CN111474351B - 一种可用于检测冠状病毒的免疫层析试纸条和试剂盒 - Google Patents

一种可用于检测冠状病毒的免疫层析试纸条和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种免疫层析试纸条，试纸条的底板上设置有依次相连搭接的样品区、检测区和吸附区。样品区含有连接有第一生物标记物的显色微球，第一生物标记物能与待测目标物特异性结合，显色微球包括载体微球和彩色颜料。检测区设置有检测线和质控线，检测线喷涂有第二生物标记物，第二生物标记物能够与目标分析物特异性结合，质控线喷涂有能与所述第一生物标记物特异性结合的对应物。第一生物标记物、待测目标物和第二生物标记物可在检测线形成夹心复合物，并截留在检测线上形成肉眼可见的颜色，本发明提供的试纸条可应用于新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)的检测，且具有检测方便，灵敏度高的优点。

Description

一种可用于检测冠状病毒的免疫层析试纸条和试剂盒
技术领域
本发明属于纳米医学生物技术检测技术领域，具体涉及一种可用于检测冠状病毒的免疫层析试纸条和试剂盒，以及其在免疫层析检测方面的应用。
背景技术
冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。
当前关于SARS-CoV-2的检测试剂主要有两类，分别是核酸检测试剂和抗体检测试剂，其中抗体检测试剂又包括胶体金法和磁微粒化学发光法等。核酸检测试剂的检测过程包括标本处理、核酸提取和PCR检测，需要配备专业的测试仪器，且平均检测时间需要2-3个小时，不容易普及使用，且当疾病在一定范围大规模爆发时很难满足实时检测的需求。
人体在接触外来抗原时，最早由产生IgM抗体，实际是B淋巴细胞表面的B细胞受体(BCR)的分泌形式，在IgM在识别抗原以后，产生这些IgM的B细胞会进入淋巴结，并从B细胞分化为浆细胞，浆细胞可以大量分泌抗体IgG，IgG抗体的亲和力比IgM会高很多，会在机体内存在很长时间，但是IgM只在病原体刚来的时候会出现，持续时间大约一周。免疫层析试纸条为抗原抗体的简便快速检测提供了可能。
基于胶体金的试纸条是使用最为普遍的免疫层析试纸条。胶体金试纸条一般包括，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水垫，其中结合垫上喷涂有胶体金标记IgG抗体(Ab1)，硝酸纤维素膜上划有IgG抗体(Ab2)的T线和二抗的C线，样本液体从样品垫加入，会通过毛细作用依次通过结合垫、NC膜和吸水垫，此过程一般10～15分钟，等试纸上的免疫反应发生之后，就可以看到胶体金聚集的位置上有没有红色条带出现，肉眼可见的，这样就知道检测结果了，红色条带颜色的深浅与胶体金聚集的数量多少相关，数量越多则颜色越深，越有利于正确判断检测结果。
目前报道的应用于胶体金试纸条的胶体金的颗粒大小为20-50nm，显色性能普遍比较有限，即单位数量的颗粒聚集后颜色不够深。样本中IgG的数量较少且同一样本中IgG数量为一定的，因此在样本液体经过结合垫与胶体金标记IgG抗体(Ab1)发生特异性反应形成免疫复合物，免疫复合物随着样本液体继续到T线聚集，IgG的数量一定，因此到达T线的胶体金数量也是一定的，而胶体金颗粒需要聚集到很多的数量才会出现肉眼可见的红色，也就是说检测的灵敏度较低，因此容易出现漏检的情况。本申请的发明人针对目前胶体金试纸条检测灵敏度低进行了进一步开发研究。
发明内容
本发明的目的是，提供一种可用于检测冠状病毒的免疫层析试纸条，在对含有相同浓度待检测物的样本进行免疫检测中，本发明显色时效果比胶体金更佳。
在本发明范畴内适用如下定义。
生物标记物应当具有一定的特异性和具有足够的灵敏度，本领域技术人员知道如何根据目标待测物来选取合适的生物标记物作为第一生物标记物和第二生物标记物。第一生物标记物的对应物为可以与第一生物标记物特异性结合的物质。第一生物标记物、第二生物标记物和第一生物标记物的对应物都可以根据需要通过偶联的方式修饰在载体微球或者标记在层析试纸条的检测区。
