し、その過程で標識された測定対象物質と抗体とが抗原抗体反応によって結合することによって時間経過に伴って集積し、局所的に発色することで測定試料中の測定対象物質の有無を判定する免疫測定法である。

イムノクロマト法の利点としては、迅速に結果が得られること、操作が簡便であること、および安価であること等が挙げられる。これらの利点を利用した妊娠検査薬やインフルエンザ診断薬等の体外診断薬が世界的に普及している。従来のイムノクロマト法は目視判定（定性評価）が一般的であったが、近年、発色強度を測定するイムノクロマトリーダー等の分析装置を利用して測定試料中に含まれる測定対象物質の量を定量化する技術が開発されつつある。

イムノクロマト法を用いて測定対象物質を定量する手法の一つとしては、抗原抗体反応を利用したサンドイッチ法が挙げられる。サンドイッチ法では測定対象物質に対してエピトープの異なる２種類の抗体を利用する。一方の抗体は、多孔質体の表面に線状に固定化した捕捉抗体としてテストラインを形成する。他方の抗体は、前記テストラインを検出するため、金コロイド、着色ラテックス粒子、蛍光粒子等の検出粒子と感作した検出抗体（以下、テストライン検出試薬とも呼称する）として使用する。加えて、前記テストライン検出試薬を特異的に捕捉する抗体を多孔質体の表面の前記テストラインとは異なる位置に線状に固定化しコントロールラインを形成する。測定試料中の測定対象物質は、イムノクロマト試験片の測定試料溶液の添加部（滴下部）を上流側として、多孔質体の一端（上流側）から展開し、テストライン検出試薬と免疫複合体を形成しながら移動し、テストライン上で捕捉抗体と接触して捕捉され発色する。テストライン上で捕捉されなかった遊離のテストライン検出試薬は、コントロールラインの捕捉抗体に捕捉され発色する。これらの発色強度をイムノクロマトリーダー等の装置を利用することで測定対象物質の量を定量することができる。

従来のイムノクロマト法では、テストライン上で捕捉されなかった遊離のテストライン検出試薬をコントロールラインの捕捉抗体で捕捉する機構であるため、測定対象物質の濃度に影響してコントロールラインの発色強度が変化することが問題であった。例えば、測定試料中に高濃度の測定対象物質が存在した場合、多量のテストライン検出試薬が測定対象物質と免疫複合体を形成し、上流側のテストラインで捕捉されるためテストラインの発色強度は高くなる。つまり、遊離のテストライン検出試薬は少量になるためコントロールラインの発色強度は低くなるといった問題があった。一方、測定試料中に測定対象物質が低濃度しか存在しない場合、測定対象物質と免疫複合体を形成するテストライン検出試薬も少量になるため、遊離のテストライン検出試薬がコントロールラインで多量に捕捉される結果、コントロールラインの発色強度が高くなるといった問題があった。

イムノクロマト法により測定試料中に含まれる測定対象物質を精度よく測定するために、コントロールラインの発色強度が測定試料（または、テストライン検出試薬）の多孔質体への展開量を反映するイムノクロマト試験片を用い、前記コントロールラインの発色強度によりイムノクロマト試験片の個体差に起因する測定試料の多孔質体への展開量のバラツキを補正する場合がある。その場合、一定量の測定試料（または、テストライン検出試薬）が多孔質体に展開した場合、前記コントロールラインの発色強度は常に一定であることが望まれる。

特許文献１、２には、低分子化合物を標識した検出粒子（以下、コントロールライン検出試薬とも呼称する）と、前記低分子化合物を特異的に捕捉する抗体を多孔質体の表面に線状に固定化したコントロールラインを有するイムノクロマト試験片を使用することで、テストラインとコントロールラインとで独立した抗原抗体反応が進行するため、測定試料中の測定対象物質の濃度の影響を受けず、コントロールラインの発色強度を安定化できる技術が開示されている。前記発明は、コントロールラインが測定試料（または、テストライン検出試薬）の多孔質体への流入量をある程度反映するため、テストラインの発色強度をコントロールラインの発色強度で補正することで、測定試料中に含まれる測定対象物質をある程度精度よく測定できる。しかしながら通常、テストラインとコントロールラインは多孔質体の異なる位置に固定化するため、テストライン検出試薬がテストラインに捕捉されるまでの時間とコントロールライン検出試薬がコントロールラインに捕捉されるまでの時間に差異が生じるため、前記補正が不十分であった。

ＷＯ２０１７／０６５２１３号公報 ＷＯ２０１７／０９４８２５号公報

本発明は、イムノクロマト法により測定試料中に含まれる測定対象物質を測定するためのイムノクロマト試験片およびそれを用いた測定方法を提供することを課題とするものである。詳しくは、測定精度の高いイムノクロマト試験片およびそれを用いた測定方法を提供することを課題とするものである

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、テストラインをコントロールラインより上流側に配置し、テストライン検出試薬を含むコンジュゲーションパッドを上流側に、コントロールライン検出試薬を含むコンジュゲーションパッドを下流側に分けて配置したイムノクロマト試験片を使用することにより、従来技術よりも測定精度が向上することを見出し、本発明を完成させた。テストライン検出試薬を含むコンジュゲーションパッドを、コントロールライン検出試薬を含むコンジュゲーションパッドよりも上流側に分けて配置することで、それぞれの試薬が抗体などの捕捉物質に捕捉されるまでの滞留時間の差異が低減し、より高精度な補正が可能になることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、代表的な本発明は以下の通りである。
（１） サンプルパッド、コンジュゲーションパッドＡ、コンジュゲーションパッドＢ、メンブレン、吸収パッドの各部材が順に連接配置されたイムノクロマト試験片であって、
前記各部材は、それぞれ一部重なり部を有し、
前記メンブレンは、上流側にテストライン、下流側にコントロールラインを有し、
前記コンジュゲーションパッドＡは、テストライン検出試薬を含有しており、
前記コンジュゲーションパッドＢは、コントロールライン検出試薬を含有している、
測定試料中に含まれる測定対象物質を定量するためのイムノクロマト試験片。
（２） 前記テストラインと前記コントロールラインとが１ｍｍ以上１５ｍｍ以下離れている、（１）に記載のイムノクロマト試験片。
（３） 前記コンジュゲーションパッドＡの上流端から前記テストラインまでの距離Ｘおよび前記コンジュゲーションパッドＢの上流端から前記コントロールラインまでの距離Ｙとの差が１０ｍｍ未満である、（１）または（２）に記載のイムノクロマト試験片。
（４） （１）～（３）のいずれか１項に記載のイムノクロマト試験片を用い、下記（ｉ）から（ｉｉｉ）の工程を順に経て、測定試料中に含まれる測定対象物質を定量する方法。
工程（ｉ）：測定試料と希釈液とを混合する工程
工程（ｉｉ）：工程（ｉ）の混合液を、サンプルパッドに点着させる工程
工程（ｉｉｉ）：テストラインおよびコントロールラインの発色強度から測定対象物質を測定する工程

