KR102142901B1 - 면역 크로마토그래피 시험편 - Google Patents

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Abstract

[과제] 검출 대상 물질의 농도에 영향을 받지 않는 컨트롤 라인 검출 시약을 포함하는 면역 크로마토그래피 시험편을 제공한다.
[해결 수단] 생체 시료 중의 검출 대상 물질을 정량하기 위한 면역 크로마토그래피 시험편으로서, a) 상기 검출 대상 물질과 특이적으로 결합하는 검출 시약 및 컨트롤 라인 검출 시약이 함침된 컨쥬게이션 패드, 및 b) 상류측에 검출 대상 물질을 포착하기 위한 항체가 고정화되어 있으며, 또한 하류측에 컨트롤 라인 검출 시약을 특이적으로 포착하기 위한 항체가 고정화되 있는 다공성 멤브레인 패드를 갖는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 시험편.

Description

면역 크로마토그래피 시험편
본 발명은, 면역 크로마토그래피법에 의한 생체 시료 중에 포함되는 검출 대상 물질의 검출 방법, 검출을 위한 키트, 당해 키트의 제조 방법에 관한 것이다.
면역 크로마토그래피법이란, 검출 대상 물질과 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 다공질 지지체의 일단부로부터, 생체 시료가 모세관 현상에 의해 다공질 지지체 내를 이동하면서 전개되고, 그 과정에서 표지된 검출 대상 물질과 항체가 면역 반응에 의해 결합함으로써, 시간 경과에 따라 집적되고, 국소적으로 발색함으로써 생체 시료 중의 검출 대상 물질의 유무를 판정하는 면역 측정법이다.
면역 크로마토그래피법의 이점으로서는, 조작이 간편한 것이나 육안 판정이 가능한 것 등을 들 수 있다. 이들의 이점을 이용한 임신 검사약이나 인플루엔자 진단약 등의 체외 진단약이 세계적으로 보급되고 있으며, POCT(Point Of Care Testing)로서 주목을 모으고 있다(특허문헌 1).
POCT란 의료 종사자가 피험자의 곁에서 행하는 임상 검사를 말한다. POCT는 대규모 병원의 중앙 검사실 등에서 행하는 임상 검사와는 상이하며, 그 자리에서 순시에 검사 결과가 얻어지기 때문에 의료 현장에서 요구가 높아지고 있다.
종래의 면역 크로마토그래피법은 육안 판정(정성 평가)이 일반적이었지만 최근 몇년간, 발색 강도를 측정하는 크로마토 리더 등의 장치를 이용함으로써, 생체 시료 중에 포함되는 검출 대상 물질의 농도를 정량화하는 기술이 개발되고 있다.
상기 정량화의 방법으로서는, 샌드위치법이 대표적이다. 샌드위치법에서는 검출 대상 물질에 있어서의 에피토프가 상이한 2종류의 항체를 이용한다. 제1 항체는, 금 콜로이드, 착색 라텍스, 형광 입자 등의 검출 입자와 감작한 검출 시약으로서 사용한다. 제2 항체는, 다공질 지지체의 일단부에 고정한 포착 항체로서 테스트 라인의 측정에 사용한다. 또한, 검출 항체와 특이적으로 결합하는 항체를 다공질 지지체의 타단부에 고정화하여 컨트롤 라인의 측정에 사용한다. 생체 시료 중에 포함되는 검출 대상 물질은 다공질 지지체의 일단부로부터 전개되어, 검출 항체와 면역 복합체를 형성하면서 이동하고, 테스트 라인 상에서 포착 항체와 접촉하여 포착되어 발색한다. 검출 대상 물질과 면역 복합체를 형성하지 않은 유리된 검출 시약은, 테스트 라인 위를 통과하고, 컨트롤 라인의 항체에 포착되어 발색한다. 이들의 발색 강도를 크로마토 리더 등의 장치를 이용함으로써 검출 대상 물질의 농도를 정량할 수 있다.
종래의 면역 크로마토그래피법에서는, 테스트 라인과 컨트롤 라인을 검출할 때에 공통된 검출 시약을 사용하고 있었기 때문에, 검출 대상 물질의 농도에 영향을 받아 컨트롤 라인의 발색 강도가 변화된다는 문제가 있었다. 생체 시료 중에 고농도의 검출 대상 물질이 존재한 경우, 다량의 검출 입자가 검출 대상 물질과 면역 복합체를 형성하고, 상류측의 테스트 라인에서 포착되어 테스트 라인의 발색 강도는 높아진다. 한편, 유리된 검출 시약은 소량이 되기 때문에 컨트롤 라인의 발색 강도는 낮아진다는 문제가 있었다. 생체 시료 중에 검출 대상 물질이 저농도로 존재한 경우, 검출 대상 물질과 면역 복합체를 형성한 검출 입자가 소량이 되기 때문에, 유리된 검출 입자가 컨트롤 라인에서 다량으로 포착된 결과, 컨트롤 라인의 발색 강도는 높아진다는 문제가 있었다.