为使本发明更容易理解，现举例说明如下：
1)采用直接法检测冠状病毒或其他病毒，其中，目标待测物为病毒的特异性蛋白(例如为病毒的S蛋白和/或N蛋白，特异蛋白表面包括多个抗原表位)，层析试纸条的样品区一端，即结合垫上喷涂偶联有识别抗体的显色微球，层析试纸条的T线上标记有捕获抗体，层析试纸条的C线上标记有抗识别抗体的二抗，当目标待测物液体从样品区加入层析试纸条后，液体爬升经过结合垫时识别抗体与目标待测物的抗原表位特异性结合，并继续爬升至T线，T线处的捕获抗体与目标待测物的抗原表位特异性结合，形成“夹心免疫复合物结构”并将部分显色微球截留在T线上，形成肉眼可见的颜色，剩余的偶联有识别抗体的显色微球随液体继续爬升到C线，C线处的二抗可与识别抗体特异性结合，从而显色微球截留在C线上形成肉眼可见的颜色。
2)采用间接法检测冠状病毒或其他病毒，即患者(包括人或者其他生物)血液里特异性针对病毒的IgM抗体或IgG抗体。假设目标待测物为人IgG抗体，则层析试纸条的结合垫上喷涂有：偶联有病毒特异性蛋白(S蛋白和/或N蛋白)的显色微球和偶联有鸡IgY抗体的显色微球，层析试纸条的T线上标记有抗人IgG，层析试纸条的C线上标记有羊抗鸡IgY，当目标待测物液体从样品区加入层析试纸条后，液体爬升经过结合垫时特异性蛋白的抗原表位与人IgG特异性结合，并继续爬升至T线，T线处的抗人IgG与人IgG特异性结合，形成“夹心免疫复合物结构”(参见图1原理图)并将部分显色微球截留在T线上，形成肉眼可见的颜色，剩余的包含有偶联有病毒特异性蛋白的显色微球和偶联有鸡IgY抗体的显色微球随液体继续爬升到C线，C线处的羊抗鸡IgY可与鸡IgY抗体特异性结合，从而显色微球截留在C线上形成肉眼可见的颜色。
上述只是举例，本发明所述的第一生物标记物、第二生物标记物和第一生物标记物的对应物包括但不限于上述所述的生物活性物质。且本领域技术人员应当明白，显色微球的颜色越深，即反射率越低，肉眼看见的颜色就越明显，即检测的灵敏度越高。
载体微球，在本发明上下文中，“载体微球”指的是球状或粒状的载体基质，其上可以负载具有不同功能的不同种类的物质。包括但不限于通过可聚合的单体与可聚合的颜料共聚制成的纳米微球或黑色的聚多巴胺纳米微球。
本发明的实施例提供一种显色微球的制备方法，所述方法包括：
1)将至少两种单体在一定条件下聚合，得到载体微球，其中至少一种单体有颜色；
2)将有机颜料加入到溶剂中分散均匀，得到分散体，然后将步骤1)所得到的所述载体微球加入到所述分散体中，加热一段时间，在此过程中所述有机颜料包埋到所述载体微球中，冷却至室温，洗涤，得到所述显色微球。
根据本发明的一种实施方式，例如，在所述步骤1)中，所述聚合为乳液聚合；
优选的，所述乳液聚合的聚合条件包括：在引发剂的作用下，加热、通入氮气并持续搅拌，反应一段时间。
根据本发明的一种实施方式，例如，在所述步骤1)中，所述乳液聚合的聚合条件包括：在引发剂的作用下，加热反应体系至50-100℃、通入氮气并持续搅拌，反应10-30h。
根据本发明的一种实施方式，例如，在所述步骤2)中，所述溶剂包括四氢呋喃/水(1:9，v:v)、苯甲醇/乙二醇/水(1:8:1，v:v:v)、丙酮/水(1:9，v:v)；优选的，所述溶剂包括四氢呋喃/水(1:9，v:v)或苯甲醇/乙二醇/水(1:8:1，v:v:v)；根据本发明的一种实施方式，例如，在所述步骤2)中，所述有机颜料与所述载体微球的质量比为1：1-1：5，优选1：2-1：4，进一步优选1：3；
根据本发明的一种实施方式，例如，在所述步骤2)中，所述加热一段时间包括：将反应体系加热到70-120℃，保持20-60min；优选的，所述加热一段时间包括：将反应体系加热到90-110℃，保持30-50min；进一步优选的，所述加热一段时间包括：将反应体系加热到105℃，保持35min。