本発明のイムノクロマト試験片およびそれを用いた測定方法は、テストラインとコントロールラインとで独立した抗原抗体反応が進行するためコントロールラインの発色強度が安定化し、かつテストライン検出試薬がテストラインで捕捉されるまでの時間とコントロールライン検出試薬がコントロールラインで捕捉されるまでの滞留時間の差異が低減することにより、測定試料中に含まれる測定対象物質を高精度に測定することができる。

イムノクロマト試験片の一例を示す（上面）図である。 イムノクロマト試験片の一例を示す（側面）図である。

本発明において、測定試料は、特に限定されないが、例えば、血液、リンパ液、髄液、汗、尿、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等の生体試料が挙げられる。血液においては、全血のほか、血液を遠心分離して得られた血清、血球または血漿を試料とすることができる。また、測定試料はヒト由来に限らず、イヌ、ネコ、ウシ等の哺乳動物由来の生体試料も対象である。

本発明において、測定項目は、特に限定されないが、例えば、ＨｂＡ１ｃ、Ｃ－ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｉｎｓｕｌｉｎ、ｍ－Ａｌｕｍｉｎ、Ｃｙｓ－Ｃ、ＮＧＡＬ、Ｔｒoｐｏｎｉｎ１、Ｄ－ｄｉｍｅｒ、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ、ＣＫ－ＭＢ、Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ、ｈ－ＦＡＢＰ、ｈｓ－ＣＲＰ、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＦＯＢ、Ｆｅｒｒｉｔｉｎ、ＰＣＴ、ＣＲＰ、ＳＡＡ、ＡＳＯ、ｈＣＧ、ＬＨ、ＴＳＨ、ＦＳＨ、Ｔ３、Ｔ４、ＶｉｔａｍｉｎＤ等や、ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｂ、Ｄｅｎｇｕｅ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、Ｍａｌａｒｉａ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ、Ｒｏｔａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、ＳｔｒｅｐＡ、Ａｄｅｎｏ、Ｚｉｋａ、Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ、ＲＳＶ等の感染症項目が挙げられる。

本発明において、イムノクロマト試験片は、イムノクロマト試験片の測定試料溶液の添加部（滴下部）を上流側として、前記添加部を有するサンプルパッド、コンジュゲーションパッドＡ、コンジュゲーションパッドＢ、メンブレン、吸収パッドの順に連接配置されたものである。次いで、本発明のイムノクロマト試験片について、図面を参照して説明する。図１および２において、１はサンプルパッド、２はコンジュゲーションパッドＡ、３はコンジュゲーションパッドＢ、４はメンブレン、５は吸収パッド、６はバッキングシート、７はテストライン、８はコントロールライン、９は粘着シートをそれぞれ示す。

図１および２において、イムノクロマト試験片は、幅３～５ｍｍ（好ましくは、４ｍｍ程度）、長さ４０～１００ｍｍ（好ましくは６０ｍｍ程度）の細長い短冊状の形態をしている。なお、イムノクロマト試験片のメンブレン４の上流側には測定対象物質と特異的に結合する捕捉物質を線状に固定化したテストライン７が形成される。また、前記下流側に後述の低分子化合物と特異的に結合する捕捉物質を線状に固定化したコントロールライン８が形成される。さらに、イムノクロマト試験片のコンジュゲーションパッド２には測定対象物質と特異的に結合する検出抗体が感作された検出粒子から構成されるテストライン検出試薬、およびコンジュゲーションパッド３には、低分子化合物で標識された検出粒子から構成されるコントロールライン検出試薬が坦持されている。

本発明において、検出粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、１０～１０００ｎｍが好ましく、１０～５００ｎｍがより好ましい。検出粒子の平均粒子径が大きいと、下流への展開が遅くなり、測定時間が長くなる。また、メンブレン上の任意の部位に捕捉されやすくなり、バックグラウンド自体が発色してしまうことでテストラインおよびコントロールラインでの発色が不明瞭になることがある。一方、検出粒子の平均粒子径が小さいと、テストライン検出試薬の場合は、物理吸着または化学結合できる検出抗体量が低下し、測定感度が低下することがある。また、コントロールライン検出試薬の場合は、標識できる低分子化合物量が低下し、補正が不十分となることがある。

本発明において、検出粒子は、特に限定されないが、着色粒子や蛍光粒子を用いることができる。着色粒子としては金属粒子、ラテックス粒子、セルロース粒子などを例示することができる。金属粒子としては金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、パラジウムコロイド、金ナノロッド、金ナノプレート、銀ナノプレートなどを例示することができる。ラテックス粒子としてはポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、アクリル酸重合体などの材質からなるものを例示することができる。蛍光粒子としてはポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリビニルトルエン、シリカなどの材質からなるものを例示することができ、蛍光色素としてはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、シアニンおよびその誘導体などを例示することができる。