면역 크로마토그래피법의 정량화에 있어서는, 컨트롤 라인은 검출 시약의 다공질 지지체로의 유입량을 측정하기 위해 사용하는 경우가 있기 때문에, 일정량의 검출 시약이 다공질 지지체로 전개된 경우, 발색 강도는 항상 일정한 것이 요망된다. 상기와 같이 검출 대상 물질의 농도에 영향을 받아 컨트롤 라인의 발색 강도가 변화되면 측정 정밀도에 큰 영향을 미치는 경우가 있다.
일본 특허 공개 제2006-67979호 공보
본 발명의 과제는, 상기한 문제점을 감안하여, 검출 대상 물질의 농도에 영향을 받지 않는 검출 시약으로서 컨트롤 라인 검출 시약을 제공함으로써, 종래보다도 고정밀도의 면역 크로마토그래피 분석 방법, 당해 분석 방법을 사용한 면역 크로마토그래피 시험편 및 키트, 키트의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 컨트롤 라인을 검출하기 위한 검출 시약으로서, 컨트롤 라인 검출 시약을 포함하는 검출 시약을 사용함으로써, 생체 시료 중의 검출 대상 물질의 농도의 영향을 받지 않고, 컨트롤 라인의 발색 강도를 안정화할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자는, 또한 이 지견을 기초로, 컨트롤 라인 검출 시약을 포함하는 면역 크로마토그래피 시험편, 당해 시험편의 제조 방법, 당해 면역 크로마토그래피 시험편을 사용한 생체 시료 중의 검출 대상 물질의 정량법 등의 발명을 완성시켰다.
즉 대표적인 본원 발명은 이하와 같다.
(1) 생체 시료 중의 검출 대상 물질을 정량하기 위한 면역 크로마토그래피 시험편으로서,
a) 상기 검출 대상 물질과 특이적으로 결합하는 검출 시약 및 컨트롤 라인 검출 시약이 함침된 컨쥬게이션 패드, 및
b) 상류측에 검출 대상 물질을 포착하기 위한 항체가 고정화되어 있으며, 또한 하류측에 컨트롤 라인 검출 시약을 특이적으로 포착하기 위한 항체가 고정화되어 있는 다공성 멤브레인 패드
를 갖는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 시험편.
(2) 상기 컨트롤 라인 검출 시약은, 비오틴 표지 단백질이 결합한 검출 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 (1)에 기재된 면역 크로마토그래피 시험편.
(3) 상기 단백질은 미생물 유래 또는 동물 유래의 단백질인 것을 특징으로 하는 (2)에 기재된 면역 크로마토그래피 시험편.
(4) 상기 미생물 유래의 단백질은 블로킹 펩티드 프래그먼트(Blocking Peptide Fragment)인 것을 특징으로 하는 (3)에 기재된 면역 크로마토그래피 시험편.
(5) 상기 동물 유래의 단백질은 소 혈청 알부민 또는 카제인인 것을 특징으로 하는 (3)에 기재된 면역 크로마토그래피 시험편.
(6) 상기 컨트롤 라인 검출 시약을 특이적으로 포착하기 위한 항체는 항비오틴 항체인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 면역 크로마토그래피 시험편.
(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 면역 크로마토그래피 시험편을 사용하는, 생체 시료 중의 검출 대상 물질의 정량 방법.
(8) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 면역 크로마토그래피 시험편, 검체 희석액 및 분석 장치를 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 키트.
(9) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 면역 크로마토그래피 시험편의 제조 방법.
본 발명의 면역 크로마토그래피 시험편에 의하면, 생체 시료 중의 검출 대상 물질의 농도에 의존하지 않고 컨트롤 라인의 발색 강도를 안정화할 수 있기 때문에, 측정 정밀도가 높은 면역 크로마토그래피 시험편을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 사용하는 면역 크로마토그래피 시험편의 일례를 도시하는 상면도이다.
도 2는 본 발명에서 사용하는 면역 크로마토그래피 시험편의 일례를 도시하는 측면도이다.
도 3은 본 발명의 면역 크로마토그래피 시험편을 사용하여, 인간 융모성 고나도트로핀(hCG)을 측정했을 때의 사진을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 면역 크로마토그래피 시험편을 사용하여, 인간 융모성 고나도트로핀(hCG)을 측정했을 때의 희석 직선성을 나타낸다.
도 5는 종래의 면역 크로마토그래피 시험편을 사용하여, 인간 융모성 고나도트로핀(hCG)을 측정했을 때의 사진을 나타낸다.
도 6은 종래의 면역 크로마토그래피 시험편을 사용하여, 인간 융모성 고나도트로핀(hCG)을 측정했을 때의 희석 직선성을 나타낸다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 시험편의 하나의 실시 형태를 설명한다. 본 발명의 실시 형태로서는, 검출 대상 물질과 특이적으로 결합하는 검출 시약과 컨트롤 라인 검출 시약을 포함하는 면역 크로마토그래피 시험편이다.