本发明的实施例还提供一种显色微球(黑色)的制备方法，所述方法包括：
1)将多巴胺盐酸盐溶于水中，持续搅拌并加入NaOH，并将上述反应液加热到温度T1后，保持温度T1反应H1小时后，冷却至室温，并离心除去上清液，得到沉淀物。
2)将上步骤1)中的所述沉淀物分散于缓冲液中，在T2温度下加入氰基硼氢化钠，持续搅拌条件下使用戊二醛与聚多巴胺上的氨基进行还原氨化偶联。
3)H2小时后，将步骤2)的反应液离心洗涤，并经过滤膜分筛，得到黑色的聚多巴胺纳米微球。
根据本发明的一种实施方式，例如，在所述步骤1)中，所述多巴胺盐酸盐与水的质量比为1：100-1：500，NaOH和多巴胺盐酸盐的质量比为1：1-1：5，温度T1为50-70℃，反应时间H1为2-8h。
根据本发明的一种实施方式，例如，在所述步骤1)中，步骤1)中的反应在敞口容器中进行。
根据本发明的一种实施方式，例如，在所述步骤2)中，缓冲液选自PBS缓冲液、BBS缓冲液，温度T2为25-35℃。
本发明提供一种免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条包括底板，所述底板上设置有依次相连搭接的样品区、检测区和吸附区；
所述样品区的一端用于置放待测样品；
所述样品区的另一端含有连接有第一生物标记物的显色微球，所述第一生物标记物能与待测目标物特异性结合；所述显色微球包括载体微球和彩色颜料；
所述检测区设置有检测线(T线)和质控线(C线)；所述检测线喷涂有第二生物标记物，第二生物标记物能够与目标分析物特异性结合；所述质控线喷涂有能与所述第一生物标记物特异性结合的对应物。
在一些实施方式中，所述彩色颜料包埋于载体微球中形成显色微球；
其中，颜料的颜色优选深色。
优选地，以聚苯乙烯(PS)或聚苯乙烯/聚甲基丙烯酸复合微球为主体，采用自由基聚合法将深色染料分子聚合进主体内，从而形成彩色载体颗粒。然后，使用该载体颗粒负载深色有机颜料分子，形成显色微球。
在聚合过程中，随着使用引发剂的不同，颗粒的表面电荷将会控制为正或者负。使用偶氮二异丁基脒盐酸盐为引发剂时，颗粒的表面将会存在大量的-NH2，致使颗粒电荷为正。而当使用无机过氧类引发剂时，颗粒的表面存在大量的-SO4-，致使颗粒的表面带负电。因此，在制备过程中，选择不同的引发剂，可对颗粒的表面电荷进行控制，更有利于调控深色有机颜料分子吸附至载体微球中。
在一些实施方式中，所述载体微球选自有颜色的聚合物微球。
其中，聚合物微球的颜色优选深色，且在水中单分散。在一些实施方式中，所述有颜色的聚合物微球为黑色的聚多巴胺纳米微球，使用该载体颗粒负载深色有机颜料分子，形成显色微球。
在一些实施方式中，所述有颜色聚合物微球通过可聚合的单体与可聚合的颜料共聚制成。
在一些实施方式中，所述彩色颜料选自黑色有机颜料、棕色有机颜料、红色有机颜料、绿色有机颜料、蓝色有机颜料、紫色有机颜料中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述蓝色有机颜料选自如下分子中的一种或多种；
所述绿色有机颜料选自如下分子中的一种或多种；
所述红色有机颜料选自如下分子中的一种或多种；
所述棕色有机颜料选自如下分子中的一种或多种；
所述紫色有机颜料选自如下分子中的一种或多种；
所述黑色有机颜料选自如下分子中的一种或多种；
在一些实施方式中，所述有颜色的聚合物微球的平均粒径为50-1000nm，优选100-500nm，更优选为200-400nm，其中变异系数为小于10％，优选为小于5％。
在一些实施方式中，所述显色微球的平均粒径为50-1000nm，优选100-500nm，更优选为200-400nm，其中变异系数为小于10％，优选为小于5％。
在一些实施方式中，在所述显色微球中所述载体微球和彩色颜料的质量比为500:1到5:1，优选100:1-10:1，更优选为50:1-10:1。
在一些实施方式中，上述任一实施例方式中的，所述待测目标物为人IgG抗体；