これらの中でも前記テストライン検出試薬における検出粒子および前記コントロールライン検出試薬における検出粒子は共に着色粒子であることが好ましく、また同一色であることがより好ましい。ここで、同一色とは、最大吸光波長が±５０ｎｍ以内であることを意味する。また、例えば、両検出粒子のうちの少なくとも一方が蛍光粒子であると、蛍光を検出するためにイムノクロマトリーダーが大型かつ高価になり、ＰＯＣＴの観点から好ましくない。また、両検出粒子が異なる色であると、例えば一般的な発光ダイオード（以下、ＬＥＤと略す場合がある）－フォトダイオード（以下、ＰＤと略す場合がある）のイムノクロマトリーダーで測定する場合に、テストラインとコントロールラインの各色に対応する複数のＬＥＤ－ＰＤの組み合わせが必要となり、装置が大型かつ高価になり、ＰＯＣＴの観点から好ましくない。

本発明において、前記テストライン検出試薬における検出抗体は、測定対象物質と特異的に結合し得るものであれば特に限定されない。例えば、測定対象物質がｈＣＧであれば抗ｈＣＧ抗体を、測定対象物質がＨｂＡ１ｃであれば抗Ｈｂ抗体または抗ＨｂＡ１ｃ抗体を使用することができる。前記検出抗体は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよい。また、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、分子サイズも特に限定されない。

前記テストライン検出試薬における検出抗体と検出粒子との結合方法は、特に限定されないが、疎水結合による物理吸着または共有結合による化学結合で感作するのが好ましく、操作が簡便であり、かつコストも安い物理吸着がより好ましい。なお、感作効率を向上させるため、検出粒子に反応性活性基を導入してもよい。反応性活性基としては、特に限定されないが、例えばカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、エポキシ基、水酸基が挙げられる。これらの中でも、カルボキシル基、アミノ基が好ましい。カルボキシル基の場合は、カルボジイミドを用いてリガンドのアミノ基と共有結合を形成することができる。

前記コントロールライン検出試薬における低分子化合物は、特に限定されないが、比較的安価で、入手し易いことやタンパク質標識分野等で実績があることから、ビオチンまたはジゴキシゲニンが好ましく、ビオチンがより好ましい。

前記テストライン検出試薬およびコントロールライン検出試薬は、ブロッキング用タンパク質によりブロッキングするのが好ましい。前記ブロッキング用タンパク質は、特に限定されず、微生物由来タンパク質のＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下、ＢＰＦと略す場合がある）、動物由来タンパク質のウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す場合がある）、カゼインが好ましい。ブロッキング用タンパク質は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよい。

本発明において、テストライン７に固定化する捕捉物質は、測定対象物質と特異的に結合し得るものであれば特に限定されない。例えば、測定対象物質がｈＣＧであれば抗ｈＣＧ抗体を、測定対象物質がＨｂＡ１ｃであれば抗Ｈｂ抗体または抗ＨｂＡ１ｃ抗体を使用することができる。なお、前記検出抗体と前記捕捉物質とは、測定対象物質に対する結合部位が異なるものが好ましい。前記捕捉物質は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよく、分子サイズも特に限定されない。また、抗体の場合、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。

本発明において、コントロールライン８に固定化する捕捉物質は、コントロールライン検出試薬の低分子化合物と特異的に結合し得るものであれば特に限定されない。例えば、低分子化合物がビオチンの場合は抗ビオチン抗体やアビジンであり、低分子化合物がジゴキシゲニンの場合は、抗ジゴキシゲニン抗体を使用することができる。前記捕捉物質は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよく、分子サイズも特に限定されない。また、抗体の場合、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。

サンプルパッド１の材質は、測定試料を速やかに吸収した後、下流のコンジュゲーションパッド２および３、メンブレン４、吸収パッド５へ展開できる材質のものであれば、特に限定されず、例えばセルロース製のろ紙または不織布、ガラス製のろ紙または不織布、ポリエステル製のろ紙または不織布、ポリエチレン製のろ紙または不織布が挙げられる。これらの中でも、セルロース製のろ紙が好ましい。また、前記サンプルパッド１の厚みは、０．１～２．０ｍｍが好ましく、０．２～１．０ｍｍがより好ましい。厚みが小さいと、下流での測定試料の流れが不均一となり測定精度が低下することがある。一方、厚みが大きいと、下流への展開が遅くなり測定時間が長くなることがある。また、下流への展開に必要となる測定試料量が多くなる。

コンジュゲーションパッド２および３の材質は、テストライン検出試薬およびコントロールライン検出試薬を乾燥状態で保持でき、かつ測定試料の下流への展開と共に前記両検出試薬を速やかに放出することができる材質のものであれば、特に限定されず、例えばセルロース製のろ紙または不織布、ガラス製のろ紙または不織布、ポリエステル製のろ紙または不織布、ポリエチレン製のろ紙または不織布が挙げられる。これらの中でも、ガラス製のろ紙が好ましい。また、前記コンジュゲーションパッド２および３の厚みは、０．１～２．０ｍｍが好ましく、０．２～１．０ｍｍがより好ましい。厚みが小さいと、目的量のテストライン検出試薬およびコントロールライン検出試薬を乾燥状態で保持できないことがある。一方、厚みが大きいと、下流への展開が遅くなり測定時間が長くなることがある。また、下流への展開に必要となる測定試料量が多くなる。

メンブレン４の材質は、測定試料を精度よく均一に展開できるものであれば、特に限定されず、例えばセルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、またはナイロン製のメンブレンが挙げられる。これらの中でも、ニトロセルロース製のメンブレンが好ましい。

吸収パッド５の材質は、上流より展開してきた測定試料を速やかに吸収した後、逆流しないよう保持できる材質のものであれば、特に限定されず、例えばセルロース製のろ紙または不織布、ガラス製のろ紙または不織布、ポリエステル製のろ紙または不織布、ポリエチレン製のろ紙または不織布が挙げられる。これらの中でも、セルロース製のろ紙が好ましい。また、前記吸収パッド５の厚みは、０．２～５．０ｍｍが好ましく、０．５～２．０ｍｍがより好ましい。厚みが小さいと、測定試料の滴下量によっては一度吸収パッドに吸収された測定試料がメンブレン側に逆流することがある。一方、厚みが大きいと、イムノクロマト試験片およびイムノクロマト試験片を覆うハウジングケースのサイズも大きくなり、ＰＯＣＴの観点から好ましくない。