(컨트롤 라인 검출 시약)
본 발명에서 사용하는 컨트롤 라인 검출 시약은, 비오틴 표지 단백질이 결합한 검출 입자이다. 비오틴의 표지 방법은 특별히 제한되지 않지만, N-히드록시숙신이미드법으로 결합하는 방법이 예시된다. 검출 입자로서는 특별히 제한되지 않지만, 금 콜로이드, 라텍스 입자, 형광 입자 등을 예시할 수 있다. 비오틴 표지 단백질과 검출 입자의 결합 방법으로서는 특별히 제한되지 않지만, 소수 결합에 의한 물리 흡착 또는 공유 결합을 통한 결합 방법이 예시된다.
(단백질)
상기 비오틴 표지 단백질에 사용하는 단백질의 종류로서는 특별히 제한되지 않지만, 미생물 유래 단백질이나 동물 유래 단백질 등이 바람직하다. 보다 바람직하게는 미생물 유래 단백질로서는, 블로킹 펩티드 프래그먼트, 동물 유래 단백질로서는 소 혈청 알부민 또는 카제인이 바람직하다. 이들 단백질은 시판되고 있는 것이 있으면 그것을 사용해도 되고, 별도 공지된 방법으로 제조해도 된다. 분자 사이즈도 특별히 제한되지 않지만, 평균 분자량으로 100kDa 이하가 바람직하다. 일반적으로 단백질의 분자 사이즈가 작을수록 검출 입자 하나의 입자에 대한 단백질의 결합량은 증가하기 때문에, 감도 등의 성능이 높아진다.
(검출 입자)
상기 검출 입자의 종류로서는 특별히 제한되지 않지만, 발색 입자나 형광 입자를 사용할 수 있다. 발색 입자로서는, 금속 입자, 라텍스 입자 등을 예시할 수 있다. 금속 입자로서는, 금 콜로이드, 은 콜로이드, 백금 콜로이드 등을 예시할 수 있다. 금속 입자의 입경은, 특별히 제한되지 않지만 1 내지 100nm인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 20 내지 80nm, 더욱 바람직하게는 40 내지 60nm이다. 라텍스 입자로서는, 폴리스티렌, 폴리메타크릴산메틸, 아크릴산 중합체 등의 재질을 포함하는 것을 예시할 수 있다. 라텍스 입자의 입경은, 특별히 제한되지 않지만 25 내지 500nm가 바람직하다. 보다 바람직하게는 50 내지 250nm, 더욱 바람직하게는 80 내지 200nm이다. 형광 입자로서는 특별히 제한되지 않지만, 폴리스티렌, 폴리메타크릴산메틸, 폴리비닐톨루엔, 실리카 등의 재질을 포함하는 것을 예시할 수 있다. 형광 색소로서는, 특별히 제한되지 않지만 FITC(플루오레세인이소티오시아네이트), 로다민 B 유도체, 히드록시쿠마린 등을 예시할 수 있다. 이들 중에서도 범용성이 높고, 시인성이 우수한 금 콜로이드나 라텍스 입자를 사용하는 것이 바람직하다.
(N-히드록시숙신이미드법)
상기 비오틴 표지 단백질의 비오틴의 표지 방법은 특별히 한정되지 않지만, N-히드록시숙신이미드법을 예시할 수 있다. N-히드록시숙신이미드법을 사용함으로써 비오틴의 카르복실기를 N-히드록시아민계 화합물과 탈수 축합제 존재하에서 축합 반응하고, 선택적으로 활성화하고, 단백질의 아미노기와 아미드 결합을 통해 표지할 수 있다.
(N-히드록시아민계 화합물)
상기 축합 반응에 사용하는 N-히드록시아민계 화합물은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 N-히드록시숙신이미드, N-히드록시노르보르넨-2,3-디카르복실산이미드, 2-히드록시이미노-2-시아노아세트산에틸에스테르, 2-히드록시이미노-2-시아노아세트산아미드, N-히드록시피페리딘, N-히드록시프탈이미드, N-히드록시이미다졸, N-히드록시말레이미드 등을 들 수 있다. 이들 화합물을 2종 이상 사용해도 된다. 이 중에서도, N-히드록시숙신이미드(이하, NHS라 표기하는 경우가 있음)가 비교적 저렴하며, 입수하기 쉽다는 점이나 펩티드 합성 분야 등에서 실적이 있다는 점에서 보다 적합하다.
(탈수 축합제)
상기 축합 반응에 사용하는 탈수 축합제로서는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 1-에틸-3-디메틸아미노프로필카르보디이미드염산염, 1-시클로헥실-(2-모르포닐-4-에틸)-카르보디이미드·메소p-톨루엔술포네이트 등을 들 수 있다. 이 중에서도 1-에틸-3-디메틸아미노프로필카르보디이미드염산염(이하, EDC·HCl라 표기하는 경우가 있음)이 펩티드 합성 분야 등에서 범용적인 수용성 축합제로서 실적이 있다는 점에서 보다 적합하다.