所述第一生物标记物包括新型冠状病毒特异性蛋白和鸡IgY抗体；
其中，所述样品区的另一端含有连接有新型冠状病毒特异性蛋白的显色微球，和连接有鸡IgY抗体的显色微球；
所述第二生物标记物为抗人IgM；
所述能与第一生物标记物特异性结合的对应物为羊抗鸡IgY。
上述实施方式所提供的免疫层析试纸条在免疫分析检测中的应用。
本发明还提供一种免疫层析试剂盒，包括如上述任一实施方式中的免疫层析试纸条，还包括：对比色卡；
所述对比色卡上设有多个顺序排列的色块，多个色块颜色由浅至深。
本发明的有益效果为：
1)传统使聚合物微球带色的方法有两种，一种是可聚合的单体与可聚合的有色单体共聚制备有色聚合物微球；一种是聚合物微球包覆颜料制备有色聚合物微球。通过共聚合方法，有色分子部分的含量有限；通过聚合物包覆的方法，有色分子的负载率有限。
本发明同时使用上述两种方法，先使用可聚合的单体与可聚合的深色单体共聚制备深色的载体微球，随后深色载体微球包覆颜料进而制备显色微球，有色物质在显色微球中的含量显著提升，使得显色微球的颜色更深。
2)在本发明的显色微球中，载体聚合物球本身为深色(例如黑色的聚多巴胺纳米微球)，其中再负载深色的有机颜料，显色微球的颜色进一步加深。另外，相比于胶体金，所形成的聚合物颗粒的粒径比较大，聚合物颗粒的的密度低于胶体金，颗粒密度较低，因此能够在水相中稳定分散。相比于无机粉体颜料或纳米显色物质，有机颜料在聚合物载体微球中的负载量更高。对比单位数量的颗粒聚集后的效果，本发明的显色微球颜色更深。在对含有相同浓度待检测物的样本进行免疫检测中，本发明显色时效果比胶体金更佳。
附图说明
图1夹心免疫复合物结构形成原理图；
图2所示为本发明各实施例制备的免疫层析试纸条安装示意图；
图3所示为本发明实施例1中的红色载体微球的TEM图；
图4所示为本发明实施例1中的红色显色微球的TEM图；
图5所示为本发明实施例2中的黑色载体微球的TEM图；
图6所示为本发明实施例2中的黑色显色微球的TEM图；
图7所示为本发明各实施例显色微球的制备原理图；
图8所示为本发明各实施例制备的试纸条测试原倍待测样品的对比图；
图9所示为图8中各试纸条的T线和C线的灰度值；
图10所示为本发明实施例1、实施例2和对比例制备的试纸条的应用部分试纸条测试对比图；
图11所示为图10中各试纸条的T线和C线的灰度值；
图12所示为本发明实施例1制备的试纸条测试原倍、稀释2倍和稀释4倍待测样品的对比图；
图13所示为图12中各试纸条的T线和C线的灰度值；
图14所示为本发明实施例2制备的试纸条测试原倍、稀释2倍和稀释4倍待测样品的对比图；
图15所示为图14中各试纸条的T线和C线的灰度值。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、红色显色微球-免疫层析试纸条的制备
1.1红色载体微球包埋红色颜料制备得到红色显色微球
1)红色载体微球的制备
苯乙烯分子、丙烯酸和可聚合红色有机颜料分子，通过聚合反应合成制备红色载体微球。
如以上反应式，采用乳液聚合的方法合成红色载体微球，其中KPS为引发剂过硫酸钾、反应温度为70℃，通入氮气，持续搅拌，反应20小时。反应结束后，离心洗涤得到红色载体微球。本反应有三种单体，分别为苯乙烯、丙烯酸、可聚合红色颜料分子，三种单体的摩尔比例为x:y:z＝92:5:3。如图3所示，制备的红色载体微球的形貌大小均匀，平均粒径为200nm。
2)显色微球(微球颜色为红色，称为红色显色微球)的制备：
将提供的红色20mg有机颜料(a)加入到6mL的苯甲醇-乙二醇-水(v:v，1:10:1)溶液中。超声分散后，加入60mg的1.1.1中制备的红色载体微球纳米粒子，在105℃加热35min。然后，冷却至室温，分别使用乙醇和水离心清洗3次，最后将纳米粒子(即红色显色微球)分散到水中保存。该方法所制备的红色显色微球表面含有羧基，通过电导滴定法测得羧基的含量以重量计占显色微球总重量的0.3％。如图4所示，制备的红色显色微球的形貌大小均匀，平均粒径为200nm。