コンジュゲーションパッド２に前記テストライン検出試薬を担持させる方法、およびコンジュゲーションパッド３に前記コントロールライン検出試薬を担持させる方法は、特に限定されず、例えば各検出試薬をそれぞれのパッドに均一に塗布、噴霧または含浸した後、恒温槽内で適当な温度で一定時間乾燥することで作製することができる。前記検出試薬の塗布量は、特に限定されないが、ライン長１ｃｍ辺り５～５０μＬが好ましい。次いで、前記塗布後に乾燥するのが好ましい。乾燥温度は、特に限定されないが、２０℃～８０℃が好ましく、２０℃～６０℃がより好ましい。乾燥時間は乾燥温度によって異なるが、通常は５～１２０分間である。

メンブレン４に前記テストラインを形成する捕捉物質と前記コントロールラインを形成する捕捉物質を線状に固定化する方法は、特に限定されず、例えば前記テストラインを形成する捕捉物質と前記コントロールラインを形成する捕捉物質を、それぞれ線上に一定量を異なる位置に塗布した後、恒温槽内で適当な温度で一定時間乾燥することで作製することができる。前記両捕捉物質の塗布量は、特に限定されないが、ライン長１ｃｍ辺り０．１～２μＬが好ましい。次いで、前記塗布後に乾燥するのが好ましい。乾燥温度は、特に限定されないが、２０℃～８０℃が好ましく、２０℃～６０℃がより好ましい。乾燥時間は乾燥温度によって異なるが、通常は５～１２０分間である。

本発明において、イムノクロマト試験片は、前記作製したメンブレン４を粘着シート９の中央付近に貼り付け、次いでコンジュゲーションパッド３をメンブレン４の上流側の端部に一部重ね合わせて貼り付け、次いでコンジュゲーションパッド２をコンジュゲーションパッド３の上流側の端部に一部重ね合わせて貼り付ける。同様に、サンプルパッド１をコンジュゲーションパッド２の上流側の端部に一部重ね合わせて貼り付け、次いで吸収パッド５をメンブレン４の下流側の端部に一部重ね合わせて貼り付けた後、一定幅の短冊状に切断することで作製することができる。なお、テストライン７およびコントロールライン８は試験片を作製した後に調製してもよいし、試験片を作製する前に調製してもよい。

本発明において、イムノクロマト試験片を構成する各部材（サンプルパッド、コンジュゲーションパッドＡ、コンジュゲーションパッドＢ、メンブレン、吸収パッド）をそれぞれ一部重ね合わせる際の、その重なり部の長さは１～５ｍｍ程度とするのが好ましいが特に限定されない。なお、重なり部は各部材が互いに接触しているだけであり、接着されていない。

本発明において、テストライン７とコントロールライン８とは１ｍｍ以上１５ｍｍ以下離れているのが好ましい。前記距離が近すぎると、テストライン７の下流側とコントロールライン８の上流側ラインが近接し、ライン読み取りの際、精度が下がる、または高精度な読み取り装置が必要となる。また、前記距離が遠すぎると、上流側のテストラインはコンジュゲーションパッドに近接して設定することになる。そのため、コンジュゲーションパッドからメンブレンへサンプルが流れた直後の、流れが安定しない状態での測定となり、テストライン測定の精度が下がる。したがって、前記距離は、２ｍｍ以上１０ｍｍ以下がより好ましく、３ｍｍ以上１０ｍｍ以下がさらに好ましい。

本発明において、コンジュゲーションパッドＡの上流側端部（上流端）からテストラインまでの距離とコンジュゲーションパッドＢの上流側端部（上流端）からコントロールラインまでの距離を同程度とすることにより、測定対象物質とテストライン検出試薬との免疫複合体の移動時間（免疫複合体がテストライン上の捕捉物質と結合するまでの時間）とコントロールライン検出試薬の移動時間（コントロールライン検出試薬がコントロールラインで捕捉されるまでの時間）との差が小さくなるため、発色強度が安定し、高精度の検出（定量）ができる。具体的には、コンジュゲーションパッドＡの上流端からテストラインまでの距離ＸおよびコンジュゲーションパッドＢの上流端からコントロールラインまでの距離Ｙは１５～３５ｍｍが好ましく、１８～３３ｍｍがより好ましい。また、前記ＸとＹとの差は１０ｍｍ未満が好ましく、７ｍｍ未満がより好ましく、５ｍｍ未満がさらに好ましく、２ｍｍ以下がよりさらに好ましい。

本発明において、前記重なり部を除いた前記コンジュゲーションパッドＡの長さが２ｍｍ以上１５ｍｍ以下が好ましく、３ｍｍ以上１５ｍｍ以下がより好ましい。重なり部を除いたコンジュゲーションパッドＡの長さを前記範囲とすることによって、試験片の全長を変えずに（すなわち、一般的な試験片長の中で）前記各移動時間を調整しやすくなる。

前記イムノクロマト試験片は、少なくともサンプルパッド１上に測定試料を滴下するための第一の開口部、メンブレン４上にテストライン７とコントロールライン８を測定するための第二の開口部を有する適当なプラスチック製のハウジングケースに収容されたものでも良い。

本発明において、測定対象物質の濃度は測定試料の展開斑を考慮し、テストラインの発色強度をコントロールラインの発色強度で割り算した補正値から測定するのがより好ましい。

本発明において、イムノクロマト試験片のテストラインおよびコントロールラインの測定方法は、特に限定されず、市販のイムノクロマトリーダーを用いてもよいし、別途公知の方法でイムノクロマトリーダーを製造してもよい。検出系としては、特に限定されないが、例えばＬＥＤ－ＦＤ、ＬＥＤ－ＣＭＯＳ、ＬＥＤ－ＣＣＤを使用することができる。