(비오틴의 도입량)
상기 비오틴 표지 단백질에 있어서의 비오틴의 도입량은, 단백질과 비오틴의 몰비를 조정함으로써 제어할 수 있다. 감도 등의 성능을 높이기 위해, 비오틴의 도입량은 많은 편이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 단백질의 몰수에 대하여 비오틴의 몰수가 1.0몰배 이상인 것이 바람직하고, 5.0몰배 이상인 것이 보다 바람직하고, 10.0몰배 이상인 것이 더욱 바람직하다. 상기 몰비는 일례이기 때문에 단백질의 종류나 현실의 감도에 따라 적절히 증감해도 된다.
(비오틴 표지 단백질과 검출 입자의 결합)
상기 비오틴 표지 단백질과 검출 입자의 결합 방법으로서는 특별히 제한되지 않지만, 소수 결합에 의한 물리 흡착, 또는 공유 결합을 통한 결합 방법을 예시할 수 있다. 소수 결합에 있어서는 비오틴 표지 단백질과 검출 입자의 표면층에서 직접적으로 결합하기 때문에, 비오틴 표지 단백질의 등전점 부근의 pH로 처리하는 것이 바람직하다. 공유 결합에 있어서는, 검출 입자 표면의 관능기에 따라 결합 방법은 상이하지만, 일례를 들면 검출 입자의 표면에 존재하는 관능기가 아미노기인 경우에는, 상술한 N-히드록시숙신이미드법을 사용하여 결합할 수 있다.
반응 온도는 특별히 한정되지 않는다. 바람직한 하한은 10℃, 보다 바람직하게는 20℃ 이상이다. 바람직한 상한은 50℃, 보다 바람직하게는 40℃ 이하이다. 반응 시간은 반응 온도에 따라 상이하지만, 바람직하게는 1시간 이상 24시간 이하, 보다 바람직하게는 2시간 이상 12시간 이하이다.
반응액 중에 포함되는 미반응된 N-히드록시아민계 화합물이나 탈수 축합제는 여과나 원심 분리 등에 의해 수용매로부터 용이하게 분리할 수 있다.
(검출 대상 물질과 특이적으로 결합하는 검출 시약)
상기 검출 대상 물질과 특이적으로 결합하는 검출 시약은, 생체 시료 중의 검출 대상 물질과 결합할 수 있는 항체(이하, 검출 항체라 표기하는 경우가 있음)가 검출 입자와 결합한 것이다. 검출 항체는, 검출 대상 물질의 종류에 따라 상이하지만, 시판되고 있는 것이 있으면 그것을 사용해도 되고, 별도 공지된 방법으로 제조해도 된다. 분자 사이즈도 특별히 제한되지 않는다.
(검출 대상 물질을 포착하기 위한 항체)
검출 대상 물질을 포착하기 위한 항체(이하, 포착 항체라 표기하는 경우가 있음)는 시판되고 있는 것이 있으면 그것을 사용해도 되고, 별도 공지된 방법으로 제조해도 된다. 검출 대상 물질에 대한 포착 항체의 인식 부위는 검출 항체와는 상이한 부위를 인식하는 항체를 사용하는 편이 바람직하다. 분자 사이즈도 특별히 제한되지 않는다. 인간 융모성 고나도트로핀을 측정하기 위한 포착 항체로서는, 예를 들어 항hCG_1646157(V-24), 인간(래빗)(산타 크루즈 바이오테크놀로지사(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)제), 항hCG/융모성 고나도트로핀, 인간(마우스)(라이프스팬 바이오사이언스사(LifeSpan Biosciences, Inc.)제), 항CGB/hCGβ, 인간(마우스)(라이프스팬 바이오사이언스사제), 항융모성 고나도트로핀, 인간(래빗)(EY 래버러토리스사(EY Laboratories, Inc.)제), 항β-HCG, 인간(마우스)(보스터 이뮤노리더(Boster Immunoleader)사제), 항CGα(αHCG), 인간(래빗)(R&D 시스템즈사(R&D Systems Inc.)제) 등을 들 수 있다.
(컨트롤 라인 검출 시약을 포착하는 항체)
상기 컨트롤 라인 검출 시약을 포착하는 항체는, 구체적으로는 비오틴을 포착하는 항체이다(이하, 항비오틴 항체라 표기하는 경우가 있음). 항비오틴 항체로서는 시판되고 있는 것이 있으면 그것을 사용해도 되고, 별도 공지된 방법으로 제조해도 된다. 분자 사이즈도 특별히 제한되지 않는다. 항비오틴 항체로서는, 예를 들어 항-비오틴 항체(제네텍스사(GENETEX, inc.)제), 항-비오틴, 고트-폴리(베틸 래버러토리스사(Bethyl Laboratories, Inc.)제), IgG 프랙션 모노클로날 마우스 항-비오틴(이와이 가가꾸 야꾸힌 가부시키가이샤제) 등을 들 수 있다.