1.2、红色显色微球分别偶联新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S蛋白和鸡IgY抗体
1)取100mg步骤1.1中制备的红色显色微球，离心，复溶到20mL pH7.4的BBS缓冲液中，充分超声使其分散均匀，得到分散体系。
2)向分散体系中分别加入10mg EDC和5mg NHSS，室温下反应2小时。
3)反应结束后，离心洗涤，复溶到20mL pH 7.4的BBS缓冲液中，
取10mL pH 7.4的BBS缓冲液，向其中加入5mg新型冠状病毒S蛋白(菲鹏生物股份有限公司)，室温下反应4小时。
取10mL pH 7.4的BBS缓冲液，向其中加入5mg鸡IgY抗体(菲鹏生物股份有限公司)，室温下反应4小时。
4)上述两个反应结束后，离心洗涤，分别复溶到10mL pH 7.4的BBS缓冲液中，并分别向其中加入100mg BSA，分别室温下反应2小时。
5)反应结束后，分别离心洗涤，并分别复溶到10mL pH 7.4的BBS缓冲液中，于4℃保存备用。
1.3结合垫的制备：
取1.2中制备的偶联有新型冠状病毒S蛋白的红色纳米微球，离心处理，用喷膜缓冲液(1％BSA，1％蔗糖)复溶制备成3×108个/mL的分散液。
取1.2中制备的偶联有鸡IgY抗体的红色显色微球，离心处理，用喷膜缓冲液(1wt％BSA，1wt％蔗糖)复溶为10mg/mL。
将上述两种溶液等体积混合并通过喷膜仪将抗体标记的红色显色微球以1.2μL/cm的速度喷于聚酯膜6614上，并于37℃烘烤过夜。
1.4硝酸纤维素(NC)膜的制备：
使用PBS缓冲液(添加有1wt％BSA，1wt％蔗糖，50mM NaCl和0.5％TWEEN 20)分别将抗人IgG(菲鹏生物股份有限公司)和羊抗鸡IgY(菲鹏生物股份有限公司)分别以1mg/mL和1mg/mL的浓度且以8mm的间隔，用划膜仪划于硝酸纤维素膜上，放于37℃过夜烘干。
1.5红色显色微球-免疫层析试纸条的组装
在白色PVC底板上依次相互交错3mm地贴上步骤1.3制备的结合垫(标记了偶联有新型冠状病毒S蛋白的红色显色微球和偶联有鸡IgY抗体的红色纳米微球的玻璃纤维)，步骤1.4制备的NC膜(划有抗人IgG的T线和羊抗鸡IgY的C线)，最后贴上吸水纸，其结构如图2所示，样品区的右端为结合垫，检测区依次划有抗人IgG的T线和羊抗鸡IgY的C线。T线上的抗人IgG可以与有新型冠状病毒S蛋白的表面抗原位点特异性结合并截留偶联有新型冠状病毒S蛋白的红色显色微球，从而出现肉眼可的红色。C线上的羊抗鸡IgY能与结合垫上随液体因毛爬升来的鸡IgY抗体特异性结合并截留偶联有鸡IgY抗体的红色显色微球，从而出现肉眼可的红色，C线作为质控线。
将组装好的层析板通过高速斩切机切割成3.8mm宽的试纸条，然后再用配套的上下两个塑料卡壳固定试纸条，即得到免疫层析试纸条。
值得说明的是，彩色颜料还可选择其他黑色有机颜料、棕色有机颜料、红色有机颜料、绿色有机颜料、蓝色有机颜料或紫色有机颜料。
如图7所示，传统使聚合物微球带色的方法有两种，一种是可聚合的单体与可聚合的有色单体共聚制备有色聚合物微球；一种是聚合物微球包覆颜料制备有色聚合物微球。通过共聚合方法，有色分子部分的含量有限；通过聚合物包覆的方法，有色分子的负载率有限。
本实施例中同时使用上述两种方法，先使用可聚合的单体与可聚合的深色单体共聚制备深色的载体微球，随后深色载体微球包埋颜料进而制备显色微球，有色物质在显色微球中的含量显著提升，使得显色微球的颜色更深。相较于颜色较浅时的情况，较深的颜色更容易被观察分辨出来。而在基于胶体金或显色纳米微球的免疫层析检测中，一般是根据检测线(T线)上出现了可辨识的颜色去判断存在待检测目标物，所以易被观察分辨出的深颜色对检测更有利。在对含有相同浓度待检测物的样本进行免疫检测时，T线上的颜色相当于一定数量的显色材料颗粒聚集后的效果，本发明的显色微球颜色更深，所以本发明的显色检测效果更佳。