以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、明細書中の評価法は以下の通りである。

（実施例１）
ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬の調製
５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧ－βモノクローナル抗体（５０１４、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）で１．０ｍｇ／ｍＬに調製した。次いで、１．０ｗｔ％のセルロース粒子（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＲＥ２：Ｄａｒｋ Ｒｅｄ、赤色、平均粒子径３４０ｎｍ、旭化成社製）１００μＬ、１０ｍＭのトリス緩衝液（２０４－０７８８５、和光純薬工業社製）（ｐＨ７．０）９００μＬ、および前記１．０ｍｇ／ｍＬ（０．１ｗｔ％）の抗ｈＣＧ－βモノクローナル抗体１００μＬを１５ｍＬの遠沈管に加え、ボルテックスで撹拌した。次いで、３７℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ１２０分間静置した。次いで、１．０ｗｔ％のカゼイン（０３０－０１５０５、和光純薬工業社製）、１００ｍＭのホウ酸緩衝液（０２１－０２１９５、和光純薬工業社製）からなるブロッキング液（ｐＨ８．０）１２ｍＬを加え、さらに３７℃に調整した低温インキュベーターで６０分間静置した。次いで、遠心分離機（ＭＸ－３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ－３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０－０４、トミー精工社製）を用い、１３，０００Ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、抗体感作セルロース粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、５０ｍＭのホウ酸緩衝液からなる洗浄液（ｐＨ１０．０）１２ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ－５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理した。次いで、遠心分離機とラックインローターとラックを用い、１３，０００Ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、抗体感作セルロース粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１５ｗｔ％のスクロース（１９６－０００１５、和光純薬工業社製）、０．２ｗｔ％のカゼイン、６２ｍＭのホウ酸緩衝液からなる塗布液（ｐＨ９．２）２．０ｍＬを加え、超音波分散機で１０秒間処理し、ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬１を作製した。

コントロールライン検出試薬の調製
Ｄビオチン（０４８２２－９１、ナカライテスク社製）１６ｍｇ、およびジメチルスルホキシド：ＤＭＳＯ（０８９０４－１４、ナカライテスク社製）１，０００μＬを５ｍＬのマイクロチューブに加え、ボルテックスで撹拌し、Ｄビオチン溶液を得た。次いで、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩：ＥＤＣ（１５０２２－８６、ナカライテスク社製）２００ｍｇ、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド：ＮＨＳ（１８９４８－０２、ナカライテスク社製）２００ｍｇ、および蒸留水１，０００μＬを５ｍＬのマイクロチューブに加え、ボルテックスで撹拌し、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を得た。次いで、前記Ｄビオチン溶液１，０００μＬおよび前記ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液１，０００μＬを混合した後、２５℃に調整した低温インキュベーターに入れ１５分間静置し、Ｄビオチン／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を得た。次いで、Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）１００ｍｇ、および蒸留水１，０００μＬを５ｍＬのマイクロチューブに加え、ボルテックスで撹拌し、ＢＳＡ溶液を得た。次いで、前記Ｄビオチン／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液１，０００μＬと前記ＢＳＡ溶液１，０００μＬを混合した後、２５℃に調整した低温インキュベーターに入れ３０分間静置し、Ｄビオチン－ＢＳＡ溶液を得た。１．０ｗｔ％のセルロース粒子（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＲＥ２：Ｄａｒｋ Ｒｅｄ、赤色、平均粒子径３４０ｎｍ、旭化成社製）１００μＬ、１０ｍＭのトリス緩衝液（２０４－０７８８５、和光純薬工業社製）（ｐＨ７．０）９００μＬ、および前記Ｄビオチン－ＢＳＡ溶液１００μＬを１５ｍＬの遠沈管に加え、ボルテックスで撹拌した。次いで、３７℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ１２０分間静置した。次いで、１．０ｗｔ％のカゼイン（０３０－０１５０５、和光純薬工業社製）、１００ｍＭのホウ酸緩衝液（０２１－０２１９５、和光純薬工業社製）からなるブロッキング液（ｐＨ８．０）１２ｍＬを加え、さらに３７℃に調整した低温インキュベーターで６０分間静置した。次いで、遠心分離機（ＭＸ－３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ－３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０－０４、トミー精工社製）を用い、１３，０００Ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、Ｄビオチン－ＢＳＡ感作セルロース粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、５０ｍＭのホウ酸緩衝液からなる洗浄液（ｐＨ１０．０）１２ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ－５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理した。次いで、遠心分離機とラックインローターとラックを用い、１３，０００Ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、Ｄビオチン－ＢＳＡ感作セルロース粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１５ｗｔ％のスクロース（１９６－０００１５、和光純薬工業社製）、０．２ｗｔ％のカゼイン、６２ｍＭのホウ酸緩衝液からなる塗布液（ｐＨ９．２）２．０ｍＬを加え、超音波分散機で１０秒間処理し、コントロールライン検出試薬１を作製した。

ｈＣＧ測定用メンブレンカードの作製
５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧ－αモノクローナル抗体（６６０１、ＭｅｄｉｘＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を蒸留水で０．５ｍｇ／ｍＬに調製した。次いで、１．０ｍｇ／ｍＬの抗ビオチンポリクローナル抗体（Ａ１５０－１１１Ａ、ＢＥＴＨＹＬ社製）を蒸留水で０．５ｍｇ／ｍＬに調製した。次いで、上流側に２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部、中央に２５ｍｍ×３００ｍｍのメンブレン部、下流側に１５ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部から構成される６０ｍｍ×３００ｍｍのメンブレンカード（Ｈｉ－Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ １２０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｃａｒｄｓ、吸水速度１２０秒／４ｃｍ、ＨＦ１２０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）のメンブレン部の上流側から１０ｍｍの位置に、分注プラットフォーム（ＸＹＺ３０６０、ＢＩＯＤＯＴ社製）と、Ｂｉｏ Ｊｅｔノズル（ＢＨＱＨＲ－ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記０．５ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧ－αモノクローナル抗体を１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した後、４５℃に調整した乾燥機（ＷＦＯ－５１０、東京理化器械社製）で３０分間乾燥し、ライン幅約１ｍｍのテストラインを形成した。さらに、前記テストラインを形成したメンブレンカードのメンブレン部の上流側から１５ｍｍの位置に、分注プラットフォームと、Ｂｉｏ Ｊｅｔノズルを用い、前記０．５ｍｇ／ｍＬの抗ビオチンポリクローナル抗体を１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した後、４５℃に調整した乾燥機で３０分間乾燥し、ライン幅約１ｍｍのコントロールラインを形成することで、ｈＣＧ測定用メンブレンカード１を作製した。

ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドの作製
前記ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬１を全面に塗布した。７ｍｍ×３００ｍｍのコンジュゲーションパッド（ＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＰＡＤ、ＧＦＤＸ００１０５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に前記ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬１を全面に塗布した。塗布には分注プラットフォームと、Ａｉｒ Ｊｅｔノズル（ＡＪＱＨＲ－ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬を１０．７μＬ／ｃｍの塗布量で２回均一に塗布した後、４５℃に調整した乾燥機で３０分間乾燥し、ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ１を得た。
一方、前記コントロールライン検出試薬１を前記塗布液で５倍希釈したものを１０ｍｍ×３００ｍｍのコンジュゲーションパッド（ＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＰＡＤ、ＧＦＤＸ００１０５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の全面に塗布した。塗布には分注プラットフォームと、Ａｉｒ Ｊｅｔノズル（ＡＪＱＨＲ－ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記コントロールライン検出試薬を７．５μＬ／ｃｍの塗布量で２回均一に塗布した後、４５℃に調整した乾燥機で３０分間乾燥し、ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ１を作製した。

ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の作製
前記ｈＣＧ測定用メンブレンカード１の上流側の２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ１を貼り合わせた。次いで、さらに上流側に前記コンジュゲーションパッドＢ１と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ１を貼り合わせた。さらに、上流側に前記コンジュゲーションパッドＡ１と２ｍｍ重なるよう９ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた。次いで、前記ｈＣＧ測定用メンブレンカードの下流側の１５ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と２ｍｍ重なるよう１７ｍｍ×３００ｍｍの吸収パッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた。次いで、ギロチン式カッティングモジュール（ＣＭ５０００、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍの短冊状にカットすることで、ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片１を作製した。

希釈ｈＣＧ試料の調製
市販のｈＣＧ抗原（３０－１１３２、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製）を、５０ｍＭのリン酸二水素カリウム（２８７３６－７５、ナカライテスク社製）、１．０ｗｔ％のＢＳＡからなる希釈液（ｐＨ７．０）で希釈し、１ＩＵ／Ｌおよび１００ＩＵ／Ｌの希釈ｈＣＧ試料を調整した。

ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の評価：精度の評価
前記ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片１を水平な台に設置した。次いで、前記希釈ｈＣＧ試料（１ＩＵ／Ｌおよび１００ＩＵ／Ｌ）１００μＬを、マイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下し、２５℃で１０分間静置した。次いで、メンブレン上のコントロールラインおよびテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０－１０、測定モード：Ｇｏｌｄ Ｃｏｌｌｏｉｄ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）を用いて測定した。前記実験操作を前記希釈ｈＣＧ試料（１ＩＵ／Ｌおよび１００ＩＵ／Ｌ）に対してそれぞれＮ＝１０で行った。精度の指標として、前記希釈ｈＣＧ試料（１ＩＵ／Ｌおよび１００ＩＵ／Ｌ）のテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をコントロールラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）で割算した補正値（１ＩＵ／Ｌおよび１００ＩＵ／Ｌ）をそれぞれ算出した後、得られた補正値（１ＩＵ／Ｌおよび１００ＩＵ／Ｌ）のＮ＝１０におけるＣＶ（１ＩＵ／Ｌおよび１００ＩＵ／Ｌ）（％）をそれぞれ算出し、さらにＣＶ（１ＩＵ／Ｌ）（％）とＣＶ（１００ＩＵ／Ｌ）（％）との平均値：ＣＶ（％）を算出し、ＣＶ≦２％を◎（ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、２％＜ＣＶ≦３％を○（ｇｏｏｄ）、３％＜ＣＶ≦５％を△（ａｖｅｒａｇｅ）、５％＜ＣＶを×（ｂａｄ）と評価した。実施例１のｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片１の精度はＣＶ＝１．５％で◎と、高精度な測定が可能であった。得られた評価結果を表１に示す。

ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の評価：感度の評価
前記ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片１を水平な台に設置した。次いで、前記希釈ｈＣＧ試料（１ＩＵ／Ｌおよび１００ＩＵ／Ｌ）１００μＬを、マイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下し、２５℃で１０分間静置した。次いで、メンブレン上のコントロールラインおよびテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０－１０、測定モード：Ｇｏｌｄ Ｃｏｌｌｏｉｄ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）を用いて測定した。前記実験操作を前記希釈ｈＣＧ試料（１ＩＵ／Ｌおよび１００ＩＵ／Ｌ）に対してそれぞれＮ＝１０で行った。感度の指標として、前記希釈ｈＣＧ試料（１００ＩＵ／Ｌ）のテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）のＮ＝１０平均値と、前記希釈ｈＣＧ試料（１ＩＵ／Ｌ）のテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）のＮ＝１０平均値との差：Δ（ｍＡｂｓ）を算出し、３００Ａｂｓ≦Δを◎（ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、２００≦ΔＬ＝＜３００ｍＡｂｓを○（ｇｏｏｄ）、Δ＜２００ｍＡｂｓを×（ｂａｄ）と評価した。実施例１のｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片１の感度はΔＬ＝４１０ｍＡｂｓで◎と、高感度な測定が可能であった。得られた評価結果を表１に示す。

（実施例２）
ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドの作製
５ｍｍ×３００ｍｍのコンジュゲーションパッド（ＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＰＡＤ、ＧＦＤＸ００１０５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に前記ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬１を全面に塗布した。塗布には分注プラットフォームと、Ａｉｒ Ｊｅｔノズル（ＡＪＱＨＲ－ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬を１５μＬ／ｃｍの塗布量で２回均一に塗布した後、４５℃に調整した乾燥機で３０分間乾燥し、ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ２を得た。
一方、実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ２を作製した。

ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の作製
実施例１と同様にして粘着テープにメンブレン、ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ２、ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ２を貼り合わせた後、前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ２の上流側に前記コンジュゲーションパッドＡ２と２ｍｍ重なるよう１１ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた以外は、実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片２を作製し、実施例1と同様の方法にて評価した。得られた評価結果を表１に示す。