(다공성 멤브레인 패드)
상기 포착 항체를 다공성 멤브레인 패드의 상류측(테스트 라인)에, 항비오틴 항체를 하류측(컨트롤 라인)에 고정화함으로써, 면역 크로마토그래피 등에서 사용 가능한 다공성 멤브레인 패드를 제작할 수 있다. 이들 항체는, 면역 크로마토그래피 등에서 일반적으로 사용되는 다공성 멤브레인 패드에 용이하게 고정화할 수 있다. 다공성 멤브레인 패드의 재질로서는 특별히 한정되지 않지만, 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 아세트산셀룰로오스, 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리염화비닐, 폴리불화비닐리덴, 나일론을 들 수 있다. 이들 재질로 구성된 막, 패브릭, 섬유상 또는 부직포상 매트릭스 등이 적합하다. 바람직하게는 셀룰로오스 유도체의 막이 사용되고, 보다 바람직하게는 니트로셀룰로오스막이 사용된다.
이어서, 본 발명의 면역 크로마토그래피 시험편의 일례를 도면을 참조하여 설명한다. 도 1에 있어서, 1은 다공성 멤브레인 패드, 2는 샘플 패드, 3은 컨쥬게이션 패드, 4는 흡수 패드, 5는 포착 항체의 고정화 부위(테스트 라인), 6은 항비오틴 항체의 고정화 부위(컨트롤 라인), 7은 점착 시트를 나타낸다.
도 1의 예에서는, 다공성 멤브레인 패드는 폭 4mm, 길이 60mm의 가늘고 긴 시험편상의 니트로셀룰로오스제 멤브레인으로 제작되어 있다. 면역 크로마토그래피 시험편의 컨쥬게이션 패드에는 검출 대상 물질과 특이적으로 결합하는 검출 시약과 컨트롤 라인 검출 시약이 함침되어 있다. 니트로셀룰로오스 멤브레인의 크로마토그래피 전개 시점측의 말단으로부터 약 10mm의 위치에 포착 항체가 고정화된 테스트 라인(5)이 형성된다. 약 15mm의 위치에 항비오틴 항체가 고정화된 컨트롤 라인(6)이 형성된다.
도 1에 도시한 바와 같은 면역 크로마토그래피 시험편은, 다공성 멤브레인 패드(1)를 점착 시트(7)의 중간 정도의 위치에 접착하고, 샘플 패드(2)와 컨쥬게이션 패드(3)를 다공성 멤브레인 패드(1)의 말단 위에 일부 중첩하여 연접함과 함께, 흡수 패드(4)를 다공성 멤브레인 패드(1)의 반대측 말단 위에 중첩하여 연접함으로써 제작할 수 있다.
샘플 패드(2)로서는, 생체 시료를 빠르게 흡수, 전개할 수 있는 재질의 것이면 되고, 특별히 제한되지 않지만, 셀룰로오스제의 여과지, 부직포나, 다공질 합성 수지제의 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등을 들 수 있다. 이 중에서도 여과지가 적합하다.
컨쥬게이션 패드(3)로서는, 검출 시약을 건조 상태에서 유지할 수 있으며, 생체 시료의 전개와 함께 검출 시약을 빠르게 방출할 수 있는 재질의 것이면 되고, 특별히 제한되지 않지만, 유리 파이버, 셀룰로오스제의 여과지, 폴리에스테르제의 부직포 등을 들 수 있다. 이 중에서도 유리 파이버가 적합하다.
흡수 패드(4)로서는, 생체 시료를 빠르게 흡수, 유지할 수 있는 재질의 것이면 되고, 특별히 한정되지 않지만, 셀룰로오스제의 여과지, 부직포나, 다공질 합성 수지제의 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등을 들 수 있다. 이 중에서도 셀룰로오스제의 여과지가 적합하다.
또한, 면역 크로마토그래피 시험편은, 샘플 패드(2), 테스트 라인(5)과 컨트롤 라인(6)의 상방에 각각 생체 시료를 주입하기 위한 개구부, 포착된 검출 입자량을 정량하기 위한 개구부를 갖는 적당한 플라스틱제의 케이스에 수용해도 된다.
(면역 크로마토그래피 시험편의 제조 방법)
본 발명의 면역 크로마토그래피 시험편의 제조 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 컨쥬게이션 패드에 있어서는, 띠 형상의 유리 파이버에 일정량의 검출 시약을 균일하게 도포한 후, 항온조 내에서 적당한 온도에서 일정 시간 건조함으로써 제작할 수 있다. 포착 항체와 항비오틴 항체는 다공성 멤브레인 패드 위에 각각 일정량을 라인 형상으로 도포하면 된다. 멤브레인 패드 위에 도포하는 방법으로서 특별히 한정되지 않지만, 시판되고 있는 면역 크로마토그래피 디스펜서를 사용할 수 있다. 포착 항체와 항비오틴 항체의 도포량은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 라인 길이 10cm당 10μl 이하, 보다 바람직하게는 8μl 이하, 더욱 바람직하게는 6μl 이하이다. 하한은, 바람직하게는 4μl 이상이다. 포착 항체와 항비오틴 항체의 농도로서는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 2.0 내지 0.1mg/ml, 보다 바람직하게는 1.8 내지 0.2mg/ml, 더욱 바람직하게는 1.6 내지 0.3mg/ml이다.