实施例2
2黑色显色微球-免疫层析试纸条的制备
2.1聚多巴胺纳米微球包埋黑色颜料(载体微球)
聚合物基质用的黑色聚多巴胺纳米微球，黑色颜料的结构如下
1)聚多巴胺纳米微球(即黑色载体微球)的制备：
在1L的烧瓶中，将1g多巴胺盐酸盐加入到500mL的水溶液中，持续搅拌。然后，加入500mg的NaOH，加热至60℃，敞口在空气中搅拌10小时。然后，冷却至室温，16000转/min离心除去上清液。沉淀用PBS缓冲液分散，保持温度30℃，加入氰基硼氢化钠，持续搅拌条件下使用戊二醛与聚多巴胺上的氨基进行还原氨化偶联。反应完成后，通过离心洗涤和滤膜分筛，得到黑色的聚多巴胺纳米微球，如图5所示，聚多巴胺纳米微球的形貌大小均匀，平均粒径为200nm。
2)黑色显色微球(显色微球，颜色为黑色)的制备：
将提供的黑色有机颜料(b)加入到5mL的苯甲醇-乙二醇-水(v:v，1:8:1)溶液中。超声分散后，加入50mg的2.1.1中制备的黑色的聚多巴胺纳米微球，在110℃加热30min。然后，冷却至室温，使用乙醇和水离心清洗3次，最后将纳米粒子(黑色显色微球)分散到水中保存，如图6所示，黑色显色微球形貌大小均匀，平均粒径为200nm。
2.2、黑色显色微球分别偶联新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S蛋白和鸡IgY抗体
将实施例1中的红色载体微球替换为步骤2.1制备的黑色载体微球，将实施1中的红色颜料替换为步骤2.1的黑色颜料，其他步骤与实施例1相同。
2.3结合垫的制备
2.4硝酸纤维素膜的制备
2.5黑色显色微球-免疫层析试纸条的组装
本实施例的步骤2.3、2.4和2.5实施例1中的步骤相同。
在本发明的显色微球中，载体聚合物球本身为深色(例如黑色的聚多巴胺纳米微球)，其中再负载深色的有机颜料，显色微球的颜色进一步加深。另外，相比于胶体金，所形成的聚合物颗粒的粒径比较大，聚合物颗粒的密度低于胶体金，颗粒密度较低，因此大粒径依然能够在水相中稳定分散，例如本发明中200nm的显色纳米微球经过1个月放置未出现沉淀。相比于无机粉体颜料或纳米显色物质，有机颜料在聚合物载体基质中的负载量更高。对比单位数量的颗粒聚集后的效果，本发明的显色微球颜色更深。在对含有相同浓度待检测物的样本进行免疫检测中，本发明显色时效果比胶体金更佳。
分别取1mL含有3×108个所述红色显色微球、所述黑色显色微球、胶体金的水溶液所述粒子的个数由纳米流式仪器测定。将上述三种溶液分别划在NC膜上形成相同面积的有色方块(20mm×20mm)，根据反射率测试结果，所述红色显色微球、所述黑色显色微球、传统胶体金(30nm)的反射率分别为11％、9％、21％。说明颜色由深到浅顺序为黑色显色微球>红色显色微球>传统胶体金。
对比例1
3胶体金-免疫层析试纸条的制备
3.1提供30nm的胶体金，购买自江苏先丰纳米材料科技有限公司。
3.2胶体金颗粒分别标记新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S蛋白和鸡IgY抗体胶体金颗粒通过电荷作用和范德华力标记分别新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S蛋白和鸡IgY抗体。
取10mL胶体金搅拌滴加50μL 0.2M的K2CO3水溶液，然后滴加入偶联蛋白100μg，室温搅拌30分钟，然后滴加入300μL的2wt％PEG水溶液继续搅拌30分钟，然后离心13000转10分钟，弃上清，沉淀用纯化水复溶到1mL，再10000转再离10分钟，弃上清，沉淀用纯水溶液复溶到500μL，即为20倍浓缩液。
3.3结合垫的制备
取500μL的浓缩金，再加入500μL的喷金稀释液(1wt％蔗糖1wt％NaCl0.5wt％B66)充分混合，制备成3×108个/mL的分散液，按照对应的喷金量循环间隔2mm喷于聚酯膜6614上放37摄氏度烘干过夜。