（実施例３）
ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドの作製
１２ｍｍ×３００ｍｍのコンジュゲーションパッド（ＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＰＡＤ、ＧＦＤＸ００１０５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に前記ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬１を全面に塗布した。塗布には分注プラットフォームと、Ａｉｒ Ｊｅｔノズル（ＡＪＱＨＲ－ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬を６．３μＬ／ｃｍの塗布量で２回均一に塗布した後、４５℃に調整した乾燥機で３０分間乾燥し、ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ３を得た。
一方、実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ３を作製した。

ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の作製
実施例１と同様にして粘着テープにメンブレン、ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ３、ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ３を貼り合わせた後、前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ３の上流側に前記コンジュゲーションパッドＡ３と２ｍｍ重なるよう４ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた以外は、実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片３を作製し、実施例1と同様の方法にて評価した。得られた評価結果を表１に示す。

（実施例４）
ｈＣＧ測定用メンブレンカードの作製
テストラインを形成したメンブレンカードのメンブレン部の上流側から２０ｍｍの位置に、ライン幅約１ｍｍのコントロールラインを形成した以外は実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用メンブレンカード４を作製した。

ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドの作製
実施例３と同様にしてｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ４およびｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ４を作製した。

ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の作製
前記ｈＣＧ測定用メンブレンカード４の上流側の２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ４を貼り合わせた。次いで、さらに上流側に前記コンジュゲーションパッドＢ４と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ４を貼り合わせた。さらに、上流側に前記コンジュゲーションパッドＡ４と２ｍｍ重なるよう４ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた以外は、実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片４を作製し、実施例1と同様の方法にて評価した。得られた評価結果を表１に示す。

（実施例５）
ｈＣＧ測定用メンブレンカードの作製
メンブレン部の上流側から１３ｍｍの位置に、ライン幅約１ｍｍのコントロールラインを形成した以外は実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用メンブレンカード５を作製した。

ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドの作製
実施例２と同様にしてｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ５およびｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ５を作製した。

ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の作製
前記ｈＣＧ測定用メンブレンカード５の上流側の２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ５を貼り合わせた。次いで、さらに上流側に前記コンジュゲーションパッドＢ５と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ５を貼り合わせた。さらに、上流側に前記コンジュゲーションパッドＡ５と２ｍｍ重なるよう１１ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた以外は、実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片５を作製し、実施例1と同様の方法にて評価した。得られた評価結果を表１に示す。

（実施例６）
ｈＣＧ測定用メンブレンカードの作製
メンブレン部の上流側から５ｍｍの位置に、ライン幅約１ｍｍのテストラインを形成し、前記テストラインを形成したメンブレンカードのメンブレン部の上流側から１０ｍｍの位置に、ライン幅約１ｍｍのコントロールラインを形成した以外は実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用メンブレンカード６を作製した。

ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドの作製
実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ６およびｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ６を作製した。

ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の作製
前記ｈＣＧ測定用メンブレンカード６の上流側の２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ６を貼り合わせた。次いで、さらに上流側に前記コンジュゲーションパッドＢ６と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ６を貼り合わせた。さらに、上流側に前記コンジュゲーションパッドＡ６と２ｍｍ重なるよう９ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた以外は、実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片６を作製し、実施例1と同様の方法にて評価した。得られた評価結果を表１に示す。

（実施例７）
ｈＣＧ測定用メンブレンカードの作製
メンブレン部の上流側から７ｍｍの位置に、ライン幅約１ｍｍのテストラインを形成し、前記テストラインを形成したメンブレンカードのメンブレン部の上流側から２２ｍｍの位置に、ライン幅約１ｍｍのコントロールラインを形成した以外は実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用メンブレンカード７を作製した。

ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドの作製
１７ｍｍ×３００ｍｍのコンジュゲーションパッド（ＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＰＡＤ、ＧＦＤＸ００１０５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に前記ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬１を全面に塗布した。塗布には分注プラットフォームと、Ａｉｒ Ｊｅｔノズル（ＡＪＱＨＲ－ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬を４．４μＬ／ｃｍの塗布量で２回均一に塗布した後、４５℃に調整した乾燥機で３０分間乾燥し、ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ７を得た。
一方、前記コントロールライン検出試薬１を前記塗布液で５倍希釈したものを６ｍｍ×３００ｍｍのコンジュゲーションパッド（ＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＰＡＤ、ＧＦＤＸ００１０５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の全面に塗布した。塗布には分注プラットフォームと、Ａｉｒ Ｊｅｔノズル（ＡＪＱＨＲ－ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記コントロールライン検出試薬を１２．５μＬ／ｃｍの塗布量で２回均一に塗布した後、４５℃に調整した乾燥機で３０分間乾燥し、ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ７を作製した。

ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の作製
前記ｈＣＧ測定用メンブレンカード７の上流側の２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ７を貼り合わせた。次いで、さらに上流側に前記コンジュゲーションパッドＢ７と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ７を貼り合わせた。さらに、上流側に前記コンジュゲーションパッドＢ７と２ｍｍ重なるよう３ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた以外は、実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片７を作製し、実施例1と同様の方法にて評価した。得られた評価結果を表１に示す。

（実施例８）
ｈＣＧ測定用メンブレンカードの作製
メンブレン部の上流側から１０ｍｍの位置に、ライン幅約１ｍｍのテストラインを形成し、前記テストラインを形成したメンブレンカードのメンブレン部の上流側から１１．５ｍｍの位置に、ライン幅約１ｍｍのコントロールラインを形成した以外は実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用メンブレンカード８を作製した。

ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドの作製
実施例２と同様にしてｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ８およびｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ８を作製した。

ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の作製
前記ｈＣＧ測定用メンブレンカード８の上流側の２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ８を貼り合わせた。次いで、さらに上流側に前記コンジュゲーションパッドＢ８と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ８を貼り合わせた。さらに、上流側に前記コンジュゲーションパッドＡ８と２ｍｍ重なるよう１１ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた以外は、実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片８を作製し、実施例1と同様の方法にて評価した。得られた評価結果を表１に示す。

（実施例９）
ｈＣＧ測定用メンブレンカードの作製
実施例５と同様にしてｈＣＧ測定用メンブレンカード９を作製した。

ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドの作製
実施例３と同様にしてｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ９およびｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ９を作製した。

ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の作製
前記ｈＣＧ測定用メンブレンカード９の上流側の２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ９を貼り合わせた。次いで、さらに上流側に前記コンジュゲーションパッドＢ９と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ９を貼り合わせた。さらに、上流側に前記コンジュゲーションパッドＡ９と２ｍｍ重なるよう４ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた以外は、実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片９を作製し、実施例1と同様の方法にて評価した。得られた評価結果を表１に示す。