멤브레인 패드 위에 도포한 포착 항체와 항비오틴 항체는, 건조하는 것만으로 매우 용이하게 고정화할 수 있다. 건조 온도는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 20℃ 내지 80℃, 보다 바람직하게는 30 내지 70℃, 더욱 바람직하게는 40 내지 60℃이다. 건조 시간은 건조 온도에 따라 상이하지만, 통상은 5 내지 120분, 바람직하게는 10 내지 60분이다.
본 발명에 있어서, 면역 크로마토그래피 분석 키트는, 생체 시료의 전처리나 희석을 목적으로 한 검체 희석액, 면역 크로마토그래피 시험편 및 분석 장치를 포함한다.
(면역 크로마토그래피 시험편을 사용한 검출 대상 물질의 측정 방법)
상기와 같은 면역 크로마토그래피 시험편을 사용하여 측정을 행하는 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 이하의 방법이 예시된다. 우선, 생체 시료를 필요에 따라 적당한 전개 용매와 혼합하여 전개 가능한 혼합액을 얻은 후, 당해 혼합액을 샘플 패드(2) 위에 주입(적하)한다. 당해 혼합액은, 샘플 패드(2)를 통과하여 컨쥬게이션 패드(3)로 전개된다. 생체 시료는 컨쥬게이션 패드(3)에 함침된 검출 시약과 컨트롤 라인 시약을 용해하면서, 검출 대상 물질과 검출 시약이 면역 복합체를 형성하여 다공성 멤브레인 패드로 전개된다. 그 후, 모세관 현상에 의해 흡수 패드(4)측으로 흐른다. 상기 혼합액이 다공성 멤브레인 패드 위의 테스트 라인(5)에 도달하면, 상기 면역 복합체는 포착 항체에서 포착되어 집적되고, 테스트 라인(5)이 발색한다. 컨트롤 라인 검출 시약을 포함하는 전개 용매는 테스트 라인(5)을 통과하여 컨트롤 라인(6)에 도달한다. 여기서 컨트롤 라인 검출 시약은 항비오틴 항체에서 포착되어 집적되고, 컨트롤 라인(6)이 발색한다. 다른 전개 용매는 최종적으로 흡수 패드에서 흡수된다. 테스트 라인(5)과 컨트롤 라인(6)의 발색 강도를 면역 크로마토 리더 등을 사용하여 측정함으로써 검출 대상 물질의 농도를 측정할 수 있다.
(컨트롤 라인의 발색 강도)
컨트롤 라인의 발색 강도는 특별히 제한되지 않지만, 육안 혹은 면역 크로마토 리더로 검출할 수 있는 범위의 발색 강도이면 된다. 바람직하게는 10mAbs 내지 500mAbs, 보다 바람직하게는 50mAbs 내지 450mAbs, 더욱 바람직하게는 100mAbs 내지 400mAbs이다. 또한, 검출 대상 물질의 농도에 의하지 않고 발색 강도가 일정한 것이 바람직하며, 구체적으로는 발색 강도의 변동 계수(Coefficient of variation)가 바람직하게는 20％ 이하, 보다 바람직하게는 10％ 이하, 더욱 바람직하게는 5％ 이하를 나타낸다.
또한, 변동 계수(Coefficient of variation)는 하기 식 1 및 식 2에 의해 구할 수 있다.
식 1
Figure 112018046221547-pct00001
식 2
Figure 112018046221547-pct00002
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 상세하게 설명한다. 본 발명은 이들 실시예로 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1]
(hCG 검출 시약의 제조)
125μl의 금 콜로이드액(OD520=12)(WRGH1, 가부시키가이샤 와인 레드 케미컬사제)에 50μl의 10mM Tris-HCl pH 9.2를 가하고, 보텍스로 교반하였다. 시판되고 있는 항hCG 모노클로날 항체(제품명: 항CGB/hCG β, 인간(마우스), 품번: LS-C196902-100, 라이프스팬 바이오사이언스사제)를 10mM Tris-HCl로 0.1mg/ml로 제조하였다. 100μl의 항hCG 모노클로날 항체 용액을 금 콜로이드액에 가하고, 보텍스로 교반한 후, 실온에서 15분간 정치하였다. 200μl의 0.3wt％ 블로킹 펩티드 프래그먼트(도요보 가부시키가이샤제)(이하, BPF라 표기하는 경우가 있음)+1.0wt％ PEG20000 수용액(산타 크루즈 바이오테크놀로지사제)(이하, PEG라 표기하는 경우가 있음)을 가하고, 보텍스로 교반한 후, 15분간 실온에서 정치하였다. 그 후, 7000rpm으로 10분간 원심 분리하고, 상청을 제거하였다. 200μl의 0.3wt％ BPF+1.0wt％ PEG 수용액을 가하고, 보텍스로 교반한 후, 15분간 실온에서 정치하였다. 7000rpm으로 10분간 원심 분리하고, 상청을 제거하였다. 1ml의 0.3wt％ BPF+5.0wt％ D(+)-트레할로오스(나카라이테스크 가부시키가이샤제) 수용액을 가하여 보텍스로 교반한 후, 15분간 실온에서 정치하였다.