3.4硝酸纤维素膜的制备
3.5胶体金-免疫层析试纸条的组装
本实施例的步骤3.4和3.5实施例1中的步骤相同。
4实施例1、实施例2和对比例1制备的试纸条的应用
4.1
1)配置阳性样本(含人IgG抗体)
用什么配的人IgG(菲鹏生物股份有限公司)配置为浓度为0.006mg/mL的待测样本溶液。
2)分别取20μL上述待测样本溶液加入到80μL PBS缓冲液中(含有1wt％BSA、0.1wt％SDS和0.1wt％Thesit)，并充分混合。
3)将混合均匀的100μL混合液加入到实施例1、实施例2和对比例中制备的免疫层析试纸条加样孔(塑料卡壳上对应加样区的位置)处，在吸附区吸水纸的作用下液体会沿着试纸条爬升，依次通过样品区(样品垫、结合垫)、检测区(NC膜)和吸水区(吸水纸)。以实施例1中的层析试纸条为例介绍如下:
检测样本中含有IgG抗体时，随着样本液体的爬升，首先IgG抗体通过新型冠状病毒S蛋白的特异性结合而与结合垫上的偶联有新型冠状病毒S蛋白的红色纳米微球结合，随后样本液体继续爬升到T线时，T线上的抗人IgG与IgG抗体特异性结合形成夹心免疫复合物，并将红色纳米微球截留在T线，形成肉眼可见红色。随后样本液体带着T线处的偶联有鸡IgG抗体的红色纳米微球继续爬升到C线，C线的羊抗鸡IgY会与鸡IgG抗体特异性结合并将偶联有鸡IgG抗体的红色纳米微球截留在C线，形成肉眼可见红色。
实施例2与实施例1的区别在于，使用黑色显色微球，即在T线和C线上出现肉眼可见的红色。
对比例1与实施例1的区别在于，纳米金颗粒为30nm，由于金的密度比较大，不易分散且易聚集，因此粒径一般在20-30nm。
如图8所示，相同浓度的待测样本(0.006mg/mL，称为单倍浓度)，红色显色微球制备的试纸条的T线的颜色比胶体金制备的试纸条的T线深。黑色显色微球制备的试纸条T线和C线颜色为黑色，且T线的颜色肉眼可见比胶体金制备的试纸条的T线颜色深。图9为图8中各试纸条的灰度值，通过灰度测量仪器测得灰度值如表1所示，红色显色微球制备的试纸条T线的灰度值为42477，黑色显色微球制备的试纸条T线的灰度值为14332，胶体金制备的试纸条T线的灰度值为12704，同样可表明红色显色微球制备的试纸条和黑色显色微球制备的试纸条的T线颜色深，检测相同浓度的含有人IgG抗体的待测样本的灵敏度更高。LoG T/C的数据是对T和C的比值取对数。
表1
4.2
2)配置阳性样本(含人IgG抗体)
将4.1中的阳性样本(0.006mg/mL)分别稀释2倍和4倍，制备0.003mg/mL、和0.0015mg/mL的待测样本溶液。
其他步骤与4.1中的检测步骤相同
如图10所示红色显色微球制备的试纸条的T线和显色微球制备的试纸条T线肉眼可见，胶体金制备的试纸条的T线肉眼不可见。图11所示是图10中各试纸条的灰度值，灰度值如表2，红色显色微球制备的试纸条T线的灰度值为31808，黑色显色微球制备的试纸条T线的灰度值为9442，胶体金制备的试纸条T线的灰度值为2820。可说明红色显色微球、黑色显色微球制备的试纸条灵敏度更高。最低检测限红色显色微球0.0007mg/mL，黑色显色微球0.0005mg/mL，都明显优于胶体金的0.002mg/mL。
表2
实施例3
试剂盒包含：
实施例1中的试纸条；
实施例2中试纸条；
实施例1中试纸条的对比色卡；
如图12所示，实施例1中制备的试纸条，待测样本浓度为0.0015mg/mL、0.003mg/mL和0.006mg/mL的测试结果图，将图12作为对比色卡，在进行其他待测样本测试时，可以以图12为参照，对待测样本中IgG浓度做半定量分析。值得说明的是，本实施例做了三组不同浓度的待测样本，也可做大于三组。图13所示为图12各试纸条T线和C线的灰度值数据。
另外，可采集上述各试纸条T线处的图像将各图像按颜色深浅顺序排列成多个色块制备成对比色卡。
实施例2中试纸条的对比色卡；