（実施例１０）
ｈＣＧ測定用メンブレンカードの作製
メンブレン部の上流側から５ｍｍの位置に、ライン幅約１ｍｍのテストラインを形成し、前記テストラインを形成したメンブレンカードのメンブレン部の上流側から１５ｍｍの位置に、ライン幅約１ｍｍのコントロールラインを形成した以外は実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用メンブレンカード１０を作製した。

ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドの作製
実施例３と同様にしてｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ１０およびｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ１０を作製した。

ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の作製
前記ｈＣＧ測定用メンブレンカード１０の上流側の２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ１０を貼り合わせた。次いで、さらに上流側に前記コンジュゲーションパッドＢ１０と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ１０を貼り合わせた。さらに、上流側に前記コンジュゲーションパッドＡ１０と２ｍｍ重なるよう４ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた以外は、実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片１０を作製し、実施例1と同様の方法にて評価した。得られた評価結果を表１に示す。

（比較例１）
ｈＣＧ測定用メンブレンカードの作製
実施例１０と同様にしてｈＣＧ測定用メンブレンカード１１を作製した。

ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドの作製
前記ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬1、および前記コントロールライン検出試薬1を５：１で混合し、１２ｍｍ×３００ｍｍのコンジュゲーションパッド（ＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＰＡＤ、ＧＦＤＸ００１０５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に前記ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬１とコントロールライン検出試薬１の混合液を全面に塗布した。塗布には分注プラットフォームと、Ａｉｒ Ｊｅｔノズル（ＡＪＱＨＲ－ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記前記ｈＣＧ測定用テストライン検出試１とコントロールライン検出試薬１の混合液を７．５μＬ／ｃｍの塗布量で２回均一に塗布した後、４５℃に調整した乾燥機で３０分間乾燥し、ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＣを作製した。

ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の作製
前記ｈＣＧ測定用メンブレンカード１１の上流側の２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＣを貼り合わせた。次いで、上流側に前記コンジュゲーションパッドＣと２ｍｍ重なるよう９ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた以外は、実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片１１を作製し、実施例1と同様の方法にて評価した。得られた評価結果を表１に示す。

（比較例２）
ｈＣＧ測定用メンブレンカードの作製
メンブレン部の上流側から１５ｍｍの位置に、ライン幅約１ｍｍのテストラインを形成し、前記テストラインを形成したメンブレンカードのメンブレン部の上流側から１０ｍｍの位置に、ライン幅約１ｍｍのコントロールラインを形成した以外は実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用メンブレンカード１２を作製した。

ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドの作製
実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ１２およびｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ１２を作製した。

ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の作製
前記ｈＣＧ測定用メンブレンカード１２の上流側の２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＢ１２を貼り合わせた。次いで、さらに上流側に前記コンジュゲーションパッドＢ１２と２ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドＡ１２を貼り合わせた。さらに、上流側に前記コンジュゲーションパッドＡ１２と２ｍｍ重なるよう９ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた以外は、実施例１と同様にしてｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片１２を作製し、実施例1と同様の方法にて評価した。得られた評価結果を表１に示す。

表１の結果から明らかなように、実施例１～１０では、テストライン検出試薬を含浸させたコンジュゲーションパッドＡおよびコントロールライン検出試薬を含浸させたコンジュゲーションパッドＢを用いることによって測定対象物質を高精度に定量できるイムノクロマト試験片が得られている。実施例７では、テストラインとコントロールラインとの距離が若干離れているためか、測定精度が他の実施例に比較して低めの結果となった。また、実施例８では、テストラインとコントロールラインとの距離が近すぎるためか、測定装置の読み取りが不十分となり測定精度が低めの結果となった。一方、比較例１では、テストライン検出試薬とコントロールライン検出試薬の両方を含浸させたコンジュゲーションパッドを用いたためか、測定精度が低い結果となった。また、比較例２では、コンジュゲーションパッドＡの上流端からテストラインまでの距離がコンジュゲーションパッドＢの上流端からコントロールラインまでの距離よりもかなり大きいためか、測定精度が低い結果となった。

本発明のイムノクロマト試験片を使用することで、測定試料中に含まれる測定対象物質を迅速・簡便・安価でかつ測定精度よく測定できるので、産業に寄与することが大である。

１：サンプルパッド
２：コンジュゲーションパッドＡ
３：コンジュゲーションパッドＢ
４：メンブレン
５：吸収パッド
６：バッキングシート
７：テストライン
８：コントロールライン
９：粘着シート

Claims (3)

1. サンプルパッド、コンジュゲーションパッドＡ、前記コンジュゲーションパッドＡとは異なるコンジュゲーションパッドＢ、メンブレン、吸収パッドの各部材が順に連接配置されたイムノクロマト試験片であって、
   前記各部材は、それぞれ一部重なり部を有し、
   前記メンブレンは、上流側にテストライン、下流側にコントロールラインを有し、
   前記コンジュゲーションパッドＡは、テストライン検出試薬を含有しており、
   前記コンジュゲーションパッドＢは、コントロールライン検出試薬を含有しており、
   前記コンジュゲーションパッドＡの上流端から前記テストラインまでの距離Ｘおよび前記コンジュゲーションパッドＢの上流端から前記コントロールラインまでの距離Ｙとの差が１０ｍｍ未満である、
   測定試料中に含まれる測定対象物質を定量するためのイムノクロマト試験片。
2. 前記テストラインと前記コントロールラインとが１ｍｍ以上１５ｍｍ以下離れている、請求項１に記載のイムノクロマト試験片。
3. 請求項１または２に記載のイムノクロマト試験片を用い、下記（ｉ）から（ｉｉｉ）の工程を順に経て、測定試料中に含まれる測定対象物質を定量する方法。
   工程（ｉ）：測定試料と希釈液とを混合する工程
   工程（ｉｉ）：工程（ｉ）の混合液を、サンプルパッドに点着させる工程
   工程（ｉｉｉ）：テストラインおよびコントロールラインの発色強度から測定対象物質を測定する工程