(컨트롤 라인 검출 시약의 제조)
3.15mg의 D-비오틴(나카라이테스크 가부시키가이샤제)을 72μl의 증류수로 용해하였다. 또한, 10mg의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(나카라이테스크 가부시키가이샤제)와 10mg의 N-히드록시숙신이미드(나카라이테스크 가부시키가이샤제)를 100μl의 증류수에 용해하였다. 이것에 D-비오틴 용액을 가하고, 실온에서 1시간 완만하게 교반하였다. 상기 용액에 80μl의 3wt％ BPF 용액을 가하고 30분간 실온에서 정치하여, 비오틴 표지 BPF 용액을 제조하였다. 이어서, 50μl의 금 콜로이드액(OD520=12)에 450μl의 10mM Tris-HCl pH 9.2를 가하고, 보텍스로 교반하였다. 추가로, 15μl의 비오틴 표지 BPF 용액을 금 콜로이드액에 가하고, 보텍스로 교반한 후, 15분간 실온에서 정치하였다. 200μl의 0.3wt％ BPF+1.0wt％ PEG20000 수용액(산타 크루즈 바이오테크놀로지사제)(이하, PEG라 표기하는 경우가 있음)을 가하고, 보텍스로 교반한 후, 15분간 실온에서 정치하였다. 그 후, 7000rpm으로 10분간 원심 분리하고, 상청을 제거하였다. 200μl의 0.3wt％ BSA+1.0wt％ PEG 수용액을 첨가하고, 보텍스로 교반한 후, 15분간 실온에서 정치하였다. 7000rpm으로 10분간 원심 분리하고, 상청을 제거하였다. 1ml의 0.3wt％BPF+5wt％ D(+)-트레할로오스(나카라이테스크 가부시키가이샤제) 수용액을 가하여 보텍스로 교반한 후, 15분간 실온에서 정치하였다.
(hCG 검출용 다공성 멤브레인 패드의 제조)
25mm×150mm의 니트로셀룰로오스 멤브레인(상품명: Hi-Flow Plus 타입 HF120(머크 밀리포아 가부시키가이샤제))의 일단부(상류측)로부터 약 10mm의 위치에 라인 폭 약 1mm의 테스트 라인으로서, 0.5mg/ml의 항hCG 모노클로날 항체(제품명: 항융모성 고나도트로핀, 인간(래빗), 품번: AT-2601-2, EY 래버러토리스사제) 용액(50mM KH2PO4, pH 7.0+5wt％ 수크로오스)을 면역 크로마토그래피 디스펜서를 사용하여 약 1.0μl/cm의 도포량으로 도포하였다. 이어서, 니트로셀룰로오스 멤브레인의 일단부(상류측)로부터 약 15mm의 위치에 라인 폭 약 1mm의 컨트롤 라인으로서, 1.0mg/ml의 항비오틴 모노클로날 항체(제품명: 항-비오틴 항체, 품번: GTX44344, 제네텍스사제) 용액(50mM KH2PO4, pH 7.0+5wt％ 수크로오스)을 면역 크로마토그래피 디스펜서를 사용하여 약 1.0μl/cm의 도포량으로 도포하였다. 그 후 50℃에서 30분 건조하였다.
(hCG 측정용 컨쥬게이션 패드의 제작)
10mm×150mm의 컨쥬게이션 패드(상품명: 슈어 위크(머크 밀리포아 가부시키가이샤제))에 상기 hCG 검출 시약과 컨트롤 라인 검출 시약의 혼합액(혼합비 1:1) 1.0ml를 균일하게 도포하였다. 그 후, 데시케이터 내에서 밤새 실온에서 감압 건조하고, hCG 검출 시약과 컨트롤 라인 검출 시약을 함침한 hCG 측정용 컨쥬게이션 패드를 제작하였다.
(hCG 측정용 시험편의 제작)
hCG 측정용 시험편은 면역 크로마토그래피에서 일반적으로 사용되는 슬라이드 구성으로 제작하였다. 구체적으로는 샘플 패드(상품명: 슈어 위크(머크 밀리포아 가부시키가이샤제)), 컨쥬게이션 패드(상품명: 슈어 위크(머크 밀리포아 가부시키가이샤제)), 니트로셀룰로오스 멤브레인(상품명: 하이-플로 플러스 타입 HF120(머크 밀리포아 가부시키가이샤제)), 흡수 패드(상품명: 슈어 위크(머크 밀리포아 가부시키가이샤제))를 직렬 연결하여 제작하였다. 이어서 가로 폭 약 4mm, 세로 폭 약60mm의 시험편상으로 재단기를 사용하여 커트하였다.