如图14所示实施例2中制备的试纸条，待测样本浓度为0.0015mg/mL、0.003mg/mL和0.006mg/mL的测试结果图，将图14作为对比色卡，在进行其他待测样本测试时，可以以图14为参照，对待测样本中IgG浓度的浓度做半定量分析。值得说明的是，本实施例做了三组不同浓度的待测样本，也可做大于三组。图15所示为图14各试纸条T线和C线的灰度值数据。
另外，可采集上述各试纸条T线处的图像将各图像按颜色深浅顺序排列成多个色块制备成对比色卡。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种免疫层析试纸条，其特征在于，
所述免疫层析试纸条包括底板，所述底板上设置有依次相连搭接的样品区、检测区和吸附区；
所述样品区的一端用于置放待测样品；
所述样品区的另一端含有连接有第一生物标记物的显色微球，所述第一生物标记物能与待测目标物特异性结合；所述显色微球包括载体微球和彩色颜料；
所述检测区设置有检测线和质控线；所述检测线喷涂有第二生物标记物，所述第二生物标记物能够与目标分析物特异性结合；所述质控线喷涂有能与所述第一生物标记物特异性结合的对应物；
所述彩色颜料包埋于所述载体微球中形成所述显色微球；
所述载体微球选自有颜色的聚合物微球；
所述有颜色聚合物微球通过可聚合的单体与可聚合的颜料共聚制成；
所述可聚合的单体为苯乙烯分子和丙烯酸；所述可聚合的颜料为：
；
所述彩色颜料为红色有机颜料；
所述红色有机颜料为：
。
2.一种免疫层析试纸条，其特征在于，
所述免疫层析试纸条包括底板，所述底板上设置有依次相连搭接的样品区、检测区和吸附区；
所述样品区的一端用于置放待测样品；
所述样品区的另一端含有连接有第一生物标记物的显色微球，所述第一生物标记物能与待测目标物特异性结合；所述显色微球包括载体微球和彩色颜料；
所述检测区设置有检测线和质控线；所述检测线喷涂有第二生物标记物，所述第二生物标记物能够与目标分析物特异性结合；所述质控线喷涂有能与所述第一生物标记物特异性结合的对应物；
所述彩色颜料包埋于所述载体微球中形成所述显色微球；
所述载体微球选自有颜色的聚合物微球；
所述有颜色的聚合物微球为黑色的聚多巴胺纳米微球；
所述彩色颜料为黑色有机颜料；
所述黑色有机颜料为：
。
3.根据权利要求1或2所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述有颜色的聚合物微球的平均粒径为50-1000nm。
4.根据权利要求3所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述显色微球的平均粒径为50-1000nm。
5.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条，其特征在于，平均粒径为100-500nm。
6.根据权利要求1或2所述的免疫层析试纸条，其特征在于，在所述显色微球中，所述载体微球和所述彩色颜料的质量比为500:1到5:1。
7.根据权利要求6所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述载体微球和所述彩色颜料的质量比为100:1到10:1。
8.一种用于检测新型冠状病毒的免疫层析试剂盒，包括如权利要求1-7任一项所述的免疫层析试纸条，其特征在于，
所述待测目标物为因新冠病毒感染而产生的人IgG抗体；
所述第一生物标记物包括新型冠状病毒特异性蛋白和鸡IgY抗体；
其中，所述样品区的另一端含有连接有新型冠状病毒特异性蛋白的显色微球，和连接有鸡IgY抗体的显色微球；
所述第二生物标记物为抗人IgM；
所述能与第一生物标记物特异性结合的对应物为羊抗鸡IgY。
9.一种免疫层析试剂盒，包括如权利要求1-7任一项免疫层析试纸条，其特征在于，还包括：对比色卡；
所述对比色卡上设有顺序排列的多个色块，所述多个色块颜色由浅至深。
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