(hCG 시료의 제조)
시판되고 있는 hCG 항원을 50mM KH2PO4, pH 7.2+1.0wt％ BSA+0.1wt％ NaN3으로 희석하여, 1IU/L, 10IU/L, 100IU/L, 1,000IU/L의 각 hCG 시료를 제조하였다.
(hCG의 측정)
제작한 hCG 측정용 시험편을 수평한 대에 설치하였다. 이어서, 제조한 4 수준의 hCG 시료를 40μl 피펫으로 취하고, 샘플 패드에 적하하였다. 검체를 적하하고 나서 10분 후에 촬영한 사진을 도 2에 도시한다. 테스트 라인은 hCG 농도에 의존하여 발색 강도가 높아졌다. 컨트롤 라인은 hCG 농도에 영향을 받지 않고, 발색 강도의 변동 계수는 2.15％였다.
(hCG의 정량)
hCG 측정용 시험편의 발색 강도를 면역 크로마토 리더를 사용하여 측정하였다. 면역 크로마토 리더는 C10060-10(하마마츠 포토닉스사제)을 사용하였다. 결과를 도 3에 도시한다. 테스트 라인은 hCG 농도에 의존하여 직선적인 반사 흡광도를 확인할 수 있었다. 컨트롤 라인은 hCG 농도에 영향을 받지 않고 반사 흡광도는 약 300mAbs인 것을 확인할 수 있었다.
[비교예 1]
(hCG 검출용 다공성 멤브레인 패드의 제조)
실시예 1과 마찬가지의 방법으로 컨트롤 라인으로서, 1.0mg/ml의 항IgG 폴리클로날 항체 용액(50mM KH2PO4, pH 7.2)을 디스펜서를 사용하여 약 1.0μl/cm의 도포량으로 도포하였다. 그 후 50℃에서 30분 건조하여 hCG 검출용 다공성 멤브레인 패드를 제작하였다.
(hCG 측정용 컨쥬게이션 패드의 제작)
실시예 1과 마찬가지의 방법으로 검출 시약으로서 hCG 검출 시약만을 균일하게 도포하고(즉, 컨트롤 라인 검출 시약의 도포없음), hCG 측정용 컨쥬게이션 패드를 제작하였다.
(hCG 시험편을 사용한 hCG의 측정)
상기 제조한 다공성 멤브레인 패드 및 컨쥬게이션 패드를 사용하여 제작한 hCG 측정용 시험편을 사용하여 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 hCG를 측정하였다. 검체를 적하하고 나서 10분 후에 촬영한 사진을 도 4에 도시한다. 테스트 라인은 hCG 농도에 의존하여 발색 강도가 높아졌다. 컨트롤 라인은 hCG 농도의 증가에 따라 발색 강도는 저하되었다.
(hCG 시험편을 사용한 hCG의 정량)
hCG 측정용 시험편의 발색 강도를 면역 크로마토 리더를 사용하여 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 측정하였다. 결과를 도 5에 도시한다. 테스트 라인은 hCG 농도에 의존하여 발색 강도가 높아졌다. 컨트롤 라인은 hCG 농도의 증가에 따라 반사 흡광도는 약 200mAbs부터 80mAbs까지 저하되고, 발색 강도의 변동 계수는 30.3％였다.
본 발명에 의해, 간편하며 측정 정밀도가 높은 면역 크로마토그래피 시험편을 제공할 수 있다.
1: 다공성 멤브레인 패드
2: 샘플 패드
3: 컨쥬게이션 패드
4: 흡수 패드
5: 테스트 라인
6: 컨트롤 라인
7: 점착 시트

Claims (9)

  1. 생체 시료 중의 검출 대상 물질을 정량하기 위한 면역 크로마토그래피 시험편으로서,
    a) 상기 검출 대상 물질과 특이적으로 결합하는 검출 시약 및 컨트롤 라인 검출 시약이 함침된 컨쥬게이션 패드, 및
    b) 상류측에 검출 대상 물질을 포착하기 위한 항체가 고정화되어 있으며, 또한 하류측에 컨트롤 라인 검출 시약을 특이적으로 포착하기 위한 항체가 고정화되어 있는 다공성 멤브레인 패드
    를 갖고, 상기 컨트롤 라인 검출 시약은, 비오틴 표지 단백질이 결합한 검출 입자를 포함하고, 상기 단백질은 블로킹 펩티드 프래그먼트인 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 시험편.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 컨트롤 라인 검출 시약을 특이적으로 포착하기 위한 항체는 항비오틴 항체인 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 시험편.
  7. 제1항 또는 제6항에 기재된 면역 크로마토그래피 시험편을 사용하는, 생체 시료 중의 검출 대상 물질의 정량 방법.
  8. 제1항 또는 제6항에 기재된 면역 크로마토그래피 시험편, 검체 희석액 및 분석 장치를 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 키트.
  9. 제1항 또는 제6항에 기재된 면역 크로마토그래피 시험편의 제조 방법.
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